DE102020108560A1

DE102020108560A1 - CBX6 als epigenetischer Marker für die Identifizierung von Immunzellen, insbesondere Gedächtnis-B-Zellen

Info

Publication number: DE102020108560A1
Application number: DE102020108560.5A
Authority: DE
Inventors: Sven Olek; Udo Baron; Kati Bourquain
Original assignee: Prec For Medicine GmbH; Precision for Medicine GmbH
Current assignee: PRECISION FOR MEDICINE GMBH, DE
Priority date: 2020-03-27
Filing date: 2020-03-27
Publication date: 2021-09-30
Anticipated expiration: 2040-03-28
Also published as: US20230151422A1; EP4127237A1; WO2021191369A1; DE102020108560B4

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren, insbesondere ein in vitro Verfahren, zur Identifizierung von Gedächtnis-B-Zellen, umfassend die Analyse epigenetischer Modifikationen/Eigenschaften (einschließlich des Methylierungsstatus) von mindestens einer CpG-Position im Säugetier-Genbereich für Chromobox-Protein-Homolog 6 (CBX6), wobei eine Demethylierung oder fehlende Methylierung dieser Genregion im Vergleich zu einer Nicht-Memory-B-Zelle eine Gedächtnis-B-Zelle anzeigt. Die erfindungsgemäßen Analysen können Gedächtnis-B-Zellen auf epigenetischer Ebene identifizieren und von allen anderen Zellen in komplexen Proben, wie z.B. anderen Blut- oder Immunzellen, unterscheiden. Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein verbessertes Verfahren zur Quantifizierung von Speicher-B-Zellen, insbesondere in komplexen Proben, zur Verfügung. Das Verfahren kann ohne einen Schritt der Reinigung und/oder Anreicherung von Zellen durchgeführt werden, vorzugsweise in Vollblut und/oder nicht-trypsiniertem Gewebe.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren, insbesondere ein in vitro Verfahren, zur Identifizierung von Gedächtnis-B-Zellen, umfassend die Analyse epigenetischer Modifikationen/Eigenschaften (einschließlich des Methylierungsstatus) von mindestens einer CpG-Position im Säugetier-Genbereich für Chromobox-Protein-Homolog 6 (CBX6), wobei eine Demethylierung oder fehlende Methylierung dieser Genregion im Vergleich zu einer Nicht-Gedächtnis-B-Zelle eine Gedächtnis-B-Zelle anzeigt. Die erfindungsgemäßen Analysen können Gedächtnis-B-Zellen auf epigenetischer Ebene identifizieren und von allen anderen Zellen in komplexen Proben, wie z.B. anderen Blut- oder Immunzellen, unterscheiden. Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein verbessertes Verfahren zur Quantifizierung von Speicher-B-Zellen, insbesondere in komplexen Proben, zur Verfügung. Das Verfahren kann ohne einen Schritt der Reinigung und/oder Anreicherung von Zellen durchgeführt werden, vorzugsweise in Vollblut und/oder nicht-trypsiniertem Gewebe
Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung ein Kit zur Durchführung der oben genannten Verfahren sowie auf deren jeweilige Verwendung. Es ist ein Ziel dieser Erfindung, ein neuartiges, robusteres Mittel zur quantitativen Erkennung und Messung von Gedächtnis-B-Zellen des Blutes in festen Organen, Geweben oder Körperflüssigkeiten eines Säugetiers bereitzustellen.
Hintergrund der Erfindung
B-Zellen entwickeln sich aus hämatopoietischen Vorläuferzellen in einem geordneten Reifungs- und Selektionsprozess. Gedächtnis-B-Zellen sind eine B-Zell-Untergruppe, die in Keimzentren nach einer Primärinfektion gebildet wird und wichtig ist, um eine beschleunigte und robustere Antikörper-vermittelte Immunantwort im Falle einer erneuten Infektion zu erzeugen.
Ag-aktivierte B-Zellen können sich zu Gedächtnis-B-Zellen oder kurz- und langlebige PCs differenzieren. Die Differenzierung in Gedächtnis-B-Zellen kann mit oder ohne T-Zellhilfe und in einer Keimzentrum (GC)-abhängigen oder unabhängigen Weise erfolgen. Dies führt zu Gedächtnis-B-Zellen-Subsets, die sich in ihrer Effektorfunktion und der Gesamtschutzkapazität unterscheiden.
Sanz et al. (Sanz I, Wei C, Lee FE, Anolik J. Phenotypic and functional heterogeneity of human memory B cells. Semin Immunol. 2008;20(1):67-82) beschreiben, dass Gedächtnis-B-Zellen heterogener sind als bisher angenommen. Trotz anfänglicher Beschreibungen von CD27 als universellem Marker menschlicher Gedächtniszellen wurden Gedächtnis-Populationen beschrieben, die CD27 nicht exprimieren und bei SLE und bei einigen Infektionen wie RSV relevant sein können. Zusätzliche Heterogenität von Gedächtnis-B-Zellen kann auch anhand der Expression von CD38, CD21, CD24, CD19, B220, FcRH4 und CD25 nachgewiesen werden.
Obwohl fast alle Zellen in einem Individuum genau das gleiche Komplement an DNA-Code enthalten, müssen höhere Organismen unterschiedliche Muster der Genexpression in den verschiedenen Gewebetypen auferlegen und beibehalten. Die meiste Genregulation ist vorübergehend, abhängig vom aktuellen Zustand der Zelle und Veränderungen in externen Reizen. Eine dauerhafte Regulierung hingegen ist eine primäre Rolle der Epigenetik - vererbbare Regulierungsmuster, die die grundlegende genetische Codierung der DNA nicht verändern. DNA-Methylierung ist die archetypische Form der epigenetischen Regulation; Sie dient als stabiles Gedächtnis für Zellen und spielt eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der langfristigen Identität verschiedener Zelltypen. Kürzlich wurden andere Formen der epigenetischen Regulation entdeckt. Neben der „fünften Basis“ 5-Methylcytosin (mC) kann eine sechste (5-Hydroxymethylcytosin, hmC), siebente (5-Formylcytosin, fC) und achte (5-Carboxycytosin, cC) gefunden werden (Michael J. Booth et al. Quantitative Sequencing of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine at Single-Base Resolution Science 18 May 2012, Vol. 336 no. 6083 pp. 934-937).
Das primäre Ziel der erwähnten DNA-Modifikationen ist die Zwei-Nukleotid-Sequenz Cytosin-Guanin (eine „CpG-Site“); in diesem Zusammenhang kann Cytosin (C) einer einfachen chemischen Modifikation unterzogen werden, um formyliert, methyliert, hydroxymethyliert oder carboxyliert zu werden. Im menschlichen Genom ist die CG-Sequenz viel seltener als erwartet, außer in einigen relativ dichten Clustern, die als „CpG-Inseln“ bezeichnet werden. CpG-Inseln werden häufig mit Genpromotoren in Verbindung gebracht, und es wurde geschätzt, dass mehr als die Hälfte der menschlichen Gene CpG-Inseln aufweisen (Antequera und Bird, Proc Natl Acad Sci USA 90: 11995-9, 1993).
Die aberrante Methylierung von DNA wird häufig mit der Transformation von gesunden zu Krebszellen in Verbindung gebracht. Zu den beobachteten Effekten gehören die genomweite Hypomethylierung, die erhöhte Methylierung von Tumorsuppressorgenen und die Hypomethylierung vieler Onkogene (zusammengefasst, beispielsweise von Jones und Laird, Nature Genetics 21:163-167, 1999; Esteller, Oncogene 21:5427-5440, 2002; und Laird, Nature Reviews/Cancer 3:253-266, 2003). Methylierungsprofile wurden als tumorspezifisch erkannt (d.h. Veränderungen im Methylierungsmuster bestimmter Gene oder sogar einzelner CpGs sind diagnostische für bestimmte Tumortypen), und es gibt jetzt eine umfangreiche Sammlung diagnostischer Marker für Blasen-, Brust-, Dickdarm-, Speiseröhren-, Magen-, Leber-, Lungen- und Prostatakrebs (zusammengefasst beispielsweise von Laird, Nature Reviews/Cancer 3:253-266, 2003).
Für eine der kürzlich beschriebenen Modifikationen von Cytosin 5-Hydroxymethylierung, wurde die Nützlichkeit der oxidativen Bisulfitsequenzierung zur Kartierung und Quantifizierung von 5hmC auf CpG-Inseln gezeigt (Michael J. Booth et al. Quantitative Sequencing of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine at Single-Base Resolution Science 18 May 2012, Vol. 336 no. 6083 pp. 934-937). Hohe Spiegel an 5hmC wurden in CpG-Inseln die mit Transkriptionsregulatoren assoziiert sind und in langen, eingestreuten Kernsequenzelementen gefunden. Es wird vermutet, dass diese Regionen epigenetisch in embryonalen Stammzellen reprogrammiert werden könnten.
WO 2012/162660 beschreibt Methoden unter der Verwendung von DNA Methylierungsarrays, die zur Identifizierung einer Zelle oder eines Zellgemischs und zur Quantifizierung von Veränderungen in der Zellverteilung im Blut oder im Gewebe sowie zur Diagnose, Prognose und Behandlung von Krankheitszuständen, insbesondere Krebs, zur Verfügung gestellt werden Die Methoden verwenden frische und archivierte Proben.
Zhang und Good-Jacobson (in: Epigenetic regulation of B cell fate and function during an immune response. Immunol Rev. 2019 Mar;288(1):75-84) beschreiben, dass epigenetische Veränderungen entscheidend sind, um sicherzustellen, dass die geeigneten Gene während der B-Zelldifferenzierung transkribiert oder unterdrückt werden. Jüngste Studien haben die Veränderungen der DNA-Methylierung und posttranslationale Histonmodifikationen beleuchtet, die die Bildung von Keimzentren und Antikörper-Sekretionszellen während einer Immunantwort begleiten. Insbesondere die B-Zell Subgruppe-spezifische Expression und Funktion von DNA-Methyltransferasen und Histon-modifizierenden Komplexen, die Epigenomveränderungen vermitteln, beginnen verstanden zu werden.
Angesichts des Vorstehenden ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein verbessertes und insbesondere spezifisches und robustes Verfahren auf Grundlage der DNA-Methylierungsanalyse als überlegenes Werkzeug bereitzustellen, um eine bessere und zuverlässigere Erkennung, Identifizierung, Unterscheidung und Quantifizierung von Gedächtnis-B-Zellen zu ermöglichen.
Die vorliegende Erfindung löst die oben genannte Aufgabe durch das zur Verfügung stellen eines Verfahrens zur Identifizierung von Gedächtnis-B-Zellen in einer Probe, umfassend ein Analysieren des Methylierungsstatus (Bisulfit-Umwandelbarkeit) von mindestens einer CpG Position in der Säugetier- (z.B. menschlichen) Genregion für Chromobox-Proteinhomolog 6 (CBX6), wobei bevorzugt die Genregion wie analysiert basierend auf/gemäß SEQ ID Nr. 1 positioniert ist, wobei weiter bevorzugt die Genregion wie analysiert basierend auf/gemäß SEQ ID Nr. 2 positioniert ist, wobei eine Demethylierung oder ein Fehlen von Methylierung der Genregion eine Gedächtnis-B-Zelle anzeigt, wenn mit einer nicht-Gedächtnis-B-Zelle verglichen.
CBX6 (Chromobox 6 oder Chromobox Proteinhomolog 6) ist eine Komponente eines Polycombgruppe (PcG) Multiprotein PRC1-ähnliches Komplexes, eine Komplexklasse, die benötigt wird, um den repressiven Zustand der Transkription vieler Gene, einschließlich Hox Genen, während der Entwicklung aufrechtzuerhalten. Der PcG PRC1 Komplex wirkt über einen Chromatinumbau und die Modifikation von Histonen; er vermittelt Mono-Ubiquitinierung von Histon H2A ‚Lys-119‘, was zu einer vererbbaren Expressionsveränderung von Chromatin führt. Das Gen für menschliches CBX6 wird auf Chromosom 22, NC_000022.11, gefunden.
Coradini et al. (in: Differential expression of genes involved in the epigenetic regulation of cell identity in normal human mammary cell commitment and differentiation. Chin J Cancer. 2014;33(10):501-510) beschreiben Expressionsmuster eines Panels von 369 Genen von denen bekannt ist, dass sie an der Etablierung und Aufrechterhaltung der Epithelzellidentität und der Mammadrüsenumbildung in Zellsubpopulationen beteiligt sind die aus normalem menschlichen Brustgewebe isoliert und selektiv in ihrem Gehalt an bipotenten Vorläufern, vorbestimmten luminalen Vorläufern und differenzierten Myoepithel- oder differenzierten Luminalzellen angereichert sind. Es wurde eine differenzielle Expression von vier Genen gefunden, die an der Aufrechterhaltung der Zellidentität beteiligt waren: CBX6 und PCGF2, die Proteine kodieren, die zur Polycomb-Gruppe gehören, und SMARCD3 und SMARCE1, die Proteine kodieren, die zur Trithorax-Gruppe gehören.
Im Kontext der vorliegenden Erfindung soll die Genregion die Gesamtheit der genomischen Region in Bezug auf und kodierend für CBX6 umfassen. Daher sind Enhancer-Regionen, Promotorregion(en), Introns, Exons und nicht-kodierende Regionen (5'- und/oder 3'-Regionen), die zu CBX6 gehören, mit eingeschlossen. Bevorzugt ist daher ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei die mindestens eine CpG Position in der 5' Region stromaufwärts vom Transkriptionsstart, in der Promotorregion, den 5' oder 3' nicht translatierten Regionen, einem Exon, einem Intron, in der Exon/Intron-Grenze und/oder in der 3' Region stromabwärts des Transkriptionsstopps des Gens wie analysiert vorhanden ist
Die vorliegende Erfindung basiert weiterhin auf der überraschenden Identifizierung einer Region des Gens für CBX6 durch die Erfinder als spezifischen epigenetischen Marker, was die Identifizierung von Gedächtnis-B-Zellen sowie die klinische Routineanwendung der Analyse ermöglicht.
Im Kontext der vorliegenden Erfindung ermöglicht die genomische Region von CBX6, insbesondere gemäß SEQ ID Nr. 1, weiter bevorzugt SEQ ID Nr. 2 (Amp 3005), die Identifizierung von Gedächtnis-B-Zellen. Überraschenderweise ist das unterscheidende Muster von Bisulfit-umwandelbaren und nicht-umwandelbaren Cytosinen für Gedächtnis-B-Zellen insbesondere und bevorzugt exklusiv auf die genomische Region gemäß SEQ ID Nr. 1 beschränkt, wie unter der Verwendung des Amplikons gemäß SEQ ID Nr. 2 gezeigt.
Die Erfinder konnten zeigen, dass in den Gedächtnis-B-Zellen die CpG Motive wie beschrieben fast vollständig demethyliert sind (d.h. zu mehr als 70%, bevorzugt 80%, bevorzugt zu mehr als 90% und am meisten bevorzugt zu mehr als 95%, sogar zu mehr als 98%), wohingegen dieselben Motive in nicht-Gedächtnis-B-Zellen nahezu vollständig und bevorzugt vollständig methyliert sind. Dies wird hier auch als „Demethylierung“ oder „Fehlen von Methylierung“ bezeichnet.
Die unterschiedliche Methylierung der CpG Motive innerhalb der oben genannten Regionen ist ein wertvolles Werkzeug, um Gedächtnis-B-Zellen zu identifizieren, wie es erforderliche sein wird/oder zumindest von einigem Wert sein wird für die Identifizierung und Quantifizierung der Zellen in Autoimmunerkrankungen, Transplantat-Abstoßungen, Krebs, Allergie, primären und sekundären Immundefizienzen, wie zum Beispiel HIV Infektionen und AIDS, Graft versus Host (GvH), hämatologischen Malignitäten, rheumatoider Arthritis, multipler Sklerose, oder einem mit zytotoxischen T Zellen zusammenhängendem Immunstatus in jedem vorhersehbaren diagnostischen Kontext. Der Test ermöglicht die Messung von Gedächtnis-B-Zellen ohne Reinigung oder jegliche Färbeverfahren.
Ein weiterer bevorzugter Aspekt des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst dann weiterhin eine Quantifizierung der relativen Menge an Gedächtnis-B-Zellen, basierend auf dem Vergleichen von relativen Mengen der Methylierungsfrequenz in der Region wie analysiert mit relativen Mengen der Methylierungsfrequenz in einem Kontrollgen, wie zum Beispiel GAPDH. Die Quantifizierung wird daher basierend auf dem Verhältnis der Bisulfit-umwandelbaren DNA zu nicht-umwandelbarer DNA in der genetischen Region von CBX6 (z.B. von SEQ ID Nr. 1) wie hier beschreiben und analysiert erhalten. Am meisten bevorzugt basiert eine Quantifizierung der relativen Menge an Gedächtnis-B-Zellen auf der (bevorzugt parallelen oder gleichzeitigen) Analyse der relativen Menge an Bisulfit-umwandelbarer DNA von Zell-spezifischer Region für CBX6 und von der relativen Menge an Bisulfit-umwandelbarer DNA von Zell-unspezifischen Genen (bevorzugt als „Kontrollgene“ oder „Kontrollregionen“ bezeichnet, wie zum Beispiel, das Gen für GAPDH).
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst die Analyse der Bisulfit-Umwandelbarkeit eine Amplifikation mit mindestens einem Primer von geeigneten Primerpaaren, die geeignet basierend auf SEQ ID Nr. 1 aufgebaut werden können, bevorzugt Oligomere gemäß einer der SEQ ID Nrn. 3 bis 10.
Im Unterschied zu FACS und mRNA Messungen, können unter der Verwendung der Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, die Messung(en) und Analysen unabhängig von der Reinigung, Lagerung - und zu einigem Ausmaß - auch von der Gewebequalität durchgeführt werden.
Bevorzugt beinhaltet die Amplifikation ein Polymeraseenzym, eine PCR oder chemische Amplifikationsreaktion oder andere Amplifikationsverfahren wie dem Fachmann bekannt wie unten beschrieben, z.B. im Kontext von MSP, HeavyMethyl, Scorpion, MS-SNUPE, MethylLight, Bisulfit-Sequenzierung, Methyl-spezifischen Restriktionstests und/oder digitaler PCR (siehe, zum Beispiel Kristensen und Hansen PCR-Based Methods for Detecting Single-Locus DNA Methylation Biomarkers in Cancer Diagnostics, Prognostics, and Response to Treatment Clinical Chemistry 55:8 1471-1483 (2009)).
Mit der Amplifikation wird ein Amplikon der CBX6 Genregion hergestellt, das ein besonders bevorzugtes „Werkzeug“ zur Durchführung des/der Verfahren(s) gemäß der vorliegenden Erfindung ist. Konsequenterweise stellen Oligomere gemäß einer der SEQ ID Nrn. 3 bis 10 oder ein Amplikon wie durch ein Primerpaar basierend auf SEQ ID Nr. 3 und 4 oder 5 und 6 oder 8 und 9 wie hier erwähnt amplifiziert bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dar. Daher können die Sequenzen der SEQ ID Nr. 1 bis 2 (und, falls benötigt, die dazu komplementären Sequenzen) dazu verwendet werden, Primer für Amplifikationen aufzubauen, d.h. sie dienen als „Positionsmarker“ in der Sequenz wie relevant. Ähnlich können zusätzliche Primer und Sonden basierend auf dem Amplikon gemäß SEQ ID Nr. 1 aufgebaut werden. Die Amplifikation kann entweder in der genomischen und/oder der Bisulfit (d.h. „umgewandelten“) DNA Sequenz stattfinden.
Der Fachmann wird weiterhin in der Lage sein, spezifische Subsets von CpG Positionen auszuwählen, um die Menge der zu analysierenden Stellen zu minimieren, zum Beispiel mindestens eine CpG Position ausgewählt aus einer CpG Position in einem Amplikon gemäß SEQ ID Nr. 1, und ist bevorzugt ausgewählt aus den CpG Positionen 55, 91, 96, 115, 157, 171, 202, 240, 408 und 439 in dem Amplikon 3005 gemäß SEQ ID Nr. 2, und ist weiter bevorzugt ausgewählt aus den CpG Positionen 91, 157, 171, 202, 240, 408 und 439 in einem Fragment des Amplikons 3005 gemäß SEQ ID Nr. 2. Bevorzugt sind Kombinationen von 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 Positionen, deren Analysis ausreichende Daten und/oder Information produziert, um im Kontext der vorliegenden Erfindung informativ zu sein.
Der Fachmann wird weiterhin in der Lage sein, spezifische Subsets von CpG Positionen auszuwählen, um die Menge der zu analysierenden Stellen zu minimieren, zum Beispiel mindestens eine der CpG Positionen 157, 171, 202, 240, 408 und 439 im Amplikon Nr. 3005 der CBX6 spezifischen Bisulfit-umwandelbaren Region (SEQ ID Nr. 1), oder alle Stellen wie in der Bisulfit-umwandelbaren Region gemäß SEQ ID Nr. 1 vorhanden. Eine oder mehrere der Positionen 96 und/oder 115 in AMP 3005 können ausgenommen werden.
Um die Bisulfit-Umwandelbarkeit von CpG Positionen zu analysieren, kann jedes bekannte Verfahren benutzt werden, um DNA Methylierung nachzuweisen. In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst die Analyse des Methylierungsstatus ein Verfahren ausgewählt aus einem Methylierungs-spezifischen enzymatischen Verdau, einer Bisulfit-Sequenzierung, einer Analyse ausgewählt aus Promotormethylierung, CpG-Insel-Methylierung, MSP, HeavyMethyl, MethyLight, Ms-SNuPE oder anderen Verfahren, die auf dem Nachweis von amplifizierter DNA beruhen. These Verfahren sind dem Fachmann alle gut bekannt und können in der jeweiligen Literatur gefunden werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung ist das Verfahren für die Routineanwendung geeignet, zum Beispiel auf einem DNA-Chip. Basierend auf der obigen Information und der jeweiligen Literatur wird der Fachmann in der Lage sein, ein Verfahren wie oben an solche Anforderungen anpassen.
In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung wird das Verfahren ohne einen Schritt des Aufreinigens und/oder der Anreicherung der zu identifizierenden Zellen durchgeführt, bevorzugt unter der Verwendung von Gesamtblut und/oder nicht-trypsiniertem Gewebe.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst die Identifizierung ein Unterscheiden der Gedächtnis-B-Zellen von allen hauptsächlichen peripheren Blut-Zelltypen und/oder nicht-Blutzellen, bevorzugt, aber nicht beschränkt auf, CD4+ T Zellen, Gedächtnis-CD4+ T Zellen, CD8+ T Zellen, CD15+ Granulozyten, CD14+ Monozyten, naiven CD4+ T Zellen, CD56+ NK-Zellen, naiven CD8+ T Zellen, naiven B Zellen und anderen Zelltypen abgeleitet von anderen Organen als Blut, insbesondere von naiven B Zellen.
In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung ist die Probe ausgewählt aus einer Körperflüssigkeit eines Säugertiers, einschließlich menschlicher Blutproben, oder ein Gewebe, Organ oder eine Probe an Lymphozyten oder einer gereinigten oder abgetrennten Fraktion von solchem Gewebe, Organ oder Lymphozyten oder einer Zelltyp-Probe. Bevorzugt ist das Säugetier eine Maus, Ziege, Hund, Schwein, Katze, Kuh, Ratte, Affe oder Mensch. Die Proben können geeignet vereinigt werden, falls erforderlich. Bevorzugt sind menschliche Zellen.
Ein anderer bevorzugter Aspekt des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst dann weiter den Schritt von Schlussfolgern auf den Immunstatus des Säugetiers basierend auf den Gedächtnis-B-Zellen. Die Gedächtnis-B-Zellen können quantifiziert werden und als ein Vergleichswert verwendet werden, um weiter detaillierte Subpopulationen relativ zu quantifizieren oder sie können als ein prädiktiver und/oder Screening und/oder diagnostischer und/oder prognostischer und/oder adverse Ereignisse nachweisender Faktor verwendet werden, oder sie können dazu verwendet werden, um letztendlich diese Population nachzuweisen, um den Gesamtstatus der Immunaktivität zu bestimmen.
In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung leidet das Säugetier an oder ist es wahrscheinlich, dass es leidet an Autoimmunerkrankungen, Transplantat-Abstoßungen, Infektionserkrankungen, Krebs und/oder Allergie, wie, aber nicht beschränkt auf Trypanosoma cruzi-Infektion, Malaria und HIV Infektion; Hämatologischen Malignitäten wie etwa, aber nicht beschränkt auf chronische myelogene Leukämie, Multiples Myelom, Non Hodgkin's Lymphom, Morbus Hodgkin, chronischer lymphozytischer Leukämie, Graft versus Host und Host versus Graft Erkrankung, Mycosis fungoides, Extranodalem T Zell-Lymphom, Kutanösen T Zell-Lymphomen, Anaplastischem große Zellen Lymphom, Angioimmunoblastischem T Zell-Lymphom und anderen T-Zell, B-Zell und NK-Zell-Neoplasmen, T Zell-Defizienzen, wie zum Beispiel, aber nicht beschränkt auf, Lymphozytopänie, schwere kombinierte Immundefizienz (SCID), Omenn Syndrom, Knorpel-Haar Hypoplasie, erworbenes Immundefizienzsyndrom (AIDS), und vererbbare Zustände, wie zum Beispiel DiGeorge Syndrom (DGS), Chromosomenbruch-Syndrome (CBSs), Multiple Sklerose, rheumatoide Arthritis, systemischer Lupus erythematosus, Sjögren Syndrom, systemische Sklerose, Dermatomyositis, primäre biliäre Zirrhose, primäre sklerodierende Cholangitis, Ulcerative Colitis, Morbus Crohn, Psoriasis, Vitiligo, bullöses Pemphigoid, Aalopekia Areata, idiopathische dilatative Kardiomyopathie, Typ 1 Diabetes mellitus, Morbus Grave, Hashimoto's Thyroiditis, Myasthenia Gravis, IgA Nephropathie, membranöse Nephropathie und perniziöse Anämie; und B-Zell und T-Zell kombinierte Erkrankungen, wie zum Beispiel, aber nicht beschränkt auf Ataxia Telangiectasia (AT) und Wiskott-Aldrich Syndrom (WAS); und Karzinomen, wie zum Beispiel, aber nicht beschränkt auf Brustkrebs, kolorektalem Krebs, Magenkrebs, Pankreaskrebs, hepatozellulärem Karzinom, Cholangiokarzinom, Melanom und Kopf und Hals Krebs.
Ein anderer bevorzugter Aspekt des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung betrifft dann ein Verfahren wie oben, weiter umfassend ein Messen und/oder Überwachen der Menge der Gedächtnis-B-Zellen in Antwort auf chemische und/oder biologische Substanzen, die an das Säugetier verabreicht werden, d.h. in Antwort auf eine Behandlung des Patienten. Das Verfahren umfasst die Schritte wie oben und Vergleichen der relativen Menge der Zellen wie identifiziert mit einer Probe, die früher oder parallel von demselben Säugetier genommen wurde, und/oder mit einer Kontrollprobe. Basierend auf den Ergebnissen, die durch das Verfahren der Erfindung zur Verfügung gestellt werden, wird der behandelnde Arzt in der Lage sein, Schlussfolgerungen auf den Immunstatus des Patienten zu ziehen, und eine Behandlung der zugrundeliegenden Erkrankung demgemäß anzupassen.
Bevorzugt wird das Verfahren ohne einen Schritt des Aufreinigens und/oder der Anreicherung der zu identifizierenden Zellen durchgeführt, bevorzugt in Gesamtblut und/oder nicht-trypsiniertem Gewebe, oder jeder anderen biologischen Probe, die potentiell die Gedächtnis-B-Zellen enthält, wie z.B. eine Probe für den Zelltransfer in einen Patienten.
Ein anderer bevorzugter Aspekt des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung betrifft dann ein Verfahren wie oben, weiter umfassend ein Formulieren der Gedächtnis-B-Zellen wie identifiziert für Transplantation in einen Patienten. Pharmazeutische Präparationen für diese Zwecke und Verfahren zu deren Herstellung werden gemäß Verfahren durchgeführt, die in der Technik der Transplantationsmedizin bekannt sind.
Ein anderer bevorzugter Aspekt des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung betrifft dann weiter ein Verfahren zur Behandlung eines Zustands oder Erkrankung in einem Säugetier, insbesondere in einem Menschen, umfassend ein Verfahren gemäß der Erfindung wie oben und den Schritt von Transplantieren von Gedächtnis-B-Zellen wie identifiziert (z.B. in einem Aliquot wie aus der Probe genommen) und in Zellkultur isoliert/vermehrt in einen Patienten. Pharmazeutische Präparationen für diese Zwecke Verfahren zu deren Herstellung werden gemäß Verfahren, die in der Technik der Transplantationsmedizin bekannt sind, durchgeführt. Das Transplantat kann autolog oder allogen sein.
Ein anderer bevorzugter Aspekt des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung betrifft dann weiter ein Verfahren zur Behandlung und/oder Prävention eines Zustands oder Erkrankung in einem Säugetier, insbesondere in einem Menschen, umfassend ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung wie oben einschließlich einer geeigneten Behandlung des Zustands oder der Erkrankung umfassend ein Verabreichen von chemischen und/oder biologischen Substanzen wie oben und Anpassen der Behandlung der zugrundeliegenden Erkrankung oder des Zustands basierend auf den Ergebnissen wie durch das Verfahren der Erfindung zur Verfügung gestellt. Dies kann den Schritt von Schlussfolgern auf den Immunstatus des Säugetiers basierend auf den Gedächtnis-B-Zellen umfassen. Die Gedächtnis-B-Zellen können quantifiziert werden und als ein Vergleichswert verwendet werden, um weiter detaillierte Subpopulationen relativ zu quantifizieren oder sie können als ein prädiktiver und/oder Screening und/oder diagnostischer und/oder prognostischer und/oder adverse Ereignisse nachweisender Faktor verwendet werden, oder sie können dazu verwendet werden, um letztendlich diese Population nachzuweisen, um den Gesamtstatus der Immunaktivität zu bestimmen. Diese Basis ermöglicht ein Anpassen der Behandlung, falls erforderlich. Solche Anpassungen können den Schritt von Transplantieren von Gedächtnis-B-Zellen wie identifiziert und in Zellkultur isoliert/vermehrt in einen Patienten wie oben umfassen und/oder eine Verabreichung von weiteren chemischen und/oder biologischen Substanzen zur Anpassung der Behandlung und/oder Prävention.
Ein besonderes Beispiel ist ein Verfahren zur Behandlung und/oder Prävention eines Zustands oder Erkrankung in einem Säugetier, insbesondere in einem Menschen, wobei zuerst ein Vakzin an das Säugetier verabreicht wird. Entsprechende Vakzine und Impfstrategien sind bekannt, im allgemeinen enthalten Vakzine, dieselben Keime (manchmal inaktiviert), die die Erkrankung verursachen oder immunogene Teile davon, gegebenenfalls mit geeigneten Trägern und Adjuvantien. Der Erfolg eines Vakzins hängt von der Erzeugung und Aufrechterhaltung eines immunologischen Gedächtnisses ab, und das Immunsystem kann sich an früher begegnete Pathogene erinnern, und Gedächtnis-B-Zellen sind für die sekundären Antworten auf Infektion wesentlich. Daher umfasst das Verfahren dann ein Messen und/oder Überwachen der Menge an Gedächtnis-B-Zellen in Antwort auf die Impfung(en) die an das Säugetier verabreicht wird/werden. Im Falle einer unzureichenden Zahl an Gedächtnis-B-Zellen wird die Behandlung (hier: Impfung) angepasst, d.h. bevorzugt wird eine Booster-Impfung verabreicht. Das Verfahren kann wiederholt werden, bis ausreichend Immunzellen (d.h. eine wesentliche Population an Gedächtnis-B-Zellen) nachgewiesen werden können.
Ein weiteres besonderes Beispiel ist ein Verfahren zur Erzeugung von Immunität gegen ein Antigen, umfassend das Verfahren wie oben umfassend zur Verfügung stellen von mindestens einem Antigen als ein Vakzin, und Nachweisen einer ausreichenden Immunität basierend auf der Population an Gedächtnis-B-Zellen wie identifiziert in Antwort auf das mindestens eine Antigen wie durch das Vakzin zur Verfügung gestellt.
Behandlung und/oder Prävention soll hier die Heilung, Prävention oder Linderung einer Abweichung oder Fehlfunktion des Körpers betreffen, d.h. Rückführung eines Körpers in seinen gesunden Zustand.
Pharmazeutische Präparationen für diese Zwecke und Verfahren zu deren Herstellung werden gemäß Verfahren die in der Technik einer Behandlung unter der Verwendung von chemischen und/oder biologischen Substanzen oder Transplantationsmedizin bekannt sind durchgeführt. Wieder kann das Transplantat autolog oder allogen sein.
Ein anderer bevorzugter Aspekt des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung betrifft ein Oligomer gemäß einer der SEQ ID Nr. 3 bis 10 oder ein Amplikon gemäß SEQ ID Nr. 2.
Noch ein anderer bevorzugter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft dann ein Kit zur Identifizierung, Quantifizierung und/oder der Überwachung von Gedächtnis-B-Zellen in einem Säugetier, basierend auf der Analyse der Bisulfit-Zugänglichkeit von CpG Positionen in der Genregion von CBX6, umfassend Komponenten zur Durchführung eines Verfahrens gemäß der Erfindung wie hier beschrieben, insbesondere ein Kit umfassend a) ein Bisulfitreagenz, und b) Materialen für die Analyse des Methylierungsstatus von CpG Positionen ausgewählt aus den CpG Positionen in der Region gemäß SEQ ID Nr. 1 oder 2, wie zum Beispiel ein Oligomer ausgewählt aus den Sequenzen gemäß SEQ ID Nr. 3 bis 10, oder ein Amplikon wie mit einem Primerpaar basierend auf SEQ ID Nr. 3 und 4 oder 5 und 6 oder 8 oder einem Primerpaar basierend auf jeweils SEQ ID Nr. 3 und 4 oder 5 und 6 oder 8 amplifiziert.
Die vorliegende Erfindung beinhaltet auch die Verwendung der Oligomere oder Amplikons oder eines Kit gemäß der vorliegenden Erfindung zur Identifizierung und/oder zur Überwachung von Gedächtnis-B-Zellen in einem Säugetier wie hier beschrieben.
Wie oben erwähnt, würden kürzlich drei neue Cytosin-Modifikationen entdeckt. Daher wird erwartet, dass zukünftige wissenschaftliche Ergebnisse früher beschriebene epigenetische Muster an Modifikation korrigieren werden. Diese früheren Muster an Cytosin-Modifikation beinhalten Bisulfit-umwandelbares (nicht-methyliertes, nicht-modifizertes) und nichtumwandelbares (methyliertes, modifiziertes) Cytosin. Beide Begriffe müssen wie beschrieben korrigiert werden. Gemäß der neuen wissenschaftlichen Ergebnisse beinhaltet (i) nicht-Bisulfit umwandelbares Cytosin 5-Methylcytosin (mC) und 5-Hydroxymethylcytosin (hmC), und (ii) Bisulfit umwandelbares (d.h. die „Bisulfit-Umwandelbarkeit“) Cytosin beinhaltet 5-Formylcytosin (fC), 5-Carboxycytosin (cC), sowie nicht-modifiziertes Cytosin.
Zusätzlich basieren frühere Erfindungen auf (i) dem Verhältnis von Bisulfit-umwandelbarem Cytosin zu gesamter Menge an Chromatin (Zelltyp-unabhängig, 100% Bisulfit-umwandelbarer DNA Locus) oder (ii) auf dem Verhältnis von Bisulfit-umwandelbarem (fC, cC, nicht-modifiziertes Cytosin) zu nicht-Bisulfit-umwandelbarem Cytosin (hmC und mC). Diese Verhältnisse charakterisieren Zelltyp, Zelldifferenzierung, Zellphase sowie pathologische Zellphasen. Daher werden neue Techniken zu neuen spezifischeren Verhältnissen führen und möglicherweise augenblickliche Zell-spezifische, Zellphasenspezifische sowie pathologische Muster von epigenetischen Modifikationen ergänzen und daher potentielle neue Biomarker definieren. Neue Verhältnisse die als Biomarker entdeckt werden, können definiert werden als: $Biomarkerverh \ddot{a} ltnis = a / b$

a = Σ (C und/oder mC und/oder hmC und/oder fC und/oder cC)
b = Σ (C und/oder mC und/oder hmC und/oder fC und/oder cC),
wobei a und b sich voneinander unterscheiden durch eine bis vier Arten an Modifikationen. Die Entdeckung von neuen DNA Modifikationen wird diese Aufzählung erweitern.
Zum Zweck der Definition für die vorliegende Anmeldung betrifft „epigenetische Modifikationen“ in der DNA Sequenz die Terminologie von (i) Bisulfit-umwandelbarem Cytosin (5-Formylcytosin, (fC) und/oder 5-Carboxycytosin (cC)) und (ii) nicht-Bisulfit-umwandelbarem Cytosin ((einschließlich 5-Methylcytosin (mC), 5-Hydroxymethylcytosin, (hmC)). Da beide Arten von Methylierung, mC und hmC, nicht Bisulfit-umwandelbar sind, ist es nicht möglich zwischen diesen beiden zu unterscheiden. Ähnlich sind fC, cC sowie nicht-modifiziertes Cytosin Bisulfit-umwandelbar und können auch nicht voneinander unterschieden werden. Der Ausdruck „methylierte“ DNA beinhaltet mC sowie hmC. Der Ausdruck „nicht-methylierte“ DNA beinhaltet fC, cC, und nicht-modifizierte DNA. Es wird erwartet, dass neue Varianten an DNA Modifikationen in der Zukunft entdeckt werden. Jeder Typ an Modifikation wird entweder Bisulfit-umwandelbar sein oder nicht. Jedoch, da das vorliegende Verfahren verlässlich zwischen diesen zwei Gruppen unterscheidet werden diese neuen Modifikationen auch als Marker brauchbar sein.
Weiterhin, außerhalb der Modifikationen an DNA können auch Histone posttranslationalen Modifikationen unterzogen werden, die deren Interaktionen mit DNA und Kernproteinen beeinflussen. Modifikationen schließen Methylierung, Acetylierung, Phosphorylierung, Ubiquitinierung, Sumoylierung, Citrullinierung und ADP-Ribosylierung. Der Kern der Histone H2A, H2B und H3 kann auch modifiziert werden. Histon-Modifikationen wirken in diversen biologischen Prozessen, wie zum Beispiel Genregulation, DNA Reparatur, Chromosomenkondensation (Mitose) und Spermatogenese (Meiose). Auch für diese Modifikationen ist ein spezifisches Muster an Modifikation für unterschiedliche Zelltypen, Zellphasen und Differenzierungsstatus spezifisch, und solch ein Muster kann auf die Bisulfit-Umwandelbarkeit oder durch ähnliche Verfahren analysiert werden, um bestimmte Zellen und Zellphasen zu identifizieren. Die vorliegende Erfindung beinhaltet auch eine Verwendung dieser Modifikationen.
Zusammengefasst, unter der Verwendung der CBX6 genetischen Region und insbesondere des Amplikons wie hier als Marker beschrieben, identifizierten, quantifizierten und insbesondere differenzierten die Erfinder sehr spezifisch Gedächtnis-B-Zellen und in deren Verhältnis zu anderen Zelltypen in einer Probe, zum Beispiel zu anderen Blutzellen.
Die Erfindung soll nun weiter in den folgenden Beispielen und mit Bezug auf die beigefügten Figuren und dem Sequenzprotokoll beschrieben werden, ohne darauf beschränkt zu sein. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung sind alle Referenzen wie hier zitiert durch Bezugnahme vollständig aufgenommen.

1 zeigt die Analyse der CpG Stellen auf Amplikon Nr. 3005 (SEQ ID Nr. 2) gemäß der Erfindung. Die Spalten in der Tabelle entsprechen den CpG Positionen im Amplikon wie analysiert (z.B. CpG 1, 2, usw.) mit den Positionen angegeben (AMP3005:55 entspricht CpG an Position 55 von Amplikon 3005 gemäß SEQ ID Nr. 2, ...usw.) und die Zeilen entsprechen den analysierten Zelltypen.
2 zeigt die genomische Region des Amplikons gemäß der vorliegenden Erfindung (SEQ ID Nr. 1, die Amplikon-Sequenz (SEQ ID Nr. 2) ist unterstrichen.
3 zeigt die genomische Sequenz des Amplikons gemäß der vorliegenden Erfindung (SEQ ID Nr. 2), die relevanten CpG Positionen sind fett und unterstrichen.

SEQ ID Nr. 1 zeigt die Sequenz der genomischen Region (genomische Sequenz mit den Ensembl-Koordinaten 22:38860000:38875000:1) des Amplikons Nr. 3005 gemäß der vorliegenden Erfindung (siehe auch 2). Homo sapiens Chromobox 6 (CBX6), Transkript-Variante 1, mRNA, NCBI Referenz-Sequenz: NM_014292.5.
SEQ ID Nr. 2 zeigt die genomische Sequenz von Amplikon Nr. 3005.
SEQ ID Nrn. 3 bis 10 zeigen die Sequenzen von spezifischen Oligomeren (Primer und Sonden) gemäß der vorliegenden Erfindung.
BEISPIELE
Beispiel 1
Um Gedächtnis-B-Zellen zu identifizieren wurde qPCR mit Bisulfit-umgewandelten Proben durchgeführt, die aus der menschlichen genomischen Region gemäß der Sequenz SEQ ID Nr. 1 (siehe 2), insbesondere der Region AMP3005 (unterstrichen und siehe 3) stammten.
Für das eigentliche epigenetische Profiling der Amplikonregion in Blutzell-Subtypen waren die Immunzell-Populationen wie analysiert wie in 1 gezeigt.
Die Bisulfit-umgewandelten Zielregionen bevorzugter qPCR-Testsysteme wie entwickelt waren:

Oligonukleotide zur Bisulfit-Sequenzierung (5' - 3')
Vorwärts Primer - TTAGATTGTAATTTTTGTTTGGTAA (SEQ ID Nr. 3)
Rückwärts Primer - AATTTCTTACCCCCTTCTATTC (SEQ ID Nr. 4)
Oligonukleotide des qPCR Tests (TpG Variante d.h., Demethylierungs-spezifisch; 5' - 3') Vorwärts Primer - GGAAAGTAGTAAGGGTGGAT (SEQ ID Nr. 5)
Rückwärts Primer - CCCTCTCTAATACCCCCA (SEQ ID Nr. 6)
Sonde - TTGATTTGTGTAAGTGTGTGGGAGGTGG (SEQ ID Nr. 7)
Oligonukleotide des qPCR Tests (CpG Variante d.h., Methylierungs-spezifisch; 5' - 3') Vorwärts Primer - GGAAAGTAGTAAGGGTGGAC (SEQ ID Nr. 8)
Rückwärts Primer - CCCTCTCTAATACCCCCG (SEQ ID Nr. 9)
Sonde - TCGATTCGTGTAAGTGTGTGGGAGGCGG (SEQ ID Nr. 10)

Die Zelltyp Spezifität (FACS-sortierte Immunzell-Präparationen mit memBLC qPCR) wurde wie folgt ermittelt (Tabelle 1):

Zelltyp	Beschreibung	Demethylierung (%)
Gedächtnis-B-Zellen	CD3 -/CD20+/IgD-/CD27+	≥ 99,9
Gedächtnis-B-Zellen	CD19+/IgD-/CD27+	≥ 99,9
CD19+ B-Zellen	CD19+	22,61
Naive B-Zellen	CD3 -/CD20+/IgD+/CD27-	5,61
Naive B-Zellen	CD 19+/IgD+/CD27-	1,99
Granulozyten	CD15++	0,23
T Helfer-Zellen	CD3+CD4+	2,17
T Helfer-Zellen	CD3+/CD8-/CD4+	2,53
Zytotoxische T Zellen	CD3+/CD8+/CD4-	1,65
Zytotoxische T Zellen	CD3+/CD8+/	1,22
CD56+ NK Zellen	CD3-/CD56+/CD16+	0,17
Monozyten	CD14+	0,20

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO ST.25. Dieses kann sowohl in DEPATISnet als auch im DPMAregister aufgerufen werden.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

WO 2012/162660 [0010]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Sanz et al. (Sanz I, Wei C, Lee FE, Anolik J. Phenotypic and functional heterogeneity of human memory B cells. Semin Immunol. 2008;20(1):67-82) [0005]
Michael J. Booth et al. Quantitative Sequencing of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine at Single-Base Resolution Science 18 May 2012, Vol. 336 no. 6083 pp. 934-937 [0006]
Jones und Laird, Nature Genetics 21:163-167, 1999 [0008]
Esteller, Oncogene 21:5427-5440, 2002; und Laird, Nature Reviews/Cancer 3:253-266, 2003) [0008]
Marker für Blasen-, Brust-, Dickdarm-, Speiseröhren-, Magen-, Leber-, Lungen- und Prostatakrebs (zusammengefasst beispielsweise von Laird, Nature Reviews/Cancer 3:253-266, 2003) [0008]
(Michael J. Booth et al. Quantitative Sequencing of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine at Single-Base Resolution Science 18 May 2012, Vol. 336 no. 6083 pp. 934-937) [0009]
Zhang und Good-Jacobson (in: Epigenetic regulation of B cell fate and function during an immune response. Immunol Rev. 2019 Mar;288(1):75-84) [0011]
Chin J Cancer. 2014;33(10):501-510) [0015]
Kristensen und Hansen PCR-Based Methods for Detecting Single-Locus DNA Methylation Biomarkers in Cancer Diagnostics, Prognostics, and Response to Treatment Clinical Chemistry 55:8 1471-1483 (2009)) [0024]

Claims

Verfahren zur Identifizierung von Gedächtnis-B-Zellen in einer Probe, umfassend ein Analysieren des Methylierungsstatus von mindestens einer CpG Position in der Säugetier-Genregion für Chromobox-Proteinhomolog 6 (CBX6), wobei bevorzugt die Sequenz der Genregion wie analysiert gemäß SEQ ID Nr. 1 ist, wobei eine Demethylierung oder ein Fehlen von Methylierung der Genregion eine Gedächtnis-B-Zelle anzeigt, wenn mit einer nicht-Gedächtnis-B-Zelle verglichen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die mindestens eine CpG Position in der 5' Region stromaufwärts vom Transkriptionsstart, in der Promotorregion, den 5' oder 3' nicht translatierten Regionen, einem Exon, einem Intron, in der Exon/Intron-Grenze und/oder in der 3' Region stromabwärts des Transkriptionsstops der Genregion wie analysiert vorhanden ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die mindestens eine CpG Position ausgewählt ist aus einem CpG ausgewählt aus den CpG Positionen 55, 91, 96, 115, 157, 171, 202, 240, 408 und 439 im Amplikon 3005 gemäß SEQ ID Nr. 2, und bevorzugt ausgewählt aus den CpG Positionen 91, 157, 171, 202, 240, 408 und 439 in einem Fragment des Amplikons 3005 gemäß SEQ ID Nr. 2.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Analyse der Bisulfit-Umwandelbarkeit ein Verfahren ausgewählt aus einem Methylierungs-spezifischen enzymatischen Verdau, einer Bisulfit-Sequenzierung, einer Analyse ausgewählt aus Promotormethylierung, CpG-Insel-Methylierung, MSP, HeavyMethyl, MethyLight, Ms-SNuPE und anderen Verfahren, die auf dem Nachweis von amplifizierter DNA beruhen, umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, weiter umfassend eine Quantifizierung der relativen Menge an Gedächtnis-B-Zellen basierend auf dem Vergleichen von relativen Mengen der Methylierungsfrequenz in der Region gemäß SEQ ID Nr. 1 wie analysiert mit relativen Mengen der Methylierungsfrequenz in einem Kontrollgen, wie zum Beispiel GAPDH.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Probe ausgewählt ist aus einer Körperflüssigkeit eines Säugertiers, einschließlich menschlicher Blutproben, oder ein Gewebe, Organ oder Zelltyp-Blutprobe, eine Probe an Blut-Lymphozyten oder eine Fraktion davon und wobei bevorzugt diese Zellen menschliche Zellen sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, weiter umfassend ein Unterscheiden der Gedächtnis-B-Zellen von allen oder mindestens einer der Zelltypen ausgewählt aus CD4+ T Zellen, Gedächtnis-CD4+ T Zellen, CD8+ T Zellen, CD15+ Granulozyten, CD14+ Monozyten, naiven CD4+ T Zellen, CD56+ NK-Zellen, naiven CD8+ T Zellen, naiven B Zellen und anderen Zelltypen abgeleitet von anderen Organen als Blut, insbesondere naiven B Zellen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Verfahren ohne einen Schritt des Aufreinigens und/oder der Anreicherung der zu identifizierenden Zellen durchgeführt wird, bevorzugt unter der Verwendung von Gesamtblut und/oder nicht-trypsiniertem Gewebe.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, weiter umfassend den Schritt von Schlussfolgern auf den Immunstatus des Säugetiers basierend auf den Gedächtnis-B-Zellen wie identifiziert.
Verfahren zur Überwachung des Spiegels an Gedächtnis-B-Zellen in einem Säugetier, umfassend ein Durchführen des Verfahrens nach einem der Ansprüche 5 bis 9, und weiterhin ein Vergleichen der relativen Menge an Zellen wie identifiziert mit einer früheren oder parallel genommenen Probe von demselben Säugetier, und/oder mit einer Kontrollprobe.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, weiter umfassend ein Messen und/oder Überwachen der Menge der Gedächtnis-B-Zellen in Antwort auf chemische und/oder biologische Substanzen, die an das Säugetier verabreicht werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei das Säugetier leidet an oder wahrscheinlich leidet an Autoimmunerkrankungen, Transplantat-Abstoßungen, Infektionserkrankungen, Krebs und/oder Allergie.
Kit zur Identifizierung, Quantifizierung und/oder der Überwachung von Gedächtnis-B-Zellen in einem Säugetier, basierend auf der Analyse der Bisulfit-Zugänglichkeit von CpG Positionen in der Genregion von CBX6, umfassend Komponenten zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 12, insbesondere ein Kit umfassend a) ein Bisulfitreagenz, und b) Materialen für die Analyse des Methylierungsstatus von CpG Positionen ausgewählt aus den CpG Positionen in der Region gemäß SEQ ID Nr. 1, insbesondere in der Region gemäß SEQ ID Nr. 2, wie zum Beispiel ein Oligomer ausgewählt aus den Sequenzen gemäß SEQ ID Nrn. 3 bis 10.
Oligomer gemäß einer der SEQ ID Nrn. 3 bis 10, Amplikon gemäß SEQ ID Nr. 2 oder die Bisulfit-behandelten Sequenzen davon.
Verwendung des Kits nach Anspruch 13 oder des Oligomers oder Amplikons nach Anspruch 14 zur Identifizierung, Quantifizierung und/oder der Überwachung von Gedächtnis-B-Zellen in einem Säugetier.