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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung einer Linezolid-Resistenz
bei Mikroorganismen in einer Probe sowie Oligonukleotid-Sonden und
diese enthaltende Diagnose-Kits, die für diesen Zweck eingesetzt
werden können. Verwendung findet das erfindungsgemäße
Verfahren bei der Bestimmung von Linezolid-Resistenzen, insbesondere
in Zusammenhang mit Enterokokken und Staphylokokken.
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Linezolid
ist eine auf Oxazolidinon basierende, antimikrobielle Substanz,
die gegen Gramm-positive Kocken, wie z. B. Vancomycin-resistente
Enterokokken (VRE) aktiv ist. Resistenz gegenüber Linezolid
wurde wiederholt bei Enterokokken, insbesondere VRE, beobachtet,
die zuvor mit dem Arzneimittel behandelt wurden (Bonora,
M. G., M. Solbiati, E. Stepan, A. Zorzi, A. Luzzani, M. R. Catania,
und R. Fontana, 2006, „Emergence of linezolid resistance
in the vancomycin-resistant Enterococcus faecium multilocus sequence
typing C1 epidemic lineage", J. Clin. Microbiol. 44: 1153–1155;
Prystowsky, J., F. Siddiqui, J. Chosay, D. L. Shinabarger, J. Millichap,
L. R. Peterson und G. A. Noskin, 2001, "Resistance to linezolid:
Characterization of mutations in rRNA and comparison of their occurrences
in vancomycin-resistant enterococci", Antimicrob. Agents Chemother.
45: 2154–2156; und Seedat, J., G. Zick, I. Klare, C. Konstabel,
N. Weiler und H. Sahly, 2006, "Rapid emergence of resistance to
linezolid during linezolid therapy of an Enterococcus faecium infection",
Antimicrob. Agents Chemother. 50: 4217–4219).
Es sind auch einige wenige Fälle einer Resistenz bei Enterokokken
bekannt, die zuvor nicht mit dem Arzneimittel behandelt wurden (Bonora,
M. G., M. Ligozzi, A. Luzzani, M. Solbiati, E. Stepan und R. Fontana,
2006, „Emergence of linezolid resistance in Enterococcus
faecium not dependent an linezolid treatment", Eur. J. Clin. Microbiol.
Infect. Dis. 25: 197–198; und Marra, A. R., Y. Major, und
M. B. Edmond, 2006, "Central venous catheter colonization by linezolid-resistant,
vancomycinsusceptible Enterococcus faecalis", J. Clin. Microbiol.
44: 1915–1916). Wann immer eine Resistenz gegen
Linezolid in klinischen Isolaten von Enterokokken festgestellt wurde,
war die Resistenz auf eine Punktmutation des 23S rRNA-Gen(e) (2576G > T). Enterokocken tragen
vier (E. faecalis) bis sechs (E. faecium) Allele des 23S rRNA-Gens.
Der Grad der Resistenz mag von der Anzahl von mutierten Allelen
abhängen, allerdings wurde berichtet, dass die Mutation
eines einzigen Allels ausreichend ist, um eine Linezolid-Resistenz
auszulösen. Eine Anzahl von Verfahren ist für
die Bestimmung der phänotypischen Empfindlichkeit verfügbar,
z. B. E-Test, Microbroth-Dilution, Agar-Dilution und Disk-Diffusion,
allerdings sind diese zeitaufwändig und nicht vollständig
zuverlässig (Qi, C., X. Zheng, A. Obias, M. H.
Scheetz, M. Malczynski, und J. R. Warren, 2006, „Comparison
of testing methods for detection of decreased linezolid susceptibility
due to G2576T mutation of the 23S rRNA gene in Enterococcus faecium
and Enterococcus faecalis", J. Clin. Microbiol. 44: 1098–1100).
Detektion von Mutationen durch molekulare Verfahren, z. B. Echtzeit-PCR
(RT-PCR), DNA-Sequenzierung und Restriktionsverdau von PCR-amplifizierten
Sequenzen, ist schnell und zuverlässig aber vergleichsweise
aufwändig.
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Resistenzen
gegen Linezolid wurden ebenfalls bei Staphylokokken festgestellt,
wobei hier die Resistenz auf eine Punktmutation des 23S rRNA-Gen(e)
(G2576T) seltener (C2534T) zurückzuführen war
(Zhu et al., „Use of pyrosequencing to identify
point mutations in domain V of 23S rRNA genes of linezolid-resistant, Staphylococcus
aureus and Staphylococcus epidermis", Eur. J. Clin. Microbiol. Infect.
Dis. (2007), 26(3), S. 161–165).
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Die
Fluoreszenz in situ-Hybridisierung (FISH) unter Verwendung von Sonden,
die komplementär zur ribosomalen rRNA sind, ist ein schnelles
und einfach durchzuführendes Verfahren, das erfolgreich
für die Detektion von durch ribosomale Mutation ausgelöste
Resistenzen gegenüber Macroliden eingeführt wurde
(Russmann, H., K. Adler, R. Haas, B. Gebert, S. Koletzko
und J. Heesemann, 2001, „Rapid and accurate determination
of genotypic clarithromycin resistance in cultured helicobacter
pylori by fluorescent in situ hybridization", J. Clin. Microbiol.
39: 4142–4144).
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Ausgehend
hiervon war es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein schnelles
und einfach zu handhabendes Verfahren zur Bestimmung von Linezolid-Resistenzen
bei Mikroorganismen bereitzustellen.
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Diese
Aufgabe wird durch das Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs
1, die Oligonukleotid-Sonden mit den Merkmalen des Anspruchs 21
und das diagnostische Kit mit den Merkmalen des Anspruchs 24 gelöst.
Die weiteren abhängigen Ansprüche zeigen vorteilhafte
Weiterbildungen auf. In Anspruch 38 wird eine erfindungsgemäße
Verwendung angegeben.
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Erfindungsgemäß wird
ein Verfahren zur Bestimmung einer Linezolid-Resistenz bei Mikroorganismen in
einer Probe bereitgestellt, das auf folgenden Schritten basiert:
- a) Inkontaktbringen der Probe mit mindestens
einer Oligonukleotid-Sonde, die unter Hybridisierungsbedingungen
spezifisch an eine ribosomale RNA des Mikroorganismus, die eine
durch Linezolid-Resistenz bedingte Punktmutation aufweist, binden
kann,
- b) Detektion von in der Probe enthaltenen, gegenüber
Linezolid resistenten Mikroorganismen, die mit den Sonden hybridisiert
sind.
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Vorzugsweise
kann die Oligonukelotid-Sonde spezifisch an eine Punktmutation des
Mikroorganismus binden und weist zumindest an der an die Punktmutation
bindenden Position der Sonde eine geschlossenen Nukleinsäure
(LNA) auf.
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Im
Fall, dass der Mikroorganismus dem Genus Enterococcus angehört,
weist die Sonde vorzugsweise ein Oligonukleotid mit einer Sequenz
auf, die zu mindestens 80% homolog zu SEQ ID NO. 1 ist, einschließlich Sequenzen,
die um ein oder mehrere Nukleotide deletiert oder verlängert
sind:
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Vorzugsweise
ist das Nukleotid des Oligonukleotids mit der Sequenz SEQ ID NO.
1 an der unterstrichenen Position der allgemeinen Formel eine LNA,
wodurch Linezolid-resistente Enterokokken detektiert werden können.
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Weiterhin
ist es bevorzugt, dass der Probe zusätzlich mindestens
eine weitere Oligonukleotid-Sonde zur Bestimmung des Linezolid-Wildtyps
enthaltend eine Sequenz, die zu mindestens 80% homolog zu SEQ ID NO.
2 ist, einschließlich Sequenzen, die um ein oder mehrere
Nukleotide verkürzt oder verlängert sind, zugesetzt
wird:
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Vorzugsweise
weist das Oligonukleotid mit SEQ ID NO. 2 an der unterstrichenen
Position der allgemeinen Formel eine geschlossene Nukleinsäure
(LNA) auf.
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Die
Funktionsweise ist hier mit kompetitivem Prinzip zu vergleichen,
da die beiden Sonden, d. h. die Resistenz- und die Wildtyp-Sonde,
um die gleiche Bindungsstelle konkurrieren, wodurch Kreuzreaktionen
vermieden werden.
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Im
Fall, dass der Mikroorganismus dem Genus Staphylococcus angehört,
weist die Sonde vorzugsweise ein Oligonukleotid mit einer Sequenz,
die zu mindestens 80% homolog zu SEQ ID NO. 3 und/oder SEQ ID NO.
4, einschließlich Sequenzen, die um ein oder mehrere Nukleotide
deletiert oder verlängert sind, auf:
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Vorzugsweise
sind die Nukleotide der Oligonukleotide mit den Sequenzen SEQ ID
NO. 3 und 4 an der unterstrichenen Position der allgemeinen Formeln
eine LNA, wodurch Linezolid-resistente Staphylokokken detektiert
werden können.
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Es
ist weiter bevorzugt, dass der Probe zusammen mit einer Sonde, die
ein Oligonukleotid mit einer Sequenz, die zu mindestens 80% homolog
zu SEQ ID NO. 3 ist, einschließlich Sequenzen, die um ein
oder mehrere Nukleotide deletiert oder verlängert sind,
aufweist, zusätzlich mindestens eine weitere Oligonukleotid-Sonde
zur Bestimmung des Linezolid-Wildtyps mit einer Sequenz, die zu
mindestens 80% homolog zu SEQ ID NO. 5 ist, einschließlich
Sequenzen, die um ein oder mehrere Nukleotide verkürzt
oder verlängert sind, zugesetzt wird:
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Vorzugsweise
weist das Oligonukleotid mit der Sequenz SEQ ID NO. 5 an der unterstrichenen
Position der allgemeinen Formel eine LNA auf.
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Ebenso
ist es bevorzugt, dass der Probe zusammen mit einer Sonde, die ein
Oligonukleotid mit einer Se quenz, die zu mindestens 80% homolog
zu SEQ ID NO. 4 ist, einschließlich Sequenzen, die um ein
oder mehrere Nukleotide deletiert oder verlängert sind,
aufweist, zusätzlich mindestens eine weitere Oligonukleotid-Sonde
zur Bestimmung des Linezolid-Wildtyps mit einer Sequenz, die zu
mindestens 80% homolog zu SEQ ID NO. 6 ist, einschließlich
Sequenzen, die um ein oder mehrere Nukleotide verkürzt
oder verlängert sind, zugesetzt wird:
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Auch
hier ist es bevorzugt, dass das Oligonukleotid mit der Sequenz SEQ
ID NO. 6 an der unterstrichenen Position der allgemeinen Formel
eine geschlossene Nukleinsäure (LNA) aufweist.
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Vorzugsweise
kann die erfindungsgemäße Oligonukleotid-Sonde
mehrere LNA's aufweisen.
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Bevorzugt
weist die Sonde mindestens einen detektierbaren Marker auf, der
bevorzugt kovalent an das Oligonukleotid gebunden ist. Der detektierbare
Marker ist dabei vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend
aus Fluoreszenz-Markern, Chemolumineszenz-Markern, radioaktive Markern,
enzymatisch aktiven Markern, Haptenen und Kombinationen hiervon.
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Besonders
bevorzugt wird die Detektion mittels Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung
(FISH) durchgeführt.
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Die
Enterokokken sind dabei vorzugsweise ausgewählt aus den
Gattungen Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus
gallinarium, Enterococcus avium, Enterococcus casseliflavus, Enterococcus
flavescens, Enterococcus hirae, Enterococcus durans, Ente rococcus
asini, Enterococcus cecorum, Enterococcus columbae, Enterococcus
dispar, Enterococcus gilvus, Enterococcus haemoperoxidans, Enterococcus
malodoratus, Enterococcus moraviens, Enterococcus mundtii, Enterococcus
pallens, Enterococcus porcinus, Enterococcus pseudoavium, Enterococcus
raffinosus, Enterococcus ratti, Enterococcus saccharolyticus, Enterococcus
seriolicida, Enterococcus solitarius, Enterococcus sulfureus und
Enterococcus villorum.
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Die
Streptokokken sind vorzugsweise ausgewählt aus den Gattungen
Staphylococcus aureus, Staphylococcus auricularis, Staphylococcus
capitis, Staphylococcus caprea, Staphylococcus carnosus, Staphylococcus
caseolyticus, Staphylococcus chromogenes, Staphylococcus cohnii,
Staphylococcus condimenti, Staphylococcus delphini, Staphylococcus
epidermidis, Staphylococcus equorum, Staphylococcus felis, Staphylococcus
fleurettii, Staphylococcus gallinarum, Staphylococcus haemolyticus,
Staphylococcus hominis, Staphylococcus hyicus, Staphylococcus intermedius,
Staphylococcus klosii, Staphylococcus lentus, Staphylococcus lugdunensis,
Staphylococcus lutrae, Staphylococcus mucilagenosus, Staphylococcus
muscae, Staphylococcus pasteuri, Staphylococcus piscifermentans,
Staphylococcus saccharolyticus, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus
schleiferi, Staphylococcus sciuri, Staphylococcus simulans, Staphylococcus
succinus, Staphylococcus vitulinus, Staphylococcus warneri und Staphylococcus
xylosus.
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Die
Staphylokokken sind vorzugsweise ausgewählt aus den Gattungen
Streptococcus acidominus, Streptococcus adjacens, Streptococcus
agalactiae, Streptococcus alactolyticus, Streptococcus anginosus, Streptococcus
bovis, Streptococcus canis, Streptococcus constella tus, Streptococcus
criceti, Streptococcus cricetus, Streptococcus crista, Streptococcus
defectivus, Streptococcus diacetylactis, Streptococcus downei, Streptococcus
dysgalactiae, Streptococcus equi, Streptococcus equinus, Streptococcus
equisimilis, Streptococcus gordonii, Streptococcus hansenii, Streptococcus
infantis, Streptococcus iniae, Streptococcus intermedius, Streptococcus
lactis, Streptococcus macacae, Streptococcus milleri, Streptococcus
mitis, Streptococcus mutans, Streptococcus oralis, Streptococcus
parasanguinis, Streptococcus parvulus, Streptococcus peronis, Streptococcus
pleomorphus, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus porcinus, Streptococcus
pyogenes, Streptococcus ratti, Streptococcus salivarius, Streptococcus
sanguinis, Streptococcus sanguis, Streptococcus sobrinus, Streptococcus
suis, Streptococcus thermophilus, Streptococcus uberis, Streptococcus
vestibularis und Streptococcus zooepidemicus.
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Ebenso
können die Mikroorganismen aus der Gruppe der Gattungen
von Vagococcus, Lactococcus und Abiotropha ausgewählt sein.
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Erfindungsgemäß wird
ebenso eine Oligonukleotid-Sonde zur spezifischen Hybridisierung
mit ribosomaler RNA von Mikroorganismen bereitgestellt, die unter
Hybridisierungsbedingungen spezifisch an eine ribosomale RNA des
Mikroorganismus, der eine durch Linezolid-Resistenz bedingte Punktmutation
aufweist, binden kann.
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Dabei
ist es bevorzugt, dass die Oligonukelotid-Sonde spezifisch an eine
Punktmutation des Mikroorganismus binden kann und die Sonde zumindest
an der an die Punktmutation bindenden Position der Sonde eine ge schlossenen
Nukleinsäure (LNA) aufweist.
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Ebenso
wird erfindungsgemäß ein diagnostisches Kit bereitgestellt,
das die zuvor beschriebenen Oligonukleotid-Sonden enthält.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform enthält das
Kit neben einer Sonde, die ein Oligonukleotid mit einer Sequenz,
die zu mindestens 80% homolog zu SEQ ID NO. 1 ist, einschließlich
Sequenzen, die um ein oder mehrere Nukleotide deletiert oder verlängert
sind, mindestens eine weitere Oligonukleotid-Sonde zur Bestimmung
des Linezolid-Wildtyps mit einer Sequenz, die zu mindestens 80%
homolog zu SEQ ID NO. 2 ist, einschließlich Sequenzen,
die um ein oder mehrere Nukleotide verkürzt oder verlängert
sind:
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Eine
weitere bevorzugte Ausführungsform sieht vor, dass das
Kit neben einer Sonde, die ein Oligonukleotid mit einer Sequenz,
die zu mindestens 80% homolog zu SEQ ID NO. 3 ist, einschließlich
Sequenzen, die um ein oder mehrere Nukleotide deletiert oder verlängert
sind, aufweist, zusätzlich mindestens eine weitere Oligonukleotid-Sonde
zur Bestimmung des Linezolid-Wildtyps mit einer Sequenz, die zu
mindestens 80% homolog zu SEQ ID NO. 5 ist, einschließlich
Sequenzen, die um ein oder mehrere Nukleotide verkürzt
oder verlängert sind, enthält:
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Ebenso
ist es bevorzugt, dass das Kit neben einer Sonde, die ein Oligonukleotid
mit einer Sequenz, die zu mindestens 80% homolog zu SEQ ID NO. 4
ist, ein schließlich Sequenzen, die um ein oder mehrere
Nukleotide deletiert oder verlängert sind, aufweist, zusätzlich
mindestens eine weitere Oligonukleotid-Sonde zur Bestimmung des
Linezolid-Wildtyps mit einer Sequenz, die zu mindestens 80% homolog
zu SEQ ID NO. 6 ist, einschließlich Sequenzen, die um ein
oder mehrere Nukleotide verkürzt oder verlängert
sind, enthält:
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Vorzugsweise
weisen die Oligonukleotide, die eine Sequenz SEQ ID NO. 4 bis SEQ
ID NO. 6 aufweisen, an der unterstrichenen Position der allgemeinen
Formel eine geschlossene Nukleinsäure (LNA) auf.
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Verwendung
finden die erfindungsgemäßen Oligonukleotid-Sonden
zur Bestimmung von Linezolid-Resistenzen bei Mikroorganismen, insbesondere
bei Enterokokken und Staphylokokken.
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Anhand
des nachfolgenden Beispiels soll der erfindungsgemäße
Gegenstand näher erläutert werden, ohne diesen
auf die hier gezeigten speziellen Ausführungsformen einschränken
zu wollen.
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Beispiel
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Die
Zuverlässigkeit von FISH bei der Detektion einer Linezolid-Resistenz
in Enterokokken wurde anhand von Blindversuchen unter Verwendung
von 23 „vor-charakterisierten" Stämmen mit einer
bekannten Anzahl von mutierten Allelen und einer bekannten minimalen
inhibitorischen Konzentration (MIC) für Linezolid evaluiert
(Tabelle 1). Tabelle 1
| Stamm-Nr. | Genus | MIC
Linezolid (Interpretation) | Anzahl der
Allele | FISH-Ergebnisse
mit Sonde |
| | | | Wildtyp | resistent | LZD
Wildtyp | LZD
resistent |
| 3 | E.
faecium | ≤ 2(s) | nd | nd | + | – |
| 4 | E.
faecium | ≤ 2(s) | nd | nd | + | – |
| 5 | E.
faecium | ≤ 2(s) | nd | nd | + | – |
| 6 | E.
faecium | ≤ 2(s) | nd | nd | + | – |
| 8 | E.
faecium | ≤ 2(s) | nd | nd | + | – |
| 9 | E.
faecium | ≤ 2(s) | nd | nd | + | – |
| 14 | E.
faecium | ≤ 2(s) | nd | nd | + | – |
| 16 | E.
faecium | ≤ 2(s) | nd | nd | + | – |
| 18 | E.
faecium | ≤ 2(s) | nd | nd | + | – |
| 19 | E.
faecium | ≤ 2(s) | nd | nd | + | – |
| 20 | E.
faecium | ≤ 2(s) | nd | nd | + | – |
| 22 | E.
faecium | ≤ 2(s) | nd | nd | + | – |
| 23 | E.
faecium | ≤ 2(s) | nd | nd | + | – |
| 1 | E.
faecium | 8(r) | 4 | 2 | + | + |
| 2 | E.
faecium | 16(r) | 1 | 3 | (+) | + |
| 7 | E.
faecium | 16(r) | 5 | 1 | + | + |
| 10 | E.
faecium | 16(r) | 3 | 3 | + | + |
| 11 | E.
faecium | 16(r) | 4 | 2 | + | + |
| 12 | E.
faecium | 16(r) | 4 | 2 | + | + |
| 13 | E.
faecium | 16(r) | 4 | 2 | + | + |
| 15 | E.
faecium | 16(r) | 3 | 3 | + | + |
| 17 | E.
faecium | 16(r) | 2 | 4 | + | + |
| 21 | E.
faecium | 16(r) | 2 | 4 | + | + |
- MIC ir. mg/L
- Legende: LZD, Linezolid; s = empfindlich, r = resistent,
- nd = nicht bestimmt; (+) = schwach positiv
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Die
Verwendung des Assays in einer Routinesituation wurde nachfolgend
unter Verwendung von 83 klinischen Isolaten bestimmt (Tabelle 2). Tabelle 2
| Genus | MIC Linezolid
(Interpretation) | n | Anzahl positiver
FISH-Ergebnisse mit Probe |
| LZD
Wildtyp | LZD
resistent |
| E.
faecium | 0.5(s) | 11 | 11
(100%) | 0
(0%) |
| | i(s) | 26 | 26
(100%) | 1
(4%) |
| | 2(s) | 6 | 6
(100%) | 1
(16%) |
| | 8(r) | 1 | 1
(100%) | 1
(100%) |
| E.
faecium VRE | 0.5(s) | 7 | 7
(100%) | 0
(0%) |
| | 1(s) | 7 | 7
(100%) | 1
(14%) |
| E.
faecalis | 0.5(s) | 4 | 4
(100%) | 0
(0%) |
| | 1(s) | 15 | 15
(100%) | 0
(0%) |
| | 2(s) | 5 | 5
(100%) | 0
(0%) |
| E.
avium | 1(s) | 1 | 1
(100%) | 0
(0%) |
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Die
VRE (Vancomycin-resistente Enterokokken)-Stämme wurden
aus rektalen Abstrichen oder Stuhlproben isoliert. Alle anderen
Isolate wurden aus Blutkulturen isoliert.
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Die
Resistenz gegenüber Linezolid wurde durch ein MIC ≥ 8
mg/L gemäß DIN 58940, EUCAST 2006-06-20 V1.3 und
CLSI-Norm M100-S15 definiert. Für den Satz der vorcharakterisierten
Teststämme wurde der Linezolid-MIC durch Microbroth-Dilution
unter Verwendung einer Iso-Sensitest-Bouillon als Nährmedium
bestimmt. Für die klinischen Isolate wurde das Linezolid
MIC durch Broth-Dilution unter Verwendung des Merlin MICRONAUT Systems
(Merlin, Bornheim-Hesel) bestimmt. Einzelne klinische Isolate, die
als Linezolid-resistent vermutet wurden, wurden zusätzlich
durch einen E-Test (AB, Biodisk, Solna, Schweden) und Iso-Sensitest
untersucht. In allen resistenten Isolaten wurde die Anzahl der mutierten
23S rDNA-Allele durch ein aus dem Stand der Technik bekanntes Verfahren
unter Verwendung der LabChip-Technologie und BioAnalyzer 2100 bestimmt
(Werner, G., B. Strommenger, I. Klare und W. Witte, 2004, „Molecular
detection of linezolid resistance in Enterococcus faecium and Enterococcus
faecalis by use of 5' nuctease real-time PCR compared to a modified
classical approach, J. Clin. Microbiol. 42: 5327–5331).
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Für
die FISH-Untersuchung wurden Isolate auf Schaafsblut-Agar 18 bis
24 Stunden lang kultiviert und in 0,9%-iger Kochsalzlösung
(McFarland, 0,5) suspendiert. 10 μl der Suspension wurden
auf einen Objektträger gegeben, luftgetrocknet und 10 Minuten
in Methanol fixiert. DNA-FISH-Sonden, die sog. „verflossene"
Nukleinsäuren (engl. locked nucleic acids, LNA) an der
Position der Punktmutation (LZD-Wildtyp: FITC-5'-CCCAGCTCGCGTGC-3';
LZD-resistent: Cy3-5'-CCAGCTAGCGTGC-3'; Thermo Hybaid, Ulm) aufwiesen,
wurden verwendet, da dies eine schärfere Diskriminierung
von Änderungen einzelner Nukleotide erlaubt. Die FISH-Untersuchungen
wurden bei 46°C unter Verwendung von 30% Formamid im Hybridisierungs-Puffer
und den entsprechenden Salzkonzentrationen im Wasch-Puffer wie zuvor
beschrieben (Amann, R. I., W. Ludwig und K. H. Schleifer,
1995, „Phylogenetic identification and in situ detection
of individual microbial cells without cultivation", Microbiol. Rev.
59: 143–169; und Manz W. und Amann R., Ludwig W Wagner
M Schleifer K-H, „Phylogenetic oligodeoxynucleotide grobes
for the major subclasses of Proteobacteria: Problems and solutions,
Syst. Appl. Microbiol. 1, 593–600, 2004) durchgeführt.
Die Hybridisierung wurde unter Verwendung einer Mikrowelle (Sharp
R208, SeaPro) durchgeführt. Die Bakterien-Sonde EUB338,
die auf nahezu alle Bakterien abzielt, wurde als positiv-Kontrolle
in allen Experimenten verwendet. Alle FISH-Untersuchungen wurden
doppelt durchgeführt.
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In
vorläufigen Untersuchungen unter Verwendung von 8 zuvor
untersuchten Stämmen führte die Anwesenheit eines
einzelnen mutierten Allels zu einem starken FISH-Signal mit den
entsprechenden Proben. Das Signal war lediglich leicht stärker,
wenn mehrere Allele mutiert waren. Das FISH-Verfahren erlaubte somit die
Detektion eines einzelnen mutierten Allels, aber nicht die Abschätzung
der Anzahl von mutierten Allelen.
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23
vor-charakterisierte Enterokokkus-Stämme, davon 10 Linezolid-sensitiv
und 13 Linezolid-resistent, wurden anschließend in Blindversuchen
durch FISH untersucht (Tabelle 1). In beiden unabhängigen
Versuchen zeigte das FISH-Verfahren richtige Ergebnisse für
alle resistenten und alle sensitiven Stämme (Tabelle 1).
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Schließlich
wurde die Anwendbarkeit des Assays unter Verwendung von 83 klinischen
Isolaten, kultiviert in Blutkulturen oder VRE-Screening-Agar-Platten
(Tabelle 2), beurteilt. FISH-Verfahren und Microtiter-Broth-Dilution
unter Verwendung des Micronaut-Systems führten zu 79 Isolaten,
die sich als sensitiv herausstellten. Ein E. faecium-Blutkulturisolat
wurde durch Broth-Dilution und E-Test mit einem MIC von 8 mg/L als
resistent bestimmt. FISH zeigte ein positives Ergebnis mit den Resistenz-Sonden
ebenso wie mit den Wildtyp-Sonden, was die Anwesenheit von mutierten
und nicht-mutierten Allelen belegt, was durch die Lab-Chip-Technologie
bestätigt werden konnte. Der Stamm war Vancomycin-sensitiv
und wurde aus der Blutkultur eines Patienten isoliert, der anstelle
von Linezolid Tazobac verabreicht bekommen hatte.
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Drei
E. faecium-Isolate gaben ein positives Ergebnis mit der Linezolid-Resistenz-Sonde,
die wiederholt durch Miktrotiter-Broth-Dilution unter Verwendung
des Mikronaut-Systems ebenso wie durch das Iso-Sensitest-System
und durch E-Test (Tabelle 2, fettgedruckte Isolate) als phänotypisch
sensitiv bestimmt wurden. Alle drei Isolate zeigten ein einzeln
mutiertes 23S rDNA-Allel durch LabChip-Technologie. Ein Stamm war
Vancomycin-resistent und wurde aus eine Stuhlprobe eines bekannten
Trägers eines vanA-Typ-VRE isoliert. Dieser Patient erhielt
5 Monate vor Isolierung des Stammes 10 Tage lang Linezolid. Zwei
Vancomycinsensitive Stämme wurden aus Blutkulturen von
zwei Patienten isoliert, die zu verschiedenen Zeiten mit unterschiedlicher intensiver
Pflege behandelt worden waren. Beide Patienten hatten verschiedene
antimikrobielle Substanzen, wie Imipenem, Vancomycin und Piperacillin,
nicht aber Linezolid erhalten.
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Unter
Betrachtung erster phänotypischer Resistenz-Untersuchungen
wäre Linezolid eine Behandlungsoption für die
drei Patienten gewesen. Im Hinblick auf vorhergehende Berichte über
den Austausch mutierter Allele durch Rekombination in vitro unter
selektivem Druck könnten solche Stämme dennoch
anfällig gegenüber einer schnellen Entwicklung
einer Resistenz sein. Um diese Hypothese zu untersuchen, wurden
in vitro-Mutagenese-Untersuchungen mit den drei Stämmen
im Vergleich zu zwei Linezolid-sensitiven Isolaten, die nur Wildtyp
23S-Allele besitzen, durchgeführt. Exponentiell gewachsene
Zellen wurden auf mit Linezolid ergänzte Agar-Platten aufgestrichen
(2, 4 und 6 mg/L). Zwei der drei Test-Stämme, aber keine
der sensitiven Referenz-Stämme zeigten einzelne Kolonien,
die auf Platten mit Linezolid nach 48 Stunden Inkubation bei 37°C
wuchsen. Alle vier untersuchten repräsentativen Kolonien
von den Platten mit 4 und 6 mg/L Linezolid zeigten Linezolid-MICs
von 8 mg/L, was eine spontane Entwicklung einer Resistenz belegte.
Die LabChip-Technologie offenbarte, dass die Anzahl von resistenten
23S-Allelen von einem im ursprünglichen Stamm auf zwei
in den mutierten Stämmen anstieg. Solche Isolate sollten
daher vorzugsweise nicht mit Linezolid behandelt werden. Wenn eine
Behandlung mit Linezolid erfolgt, kann eine genaue Beobachtung der
Entwicklung einer Resistenz durch Beurteilung einer klinischen Verbesserung
und wiederholte Probennahme sowie, falls anwendbar, durch Untersuchungen
weiterer Isolate durch phänotypische Verfahren gewährleistet werden.
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Es
ist eine entscheidende Beobachtung, dass die Anwesenheit eines einzeln
mutierten 23S-Allels zu phänotypisch detektierbarer Linezolid-Resistenz
in einigen (Tabelle 1) aber nicht allen Isolaten (Tabelle 2) führte.
Es kann daher spekuliert werden, dass 23S-Allele heterogen exprimiert
werden, z. B. in Abhängigkeit von der Entfernung des mutierten
23S-Allels vom Ursprung der Replikation, was die Menge von replizierten
mutiertern rRNA, die für die Bildung von mutierten/Linezolid-resistenten
Ribosomen zur Verfügung stehen, beeinflussen könnte.
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Das
Auftreten solcher Stämme sogar in Patienten, die nie zuvor
Linezolid erhalten hatten, betont die Notwendigkeit für
eine molekulare Bestimmung von Linezolid-Resistenzen von Enterokokken,
insbesondere in Fällen von erhöhten Linezolid-Werten
oder unbefriedigenden Antworten auf eine Therapie mit Linezolid.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren unter Verwendung von
LNA-enthaltenen Sonden stellte sich als geeignetes und zuverlässiges
Verfahren für diesen Zweck heraus. Es zeigte 100%-ige Sensitivität
für die Detektion einer phänotypischen Linezolid-Resistenz
und erlaubte sogar die Detektion eines einzeln mutierten 23S-Allels
in phänotypischen Linezolid-sensitiven Enterokokken. Als
schnelles und einfach zu handhabendes Verfahren kann FISH auch für
die anfängliche Bestimmung einer Linezolid-Resistenz oder
das Screening von Probensammlungen eingesetzt werden. Das erfindungsgemäße
Verfahren hat somit das Potential, die Bestimmung einer Linezolid-Resistenz
in E. faecium signifikant zu verbessern und beschleunigen.
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Es folgt ein
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- - Bonora, M.
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- - Bonora, M. G., M. Ligozzi, A. Luzzani, M. Solbiati, E. Stepan
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- - Qi, C., X. Zheng, A. Obias, M. H. Scheetz, M. Malczynski,
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- - Zhu et al., „Use of pyrosequencing to identify point
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- - Werner, G., B. Strommenger, I. Klare und W. Witte, 2004, „Molecular
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- - Amann, R. I., W. Ludwig und K. H. Schleifer, 1995, „Phylogenetic
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