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Die Erfindung betrifft eine Plattform, insbesondere einen Probenträger, zur fluidischen Prozessierung und/oder zur Durchführung einer chemischen und/oder einer biochemischen Reaktion, insbesondere zur Detektion von antibiotikaresistenzrelevanten Parametern in Mikroorganismen, mit einer Zuführöffnung, in die eine Untersuchungsprobe vorzugsweise direkt einführbar ist, und mit wenigstens einer Reaktionskammer, die ein Nachweisreagenz enthält, wobei die Zuführöffnung mit wenigstens einer ersten Reaktionskammer für wenigstens eine phänotypische Reaktion und wenigstens einer zweiten Reaktionskammer für wenigstens eine nukleinsäurebasierte, insbesondere genotypische, Reaktion verbunden ist.
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Die zunehmende Resistenz von Bakterien gegenüber Antibiotika ist aktuell eines der wichtigsten Probleme in der Infektiologie. Nahezu alle bekannten bakteriellen Erreger von Infektionskrankheiten zeigen mehr oder weniger stark ausgeprägte Resistenzen gegenüber antibakteriellen Präparaten. Es besteht daher die klinische Notwendigkeit für die möglichst schnelle und umfangreiche vor-Ort-Bestimmung von Antibiotikasensitivität, um sowohl eine optimale Therapie für Patienten zu ermöglichen, als auch eine Entstehung und Verbreitung von antibiotikaresistenten Stämmen zu vermeiden.
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Typischerweise werden die Antibiotikaempfindlichkeitsteste mittels phänotypischer Untersuchungen oder mittels molekularbiologischer und biochemischer Methoden in spezialisierten Laboren durchgeführt. Um die Aussagefähigkeit in Hinblick auf eine vorhandene Antibiotikaempfindlichkeit zu verbessern, ist es erstrebenswert, eine Vorrichtung sowie ein Nachweisverfahren zu schaffen, welche eine Kombination der beiden Aspekte einer phänotypischen Bestimmung von Parametern, die für eine Antibiotikaresistenz relevant sind, und einer Bestimmung von molekularbiologischen Determinanten für Antibiotikaresistenzen ermöglichen.
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Die bekannten Nachweisverfahren zur phänotypischen Resistenzbestimmung, die auf Kultivierungsschritten basieren, sind zeitaufwendig. Der Nachweis auf Basis einer genotypischen Identifizierung der Antibiotikaresistenz ist deutlich schneller, erfordert jedoch eine genaue Kenntnis der charakteristischen Nukleinsäuresequenzen und übersehen daher oft neue Resistenzmechanismen.
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Bei den herkömmlichen Nachweisverfahren besteht weiterhin aufgrund der mehreren Arbeitsschritte der gesamten Kultivierung, Analyse und Inaktivierung einer Probe ein hohes Risiko einer Kontamination der Umgebung und umgebenden Personen. Es ist daher wünschenswert, eine entsprechende Vorrichtung sowie ein Nachweisverfahren bereitzustellen, durch welche das Risiko einer Kontamination für Umgebung und umgebende Personen reduziert ist und welche außerdem außerhalb von Laborumgebungen einsetzbar sind.
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Zur Durchführung biochemischer oder mikrobiologischer Tests und Untersuchungen außerhalb einer Labor-Infrastruktur können bekannterweise mikrofluidische Vorrichtungen als sogenannte Lab-on-a-Chip(LoC)-Systeme verwendet werden. Von Vorteil ist dabei, dass eine umfangreiche und aussagekräftigere Analytik, die eine gleichzeitige Bestimmung eines mikrobiellen Erregers sowie dessen Antibiotikaresistenz gewährleisten kann, erreichbar ist.
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Vor diesem Hintergrund ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Plattform zur fluidischen Prozessierung so zu gestalten, dass eine phänotypische Detektion von relevanten Parametern in Mikroorganismen mit einer genotypischen Detektion der entsprechenden Parameter in einer Untersuchungsprobe kombinierbar ist.
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Zur Lösung dieser Aufgabe sind erfindungsgemäß die Merkmale von Anspruch 1 vorgesehen. Insbesondere wird somit erfindungsgemäß zur Lösung der genannten Aufgabe bei einer Plattform der eingangs beschriebenen Art vorgeschlagen, dass eine Zuführöffnung mit wenigstens einer ersten Reaktionskammer für wenigstens eine phänotypische Reaktion und wenigstens einer zweiten Reaktionskammer für wenigstens eine nukleinsäurebasierte, insbesondere genotypische, Reaktion verbunden ist. Von Vorteil ist dabei, dass sich unterschiedliche Nachweisverfahren in einem Probenträger und somit in einem Verfahrensschritt kombinieren lassen können. Insbesondere kann somit eine kombinierte phänotypische und molekularbiologische Bestimmung von Parametern, die für eine Antibiotikaresistenz relevant sind, ermöglich werden. Vorteilhaft ist dabei, dass eine umfangreiche und zuverlässige Analytik gewährleistet werden kann.
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Die Plattform kann beispielsweise mit einer Mikrofluidik versehen sein, beispielsweise als ein vorzugsweise scheibenförmiger Probenträger mit einem Kanalsystem mit mikrofluidischen Kanälen. Dies ermöglicht auf einfache Weise eine getrennte Verarbeitung einzelner Mikroorganismen. Von Vorteil ist dabei, dass eine aussagekräftigere Analytik erreichbar ist, die eine gleichzeitige Bestimmung eines mikrobiellen Erregers sowie dessen Antibiotikaresistenz gewährleisten kann.
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Eine vorteilhafte Ausführungsform gemäß der Erfindung sieht vor, dass zwischen der Zuführöffnung und der ersten und/oder zweiten Reaktionskammer zusätzlich eine Vorkultivierungskammer angeordnet ist. Vorteilhaft ist dabei, dass somit ein bakterielles Wachstum der in der Untersuchungsprobe enthaltenen Mikroorganismen ermöglicht werden kann. Dies ist insbesondere vorteilhaft, wenn eine nicht bereits vorkultivierte Untersuchungsprobe verwendet wird.
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Eine vorteilhafte Ausführungsform gemäß der Erfindung sieht weiterhin vor, dass die Untersuchungsprobe in flüssiger Form, beispielsweise als Blutserum oder Urin, in die Zuführöffnung einführbar ist. Alternativ oder zusätzlich kann die Untersuchungsprobe in fester Form, beispielsweise als Abstrich-Tupfer, in die Zuführöffnung eingeführt werden.
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Beispielsweise ist die Untersuchungsprobe aus der Liste ausgewählt, bestehend aus klinischen Proben, insbesondere Abstrich-Tupfer, biologischen Flüssigkeiten, insbesondere Blutserum, Urin, Sputum und Speichel, reiner Bakteriensuspension, Auswaschproben von medizinischen Geräten, klinischen Medien, Impflösungen, Lebensmittelproben und veterinärdiagnostischen Proben. Die zu untersuchenden Lebensmittelproben können flüssig oder fest vorliegen. Eine feste Lebensmittelprobe kann beispielsweise durch ein Spülmedium aufgelöst oder bereitgestellt werden. Von Vorteil ist dabei, dass eine spezifische Untersuchung in unterschiedlichen Applikationsfeldern ermöglicht werden kann.
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Eine vorteilhafte Ausführungsform gemäß der Erfindung sieht vor, dass die antibiotikaresistenzrelevanten Parameter eine Antibiotikaempfindlichkeitsprüfung (Antimicrobial Susceptibility Testing) und eine Bestimmung von molekularbiologischen Determinanten für Antibiotikaresistenzen und/oder Mikroorganismenidentifikation umfassen. Von Vorteil ist dabei, dass sowohl eine phänotypische Ausprägung der Antibiotikaempfindlichkeit, als auch genotypische Determinanten für diese Antibiotikaempfindlichkeit bestimmt und somit die Aussagefähigkeit in Hinblick auf eine vorhandene Antibiotikaempfindlichkeit verbessert werden können.
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Eine vorteilhafte Ausführungsform gemäß der Erfindung sieht vor, dass das Nachweisreagenz in wenigstens einer (ersten und/oder zweiten) Reaktionskammer vorgelagert bereitgehalten ist. Somit ist eine schnelle Analytik ohne zusätzliche Verfahrensschritte erreichbar, was insbesondere für eine automatisierte Anwendung vorteilhaft ist.
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Eine vorteilhafte Ausführungsform gemäß der Erfindung sieht vor, dass eine Vielzahl von phänotypischen Reaktionen in einer Vielzahl von ersten Reaktionskammern ausführbar ist. Dabei kann es sich um unterschiedliche oder gleiche Reaktionen handeln. Von Vorteil ist dabei, dass auch eine phänotypische Bestimmung von mehreren unterschiedlichen Parametern in einer Untersuchungsprobe erreichbar ist. Als Nachweisreagenz kann insbesondere wenigstens eine antibakterielle Substanz und/oder eine Indikatorsubstanz für antibakterielle Wirkung bereitgehalten werden, die die entsprechenden phänotypischen Reaktionen ermöglicht. Insbesondere kann hierfür eine Indikatorsubstanz, welche auf das Vorhandensein und/oder auf die Ausprägung der Antibiotikaresistenz hindeutet, verwendet werden. Beispielsweise kann hierfür eine Verwendung von Nitrocefin als Indikator von β-lactam Aktivität vorgesehen sein.
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Eine vorteilhafte Ausführungsform gemäß der Erfindung sieht vor, dass die oder wenigstens eine antibakterielle Substanz und/oder eine Indikatorsubstanz für antibakterielle Wirkung eine profluoreszierende Substanz ist. Alternativ oder zusätzlich kann eine prolumineszierende Substanz und/oder ein Enzym und/oder eine Substanz, die einen Farbumschlag bewirkt, verwendet werden. Bei der Substanz kann es sich zum Beispiel um eine Indikatorsubstanz handeln.
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Eine vorteilhafte Ausführungsform gemäß der Erfindung sieht vor, dass eine Vielzahl von nukleinsäurebasierenden Nachweisreaktionen in einer Vielzahl von zweiten Reaktionskammern ausführbar ist. Vorteil ist dabei, dass eine genotypische Bestimmung von mehreren Parametern in einer Untersuchungsprobe ermöglicht werden kann. Insbesondere kann als Nachweisreagenz wenigstens eine Nukleinsäure bereitgehalten werden, die die entsprechenden nukleinsäurebasierenden Nachweisreaktionen ermöglicht. Beispielsweise kann als Nachweisreagenz eine natürliche Nukleinsäure vorgesehen sein. Alternativ oder zusätzlich kann es sich bei dem Nachweisreagenz auch um eine synthetische Nukleinsäure handeln.
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Eine vorteilhafte Ausführungsform gemäß der Erfindung sieht vor, dass die Nukleinsäure und/oder eine Nukleinsäure-bindende Substanz mit einem detektierbaren Marker verbunden ist. Es kann vorgesehen sein, dass hierzu amplifikationsbasierte Verfahren verwendet werden, in denen eine Vervielfältigung von Nukleinsäuren durch nicht markierte Nukleinsäuren ausgelöst oder indiziert wird. Ein Amplifikationsverfahren kann beispielsweise Polymerasekettenreaktion („PCR“) und/oder isotherme DNA Amplifikation sein. Alternativ oder ergänzend zu amplifikationsbasierten Verfahren kann ein hybridisierungsbasiertes Verfahren, beispielsweise FISH (insitu-hybridisierung), verwendet werden. Dabei werden Nukleinsäuren nicht vervielfältigt, sondern bereits vorhandene Targets detektiert. Während und/oder nach der Amplifikation und/oder nach der Durchführung des hybridisierungsbasierten Verfahrens kann der optische Nachweis mithilfe einer Markierung erfolgen. Der detektierbare Marker kann beispielsweise ein Fluoreszenzmarker, ein Chemoluminiszenzmarker oder eine enzymatisch aktive Gruppe sein. Der enzymatisch aktive Marker kann beispielsweise Peroxidase oder Phosphatase sein.
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Eine vorteilhafte Ausführungsform gemäß der Erfindung sieht vor, dass die bereits phänotypisch untersuchte Probe anschließend genotypisch untersucht wird, insbesondere wobei eine erste Reaktionskammer für eine phänotypische Reaktion und eine zweite Reaktionskammer für eine genotypische Reaktion seriell hintereinandergeschaltet sind. Die erste Reaktionskammer und die zweite Reaktionskammer können beispielsweise auch parallel zueinander geschaltet sein. Dies ist insbesondere bei einem Screening Verfahren vorteilhaft.
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Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur fluidischen Untersuchung eines Probenmaterials, insbesondere zum Nachweis von antibiotikaresistenzrelevanten Parametern in einer Untersuchungsprobe mittels Einführens der Untersuchungsprobe in eine Zuführöffnung einer erfindungsgemäßen Plattform, insbesondere wie zuvor beschrieben und/oder nach einem der auf eine Plattform gerichteten Ansprüche. Ein Nachweisreagenz, das in wenigstens einer Reaktionskammer bereitgehalten wird, reagiert mit den in der Untersuchungsprobe enthaltenen Mikroorganismen, wobei anschließend ein optischer Nachweis einer Detektionsreaktion erfolgt. Hierbei werden wenigstens eine genotypische Reaktion und wenigstens eine phänotypische Reaktion ausgeführt, vorzugsweise in voneinander getrennten Reaktionskammern. Als eine genotypische Reaktion kann beispielsweise eine Bestimmung von Mikroorganismen mittels Hybridisierungsreagenzien vorgesehen sein. Für eine phänotypische Reaktion können beispielsweise unterschiedliche Antibiotika verwendet werden. Von Vorteil ist dabei, dass sowohl eine phänotypische Ausprägung der Antibiotikaempfindlichkeit, als auch potentielle bakterielle Erreger, welche diese Antibiotikaempfindlichkeit verursachen, bestimmt werden können.
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Es kann vorgesehen sein, dass das erfindungsgemäße Verfahren mit einem fluidischen Kanalsystem ausgeführt wird. Von Vorteil ist dabei, dass ein spezifischer Nachweis von Mikroorganismen in unterschiedlichen Applikationsfeldern ermöglicht werden kann. Beispielsweise kann das erfindungsgemäße Verfahren zur mikrobiologischen Lebensmittelkontrolle, Hygienekontrolle, klinischen und biotechnologischen Anwendungen sowie Umweltanalyse zum Einsatz kommen. Das fluidische Kanalsystem kann beispielsweise als ein scheibenförmiger Probenträger ausgebildet sein. Insbesondere kann vorgesehen sein, dass die Querschnitte der Kanäle des fluidischen Kanalsystems auf Abmessungen der Mikroorganismen angepasst sein können.
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Der scheibenförmige Probenträger kann beispielsweise als ein flacher Probenträger ausgebildet sein. Von Vorteil ist dabei, dass durch die Scheibenform des Probenträgers die Zentrifugalkraft für die Fluidförderung ausgenutzt werden kann. Alternativ kann der Probenträger eine dreidimensionale Erstreckung, beispielsweise in Form eines Zylinders oder küvettenartig, aufweisen. Dadurch ist die Fluidförderung über Druck oder auf eine andere Weise erreichbar.
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Beispielsweise kann die Scheibenförmigkeit rotationssymmetrisch ausgebildet sein. Dies kann für ein Zentrifugieren von Vorteil sein. Es sind auch alternativ rechteckförmige Probenträger wie bei einer Chipkarte oder segmentförmige Probenträger wie bei einem Pizzastück bildbar.
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Eine vorteilhafte Ausführungsform gemäß der Erfindung sieht weiterhin vor, dass nach dem Einführen der Untersuchungsprobe eine Kultivierung der in der Untersuchungsprobe enthaltenen Mikroorganismen in einer Vorkultivierungskammer durchgeführt wird. Somit kann ein bakterielles Wachstum der in der Untersuchungsprobe enthaltenen Mikroorganismen ermöglicht werden. Dies ist insbesondere vorteilhaft, wenn eine nicht bereits vorkultivierte Untersuchungsprobe, wie beispielsweise eine Bakteriensuspension, verwendet wird.
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Eine vorteilhafte Ausführungsform gemäß der Erfindung sieht vor, dass der optische Nachweis einer Detektionsreaktion mittels Photometrie, vorzugsweise Turbidimetrie (Trübungsanalyse, Trübungsmessung), ausführbar ist. Alternativ oder zusätzlich kann der optische Nachweis einer Detektionsreaktion mittels Fluoreszenzmessung ausgeführt werden.
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Die Erfindung wird nun anhand von Ausführungsbeispielen näher beschrieben, ist aber nicht auf diese Ausführungsbeispiele beschränkt. Weitere Ausführungsbeispiele ergeben sich durch Kombination der Merkmale einzelner oder mehrerer Schutzansprüche untereinander und/oder mit einzelnen oder mehreren Merkmalen der Ausführungsbeispiele.
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Es zeigt:
- 1 eine erfindungsgemäße Plattform mit den Reaktionskammern 4 und den Reaktionskammern 5, die parallel zueinander geschaltet sind, in einer schematischen Darstellung,
- 2 eine erfindungsgemäße Plattform mit den Reaktionskammern 4 und den Reaktionskammern 5, die seriell hintereinandergeschaltet sind, in einer schematischen Darstellung.
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In den 1 und 2 ist eine Plattform zur fluidischen Prozessierung in verschiedenen Ausführungen gezeigt.
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1 und 2 zeigen eine erfindungsgemäße Plattform 1 zur fluidischen Prozessierung mit einer Zuführöffnung 2, in die eine Untersuchungsprobe 3 direkt einführbar ist. Die Plattform 1 hat wenigstens eine erste Reaktionskammer 4, die ein Nachweisreagenz 6 enthält, und wenigstens eine zweite Reaktionskammer 5, die ein Nachweisreagenz 8 enthält.
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Die Zuführöffnung 2 ist mit der wenigstens einen Reaktionskammer 4 und der wenigstens einen Reaktionskammer 5 verbunden.
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Aus 1 und 2 ist erkennbar, dass zwischen der Zuführöffnung 2 und den Reaktionskammern 4 und 5 eine Vorkultivierungskammer 7 angeordnet ist. Bei einem weiteren Ausführungsbeispiel ist eine erfindungsgemäße Plattform 1 frei von Vorkultivierungskammer 7 ausgebildet.
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In der hier in 1 dargestellten Plattform-Ausführung ist die Plattform 1 mit drei Reaktionskammern 4 und drei Reaktionskammern 5 ausgebildet, die parallel zueinander geschaltet sind. Bei weiteren Ausführungsbeispielen ist eine andere Anzahl von Reaktionskammern 4 und Reaktionskammern 5 vorhanden, beispielsweise mehr als drei oder weniger als drei.
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In der hier in 2 dargestellten Plattform-Ausführung ist die Plattform 1 mit zwei Reaktionskammern 4 und zwei Reaktionskammern 5 ausgebildet, die seriell hintereinandergeschaltet sind. Bei weiteren Ausführungsbeispielen ist eine andere Anzahl von Reaktionskammern 4 und Reaktionskammern 5 vorhanden, beispielsweise mehr als zwei oder weniger als zwei.
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In einer bevorzugten Anwendung wird zunächst die Untersuchungsprobe 3 entweder in flüssiger Form oder in fester Form in die Plattform 1 eingeführt. Nun wird die Untersuchungsprobe 3 in der Plattform 1 ausgewaschen, durchgemischt und kultiviert bei Bedingungen, die ein bakterielles Wachstum ermöglichen. Der Vorkultivierungsschritt kann entfallen, falls bereits kultivierte Bakteriensuspensionen verwendet werden oder falls in einer zu analysierenden Probe eine ausreichende Anzahl an Mikroorganismen enthalten ist. Anschließend wird die vorkultivierte Untersuchungsprobe 3 auf die Reaktionskammern 4 und 5 verteilt, die bereits Nachweisreagenzien enthalten. Die Nachweisreaktion wird durch die optische Signalerfassung mittels Photometrie durchgeführt. Beispielsweise wird die Nachweisreaktion mittels Turbidimetrie oder Fluoreszenzmessung durchgeführt.
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Erfindungsgemäß wird somit vorgeschlagen, aus einer Zuführöffnung 2 und wenigstens einer Reaktionskammer 4, die ein Nachweisreagenz 6 enthält, und wenigstens einer Reaktionskammer 5, die ein Nachweisreagenz 8 enthält, eine Plattform 1 zur fluidischen Prozessierung einer Untersuchungsprobe 3 zu bilden, wobei die Zuführöffnung 2 mit wenigstens einer ersten Reaktionskammer 4 für wenigstens eine phänotypische Reaktion und wenigstens einer zweiten Reaktionskammer 5 für wenigstens eine genotypische Reaktion verbunden ist.
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Bezugszeichenliste
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- 1
- Plattform
- 2
- Zuführöffnung
- 3
- Untersuchungsprobe
- 4
- Reaktionskammer für eine phänotypische Reaktion
- 5
- Reaktionskammer für eine genotypische Reaktion
- 6
- Nachweisreagenz für eine phänotypische Reaktion
- 7
- Vorkultivierungskammer
- 8
- Nachweisreagenz für eine genotypische Reaktion
