DE102020101110A1

DE102020101110A1 - Antimykotische Aktivitäten von Hydrogelen auf Basis von Polysacchariden

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Publication number: DE102020101110A1
Application number: DE102020101110.5A
Authority: DE
Inventors: Prof. Dr. Vollrath Mont Kumpugdee; Alaa Seklaoui; Prof. Dr. Seidler Tassilo
Original assignee: BEUTH HOCHSCHULE fur TECHNIK BERLIN
Current assignee: Berliner Hochschule Fuer Technik Koerperschaf De
Priority date: 2020-01-17
Filing date: 2020-01-17
Publication date: 2021-07-22

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die lokale Behandlung von Mykosen, insbesondere Candidosen. Insbesondere stellt die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, umfassend ein homogenes Hydrogel auf Basis eines Polysaccharids, wobei das Polysaccharid ein Alginat (Alginatpolymer) und/oder Chitosan ist. Dies ermöglicht es, eine hervorragende antimykotische Wirkung bei geringer Konzentration antimykotischer Wirkstoffe wie Nystatin oder sogar ohne Wirkstoff zu erhalten. In Kombination mit dem erfindungsgemäßen Polysaccharid-Hydrogel weist Nystatin bereits bei niedrigen Konzentrationen eine gesteigerte antimykotische Wirksamkeit auf, woraus sich ein Synergieeffekt ableiten lässt. Die Erfindung lehrt auch ein Verfahren zur Herstellung bevorzugter erfindungsgemäßer Zusammensetzungen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die lokale Behandlung von Mykosen, insbesondere Candidosen. Insbesondere stellt die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, umfassend ein homogenes Hydrogel auf Basis eines Polysaccharids, wobei das Polysaccharid ein Alginat (Alginatpolymer) und/oder Chitosan ist. Dies ermöglicht es, eine hervorragende antimykotische Wirkung bei geringer Konzentration antimykotischer Wirkstoffe wie Nystatin oder sogar ohne Wirkstoff zu erhalten. In Kombination mit dem erfindungsgemäßen Polysaccharid-Hydrogel weist Nystatin bereits bei niedrigen Konzentrationen eine gesteigerte antimykotische Wirksamkeit auf, woraus sich ein Synergieeffekt ableiten lässt. Die Erfindung lehrt auch ein Verfahren zur Herstellung bevorzugter erfindungsgemäßer Zusammensetzungen.
Auch circa 120 Jahre nach der Entdeckung der Antibiotika stellt die Aufklärung antimikrobieller Mechanismen zum Zwecke der Optimierung von Therapien gegen Infektionskrankheiten eine immense Herausforderung dar. Insbesondere pilzbedingte Infektionen bereiten Mediziner/-innen und Pflegepersonal im klinischen Bereich wachsende Schwierigkeiten. Dies ist vor allem durch die Zunahme immunsupprimierter Patienten bedingt, deren Immunsystem beispielsweise durch HIV-Infektion, Chemotherapie zur Behandlung maligner Erkrankungen oder nach Organtransplantation geschwächt ist. Daher ist die Erforschung neuer fungizider Wirkstoffe und effizienterer Wege der Wirkstoffabgabe heute relevanter denn je.
Pilzinfektionen können mit Antimykotika behandelt werden. Ziel der Therapie bzw. der Gabe eines Antimykotikums ist die Abtötung/Inaktivierung oder die Wachstumshemmung der Krankheitserreger. Hierfür werden meist topische Arzneimittel verwendet. Diese Arzneimittel haben den Vorteil, dass sie nicht eingenommen oder gespritzt werden müssen, sondern lokal angewendet werden. Da bei örtlicher Applikation der Wirkstoff direkt an die infizierte Stelle gebracht wird, kann hierbei oft die Wirkstoffdosis weitestgehend verringert und somit das Nebenwirkungsrisiko vermindert werden.
Einer örtlichen Behandlung zugänglich sind alle an der Oberfläche liegenden Organe, demnach sowohl die Haut als auch die Schleimhäute der Atemwege, des Verdauungstraktes und des äußeren Auges. Aber auch eine Injektion in ein Gelenk stellt eine topische, in diesem Fall intraartikuläre Behandlung dar.
Der antimykotische Wirkmechanismus basiert auf einer fungistatischen oder fungiziden Wirkung. Eine fungizide Wirkweise bezieht sich auf das Abtöten aller infektionsverursachenden Pilzzellen. Meist wird jedoch eine fungistatische Wirkweise präferiert. Bei diesem Mechanismus wird lediglich das Wachstum der Erreger gehemmt, ohne diese abzutöten. Der befallene Organismus synthetisiert daraufhin gegen die gehemmten Erregerzellen diverse Abwehrkomponenten. Die in der antimykotischen Therapie angewandten Wirkstoffe entstammen verschiedenen Substanzklassen, wie beispielsweise den Azolen oder den Polyenen.
Polyene oder Polyen-Antimykotika sind die ältesten Antimykotika und werden seit den 50er Jahren eingesetzt. Zu der Gruppe der Polyene zählen u.a. Nystatin und Amphotericin B. Polyene entfalten einen fungiziden Wirkmechanismus, indem sie irreversible Komplexe mit dem bereits synthetisierten Ergosterol der Pilzmembran bilden. Daraus resultierend kommt es infolge einer Porenbildung in den angegriffenen Pilzzellen zu einem vermehrten Austreten von Kaliumionen mit nachfolgendem Zelltod. Nystatin wird daher zu der Klasse der ionophoren Moleküle gezählt.
Nystatin wurde 1948 als erstes Antimykotikum aus Streptomyces noursei isoliert. Aufgrund seiner hohen systemischen Toxizität sollte Nystatin nicht parenteral, also z.B. intravenös appliziert werden. Nystatin wird jedoch nicht durch intakte Haut oder Schleimhäute absorbiert oder im Darm resorbiert, weshalb es bei oraler Applikation nur lokal im Verdauungstrakt wirkt. Daher gilt Nystatin allgemein als gut verträglich und kommt als bevorzugtes Antimykotikum in der Behandlung oraler, vaginaler und gastrointestinaler Pilzinfektionen zum Einsatz.
Das Stabilitätsoptimum von Nystatin liegt zwischen pH 5 und 7, das Wirkoptimum bei pH 4,5-6,5. Für wässrige Suspensionen wird in der Literatur bei 4 °C eine Haltbarkeit von 1 Woche angegeben.
Auf dem Markt befindet sich eine Vielzahl von Salben, Injektionen und Gelen, die Nystatin in Konzentrationen von 100.000 internationalen Einheiten (IE) pro Gramm enthalten, darunter Candio-Hermal^®, Candio Hermal Plus^® (Kombination mit Flupredniden, Almirall, Spanien), My-kundex^® (Riemser Pharma, Deutschland) oder Multilind^® Heilsalbe mit Nystatin (STADA, Deutschland). Bei vielen dieser Produkte kommen Paraffin oder Propylenglycol als Hauptarzneistoffträger zur Verwendung. Allerdings ist die antimikrobielle Wirksamkeit dieser Darreichungsformen aufgrund der nur oberflächlichen und kurzzeitigen Wirkung - trotz einer hohen Wirkstoffkonzentration - oftmals gering. Zudem weisen viele dieser Salben eine nur sehr begrenzte Haftfähigkeit z.B. auf der Mundschleimhaut auf.
Biopolymere, z.B. Polysaccharide und Proteine, werden oft als Ausgangsstoffe für Trägermittel von Enzymen und anderen essenziellen Proteinen, als Verpackungsmaterial für Lebensmittel und zur Medikamentenbeschichtung verwendet. Ein weiteres Anwendungsgebiet ist die Herstellung von kolloidalen Systemen beladen mit Wirkstoffen. So offenbart US5385738A eine injizierbare pharmazeutische Zusammensetzung mit verzögerter Wirkstofffreisetzung auf der Basis von biologisch abbaubaren Trägerstoffen, darunter Proteine wie Kollagen und Albumin oder Polysaccharide wie Chitin.
Polysaccharide zeichnen sich durch ihre hohe Stabilität, eine gute Gelierungseigenschaft und ihre Biokompatibilität aus. Polysaccharide sind zudem biologisch leicht abbaubar und besitzen eine gute physiologische Verträglichkeit gegenüber der menschlichen Haut und Schleimhaut. Sie sind nicht toxisch und sind zudem durch ein hohes Vorkommen und günstige Anschaffungskosten gekennzeichnet.
Besonders Wirkstoffträger aus Alginsäure oder deren Natrium- und Kaliumalginatsalze erwiesen sich in der Forschung der letzten Jahre als vielversprechend. Insbesondere wurde festgestellt, dass Alginat-Mikropartikel oder -Nanopartikel sich gut als Träger von pharmazeutischen Wirkstoffen eignen. Mehrere Studien thematisierten die positiven Eigenschaften von Alginat-Mikropartikeln und/oder -Nanopartikeln als Trägersystem für Nystatin und andere antimykotische Wirkstoffe, darunter de Castro Spadari et al. (2019, International Journal of Nanomedicine 14, 5187-5199), Martin et al. (2015, Carbohydrate Polymers 117, 140-149), Pandey et al. (2005, Int. J. Pharm. 301, 268-276), Ahmad et al. (2007, Nanomedicine 3, 239-243), Sangeetha et al. (2007, Trop. J. Pharm. Res. 6, 653-659), Gupta et al. (2015, Pharm. Res. 32, 1727-1740) und Martin-Villena et al. (2013, Carbohydr. Polym. 94, 1-11). Reis et al. (2015, Pharm. Dev. Technol. 7450, 1-6) zeigten, dass die antifungale Wirksamkeit von Nystatin gegen C. albicans durch Kombination mit Alginat-Mikropartikeln erhöht werden konnte.
Alginate lassen sich als Polysaccharid-Derivate charakterisieren, die aus den beiden Uronsäuren α-L-Guluronsäure (GulUA) und β-D-Mannuronsäure (ManUA) gebildet werden. Diese sind in der Regel 1,4-glycosidisch in wechselndem Verhältnis zu linearen Ketten verknüpft. Dies führt zu der Bildung homopolymerer Bereiche, in denen Mannuronsäure oder Guluronsäure als Blöcke vorliegen. Folglich werden diese Blöcke vereinfacht als GG- oder MM-Blöcke bezeichnet. Im Bereich dieser GG- und MM-Blöcke kommt es zu einer Art Faltstruktur, die von besonderer Bedeutung in der Herstellung von Gelen sind. Alginate liegen also üblicherweise als Alginatpolymere vor.
In einer Studie konnte gezeigt werden, dass die Herstellung von Konjugaten aus oxidiertem Natriumalginat und Amphotericin B eine signifikant verlangsamte Wirkstofffreisetzung ermöglichte (Ravichandran and Jayakrishnan, 2018, Int J Biol Macromol. 108, 1101-1109).
Tondervick et al. (2014, PLoS ONE 9,11, 1-10) und WO 2013/038197 A1 offenbaren, dass Alginatoligomere aus weniger als 100 Monomeruntereinheiten die Wirksamkeit von Nystatin und weiteren Antimykotika bei der Bekämpfung von Candida spp. und anderen Pilzarten signifikant erhöhen kann.
Mit Kalzium, Kupfer- und Zink derivatisierte Alginate sollen ebenfalls einen antikykotischen Effekt aufweisen (Reddy N., Yang Y., 2015, Antifungal and Antiflammable Properties of Alginate Fibers. In: Innovative Biofibers from Renewable Resources, 147-149).
Neben Alginaten wird auch Chitosan in seiner Rolle als bioadhäsiver antimykotisch wirkender Arzneistoffträger erforscht. Chitosan ist ein Polyaminosaccharid, das durch Deacetylierung aus Chitin gewonnen wird. Chitin gehört als strukturbildendes Polysaccharid in den Zellwänden von Pilzen oder den Exoskeletten von Gliederfüßern zu den am weitesten verbreiteten Biopolymeren. Liegen im Gesamtmolekül des Chitins mehr deacetylierte 2-Amino-2-desoxy-β-D-Glucopyranose-Einheiten vor, spricht man von Chitosan. Eine antimykotische Aktivität des Chitosans wurde in zahlreichen Studien beschrieben (Ing et al., 2012, International Journal of Biomaterials; Alburquenque et al., 2010, Med. Mycol. 48:8, 1018-23; Avelelas et al., 2019, Mar. Drugs 17:4; El Ghaouth et al., 1992, Mycol. Res. 96:9, 769-779; Fawzya et al., 2019, IOP Conf. Ser.: Earth Environ. Sci. 278 012026). Überdies wurde gezeigt, dass eine Kombination von Chitosan und dem polyenen Antimykotikum Amphotericin B eine höhere Hemmwirkung auf das Wachstum von C. albicans aufweist als Chitosan oder Amphotericin B allein (Soliman et al., 2015, The Journal of Basic & Applied Zoology, 72, 163-172; Grisin et al., 2017, Pharmaceutical Research 34:5, 1067-1082). Ähnliche Synergieeffekte wurden auch zwischen Chitosan und dem Azol-Antimykotikum Miconazol beschrieben (Tejada et al., Materials Science and Engineering: C 79:1, 140-150). Dagegen beschäftigten sich in der Vergangenheit nur wenige Studien mit der Erforschung von Hydrogelen auf Chitosanbasis als mögliche Träger für Nystatin (Perchyonok et al., 2013, Eur. J. Dent., 7:4, 412-418; Perchyonok et al., 2014, J. Funct. Biomater. 5:4, 259-272; Bezigha et al., 2010, Jordan Journal of Pharmaceutical Sciences 3:1, 44-55).
Das fortschreitende Aufkommen von Antibiotikaresistenzen stellt eine der größten medizinischen Herausforderungen unserer Zeit dar. Zwar sind bisher nur wenige Fälle von Resistenzen gegen antimykotische Polyene bekannt und insbesondere gegen Nystatin sind bis heute keine Resistenzen bei Hefen der Gattung Candida beschrieben worden. Allerdings wurde zuletzt ein steigendes Aufkommen von Resistenzen gegen Azol-Antimykotika, wie z.B. Fluconazol, Itraconazol und Voriconazol verzeichnet. Daher liegt bei der Entwicklung neuer antimykotischer Präparate ein wichtiger Fokus auf der Minimierung der verwendeten Wirkstoffkonzentration und in der Potenzierung des Wirkstoffeffekts durch Kombination mit weiteren Substanzen.
In Anbetracht des Standes der Technik stellt sich dem Fachmann daher die Aufgabe, neue und verbesserte topisch anwendbare pharmazeutische Zusammensetzungen zur Therapie von Mykosen zur Verfügung zu stellen, die einfach und kostengünstig herstellbar sind.
Gelöst wird die erfindungsgemäße Aufgabe durch den Gegenstand der vorliegenden Erfindung, insbesondere der Ansprüche. Die Erfindung stellt eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verfügung, umfassend ein homogenes Hydrogel auf Polysaccharidbasis zur Verwendung bei der lokalen Behandlung einer Mykose, insbesondere einer kutanen oder oralen Mykose, wobei das Polysaccharid

a) ein Alginat, also ein Alginatpolymer, ist und die Zusammensetzung 0-2 % (Gew. %) Nystatin umfasst, oder
b) ein Chitosan ist und die Zusammensetzung 0,1- 2 % (Gew. %) Nystatin umfasst,

a) ein Alginatpolymer ist, oder
b) ein Chitosan ist,

Die Erfinder haben überraschend herausgefunden, dass in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen das homogene Hydrogel auf Basis von Alginat oder Chitosan eine synergistische Wirkung mit Nystatin aufweist, welche den Einsatz einer sehr geringen Wirkstoffkonzentration bei hervorragender antimykotischer Wirkung erlaubt. Ferner wurde für die erfindungsgemäßen Hydrogele auf Alginatbasis erstmalig auch ohne Wirkstoff eine antimykotische Wirkung gefunden.
Mykosen
Der Begriff Mykose bezeichnet durch Pilze verursachte Infektionen oder Erkrankungen. Mykosen können durch myzelbildene Pilze oder Hefen ausgelöst werden, die sich parasitär auf dem infizierten Gewebe ausbreiten. Die Begriffe Mykose, Pilzinfektion und Pilzerkrankung werden im Rahmen der Erfindung synonym genutzt. Es ist unerheblich, ob eine Pilzinfektion sich in einer Erkrankung mit klinischen Symptomen offenbart, wobei dies üblicherweise der Fall ist, wenn eine Behandlung angestrebt wird.
Pilze im Sinne der vorliegenden Erfindung sind Tier- oder Pflanzenpathogene und/oder -parasiten mit der Fähigkeit, organisches Material zu zersetzen. Der Pilz kann ein opportunistischer Parasit sein, kann also nur immunsupprimierte Subjekte befallen. Ferner umfasst der Begriff Pilz sowohl myzelbildende Pilzarten wie Schimmelpilze als auch einzellige Hefen. Der Pilz kann zudem ein Pilz sein, der Mykotoxine produziert, die zu einer Vergiftung oder einer allergischen Reaktion des infizierten Subjekts führen können. Pilz umfasst des Weiteren sowohl eine Pilzpopulation bestehend aus einer Vielzahl einzelner Pilze oder Pilzzellen als auch einen einzelnen Pilz oder eine einzelne Pilzzelle. Eine Pilzpopulation kann homogen sein, d.h. aus einer einzigen Art von Pilz bestehen, oder heterogen sein, d.h. aus einer Mehrzahl an unterschiedlichen Pilzarten und/oder -sorten bestehen.
Bevorzugt ist der Erreger, der die im Rahmen der Erfindung behandelte Mykose auslöst, eine Hefe. Die häufigste beim Menschen als Krankheitserreger gefundene Hefegattung ist Candida, die sich zurzeit aus mehr als 200 bekannten Spezies zusammensetzt. Der Begriff Candidose beschreibt eine Infektionskrankheit, die durch Pilze der Hefegattung Candida ausgelöst wird. Die bekanntesten pathogenen Candida Spezies umfassen C. albicans, C. auris, C. blankii, C. stellatoidea, C. dubliniensis, C. famata, C. glabrata, C. guilliermondii, C. krusei, C. lusitaniae, C. parapsilosis und C. tropicalis.
Candida albicans, die am häufigsten isolierte Candida-Spezies, besiedelt die Schleimhäute vieler gesunder Menschen, ohne zunächst Krankheitserscheinungen hervorzurufen. Einen wichtigen Virulenzmechanismus von Candida albicans stellt die Fähigkeit zur Bildung filamentöser Wachstumsformen dar. Andere beschriebene Faktoren sind die Fähigkeit zur Anheftung an Gewebestrukturen sowie die Bildung von Enzymen zu deren Zerstörung.
Die Zellwände der Candida können durch das Wachstum und die Entwicklung der einzelnen Hefezellen ständig erweitert und modifiziert werden. Neben der Bedeutung als Abgrenzung gegenüber ihrer Umwelt befähigen mehrere Möglichkeiten die Sprosszellen zur Interaktion mit ihrer Umgebung, weshalb diese auch die häufigste Ursache für Pilzinfektionen weltweit darstellen. Die wichtigsten Erscheinungsformen einer infektiösen Besiedlung mit Candida sind die orale und die kutane Candidose.
Orale Mykosen umfassen Pilzinfektionen der Mundhöhle und/oder der Mundwinkel und können bis in den Rachenraum und die Speiseröhre vordringen. Meistens werden orale Mykosen durch Hefepilze der Gattung Candida ausgelöst, sodass man allgemein von oralen Candidosen spricht. Infektionen der Mundschleimhaut treten meist als weiße, plaqueartige, schwer abwischbare Beläge (Soor) in Erscheinung. In der Literatur finden sich weitere Erscheinungsformen, wie u.a. die akute pseudomembranöse Form, mit gelblich stippchenförmigen, abstreifbaren Belegen im Mund- und Rachenraum. Betroffene klagen bei dieser Form der Candidose über brennende Schmerzen und Mundtrockenheit und haben, auch bei einer guten Mundhygiene, ständig ein pelziges Gefühl mit einem veränderten Geschmackssinn im Mund. Wird der weiße Belag mit einem Holzspatel abgestreift, finden sich darunter rote, entzündete, oft auch leicht blutende Stellen. Breitet sich die Hefe vom Mund in die Speiseröhre aus, kann dies zu Schluckbeschwerden führen, weshalb Betroffene meist weniger essen. Unbehandelt kann eine Candidose der Mundhöhle Monate oder gar Jahre andauern. Auch können die Hefen in tiefere Gewebsschichten vordringen, den Blutkreislauf erreichen und hierdurch eine lebensbedrohliche Blutvergiftung (Sepsis) auslösen.
Die orale Mykose kann sowohl akut als auch chronisch verlaufen und zudem durch eine Entzündung der Mundwinkel begleitet werden. Die Candidose der Mundwinkel wird meist durch das Entstehen von feuchten Kammern begünstigt. Die klinische Erscheinungsform reicht dabei von lokal entzündeten Hautveränderungen bis zur Bildung von Granulomen.
Eine kutane Mykose ist in erster Linie eine Pilzinfektion der Haut. Das klinische Bild der Hautcandidose wird durch flächenhafte Erosionen mit geringfügigem Nässen und Satellitenherden in der näheren Umgebung des Hauptherdes charakteristisch in Verbindung gebracht. Vorzugslokalisationen dieser Form der Hefeinfektion sind Hautfalten, wie der Windelbereich bei Säuglingen und bettlägerigen, inkontinenten Personen. Darüber hinaus finden sich erosive Hautläsionen in den Zwischenräumen der Finger.
Andere kutane Mykosen sind diverse Pilzerkrankungen der Füße und Zehen, des Kopfes und weiterer behaarter Hautpartien sowie Infektionen der Hautanhangsgebilde, wie z.B. Nagelpilz.
Medizinische Anwendung
Die erfindungsgemäßen Hydrogele dienen hauptsächlich zur Verwendung bei der lokalen Behandlung einer Mykose. Der Begriff lokal beschreibt eine örtliche oder topische, zumeist äu-ßerliche Anwendung eines Arzneimittels, die von einer systemischen Anwendung zu unterscheiden ist. Topische bzw. lokale Behandlungen umfassen Medikamente in der Form von u.a. Gelen, Salben, Cremes, aber auch Nasen- oder Augentropfen. Einer lokalen Behandlung zugänglich sind alle an der Oberfläche liegende Organe, demnach sowohl die Haut als auch die Schleimhäute der Atemwege, des Verdauungstraktes und des äußeren Auges. Aber auch eine Injektion in ein Gelenk stellt eine lokale, in diesem Fall intraartikuläre Behandlung dar.
Bevorzugt ist die lokale Behandlung erfindungsgemäß die Behandlung einer kutanen oder oralen Mykose, wobei die Mykose, wie beschreiben, bevorzugt eine Candidose ist.
Zur lokalen Behandlung kann das erfindungsgemäße Hydrogel auf von der Mykose betroffene und ggf. benachbarte Stellen aufgetragen werden, z.B. in einer dünnen Schicht, z.B. von etwa 3-7 mm oder etwa 5-6 mm. Bei einer kutanen Mykose wird das Hydrogel auf die Haut aufgetragen. Das erfindungsgemäße Hydrogel weist gute Hafteigenschaften auch auf Schleimhaut auf, die auch eine Behandlung einer oralen Mykose erlauben. Bei einer oralen Mykose wird das Hydrogel auf die Schleimhaut aufgetragen. Auch eine Applikation in den Mundwinkeln ist möglich.
Das Hydrogel wird z.B. 3-5-mal pro Tag, bevorzugt täglich, auf betroffene Stellen aufgetragen. Die Behandlung sollte stattfinden, bis die Mykose verschwunden ist.
Die Zusammensetzung eignet sich für die Behandlung jedes Subjekts oder Patienten, welcher durch einen Pilz infiziert ist und/oder bei aufgrund von Symptomen unter dem Verdacht steht, durch einen Pilz infiziert worden zu sein und/oder bei dem ein Risiko besteht, durch einen Pilz infiziert zu werden. Dies kann wegen einer generellen Anfälligkeit gegenüber Pilzinfektionen (z.B. in immunsupprimierten Patienten) oder aufgrund einer erhöhten Infektionsanfälligkeit durch eine spezifische Pilzart der Fall sein. Die Verwendung der pharmazeutischen Zusammensetzung in der Prophylaxe ist ebenfalls möglich, also zur Verhinderung, Reduzierung oder Verzögerung einer Mykose. Dazu sind besonders die erfindungsgemäßen Gele ohne Nystatin oder anderen antimykotischen Wirkstoff geeignet, da hier eine evtl. unnötige Exposition gegenüber dem Wirkstoff unnötig wird.
Das zu behandelnde Subjekt kann ein menschliches oder nicht-menschliches Tier sein, bevorzugt ein Wirbeltier, z.B. ein Säuger wie ein Mensch, eine Maus, eine Ratte, ein Hund oder eine Katze. Es kann sich auch um einen Fisch handeln. Bevorzugt handelt es sich bei dem Subjekt um einen Menschen.
Hydrogele
Der Begriff Hydrogel beschreibt ein dreidimensionales Polymernetzwerk mit hohem Wasseranteil. Dabei quillt das Polymernetzwerk durch den Kontakt mit Wasser auf und gewinnt somit an Volumen. Hydrogele zeichnen sich im Allgemeinen durch eine hohe Biokompatibilität aus.
Ein homogenes Hydrogel weist einen gleichmäßigen und kontinuierlichen Aufbau des Gels in Form eines Netzwerks auf, und unterscheiden sich somit von Hydrogelen, die einzelne Partikel, z.B. Mikro- oder Nanopartikel, also Teilchen mit Durchmessern von unter einem Millimeter, umfassen oder daraus bestehen. Polysaccharide (Mehrfachzucker) sind typische Polymere, die unter natürlichen Verhältnissen in biologischen Zellen hergestellt und daher der Gruppe der Biopolymere zugeordnet werden. Dabei beschreibt der Begriff Polymer einen chemischen Stoff, der aus Ketten sich wiederholender Untereinheiten besteht. Polysaccharide setzen sich aus mindestens elf Einfachzuckereinheiten (Monosacchariden) zusammen, die über eine glycosidische Bindung miteinander verknüpft sind. Bekannte Polysaccharide umfassen Stärke, Cellulose, Glykogen, Chitin, Pektin oder Alginsäure, auch als Alginat bezeichnet.
Alginate
In einer ersten Ausgestaltung der Erfindung handelt es sich bei dem verwendeten Polysaccharid um ein Alginat, also ein Alginatpolymer.
Als Alginate werden die Salze der Alginsäure bezeichnet, die in der Natur als strukturgebendes Element der Zellwände von Braunalgen und Bakterien, z.B. Azotobacter vorkommt. Alginate gehören zu den sogenannten hydrophilen Kolloiden, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sich die kolloidal gelösten Teilchen in erster Linie durch Umhüllung mit Wasser-Molekülen stabilisieren. Unter Kolloiden versteht man Teilchen oder Tröpfchen, die in einem Dispersionsmedium fein verteilt sind. Die mittlere Molmasse von Alginaten beträgt 48.000-186.000 g·mol-1. Alginate weisen aufgrund ihres Polyanion-Charakters eine hohe Hydrophilie auf. Alginate finden vor allem als Verdickungs- oder Geliermittel auch in pharmazeutischen Zubereitungen Verwendung und werden regelmäßig in verschiedensten medizinischen Bereichen genutzt. So werden Alginatkompressen u.a. zur Versorgung oberflächlicher und tiefgehender Wunden verwendet, wodurch das Verkleben des Verbandmaterials mit der Wunde verhindert wird. Des Weiteren wird Alginat in der Chirurgie auch als Wundauflage oder Wundfüller verwendet, um chronische Wunden zu desinfizieren und schneller abheilen zu lassen. Alginat wird ebenfalls als Biomaterial zur Verkapselung menschlichen Gewebes eingesetzt. Dadurch ist es möglich, körperfremdes Material, wie zum Beispiel Spenderzellen einzulagern, ohne dass diese durch das Immunsystem erkannt und zerstört werden.
Der Begriff Alginatpolymer beschreibt ein dreidimensionales Alginatnetzwerk in Form eines Gels oder Hydrogels. Das erfindungsgemäße Alginatpolymer weist ein Molekulargewicht von mindestens 30.000 Da, besonders bevorzugt mindestens 35.000 Da oder mindestens 40.000 Da auf und umfasst bevorzugt mindestens 175, mindestens 190 oder mindestens 200 Monomereinheiten. Das erfindungsgemäße Alginatpolymer besteht bevorzugt zu mindestens 80%, besonders bevorzugt zu mindestens 85, 90, 95 oder 99% aus Uronsäuren und/oder Uronatresten, insbesondere aus α-L-Guluronsäure (GulUA) und β-D-Mannuronsäure (ManUA). Folglich umfasst das Alginatpolymer bevorzugt keine weiteren Molekülreste (z.B. weitere Saccharidreste, insbesondere andere Uronsäuren und/oder Uronatreste). Ferner sind die GulUA- und ManUA-Reste bevorzugt zu mindestens 70%, besonders bevorzugt zu 75%, zu 80%, zu 85%, zu 90%, zu 95%, zu 100% 1,4-glycosidisch miteinander verknüpft. Typischerweise besteht das Alginat aus den beiden Uronsäuren α-L-Guluronsäure (GulUA) und β-D-Mannuronsäure (ManUA), welche 1,4-glycosidisch in wechselndem Verhältnis zu linearen Ketten verbunden sind. Üblicherweise liegen GulUA und ManUA zu je 25%-75% vor.
Die Alginatpolymersequenz kann aus alternierenden GuIUA- und ManUA-Resten bestehen oder diese umfassen. Bevorzugt umfasst die Alginatpolymersequenz homopolymere Bereiche, bestehend aus Blöcken von mindestens 2 aufeinanderfolgenden GuIUA- oder ManUA-Resten. Das erfindungsgemäße Alginatpolymer kann ein durch die Polymerisierung von GuIUA- und ManUA-Resten synthetisch hergestelltes Material umfassen oder aus natürlichen Quellen, z.B. Braunalgen isoliert sein.
Optional können die Alginatpolymere chemisch modifiziert sein, z.B. durch die Verknüpfung mit geladenen funktionellen Gruppen oder Lipiden und Hydrokolloiden, wie z.B. Carragenen, Chitosanen und Pektinen.
Bevorzugt sind die Alginate nicht chemisch modifiziert. In unserem Fall verwendet wurde Alginsäure Natriumsalz, für die Biochemie geeignet.
Alginatpolymere tragen typischerweise eine elektrische Ladung, die durch Zugabe von Gegenionen neutralisiert werden kann. Als Gegenionen eignen sich besonders typische, physiologisch tolerierbare Ionen wie u.a. Natrium (Na⁺), Kalium (K⁺) oder Ammonium (NH₄ ⁺). Natriumalginat ist bevorzugt. Es ist im Handel als weißes bis blass gelblich-braunes Pulver erhältlich, das in Wasser unter Bildung einer viskosen, kolloidalen Lösung leichter löslich ist als Alginsäure.
In einer Ausführungsform ist das Polysaccharid ein Alginatpolymer und die Zusammensetzung umfasst ferner Chitosan. Eine solche Mischung umfasst bevorzugt eine Carbonsäure.
Chitosan
In einer zweiten Ausgestaltung der Erfindung handelt es sich bei dem erfindungsgemäß verwendeten Polysaccharid um ein Chitosan.
Chitosan ist ein Biopolymer, das sich vom Chitin ableitet. Liegen im Gesamtmolekül des Chitins mehr deacetylierte 2-Amino-2-desoxy-β-D-Glucopyranose-Einheiten vor, spricht man von Chitosan. Chitosan ist ein farbloser, amorpher, zäher Stoff. Industriell hergestelltes, hochmolekulares Chitosan ist in verdünnten starken Säuren (außer Schwefelsäure) sowie in organischen Säuren löslich. Die Löslichkeit in Säuren und gleichzeitig schlechte Löslichkeit bei neutralem oder alkalischem pH ist einzigartig unter den Biopolymeren und daher charakterisierend. Chitosan ist ungiftig, antibakteriell, antiviral und antiallergen. Das Anwendungsspektrum dieses Polymers ist auf Grund der genannten Eigenschaften vielfältig. Aufgrund seiner adsorbierenden, blutstillenden, antimikrobiellen und heilenden Wirkung kommt Chitosan in verschiedenen Medizinprodukten - wie beispielsweise bei Wundauflagen - zum Einsatz.
Chitosan umfasst mindestens 51 %, bevorzugt mindestens 55 %, mindestens 60 %, mindestens 65 %, oder mindestens 70 % deacetylierte 2-Amino-2-desoxy-β-D-glucopyranose-Einheiten. Erfindungsgemäß kann das verwendete Chitosan durch Deacetylierung aus Chitin gewonnen werden. Dies kann durch die Verwendung von Natronlauge oder enzymatisch erfolgen. Alternativ kann Chitosan verwendet werden, dass direkt aus der Zellwand von Pilzen isoliert wurde.
Das Chitosan kann chemisch modifiziert sein, z.B. durch die Verknüpfung mit geladenen funktionellen Gruppen oder Lipide und Hydrokolloide wie z.B. Carragene, Alginate und Pektine.
Nystatin
Der Wirkstoff Nystatin ist ein bereits im Jahre 1951 aus Streptomyces noursei isolierter Metabolit (1). Obwohl seit mehreren Jahrzehnten allgemein bekannt, ist das therapeutische Spektrum für in vivo-Applikationen von Nystatin praktisch auf die Verwendung als Antimykotikum beschränkt. Nystatin zeigt eine sehr breite antimykotische Aktivität. Abhängig von der applizierten Dosis wirkt Nystatin entweder fungistatisch oder fungizid. Der Anwendungsbereich liegt vor allem in der örtlichen Behandlung und Prophylaxe von Candidosen der Haut und der Schleimhaut.
Einzelne Studien verweisen auch auf die Fähigkeit von Nystatin, die Immunantwort auf Pilzinfektionen über die Hochregulierung von Zytokinen wie IFN-γ oder IL-17 zu modulieren (Zhang et al., 2018, BMC Microbiology 18; 166).
Des Weiteren wurde Nystatin in der Vergangenheit als möglicher Wirkstoff für die Bekämpfung nicht-mykotischer entzündlicher Schleimhauterkrankungen (z.B. rezidivierender Stomatitis aphthosa) genannt ( DE 4434929A1 ). Auch dies sind mögliche Anwendungsbereiche der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
Da der Wirkstoff nur lokal begrenzt wirkt und praktisch nicht aus dem Darm ins Blut aufgenommen wird, treten Nebenwirkungen nur sehr selten auf. Deshalb kann er gut für die lokale Behandlung eines Pilzbefalls im Darm verwendet werden. Nach Aufnahme über den Mund wird er über den Stuhl wieder ausgeschieden. Auch über die Haut wird praktisch kein Wirkstoff resorbiert, die Wirkung ist auf den Ort begrenzt, an dem er aufgetragen wird. Der Wirkmechanismus spiegelt sich in der irreversiblen Zerstörung der Pilzzelle wider, da der Wirkstoff sich an die Membran der Pilzzellen anlagert, wodurch sich darin Poren bilden und geladene Teilchen, wie vor allem Kalium-Ionen, aus den Zellen ausströmen. Durch diesen Mechanismus wird der Stoffwechsel der Pilzzellen gestört und sie sterben ab.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Erkenntnis, dass durch die Kombination von Nystatin mit einem homogenen Hydrogel eines geeigneten Biopolymers, z.B. eines Alginats, ein synergistischer therapeutische Effekt bei der topischen Behandlung von Mykosen, z.B. Candidosen und anderen lokalen Pilzerkrankungen auftritt, wobei eine - vorteilhafte - geringere Konzentration an Wirkstoff notwendig ist.
Die Erfindung stellt in einer Ausführungsform eine Zusammensetzung zur Verfügung, die ein homogenes Hydrogel auf Polysaccharidbasis umfasst, umfassend 0,1-2 % (Gew. %), Nystatin, wobei das Polysaccharid ein Alginatpolymer oder Chitosan ist.
Die Zusammensetzung umfasst bevorzugt 0,15-0.45 % (Gew. %), besonders bevorzugt 0,2-0,4% (Gew. %) Nystatin. In der am meisten bevorzugten Ausgestaltung umfasst die Zusammensetzung 0,30-0,35% (Gew. %) Nystatin. Wenn nicht ausdrücklich anders definiert, beziehen sich %-Angaben im Rahmen der Erfindung immer auf Gew. %, also Gewicht pro Gewicht oder, besser, m/m.
Eine größere Konzentration als 2% an Nystatin ist für die Erzielung des therapeutischen Effekts im Rahmen der erfindungsgemäßen Zusammensetzung nicht nötig. Ebenfalls ist es nicht nötig, einen anderen antimykotischen Wirkstoff zu kombinieren.
Die pharmazeutische Zusammensetzung auf Basis von Alginatpolymer umfasst bevorzugt 0-0.45 Gew. %, besonders bevorzugt 0,15-0,4 Gew. % Nystatin. So konnten die Erfinder, wie im experimentellen Teil dargestellt, zeigen, dass eine erfindungsgemäße Zusammensetzung z.B. mit 0,30-0,35 Gew. % Nystatin eine hervorragende Wirksamkeit aufweist. Aber auch Zusammensetzungen ohne Nystatin weisen bereits eine Wirksamkeit auf, die der der getesteten kommerziell erhältlichen Nystatinpräparate auf anderer Basis entspricht. Hydrogele auf Basis von Alginaten sind im Rahmen der Erfindung bevorzugt.
Die pharmazeutische Zusammensetzung auf Chitosanbasis umfasst bevorzugt 0,1-0,5 Gew. %, z.B. 0,15-0,4 Gew. % Nystatin. Die Zusammensetzung kann etwa 0,30-0,35 Gew. % Nystatin umfassen.
Das Nystatin ist erfindungsgemäß, wenn vorhanden, homogen in dem Hydrogel auf Alginat- oder Chitosanbasis verteilt. Das Nystatin wird bevorzugt während des Herstellungsverfahrens des Hydrogels in die Polysaccharidmatrix eingearbeitet. Der Wirkstoff wird daher während der Behandlung der Mykose gemeinsam mit dem erfindungsgemäßen Hydrogel auf Polysaccharidbasis auf die betroffene Haut- oder Schleimhautstelle aufgetragen.
Die Summenformel von Nystatin ist C₄₆H₇₇NO₁₉ und die molare Masse beträgt 926.09 g/mol-1. Die Aktivität der Substanz beträgt mindestens 4400 I.E. je mg. Aufgrund seines π-Elektronensystems, das vier konjugierte Doppelbindungen umfasst, wird Nystatin auch als Tetraen-Makrolid bezeichnet.
Das Stabilitätsoptimum von Nystatin liegt zwischen pH 5 und 7, das Wirkoptimum bei pH 4,5-6,5. Für wässrige Suspensionen wird in der Literatur bei 4 °C eine Haltbarkeit von 1 Woche angegeben.
Erfindungsgemäß schließt die Bezeichnung Nystatin sämtliche gleichwirkenden Strukturanaloga und Derivate mit ein (z.B. Nystatin A₁, Nystatin A₂ oder Nystatin A₃).
Die Erfinder beobachteten einen überraschenden Synergieeffekt zwischen dem erfindungsgemäß verwendeten Polysaccharid und dem antimykotischen Wirkstoff Nystatin, der zu einer erhöhten antimykotischen Wirkung der pharmazeutischen Zusammensetzung führte. Eine erhöhte antimykotische Wirkung bedeutet, dass die Hemmwirkung von Nystatin auf das Pilzwachstum bzw. die Pilzlebensfähigkeit durch die Kombination mit dem erfindungsgemäß verwendeten Polysaccharid-Hydrogel verstärkt wird. Pilzwachstum umfasst sowohl einen Anstieg der Größe des Pilzes bzw. des Volumens der Pilzbestandteile (z.B. die Menge der Nukleinsäuren oder Proteine, die Anzahl und Größe der Zellorganellen oder das Volumen des Zytoplasmas) als auch der Anzahl der Pilzzellen durch eine verstärkte Pilzreplikation, wobei der Begriff Replikation in diesem Kontext auf die Reproduktion des Pilzes verweist. Das Pilzwachstum lässt sich typischerweise durch mikroskopische Untersuchungen oder durch die Nutzung geeigneter Marker feststellen. Unter Pilzlebensfähigkeit wird die Fähigkeit eines Pilzes verstanden, unter bestimmten Umwelteinflüssen zu überleben. Daher bedeutet ein Töten des Pilzes, dass dessen Fähigkeit zum Überleben, Reproduzieren und Wachsen beendet wird. Die Lebensfähigkeit eines Pilzes kann auf verschiedene Wege ermittelt werden, z.B. in dem das Pilzwachstum geprüft wird, oder durch die Beobachtung charakteristischer morphologischer Veränderungen, die mit dem Sterben eines Pilzes in Verbindung gebracht werden. Die antimykotische Wirkung einer Substanz oder Zusammensetzung kann u.a. in vitro durch Agardiffusionstests, insbesondere durch sogenannte Hemmhoftest ermittelt werden. Dabei wird erregerhaltiges Material auf einem Nährboden ausgestrichen. Auf die Pilzschicht gibt man kleine Filterpapierscheibchen, die jeweils mit einer antimykotisch wirksamen Substanz oder Zusammensetzung getränkt sind. Diese diffundieren in die Agarschicht. Ist der Pilz gegenüber der verwendeten Substanz oder Zusammensetzung empfindlich, so wird das Pilzwachstum gehemmt und es entstehen deutlich sichtbare Hemmhöfe. Die erhöhte antimykotische Aktivität der erfindungsgemäßen Zusammensetzung hat zudem zur Folge, dass der Polysaccharidmatrix eine geringere Menge an Nystatin zugeführt werden muss, um eine vergleichbare Hemmwirkung auf das Pilzwachstum bzw. die Pilzlebensfähigkeit zu erzielen, als bei der Verwendung handelsüblicher Nystatinpräparate. So besitzt z.B. eine therapeutisch hervorragend wirksame erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung auf Alginatbasis in einer Ausgestaltung einen Nystatinanteil von etwa 0,3% Nystatin und damit eine Wirkstoffkonzentration von ungefähr 65.000 IE/g, ein Wert deutlich unter dem Wert handelsüblicher Nystatingele bzw. - cremes.
In einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung ist das Polysaccharid ein Alginatpolymer, und die Zusammensetzung umfasst keinen antimykotischen Wirkstoff. Im Rahmen der Erfindung wurde festgestellt, dass das erfindungsgemäße Alginatpolymer-Hydrogel selbst ohne die Beigabe eines antimykotischen Wirkstoffs eine signifikante Hemmwirkung auf das Wachstum z.B. von C. albicans aufweist. Die Hemmwirkung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung auf Alginatpolymerbasis ohne Wirkstoffzugabe war überraschenderweise vergleichbar mit der Wirkung bekannter, im Handel erhältlicher Antimykotika in Gel- oder Cremeform, die als antimykotische Wirkstoffe Nystatin, Bifonazol oder Terbinafin hydrochlorid enthalten.
Zusatzstoffe
Die Zusammensetzung umfasst bevorzugt eine oberflächenaktive Substanz, bevorzugt ein nichtionisches Tensid, z.B. ein Polysorbat. „Ein“ ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung, wenn nicht ausdrücklich anders definiert, als „mindestens ein“ zu verstehen, kann also auch mehrere, z.B. zwei oder drei umfassen.
Oberflächenaktive Substanzen dienen als Dispergiermittel, Feuchtigkeits- und Suspensionsmittel, insbesondere, um die Löslichkeit der Bestandteile zu erhöhen und die hergestellten Zusammensetzungen zu stabilisieren. Beispiele für oberflächenaktive Substanzen sind Polyoxyethylenether, Natriumlaurylsulfat, Sorbitolfettsäureester oder Poloxomer.
Erfindungsgemäß eignen sich besonders nichtionische Tenside wie Polyoxyethylen-Sorbitolfettsäureester, auch Polysorbate genannt. Der Vorteil nichtionischer Emulgatoren gegenüber ionischen Emulgatoren besteht darin, dass sie weniger Inkompatibilitäten mit Wirk- und Hilfsstoffen aufweisen und in geringerem Umfang Hautunverträglichkeiten nach sich ziehen. Die Zugabe von oberflächenaktiven Polysorbaten gewährleistet zudem eine homogenere Gelzusammensetzung.
In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung handelt es sich bei der verwendeten oberflächenaktiven Polysorbat um Polysorbat 80. Die Konzentration von Polysorbat 80 in der erfindungsgemäßen Alginatpolymer- bzw. Chitosanzusammensetzung liegt z.B. bei 1-3 Gew.%, bevorzugt bei 1,5-2,5 Gew. %, optional bei 1,75-2 Gew. % .
Polysorbat 80 (Tween 80) ist eine grenzflächenaktive Substanz, die als Emulgator und Netzmittel beispielsweise in Lebensmitteln, Kosmetika und Arzneimitteln verwendet wird. Bei Polysorbat 80 handelt es sich um eine polyoxyethylierte Verbindung, die sich von Sorbitol und Ölsäure ableitet. Tenside werden nach der Ladung ihrer hydrophilen Gruppe in anionische, kationische und nichtionische Tenside eingeteilt. Das Polysorbat zählt zu den nichtionischen Tensiden und die hydrophilen Gruppen sind Polymere von insgesamt 20 Ethylenoxiden. Die Viskosität der Ausgangssubstanz beträgt 425 mPa*s. Der pH-Wert einer 5%igen wässrigen Polysorbat 80 Lösung liegt sich zwischen 5-7 und die kritische Micellbildungskonzentration (CMC) beträgt 1,2·10-5 mol/l in Wasser bei 25°C. Polysorbat 80 wird auch in Lebensmitteln als Emulgator und Stabilisator benutzt. Es ist chemisch und biologisch weitgehend inert und als Lebensmittelzusatzstoff E 433 zugelassen. Zudem handelt sich bei Polysorbat 80 um eine der wenigen oberflächenaktiven Substanzen, die parenteral verträglich ist. Studien zeigten, dass die Polysorbat auf Grund einer mittleren letalen Dosis von LD₅₀ = > 471 mg/l in 96 h bei Fischen keine Gefahr für Fauna und Flora darstellt.
Weitere Polysorbate sind für die Herstellung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung geeignet, etwa

• Polysorbat 20 (Polyoxyethylen-(20)-sorbitanmonolaurat), E 432
• Polysorbat 21 (Polyoxyethylen-(4)-sorbitanmonolaurat)
• Polysorbat 40 (Polyoxyethylen-(20)-sorbitanmonopalmitat), E 434
• Polysorbat 60 (Polyoxyethylen-(20)-sorbitanmonostearat), E 435
• Polysorbat 61 (Polyoxyethylen-(4)-sorbitanmonostearat)
• Polysorbat 65 (Polyoxyethylen-(20)-sorbitantristearat), E 436
• Polysorbat 80 (Polyoxyethylen-(20)-sorbitanmonooleat), E 433
• Polysorbat 81 (Polyoxyethylen-(5)-sorbitanmonooleat)
• Polysorbat 85 (Polyoxyethylen-(20)-sorbitantrioleat),
• Polysorbat 120 (Polyoxyethylen-(20)-sorbitanmonoisostearat)

Bevorzugt sind Polysorbate, die als Lebensmittelzusatzstoffe zugelassen sind (also solche mit E-Nummer), insbesondere für die Applikation an Schleimhäuten.
Die offenbarte Zusammensetzung umfasst ferner bevorzugt mindestens ein Plastifizierungsagens. Plastifizierungsmittel im Sinne von Quellmitteln steigern die Plastizität einer Masse, wobei Plastizität im Allgemeinen als die Verformbarkeit eines Feststoffes oder einer viskosen Flüssigkeit definiert wird. Plastifizierungsagentien, auch als Weichmacher bezeichnet, nehmen während der Gelherstellung Teile des zugeführten Zubereitungswassers auf und erhöhen infolge ihrer Quellfähigkeit die Bildsamkeit der Masse. Zur Erzielung optimaler Applikationseigenschaften der erfindungsgemäßen Polymerzusammensetzung war der Zusatz geeigneter plastifizierender Agentien in der Rezeptur hilfreich. In einer bevorzugten Ausführung wird auf die Nutzung von Phthalat-basierenden Weichmachern aufgrund gesundheitlicher Bedenken verzichtet. Geeignete Plastifizierungsagentien sind z.B. Phthalsäureester, Triglyceride z.B. Öle, Fettsäuren, Glycerol und Sorbitol, bevorzugt Glycerol. Z.B. kann 2 Gew. % Glycerol als Plastifizierungsagens enthalten sein.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann eine Carbonsäure, z.B. Essigsäure umfassen. Bei Zusammensetzungen auf Chitosanbasis ist üblicherweise immer eine Carbonsäure enthalten.
Die Zugabe einer Carbonsäure zu einer wässrigen Alginatlösung ist z.B. möglich, um die Viskosität des Gels der Viskosität eine synthetischen Gels anzupassen. Anstelle der Essigsäure wäre die Erhöhung des Alginat - Anteils, z.B. auf etwa 5 Gew. % möglich.
So werden z.B. bei einem pH-Wert < 5 freie Carboxylat (COO-) -Gruppen innerhalb der Alginatpolymere protoniert, was eine Reduzierung der elektrostatischen Abstoßung zwischen den Ketten bewirkt. Infolgedessen rücken die einzelnen Alginatketten näher zusammen und können Wasserstoffbrückenbindungen ausbilden, was zu einer erhöhten Viskosität der Alginatlösung führt. Bei pH-Werten zwischen 3 und 4 bilden Alginatlösungen feste Gele.
Erfindungsgemäß ist die Carbonsäure bevorzugt eine wasserlösliche Carbonsäure.
Die Auflösung von Chitosan erfolgt in einem sauren Milieu. Hier ist die Verwendung einer Säure, bevorzugt einer Carbonsäure, essenziell, um den pH-Wert zunächst auf einen Wert zwischen 2 und 3 zu reduzieren. Nach der Auflösung des Chitosans erfolgt die Gelierung.
In einer bevorzugten Ausgestaltung wird die Carbonsäure aus einer Gruppe ausgewählt, die Carbonsäuren mit 1-4 Kohlenstoffatomen umfasst, also Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure oder Buttersäure. In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung ist die erfindungsgemäße Carbonsäure Essigsäure und macht in dem finalen Polysaccharid-Hydrogel einen Anteil von 0,5-3 Gew. % aus, wobei die Essigsäurekonzentration in Alginatpolymer-Hydrogelen bevorzugt bei ungefähr 1 Gew. % und in Chitosan-Hydrogelen bevorzugt bei ungefähr 2 Gew. % liegt. Der Begriff „ungefähr“ sollte als +/- 10% der Bezugsgröße, also hier +/- 0,2 Gew. % verstanden werden. Die erfindungsgemäße Carbonsäure kann alternativ eine wasserlösliche Hydroxycarbonsäure sein (z.B. Citronensäure oder Weinsäure). Weiterhin kann in einer alternativen Ausgestaltung eine geeignete Mineralsäure anstatt einer Carbonsäure der Polysaccharidzusammensetzung zugeführt werden (z.B. Phosphorsäure).
Ferner kann die erfindungsgemäße Zusammensetzung Ethanol oder ein anderes biokompatibles organisches Lösungsmittel enthalten, bevorzugt Ethanol (z.B. 70 v/v % Ethanol in Wasser), z.B. in einem Anteil von 2-8 Gew.% oder 2-6 Gew.%, bevorzugt 2-3 Gew.%. Das Ethanol erleichtert vor allem die Zugabe des Nystatins, erhöht aber auch die Haltbarkeit.
Viskosität
Als vorteilhaft im Rahmen der Erfindung haben sich Zusammensetzungen mit einer Viskosität η von 2000-8000 mPas*s, bevorzugt 4000-7000 mPas*s oder auch 5000-6000 mPas*s erwiesen, gemessen mit einem Rotationsviskosimeter bei einer Messtemperatur von 32°C und einer Schergeschwindigkeit von 40 U/min. Die gewählte Messtemperatur von 32°C entspricht der ungefähren mittleren Hauttemperatur von 32-34°C eines gesunden Menschen. Die Schergeschwindigkeit beschreibt bei Flüssigkeiten die räumliche Veränderung der Flussgeschwindigkeit. Im Zuge der Erfindung wurden verschiedene Viskositätswerte für unterschiedliche Schergeschwindigkeiten ermittelt (siehe experimenteller Teil), und die Viskosität optimiert.
Studien haben gezeigt, dass sich die Gelierungsprozesse unter- und oberhalb eines pH-Werts von etwa 7 voneinander unterscheiden. Dies spiegelt sich in den resultierenden Eigenschaften der Gele in Bezug auf ihre Stabilitäten und Viskosität wider. So kann z.B. ein Absenken des pH-Werts durch Zugabe einer geeigneten Säure die Viskosität einer wässrigen Alginatlösung kontinuierlich erhöhen. Wässrige Alginatlösungen formen Gele bei einem pH-Wert zwischen 3 und 4 (Qin, 2008, Polym Int 57, 171-180; siehe weiter unten). Der pH-Wert der erfindungsgemäßen Polysaccharidzusammensetzung liegt bevorzugt bei 4,5-7, besonders bevorzugt bei 5-6. Alginatgele ohne Säure haben typischerweise einen pH von etwa 6,5-7, bevorzugt etwa 6,8. Bei Zugabe einer Säure liegt der pH-Wert bei ca. 5-6, z.B. etwa 5,5.
Das Alginatgel weist ohne die Zugabe einer Säure einen pH-Wert von 6,8 auf. Durch die Zugabe einer Säure hingegen einen pH-Wert von 5,5.
Der pH-Wert erfindungsgemäßer Chitosangele liegt im Allgemeinen bei etwa 4-5, bevorzugt bei etwa 4,5.
Zusammensetzungen
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung weist z.B. einen Polysaccharidanteil von 1-5 Gew. %, optional 1-3 Gew. %, bevorzugt 2-2,5 Gew. % auf, bevorzugt einen solchen Alginatanteil. Bei einem gleichzeitigen Wasseranteil von 85-93 Gew. % weist die Zusammensetzung eine optimale Fließeigenschaft auf und ermöglicht eine gleichmäßige Verteilung auf den betroffenen Haut- bzw. Schleimhautpartien.
In einer Ausführungsform umfasst die erfindungsgemäße Zusammensetzung folgende Bestandteile oder besteht bevorzugt daraus:

- 1-5 Gew. %, bevorzugt 1,5-2,5 Gew. % Polysaccharid, also Alginatpolymer oder Chitosan,
- 0-2 Gew. % Nystatin (bzw. bei einem Gel auf Chitosanbasis 0,1-2 Gew. % Nystatin), bevorzugt 0,1-0,45 Gew. Nystatin,
- 0-3 Gew. % biokompatibles Lösungsmittel, z.B. Ethanol, wobei bevorzugt Lösungsmittel enthalten ist, wenn Nystatin vorliegt,
- 0-3 Gew. % Plastifizierungsagens, z.B. Glycerol,
- 1-2,5 Gew. % oberflächenaktive Substanz, z.B. Polysorbat,
- 0-3% Carbonsäure, z.B. Essigsäure, und
- Wasser, z.B. ad 100 Gew. %. Bevorzugt ist das Polysaccharid ein Alginatpolymer.

Beispielsweise wird für ein erfindungsgemäßes Alginatgel für die Herstellung von 100 g Gel 3,0 g Ethanol, 2,5 g Natriumalginat, 0,45 g Nystatin, 135 g destilliertes Wasser, 0,5 g Essigsäure und 2,16 g Polysorbat 80 eingesetzt, wobei ein Teil des Wassers beim Kochen verdampft.
Beispielsweise wurde für ein erfindungsgemäßes Chitosangel für die Herstellung von 100 g Gel 3,0 g Ethanol, 5 g Chitosan, 5 g Essigsäure, 0,45 g Nystatin, 2,16 g Polysorbat 80 und 135 g destilliertes Wasser eingesetzt, wobei ein Teil des Wassers beim Kochen verdampft.
Herstellung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung
Die vorliegende Erfindung lehrt ferner ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst:

a) Dispergieren des Polysaccharids in einer wässrigen Lösung, bevorzugt Wasser, bevorzugt bei einer Temperatur von 70-100°C, um eine Polysaccharidzubereitung zu erhalten,
b) optional, Zugeben einer Säure, bevorzugt einer Carbonsäure, wobei der Anteil der Säure in dem Endprodukt eine Konzentration von 1-3 % umfasst,
c) Abkühlen der Polysaccharidzubereitung auf 18-45°C, bevorzugt etwa 25°C,
d) optional, Beimischen eines Plastifizierungsagens in die Polysaccharidzubereitung,
e) optional, Beimischen von Nystatin, bevorzugt einer Nystatin-Suspension, in die Polysaccharidzubereitung,
f) optional, Beimischen einer oberflächenaktiven Substanz, bevorzugt eines Polysorbats, z.B. Polysorbat 80, in die Polysaccharidzubereitung, und

In einer bevorzugten Ausführungsform lehrt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst:

a) Dispergieren des Polysaccharids, z.B. eines Alginatpolymers, in Wasser bei einer Temperatur von 70-100°C, um eine Polysaccharidzubereitung zu erhalten,
b) Zugeben einer Säure, bevorzugt einer Carbonsäure , wobei der Anteil der Säure in dem Endprodukt eine Konzentration von 1-3 % umfasst,
c) Abkühlen der Polysaccharidzubereitung auf 18-30°C,
d) Beimischen eines Plastifizierungsagens in die Polysaccharidzubereitung,
e) optional, Beimischen von Nystatin, bevorzugt einer Nystatin-Suspension, in die Polysaccharidzubereitung,
f) Beimischen einer oberflächenaktiven Substanz, bevorzugt eines Polysorbats, z.B. Polysorbat 80, in die Polysaccharidzubereitung.

In Schritt a) kann das Wasser zunächst bei einer Temperatur von 100°C zum Kochen gebracht werden, um mögliche Keime abzutöten. Keime umfassen Mikroorganismen, mit dem Potential, ein Subjekt zu infizieren und Krankheiten zu erregen, darunter Bakterien oder Pilze. Die Dauer des Abkochens richtet sich unter anderem nach dem Luftdruck in der Umgebung. Generell ist eine Abkochzeit von mindestens 3 min empfohlen, z.B. 5-10 min. Ein Abkochen ist jedoch nicht nötig, z.B. wenn die Wahrscheinlichkeit dafür, dass Keime in dem Wasser vorliegen, gering ist.
Das Wasser kann, z.B. im Anschluss an das Kochen, auf eine Temperatur zwischen 60 und 80°C reduziert werden, um das gewählte Polysaccharid, z.B. Alginat, in dem Wasser zu dispergieren. Das Polysaccharid sollte schrittweise und Rühren, bevorzugt konstantem Rühren dem Wasser zugeführt werden, um ein Verklumpen des Polysaccharids zu verhindern. Z.B. kann bei ca. 200-600 U/min, bevorzugt etwa 400 U/min gerührt werden. Die erhaltene Lösung sollte einen Polysaccharidanteil von bevorzugt 1,5-3 Gew. %, besonders bevorzugt 2-2,5 Gew. % besitzen.
Sodann wird optional eine Säure, bevorzugt eine Carbonsäure zur Erhöhung der Viskosität hinzugegeben, wobei der Anteil der Säure, z.B. Carbonsäure, in dem Endprodukt eine Konzentration von 1-3 % ist. Die Carbonsäure in Schritt b) ist bevorzugt eine wasserlösliche Carbonsäure, z.B. eine C1-C4-Carbonsäure. Mit Essigsäure wurden gute Ergebnisse erhalten. Die Carbonsäure, z.B. Essigsäure, kann in der Polysaccharidzubereitung einen Anteil von 0,5-3 Gew. % ausmachen, bei Alginatpolymerzubereitungen bevorzugt ungefähr etwa 1 Gew. % und bei Chitosanzubereitungen bevorzugt etwa 2 Gew. %.
Während der Zugabe der Carbonsäure kann der pH-Wert der Polysaccharidlösung mit geeigneten Mitteln überprüft werden, z.B. mit Hilfe eines pH Meters oder pH-Indikatorpapiers. Bei Alginatgelen erhöht die Zugabe der Säure, bevorzugt der Carbonsäure, die Viskosität. Als vorteilhaft hat sich eine Absenkung des pH-Wertes auf ca. 5-6, z.B. etwa 5,5 gezeigt. Bei Chitosan ist ein nierdriger pH-Wert für die Gelierung nötig. Hier muss der Einsatz der Essigsäure oder einer anderen Säure erfolgen, damit die Gelierung erfolgt. Optional bietet es sich an, zunächst einen pH-Wert von 4 für den Gelierungsprozess einzustellen.
Zweckmäßigerweise erfolgt Schritt a) bevorzugt vor Schritt b). In Schritt b) ist die Temperatur gegenüber Schritt a) im Allgemeinen bereits reduziert. Es ist grundsätzlich auch möglich, zunächst Wasser und Carbonsäure zu mischen und dann das Polysaccharid dazuzugeben, dies ist jedoch nachteilig, da man zu Beginn meist bei höheren Temperaturen arbeitet.
In Schritt c) wird die Temperatur auf 18-45°C, z.B. Raumtemperatur oder etwa 25°C verringert. Alginatlösungen sollten nur für eine begrenzte Zeit Temperaturen von über 50°C ausgesetzt werden, da so hohe Temperaturen schon nach wenigen Stunden irreversible Depolymerisierungsprozesse auslösen. Des Weiteren beeinflusst die Temperatur die Stabilität von Wirkstoffen, die der Polysaccharidzubereitung in den folgenden Schritten zugeführt werden können.
In Schritt d) wird optional ein Plastifizierungsagens in die Polysaccharidzubereitung beigemischt. Dies kann in einem der Schritte a-f, davor oder dazwischen erfolgen, z.B. in das Wasser vor Schritt a. Bevorzugt kann das Plastifizierungsagens vor der Zugabe der Wirkstoff-Suspension zugefügt werden. Es kann z.B. etwa 2 Gew. % Glycerin als Plastifizierungsagens eingesetzt werden.
In Schritt e) kann der Polysaccharidzubereitung Nystatin beigemischt werden, wenn ein Wirkstoffgehalt erwünscht ist. Da Nystatin in Wasser weitgehend unlöslich ist, wird das Nystatin zunächst in Ethanol suspendiert, z.B. in einem Gemisch mit einem Verhältnis von 70 Anteilen 96% Ethanol zu 30 Anteilen Wasser, bevor es der Polysaccharidzubereitung beigemischt wird. Alternativ kann das Nystatin auch z.B. in einem anderen geeigneten biokompatiblen Lösungsmittel gelöst werden. Die finale Polysaccharidzusammensetzung umfasst, wenn Wirkstoff vorhanden ist, z.B. 0,1-2 Gew. %, mehr bevorzugt 0,15-0.45 Gew. %, besonders bevorzugt 0,2-0,4 Gew. % Nystatin. In der am meisten bevorzugten Ausgestaltung umfasst die Zusammensetzung, z.B. auf Alginatbasis, 0,30-0,35 Gew. % Nystatin. Die Zugabe des Nystatins sollte bevorzugt bei 18-45°C, z.B. etwa 25°C erfolgen. Das Nystatin sollte langsam zugegeben werden. Rühren z.B. bei 200-700 U/min, bevorzugt etwa 600 U/min unterstützt die homogene Verteilung des Wirkstoffs. Durch die Zugabe des Nystatins vor endgültiger Ausbildung des Hydrogels wurde ein homogener Einschluss des Wirkstoffs in die Gelmatrix erreicht.
Das Herstellungsverfahren der erfindungsgemäßen Zusammensetzung ohne Nystatin erfolgt nach dem gleichen Prinzip, wobei in Schritt e) der Polysaccharidzubereitung kein Wirkstoff zugeführt wird. Es kann in diesem Fall auf die Zugabe von Ethanol verzichtet werden.
Vor der Zugabe der oberflächenaktiven Substanz in Schritt f) ist es sinnvoll, die Polysaccharidzubereitung für mindestens 15 min, z.B. mindestens 30 min, bevorzugt für 1 h bei Raumtemperatur, z.B. bei etwa 25°C zu rühren, um eine möglichst hohe Homogenität, d.h., Gleichmäßigkeit der Polysaccharidzubereitung zu erzielen.
In Schritt f) wird die oberflächenaktive Substanz der Polysaccharidzusammensetzung bevorzugt schrittweise und unter konstantem Rühren zugeführt, wobei die oberflächenaktive Substanz bevorzugt ein Polysorbat, z.B. Polysorbat 80 ist. Die finale Polysaccharidzubereitung sollte bevorzugt 1-2,5 Gew. % Polysorbat 80 umfassen, z.B. 1,5-1,75 Gew. %.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann verpackt werden, z.B. in eine Tube, eine Dose oder einen sonstigen verschließbaren Behälter. Üblicherweise wird bei oder vor der Umverpackung ein Beipackzettel mit Instruktionen zur Anwendung der Zusammensetzung zur Behandlung von Mykosen, z.B. oralen oder kutanen Mykosen, hinzugefügt.
Die vorliegende Erfindung stellt auch eine Zusammensetzung zur Verfügung, die durch das hierin beschriebene Verfahren erhältlich ist.
Im Zusammenhang mit der Erfindung wurden verschiedene Verfahren zur Herstellung von Hydrogelen auf Polysaccharidbasis mit oder ohne antimykotischen Wirkstoff getestet. Die oben beschriebene Methode hat sich als vorteilhaft gegenüber alternativen Verfahrensprozessen erwiesen, z.B. der ionotropen Gelierung oder der Herstellung von Mikropartikel-Hydrogelen. Im Vergleich ist das offenbarte Verfahren schneller, unkomplizierter, und kosteneffizienter und führt zu einem Endprodukt mit vergleichbarer oder sogar höherer Stabilität. Darüber hinaus ermöglicht die erfindungsgemäße Zusammensetzung die Verwendung von deutlich niedrigeren Wirkstoffkonzentration als bei vergleichbaren handelsüblichen nystatinhaltigen Gelen oder Salben bei oftmals höherer Wirkung. Ferner benötigt die erfindungsgemäße Zusammensetzung eine niedrigere Wirkstoffkonzentration als vergleichbare Produkte aus der zitierten wissenschaftlichen Literatur. Durch die erfindungsgemäße einzigartige, pharmazeutische Zusammensetzung als topische Applikationsform aus dem in eine Biomatrix eingebetteten Antimykotikum gelingt es, empfindliche Wirkstoffe wie Nystatin vor äußerlichen Einflüssen wie Sauerstoff zu schützen und resultierend hieraus eine verlängerte Lagerfähigkeit und Stabilität der Ingredienzien zu gewährleisten. Zudem ist durch den Wirkstoffeinschluss eine Wechselwirkung zwischen Wirkstoff und Biopolymer möglich. Auf diesem Wege ist eine effektivere, für den Patienten schonendere und länger anhaltende antimykotische Wirkung zu realisieren.
Sämtliche hier zitierte Literatur wird hiermit vollständig einbezogen. Die vorliegende Erfindung wird durch das folgende Beispiel weiter veranschaulicht, aber nicht beschränkt.
Legende

1: Nystatin (3-(4-amino-3,5-dihydroxy-6-methyl-tetrahydropyran-2-yl)oxy 19,25,27,29,32, 33,35,37-octahydroxy-18,20,21-trimethyl-23-oxo-22,39 dioxabicyclo [33.3.1] nonatriaconta 4,6, 8,10,14,16- hexaen-38-carbonsäure)
2: Fließschema zur Herstellung eines Natriumalginatpolymer-Hydrogels
3: Absorptionsspektrum Nystatin in Ethanol (96%) -Wasser (70:30) (Jasco V 630)
4: Viskositäten des Biopolymergels im Vergleich zum synthetischen Gel, T 32 °C. Die höchste Viskosität bei allen Schwergeschwindigkeiten ergibt sich bei dem synthetischen Gel (Lutrol F, Artikelnummer: 12751632903, Firma: BASF SE), die niedrigste bei dem nicht optimierten Biopolymergel, ohne Essigsäure hergestellt. Die Viskosität des optimierten Biopolymergels mit Essigsäure und pH von 5,5 liegt in der Mitte.
5: Wachstumshemmung von C. albicans durch Testsubstanzen
6: Antimikrobiologische Wirkung gegenüber Candida albicans. Biopolymergel bezieht sich auf ein Natriumalginatpolymer-Gel (mit oder ohne Wirkstoff). Die Negativkontrolle ist Ethanol, die Positivkontrolle Wirkstofflösung (100 mg/l). Der Wirkstoff ist Nystatin. Die Abbildung zeigt den aus den Fünffachmessungen resultierenden Mittelwert.
7: Natriumalginatpolymer-Gel bzw. Chitosan-Gel und Handelsprodukte gegenüber Candida albicans A: Nystatin acis - Mundgel; B: Nystatin acis -Creme, C: Bifon - Gel, D: Lamisil - Creme, E: Bifon - Creme, F: Mykosert - Creme, Chitosan-Gel ohne Wirkstoff, H: Chitosan-Gel mit Nystatin, I: Alginat-Gel ohne Wirkstoff, J: Alginat-Gel mit Nystatin.

Beispiele
Herstellung und Charakterisierung von Alginatpolymer- und Chitosan Hydrogelen zur topischen Behandlung von Candida albicans
Herstellung eines Polysaccharid-Hydrogels auf Natriumalginat-basis
Für die Herstellung eines homogenen Hydrogels auf Polysaccharidbasis wurden 92 Gew. % Wasser in einem Becherglas auf 100°C erhitzt, wobei schnell, z.B. bei 750 U/min gerührt wurde. Gew. % beziehen sich auf den Anteil an dem gewünschten Endprodukt. Anschließend wurde das Wasser optional auf etwa 80°C heruntergekühlt, optional wurde auch mit siedendem Wasser weitergearbeitet. Daraufhin wurden 2,1 Gew. % Natriumalginatpulver (Artikelnummer: 435226212 Firma: Roth-Chemie) bzw. 2,5 Gew. % Chitosanpulver (Artikelnummer: 9012-76-4, Firma: Sigma Aldrich) dem Wasser unter konstantem Rühren, z.B. mit einer Umdrehungsgeschwindigkeit von 750 U/min beigemischt, wobei die Zugabe des Polysaccharids schrittweise und so langsam erfolgte, dass ein Verklumpen des Pulvers im Wasser vermieden wurde.
Die Konzentration des Natriumalginats bzw. des Chitosans in dem Endprodukt lag allgemein bei 1-5 Gew. %, bevorzugt bei 1,5-2,5 Gew. %, besonders bevorzugt bei 2-2,3 Gew. %.
Zur Erhöhung der Viskosität wurden der Polysaccharidzubereitung 1-3 Gew.% einer C1-C4 Carbonsäure beigemischt, wobei es sich bei der Carbonsäure typischerweise um Essigsäure (Artikelnummer: 7332.2, Firma: Roth-Chemie,) handelte. Alternativ können auch andere Säuren eingesetzt werden z.B. Citronensäure oder Phosphorsäure, wobei der pH bei einem Alginatgel von anfänglich ca. 6,8 auf ca. 5 reduziert wird. für den Gelierungsprozess verwendet werden. Die finale Konzentration der Carbonsäure in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung lag bei 1-3 Gew. %, bei Alginat bevorzugt bei etwa 1%, bei Chitosanzubereitung bevorzugt bei etwa Gew.2%. So wird bei hierin beschriebenem Hydrogel auf Basis von Alginat z.B. 1 Gew. % Essigsäure hinzugegeben.
Nach der vollständigen Auflösung des Polysaccharids wird die Temperatur langsam auf 18-45°C, bevorzugt Raumtemperatur, z.B. 25°C, abgekühlt. Dabei kann die Umdrehungsgeschwindigkeit z.B. auf 400 U/min verringert werden.
Es wurden 0,30 Gew. % Nystatin mit 3 Gew. % Ethanol (96%, vergällt) /Wasser (Mischverhältnis 70:30) unter langsamem Rühren vermischt. Die Nystatinsuspension wurde der Polysaccharidbereitung bei einer Umdrehungsgeschwindigkeit von 600 U/min langsam beigemischt. Die finale Nystatinkonzentration in dem Polysaccharidgel lag bei 0,15 bis 0,4 Gew. %, wobei eine hervorragende antimykotische Aktivität bei Nystatinkonzentrationen z.B. bei 0,3 - 0,35 Gew. % beobachtet wurde. Das erhaltene kolloidale System wurde unter konstantem Rühren für einen geeigneten Zeitraum homogenisiert, z.B. für 30 min bis 4 Stunden, typischerweise für etwa eine Stunde. Die Herstellung der Alginatgele ohne Wirkstoff verläuft identisch, jedoch ohne den Schritt der Wirkstoffzugabe. Hierfür wird lediglich der entsprechende Anteil Ethanol zugegeben.
Zum Schluss erfolgte die tropfenweise Zugabe von 1,6 Gew. % Polysorbat 80 (Artikelnummer: 51303225, Firma: Caesar & Loretz GmbH), und ein weiteres Rühren für einen geeigneten Zeitraum z.B. etwa 30 min.
Das Gel sollte bis zur Verwendung bei 4 bis 6°C gelagert werden, um die Lagerstabilität zu erhöhen.
Herstellung eines Polysaccharid-Hydrogels auf Chitosanbasis
Zu Beginn der Herstellung wurden 90,6 Gew. % Wasser in ein Becherglas vorgelegt und unterlangsamen Rühren mit einer Umdrehungsgeschwindigkeit z.B. von 250 U/min gewirbelt. Die Temperatur wurde dabei auf 80°C eingestellt. Anschließend wurden 2 Gew. % Chitosan mittels Analysenwaage eingewogen und langsam dem rührenden Wasser zugegeben, es erfolgte die Zugabe von 2,5 Gew. % Essigsäure. Nach der vollständigen Auflösung des Biopolymers wurde die Umdrehungsgeschwindigkeit auf z.B. 400 U/min eingestellt und die Temperatur auf etwa 25°C abgekühlt. In einem zweiten Becherglas wurde 3 Gew. % Ethanol vorgelegt. Anschließend wurden 0,30 Gew. % Nystatin eingewogen und dem Ethanol unter langsames Rühren hinzugefügt. Dies erleichtert später die Zugabe des Wirkstoffs zum Biopolymer. Hat das Biopolymergel 25°C erreicht, wurde die Nystatin/Ethanol-Suspension dem Gel langsam unter schnellerem Rühren z.B. bei 600 U/min hinzugefügt. Das kolloidale System wurde nun zur Homogenisierung z.B. 1h gerührt. Zum Schluss erfolgte die tropfenweise Zugabe von 1,6 Gew. % Polysorbat 80 und ein weiteres Rühren für z.B. 30 min. Die Herstellung des Chitosan-Gels ohne Wirkstoff verlief identisch, jedoch ohne den Schritt der Wirkstoffzugabe. Hierfür wurde lediglich der Anteil an Ethanol zu dem Chitosan-Gel zugegeben.
Bestimmung der Viskosität
Die Viskositätsmessung erfolgte an dem Rotationsviskosimeter der Firma Brookfield (Exakte Instrumentbezeichnung). Die Auswahl der Spindel richtete sich auf den Messbereich der Proben. Da es sich um ein Gel mit einer etwas höheren Viskosität handelt, wurde eine Spindel gewählt, die einen Messbereich von 1.000 bis 200.0000 mPas abdeckt.
Als Vergleich wurde ein synthetisches Gel (Lutrol F 127 Artikelnummer: 51632903 der Firma: BASF Aktiengesellschaft) verwendet.
Die Messung wurde bei einer spezifischen Hauttemperatur von 32 °C und unterschiedlichen Schergeschwindigkeiten durchgeführt. Diese Messung wurde durchgeführt, um das Viskositätsverhalten der Gele bei Hauttemperatur zu analysieren und Aussagen über eine mögliche Anwendbarkeit des Gels als topische Applikationsform machen zu können.

Mit dem Absenken des pH-Werts wurde die Viskosität des Biopolymergels der Viskosität synthetisch hergestellter Gele angenähert (Tab. 1 und 3). Tabelle 1: Viskositäten des in Bespiel 1 hergestellten erfindungsgemäßen Natriumalginatgels im Vergleich zum synthetischen Gel, T= 32°C

Geschwindigkeit [U/min]	Alginatpolymer optimert η [mPas]	S [%]	Abs. Fehler η [mPas]	Synthes. Gel η [mPas]	S [%]	Abs. Fehler η [mPas]
0,50	12820,00	4	x ± 360,05	15830,00	6	x ± 504,61
1,00	11220,00	4	x ± 135,77	14553,33	2	x ± 188,77
2,00	9653,33	5	x ± 169,15	13566,67	2	x ± 156,24
10,00	7910,00	4	x ± 130,13	12120,00	3	x ± 185,20
20,00	6966,67	2	x ± 127,19	11096,67	5	x ± 324,57
40,00	5580,00	4	x ± 217,33	10200,00	5	x ± 291,43
80,00	4056,67	9	x ± 306,45	8313,33	9	x ± 426,82
100,00	2703,33	14	x ± 220,18	4730,00	10	x ± 265,14

S= Standardabweichung in [%]

Stresstest
Die Haltbarkeit von Arzneimitteln ist in den Richtlinien der Arbeitsgemeinschaft für Pharmazeutische Verfahrenstechnik e.V. (APV) national geregelt. Nach der APV-Richtlinie ist die „Haltbarkeit und Stabilitätsprüfung von Arzneimitteln“ folgendermaßen definiert:

„Haltbarkeit bedeutet spezifikationsgerechte Qualität des Arzneimittels bis zum Ende der vom Hersteller festgelegten Laufzeit. Die Qualität des Arzneimittels wird dabei durch den Wirkstoffgehalt und die Reinheit, die sensorisch wahrnehmbaren, die physikalisch-chemischen und die mikrobiologischen Eigenschaften bestimmt [66] ...“

Ein Stresstest bezeichnet einen Test, bei dem Reaktionen einer Substanz auf Stress wie erhöhte Beanspruchung und Belastung gemessen werden. Resultierend aus diesen Ergebnissen können Aussagen über die Zusammensetzung des Gels getätigt werden.
Der Stresstest wurde anhand der Methoden der Wärme-Kälte-Zyklen und der Gefrier-Tau-Zyklen durchgeführt.
Wärme-Kälte-Zyklen: Die Proben wurden Lager- Temperaturen von +6 °C im Kühlschrank bis +45 °C im Trockenschrank im Wechsel ausgesetzt. Das Temperaturprofil wurde dabei so gewählt, dass die höchste bzw. die niedrigste Temperatur im Wechsel kontinuierlich über eine Zeit von 24 h angesteuert wurden. Jede Zubereitung wurde dabei 10 Temperaturzyklen unterzogen und schließlich nach einer Lagerungszeit von 20 Tagen analysiert.
Gefrier-Tau-Zyklen: Die Proben wurden jeweils im 24 h-Takt im Wechsel bei einer Raumtemperatur von 22 °C ± 2 °C und im Gefrierfach bei -22 °C eingelagert. Die Einlagerung umfasste hier ebenfalls 10 Temperaturzyklen.
Es lässt sich demnach festhalten, dass die Stabilität des Biopolymergels bei kühlen Temperaturen (optimal bei 4 bis 6 °C), unabhängig von seiner Beladung, für mind. 8 Wochen gegeben ist. Temperaturen über 20 °C zerstörten das Matrixgerüst zunehmend und führten zu einer Separation der Wirkstoff-Gelkomponenten innerhalb der ersten 2 Wochen, Alginatgele ohne Wirkstoff zeigten hingegen auch bei Raumtemperaturen keine Veränderungen innerhalb der untersuchten Lageroptionen für einen Zeitraum von über 8 Wochen.
Lichtmikroskopie
Es erfolgte eine optische Beurteilung der einzelnen Hydrogel-Dünnschicht hinsichtlich des Aussehens, und der Konsistenz. Hierfür wurde das Mikroskop Motic 3000 bei einer 10-fachen Vergrößerung verwendet. Es wurden Gele mit und ohne Wirkstoff hergestellt sowie Gele mit und ohne Polysorbat 80, um die Aktivität der Gele mit und ohne Zugabe eines Tensids einschätzen zu können. Erkennbar war bei allen Gelrezepturen eine homogene Struktur ohne Flocken, Klumpen oder Körnungen.
Das Natriumalginat-Gel mit lediglich 1,6 % Polysorbat zeigte eine cremeartige und homogene, weiß-transparente Konsistenz. Bei Erhöhung des Polysorbat-Anteils auf 2,2 % fiel auf, dass die Farbe des Gels noch weiter in das Weißliche überging. Das Gel ließ sich leicht verteilen und haftete an der Glasoberfläche. Gele mit Nystatin erschienen in der für das Nystatin üblichen gelben Farbe. Das Gel ohne Polysorbat erschien transparent mit einer schwach ausgeprägten gelblichen Farbe. Die Gele mit Nystatin bilden eine emulsionsartige Struktur, da der Wirkstoff fein verteilt mit einem Porendurchmesser von ca. 30 µm in der Gelmatrix erscheint, was darauf schließen lässt, dass sich der Wirkstoff in den Zwischenräumen des Gels platziert hat.
Vorteile der Polysorbat-Zugabe ergeben sich vor allem durch eine einfache, länger andauernde Wirkstoffdiffusion aus dem Gerüst. Auch kann dadurch eine homogenere Verteilung des Wirkstoffs erreicht werden, da dieser sich innerhalb der Matrix befindet und nicht angehäuft vorliegt. Bei der Präparation ist dies insofern von Vorteil, dass das Gel homogener ist und man bei einer Befüllung der möglichen Applikationsform in beispielweise Tuben besser sicherstellen kann, dass sich der Wirkstoff überall innerhalb des Gels befindet und nicht ausfallen kann.
Auch in dem Chitosan-Gel lag eine gleichmäßige und homogene Gelstruktur vor.
Freisetzung des Wirkstoffes und quantitative Bestimmung des Nystatins
Sowohl zur Gehaltsbestimmung des Wirkstoffs im Polysaccharid als auch zum Nachweis der Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen musste der Wirkstoff, der in den Polysacchariden eingeschlossen wurde, möglichst quantitativ freigesetzt werden.
Es wurde eine Kalibriergerade für den Wirkstoff Nystatin in dem Konzentrationsbereich von 1 mg/l bis 100 mg/l mittels des Photometers Jasco V 630 erstellt. Als Lösemittel wurde ein Gemisch aus Ethanol-Wasser (Mischverhältnis 70:30) verwendet. Das Absorptionsmaximum von Nystatin liegt laut Literatur zwischen 304 und 305 nm (4).
Bei einer topischen Applikation von aktiven Wirkstoffen ist es wichtig, dass die Wirkstoffe in die Zielhautschichten penetrieren, in denen sie ihre Wirkung ausüben können. Es wird zwischen Stratum corneum (SC)-Absorption, dermaler Absorption und perkutaner Penetration unterschieden. Die SC-Absorption charakterisiert die Menge der topisch applizierten Substanz, die in dem SC verbleibt. Diese gilt als nicht systemisch verfügbar. Dermale Absorption beschreibt die Substanzmenge, die in die Epidermis und Dermis diffundiert.
Zur quantitativen Bestimmung der Wirkstoffe in den erfindungsgemäßen Polysaccharidrzusammensetzungen und zum Nachweis der physiologischen Wirksamkeit der Zusammensetzungen erfolgte die Betrachtung der Wirkstofffreisetzung mittels der sogenannten Franz-Diffusionszellen-Methode nach der Prüfrichtlinie 428 der OECD, 2004. Während der Untersuchung wird die gesamte Messzelle auf die physiologische Hauttemperatur von 32 °C temperiert. Durch regelmäßige Probennahme aus dem Akzeptorkompartiment kann die Permeation einer Substanz über den gewählten Zeitraum durch die Haut hindurch mittels einer anschließenden analytischen Untersuchung, wie beispielsweise der UV-Vis-Spektroskopie, verfolgt werden. Im Vergleich zur eingesetzten Konzentration des Wirkstoffes bei der Herstellung der verschiedenen Zusammensetzungen betrug die Wiederfindungsrate des nach der Freisetzung gefundenen Wirkstoffes etwa 96 %.
Mikrobiologische Untersuchung der pharmazeutischen Zusammensetzungen
Die Einführung eines neuartigen, wirkstoffhaltigen Materials gegenüber möglichen pathogenen Hefeformen erfordert neben pharmakologischen Untersuchungen ebenfalls mikrobiologische Untersuchungen in vitro. Studien zur Aussagekraft über Wirksamkeit sind hier von großer Bedeutung und erfordern ein reproduzierbares, methodisches Verfahren. Hierfür wurde die effektive Wirkung der entwickelten Zusammensetzungen gegenüber pathogenen, aeroben Hefen in einem mikrobiologischen Labor mithilfe der in der Mikrobiologie häufig angewendeten Methode des Agardiffusionstests untersucht. Um eine fundierte Aussage über die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Zubereitungen gegenüber dominierenden und relevanten Erregern von viralen Krankheiten zu erhalten, wurde die Methode des Agardiffusionstests/ Hemmhoftests eingesetzt. Sie erlaubte die Empfindlichkeit von Hefen gegenüber bestimmten wachstumshemmenden Substanzen qualitativ und quantitativ durch sichtbare Hemmhöfe zu bestimmen. Die Größe des Hemmhofes ist spezifisch und proportional zu einer wachstumshemmenden Wirkung gegenüber Candida-Isolaten. Die Proben zur mikrobiologischen Untersuchung wurden 24 h vor Beginn der mikrobiologischen Testung hergestellt und bei einer Temperatur von 6 °C gelagert.
Im Versuchsdurchlauf wurden Natriumalginat-Gele (mit oder ohne Wirkstoff), Negativkontrolle (Ethanol) und Positivkontrolle (Wirkstofflösung (100 mg/l)) an Candida albicans auf ihre antimikrobiologische Wirkung hin untersucht. Der Wirkstoff war Nystatin.
Die Größe der Hemmhöfe wurde nach einer Inkubationszeit von 24 h bei 30 °C mittels eines Lineals ermittelt und dokumentiert (5/6). Um eine verlässliche Aussage zu erhalten, wurde eine Fünffachbestimmung durchgeführt.
Die Auswertung der mikrobiologischen Untersuchungen zeigte, dass die Hemmhöfe der reinen Wirkstofflösung in hoher Konzentration erwartungsgemäß breit ausfielen. Eine Wirkung war hier vorhersehbar. Das Wirkstoffgel wirkt ebenfalls hemmend auf die Erregerkolonie und wies so eine ausgesprochen klare fungizide Wirksamkeit auf.
Der Vergleich der Wirksamkeiten aller Testsubstanzen demonstriert, dass sich bei Alginatgel ohne Wirkstoff, Alginatgel mit Wirkstoff und Positivkontrolle Hemmhöfe ausbildeten, die eine antimykotische Wirkung zeigten.
Dabei bildeten sich bei der erfindungsgemäßen Zusammensetzung mit Nystatin auf Basis von Natriumalginat im Vergleich zur Positivkontrolle ausgeprägtere und größere Hemmhöfe. Bedacht werden muss hier jedoch, dass lediglich 25 ± 0,25 µl Gel verwendet wurde. Die maximale Wirkstoffbeladung bei einer homogenen Verteilung des Wirkstoffs in dem Gel liegt bei Verwendung von ungefähr 25 mg Nystatingel demnach bei 0,00013 mg Nystatin. Diese Rechnung zeigt, dass der Wirkstoffgel mit lediglich 0,3 Gew. % Nystatin in 100 g Gel eine weitaus höhere Wirksamkeit darstellt als die reine Wirkstofflösung, die eine Konzentration von 100 mg/l aufweist. Die reine Wirkstofflösung weist über das 750-fache an Nystatin auf als in dem hergestellten erfindungsgemäßen Gel. Diese Wirkung deutet auf einen Synergieeffekt hin.
Im Vergleich zu der Wirkweise des wirkstoffhaltigen Gels erreichte das Natriumalginat ohne Wirkstoffzugabe eine Wirkung von 30 %, was vermuten lässt, dass nicht wirkstoffhaltige Präparate aus Biopolymeren ebenfalls effektiv gegen die Bekämpfung der Candida albicans eingesetzt werden können (6).
Vergleichbarkeitsstudien

Zur mikrobiologischen Wirkbeurteilung des Biopolymergels (Natriumalginatpolymer-Gels bzw. Chitosan-Gels) wurden Vergleichbarkeitsstudien mit bestehenden Handelsprodukten durchgeführt. Verwendete Produkte sind in der Tabelle 3 notiert. Tabelle 2: Kommerziell erhältliche antimykotische Handelsprodukte und Wirkstoffe

Handelsprodukt	Wirkstoff	Preis à 100 g
Nystatin acis Creme, Polyene (Haut, Fuß)	Nystatin (100.000 IE/g)	35,60€
Nystatin acis, Polyene (Mundgel)	Nystatin (100.000IE/g)	22,68€
Bifon Gel, Imidazole (Haut, Fuß)	Bifanozol 20 mg/l	24,66€
Lamisil Creme, Allylamin-Derivat (Fuß)	Terbinafinhydro-Chlorid 10mg/g	46,33€
Bifon Creme, Imidazole (Haut, Fuß)	Bifonazol, 10 mg/g	24,66€
Mykosert Creme, Imidazole (Haut, Fuß)	Sertaconazol nitrat (20 mg/g)	52,90€

Bezogen auf die Wirksamkeit von erfindungsgemäßen Biopolymergelen konnte eindeutig dargelegt werden, dass diese zum einen alleinig ohne Zusatz von Wirkstoffen Hemmhöfe bildeten, die im Vergleich zu wirkenden Handelsprodukten sogar gleichwertig ausfielen. Eine ausführliche Datierung der mikrobiologischen Untersuchungen erfolgt in Tabelle 4. Die Vergleichbarkeitsstudien zeigten zudem, dass die Alginatgele größere Hemmhöfe ausbildeten, als alle getesteten Handelsprodukte, wobei an dieser Stelle ebenfalls der Synergieeffekt verdeutlicht werden kann. Trotz einer Konzentration von lediglich 0,3 Gew. % Nystatin in der Zusammensetzung (65.000 IE/g) erfolgte eine erhöhte Inhibition des Pilzwachstums, welches auch in 7 dargestellt ist. Tabelle 3: Hemmwirkung bestehender Handelsprodukte im Vergleich zu dem Alginatgel gegenüber Candida albicans

Produkt	Wirkstoffgehalt in %	Hemmhof in mm
Nystatin acis - Mundgel	2,2	20
Nystatin acis -Creme	2,2	10
Bifon - Gel	1	10
Lamisil - Creme	1	6
Bifon - Creme	1	6
Mykosert - Creme	2	18
Chitosan-Gel ohne Wirkstoff	0	4
Chitosan-Gel mit Nystatin	0,32	20
Alginat-Gel ohne Wirkstoff	0	6
Alginat-Gel mit Nystatin	0,32	22

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

US 5385738 A [0010]
WO 2013/038197 A1 [0015]
DE 4434929 A1 [0053]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

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Claims

Eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein homogenes Hydrogel auf Polysaccharidbasis zur Verwendung bei der lokalen Behandlung einer Mykose, wobei das Polysaccharid a) ein Alginatpolymer ist und die Zusammensetzung 0-2 Gew. % Nystatin umfasst, oder b) ein Chitosan ist und die Zusammensetzung 0,1-2 Gew. % Nystatin umfasst.
Die pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Polysaccharid ein Alginatpolymer ist und wobei die Zusammensetzung keinen antimykotischen Wirkstoff umfasst.
Eine Zusammensetzung, umfassend ein homogenes Hydrogel auf Polysaccharidbasis, umfassend 0,1-2 Gew. % Nystatin, wobei das Polysaccharid c) ein Alginatpolymer ist, oder d) ein Chitosan ist.
Die Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1-3, wobei das Polysaccharid ein Alginatpolymer ist, bevorzugt Natriumalginat.
Die Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 oder 3, wobei das Polysaccharid Chitosan ist.
Die Zusammensetzung nach einem der vorigen Ansprüche zur Verwendung bei der lokalen Behandlung einer kutanen oder oralen Mykose, wobei die Mykose bevorzugt eine Candidose ist.
Die Zusammensetzung nach einem der vorigen Ansprüche, umfassend mindestens eine oberflächenaktive Substanz, bevorzugt ein nichtionisches Tensid, optional ein Polysorbat.
Die Zusammensetzung nach einem der vorigen Ansprüche, wobei die Zusammensetzung einen Polysaccharidanteil von 1-5 Gew. %, bevorzugt 1,5-2,5 Gew. %, aufweist.
Die Zusammensetzung nach einem der vorigen Ansprüche, wobei die Zusammensetzung eine Viskosität η von 2000-8000 mPa*s bei einer Temperatur von 32°C und einer Schergeschwindigkeit von 40 U/min, bevorzugt 4000-8000 mPa*s aufweist.
Die Zusammensetzung nach einem der vorigen Ansprüche, wobei die Zusammensetzung mindestens ein Plastifizierungsagens umfasst, ausgewählt aus der Gruppe umfassend Phthalsäureester, Öl, Fettsäuren, Glycerol und Sorbitol.
Die Zusammensetzung nach einem der vorigen Ansprüche, wobei die Zusammensetzung eine Carbonsäure, bevorzugt Essigsäure, umfasst.
Ein Verfahren zur Herstellung der Zusammensetzung nach einem der vorigen Ansprüche, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst: a) Dispergieren des Polysaccharids in Wasser, bevorzugt bei einer Temperatur von 70-100°C, um eine Polysaccharidzubereitung zu erhalten, b) optional, Zugeben einer Säure, wobei der Anteil der Säure in dem Endprodukt 1-3 Gew. % ist, wobei eine Säure zugegeben wird, wenn das Polysaccharid Chitosan ist, c) Abkühlen der Polysaccharidzubereitung auf 18-45°C, bevorzugt 25°C, d) optional, Beimischen eines Plastifizierungsagens in die Polysaccharidzubereitung e) optional, Beimischen von Nystatin, bevorzugt einer Nystatin-Suspension in die Polysaccharidzubereitung, und f) Beimischen einer oberflächenaktiven Substanz, bevorzugt eines Polysorbats, in die Polysaccharidzubereitung.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1-11, erhältlich durch ein Verfahren nach Anspruch 12.