DE102019217898A1 - Kosmetische Zubereitung mit selektiver antimikrobieller Wirksamkeit - Google Patents

Abstract

Die Verwendung der Kombination aus Anissäure und Lävulinsäure führt zur Reduktion anaerober Bakterien und gleichzeitiger Bewahrung aerober Bakterien auf der Haut.

Description

• Die Erfindung ist eine Kombination aus Lävulinsäure und Anissäure zur Anwendung auf der Haut. Die Kombination erlaubt eine selektive antibakterielle Wirkung auf der Haut.
• Anissäure ist eine methoxylierte Benzoesäure, 4-Methoxybenzoesäure. Sie wirkt bakteriostatisch und wird u.a.als Konservierungsmittel verwendet.
• Die Lävulinsäure (auch 4-Oxopentansäure oder 4-Oxovaleriansäure) ist eine chemische Verbindung, die zu den γ-Ketosäuren gehört.
• Als international deklarierte Levulinic Acid ist die Säure und ihre Salze in der Hautpflege zum einen als Duftstoffzusatz gefrag, da ihr typischer Geruch angenehm an Karamell oder Vanille erinnert. Bekannt ist aber darüber hinaus die antibakterielle und fungizide Wirkung von Lävulinsäure. Dies macht diesen Stoff auch als Hautpflegemittel bei unreiner Haut interessant.
• Da Lävulinsäure nicht als Konservierungsmittel deklariert ist, kann sie als ideale natürliche Konservierungsmethode in natürlichen Kosmetika funktionieren.
• EP 1541124 A2 beschreibt eine synergistischen Wirkung zwischen zwei Wirkstoffen, Anissäure und C6-14-Fettsäuremonoglyceride. Die Mischung soll eine antimikrobielle Aktivität aufweisen. In kosmetischen Formulierungen entsteht somit ein breites antimikrobielles Mittel bei gleichzeitig guter Hautverträglichkeit.
• Die mikrobiologische Stabilität von Kosmetika ist ein entscheidender Faktor für die Haltbarkeit und den gesundheitlichen Schutz der Verbraucher. In der europäischen Kosmetikverordnung sind Konservierungsstoffe als Stoffe definiert, die ausschließlich oder überwiegend dafür eingesetzt werden, um die Entwicklung von Mikroorganismen in kosmetischen Mitteln zu hemmen. Die hierfür zugelassenen Stoffe sind in der entsprechenden Positivliste in Anhang V der EU KVO aufgeführt.
• Die ebenfalls natürlich vorkommende Anissäure weist eine starke fungizide Wirkung auf und wird oft in Kombination mit Lävulinsäure eingesetzt, welche neben einer fungiziden Wirkung auch stark bakterizid wirkt. Es handelt es sich hierbei um keine gelisteten Konservierungsstoffe.
• In der EP 2735301 A1 wird die Kombination von Lävulinsäure, dem Natriumsalz (Natriumlävulinat) und Anissäure offenbart.
• Neben dem Auftrag einer verträglichen Konservierung von kosmetischen Zubereitungen besteht aber auch der Wunsch nach einer gesunden Hautflora.
• Die Erfindung ist die Verwendung der Kombination aus Anissäure und Lävulinsäure zur Reduktion anaerober Bakterien und gleichzeitiger Bewahrung aerober Bakterien auf der Haut.
• Die erfindungsgemäße Kombination erlaubt so eine selektive antibakterielle Wirkung auf der Haut.
• Überraschend wirkt die Kombination aus Anissäure und Lävulinsäure selektiv, d.h. die unangenehmen Bakterien, wie Propionibacterium acnes werden auf der Haut reduziert und die angenehmen Bakterien, wie Staphylococcus epidermidis bleiben unangetastet.
• Erfindungsgemäß bedeutet selektiv eine Reduktion der anaeroben Bakterien und wenig (gar keine) Reduktion der aerobe Bakterien.
• Erfindungsgemäß vorteilhaft kommt die Kombination in kosmetischen oder dermatologischen Zubereitungen zur Anwendung.
• Der Anteil an Anissäure wird vorteilhaft gewählt im Bereich von 0,01 bis 5 Gew.%, insbesondere im Bereich von 0,1 bis 1 Gew.%, bezogen auf die Gesamtmasse der Zubereitung.
• Der Anteil an Lävulinsäure wird vorteilhaft gewählt im Bereich von 0,01 bis 5 Gew.%, insbesondere im Bereich von 0,1 bis 1 Gew.%, bezogen auf die Gesamtmasse der Zubereitung.
• Neben der Lävulinsäure werden auch deren Salze, insbesondere Natriumlävulinat, verwendet.
• Vorteilhaft werden die erfindungsgemäßen Anissäure - Lävulinsäure Kombinationen in übliche kosmetische und dermatologische Zubereitungen eingearbeitet, welche in verschiedenen Formen vorliegen können. So sind z.B. eine Lösung, eine Emulsion vom Typ Wasser-in-Öl (W/O) oder vom Typ Öl-in-Wasser (O/W), oder eine multiple Emulsionen, beispielsweise vom Typ Wasser-in-Öl-in-Wasser (W/O/W) oder ÖI-in-Wasser-in-ÖI (O/W/O), eine Hydrodispersion oder Lipodispersion, ein Gel, einen festen Stift oder auch ein Aerosol bevorzugte Zubereitungsformen.
• Erfindungsgemäß hergestellte Emulsionen z.B. in Form einer Creme, einer Lotion, einer kosmetischen Milch sind vorteilhaft und enthalten z.B. Fette, Öle, Wachse und/oder andere Fettkörper, sowie Wasser und einen oder mehrere Emulgatoren, wie sie üblicherweise für einen solchen Typ der Formulierung verwendet werden.
• Es ist auch möglich und vorteilhaft die erfindungsgemäß verwendeten Kombinationen in wäßrige Systeme bzw. Tensidzubereitungen zur Reinigung der Haut und der Haare einzufügen.
• Es ist dem Fachmanne natürlich bekannt, dass anspruchsvolle kosmetische Zusammensetzungen zumeist nicht ohne die üblichen Hilfs- und Zusatzstoffe denkbar sind. Darunter zählen beispielsweise Konsistenzgeber, Füllstoffe, Parfüm, Farbstoffe, Emulgatoren, zusätzliche Wirkstoffe wie Vitamine oder Proteine, Lichtschutzmittel, Stabilisatoren, Insektenrepellentien, Alkohol, Wasser, Salze, antimikrobiell, proteolytisch oder keratolytisch wirksame Substanzen usw. sofern deren Einsatz der erfindungsgemäßen Verwendung nicht zu Wider läuft.
• Mutatis mutandis gelten entsprechende Anforderungen an die Formulierung medizinischer Zubereitungen.
• Es ist zunehmend eine Herausforderung an die Bereitstellung kosmetischer Zubereitungen, diese as Microbiom freundlich zu formulieren.
• Dazu wurden verschiedene Untersuchungen durchgeführt.
• In einem Test wurden dazu Bakterien von der Wange mittels Abstrichtechnik gewonnen und aerob und anaerob (reduzierter Sauerstoffgehalt) inkubiert. Nach 14 Tagen Anwendung wurden erneut Bakterien von den Probanden entnommen.
• Nach der Auswertung aller Probandendaten zeigte sich ein überaschendes Bild, die aerob bebrühteten Bakterien (Staphylokokken) zeigten keine Auffäligkeiten, hingegen die anaerob bebrühteten Bakterien (Cutibakterien vorher Propionibakterien) zeigten schon nach einer Woche eine signifikante Reduktion von mehr als 90% der Bakterien.
• In weiteren in vitro Untersuchungen konnte dieses erstaunliche, selektive Verhalten, bestätigt werden.
• Als Beispiele für anaerobe bzw. aerobe Bakterien gelten Propionibacterium acnes bzw. Staphylococcus epidermidis.
• Propionibacterium acnes ist ein langsam wachsendes grampositives, anaerobes Bakterium.
• Staphylococcus epidermidis ist ein kugelförmiges, Gram-positives Bakterium. S. epidermidis ist aerob, Katalase-positiv und Koagulase-negativ
• Nachstehend wird die Durchführung eines Growth-Assay mit Staphylococcus epidermidis bzw. Cutibacterium acnes dargestellt.
• Herstellung der Bakteriensuspension Staphylococcus epidermidis:
• Staphylococcus epidermidis (DSM 1798) wurde aus einem Kryoröhrchen (EN 12353) auf einer Agarplatte (CASO-Agar) ausgestrichen und bei 37°C 24 h inkubiert. Anschließend wurde eine zweite Passage angelegt. Mit der zweiten Passage wurden 10 ml BHI-Medium und 5 g Glasperlen (4 mm Durchmesser) angeimpft und 3 min geschüttelt. Danach wurde dieser Ansatz auf eine OD600 von 0,1 eingestellt und anschließend 1:10 mit Verdünnungsmittel verdünnt. Diese Bakteriensuspension wurde anschließend für den Growth-Assay eingesetzt.
• Test:
• In jedes Well einer 24-Well-Platte wurden 10µL- Bakteriensuspension gegeben und komplett trocknen lassen (mind. 45min unter der Sterilwerkbank). Nach der Trocknung wurden 10mg der Formulierung aufpipettiert und mittels T-Spatel im Well verteilt. Die Kontrolle blieb unbehandelt. Die Platte wurde für die Inkubationsdauer (6h / 24h) im Feuchtebrutschrank bei 37°C und 90% Luftfeuchtigkeit ohne Deckel gelagert. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurde in jedes Well 500µL Abspülpuffer gegeben und 1min im Ultraschallbad abgespült. 100µL- des erhaltenen Überstandes wurden zu 900µL- Neutralisationsmittel gegeben und anschließend auf CASO-Agar mittels Spiralplater ausplattiert. Die Agarplatten wurden bei 37°C für 24h inkubiert und anschließend mit dem I+L Countermat ausgezählt.
• Herstellung der Bakteriensuspension Cutibacterium acnes:
• Cutibacterium acnes (DSM 1897) wurde aus einem Kryoröhrchen (EN 12353) auf einer Agarplatte (COST-Agar) ausgestrichen und bei 37°C 5 Tage in der anaeroben Box inkubiert. Mit dieser Kultur wurden 10 ml anaeroben Medium im CELLSTAR CELLreactor - Röhrchen angeimpft und 18h in der anaeroben Box inkubiert. Danach wurde dieser Ansatz auf eine OD600 von 0,5 eingestellt und anschließend 1:10 mit anaeroben Medium verdünnt. Diese Bakteriensuspension wurde anschließend für den Growth-Assay eingesetzt.
• Test:
• In jedes Well einer 24-Well-Platte wurden 10µL Bakteriensuspension gegeben und komplett trocknen lassen (mind. 45min unter der Sterilwerkbank). Nach der Trocknung wurden 10mg der Formulierung aufpipettiert und mittels T-Spatel im Well verteilt. Die Kontrolle blieb unbehandelt. Die Platte wurde für die Inkubationsdauer (6h / 24h) ohne Deckel in einer anaeroben Box (mit Zellstoff ausgelegt + 50mL Wasser) im Brutschrank bei 37°C gelagert. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurde in jedes Well 500µL Abspülpuffer gegeben und 1min im Ultraschallbad abgespült. 100uL des erhaltenen Überstandes wurden zu 900µL Neutralisationsmittel gegeben und anschließend auf COST-Agar mittels Spiralplater ausplattiert. Die Agarplatten wurden bei 37°C für 5 Tage inkubiert und anschließend mit dem I+L Countermat ausgezählt.
• Nachstehend die getesteten Zubereitungen und die Ergebnisse der Bakterienreduktion.

  	1	2	3	4	5	6
  INCI
  	%	%	%	%	%	%
  p-Anisic Acid	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1
  Levulinic Acid (Aqua/Glycerin/ Sodium Levulinate)	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
  Glycerin + Arctium Lappa Fruit Extract	1,2	1,2	1,2	0	0	0
  Ethylhexylglycerin	0,1	0,1	0	0,1	0,2	0,1
  Decylene Glycol	0	0,1	0,1	0,1	0	0
  Sodium Hyaluronate + Aqua	0	0	0,1	0	0	0
  Maltodextrin + Chamomilla Recutita Flower Extract	0	0	0	0,6	0	0
  Dicaprylyl Ether	2,8	3,5	0	3,5	2,8	2,8
  Simmondsia Chinensis Seed Oil	3,5	3,5	0	3,5	3,5	3,5
  Butyrospermum Parkii Butter	2	2	0	2	3,5	2
  Prunus Amygdalus Dulcis Oil	3	3,5	0	3,5	5	3
  Coco-Caprylate/Caprate	1,2	0	0	0	0	1,2
  Argania Spinosa Kernel Oil	0,1	0,1	0,1	0	0,1	0
  Caprylic/Capric Triglyceride	0	1	0	1	0	0
  Brassica Campestris Seed Oil	0	0	6	0	0	0
  Glyceryl Stearate	2	2	0	2	2	2
  Glyceryl Caprylate	0,3	0,3	0,3	0,3	0,3	0,3
  Sodium Stearoyl Glutamate	0,3	0,3	0	0,3	0,3	0,3
  Sodium Cetearyl Sulfate	0	0	0,2	0	0	0
  Parfüm	0,35	0,35	0,35	0	0,3	0,3
  Glycerin	8,4	8,4	9	8,4	8,4	8,4
  Cetearyl Alcohol	5	5	0	5	5	5
  Xanthan Gum	0,3	0,3	0,2	0,3	0,3	0,3
  Cetyl Alcohol	0	0	3	0	0	0
  Hydroxypropyl Starch Phosphate + Aqua	0	0	3	0	0	0
  Alcohol Denat. + Aqua	4	4	4	4	4	4
  Aqua	ad 100	ad 100	ad 100	ad 100	ad 100	ad 100
  Reduktionsfaktoren	1	2	3	4	5	6
  Staphylococcus epidermidis nach 6h	1	1	10	1	1	1
  Cutibacterium acnes nach 6h	40	134	1651	214	813	71

• Es zeigte sich, dass die positiven, guten aeroben Bakterien unverändert bleiben die unguten, negativen anaeroben Bakterien jedoch signifikant reduziert werden konnten.
• und nachstehende Tabelle zeigt die Reduktion der aeroben Bakterien gewonnen auf der Stirn von Probanden.

  Stim
  Parameter	Behandlung	Vergleich	p-Wert	Ergebnis	N
  log 10 Bakterienzahlen [CFU/cm2]	Vor Behandlung mit Wasser 05, 06	t0 ~ t2	0.2990	n.s.	36
  	Vor Behandlung mit Zubereitung 5. 20, 30	t0 < t2	0.0409	+	36

• zeigt die Reduktion der anaeroben Bakterien gewonnen auf der Stirn der Probanden.

  Stim
  Parameter	Behandlung	Vergleich	p-Wert	Ergebnis	N
  log10 Bakterienzahlen [CFU/cm2]	Vor Behandlung mit Wasser 05, 06	t0 > t2	0.0000	+	36
  	Vor Behandlung mit Zubereitung 5. 20, 30	t0 > t2	0.0001	+	36

• Auch hier zeigen die erfindungsgemäßen Zubereitung eine selektive bakterielle Wirksamkeit, was zu einer gesunden Hautflora beiträgt.
• und zeigen die Testergebnisse des ATA Versuchs.
• Der ATA Test dient der Bestimmung einer i.d.R. 1-wöchigen antibakteriellen Wirksamkeit von kosmetischen Formulierungen nach 2x täglicher Anwendung. Die Anwendung des Testproduktes und die Messung der Wirksamkeit erfolgen in dem verbraucherrelevanten Areal, der Wange. Zielgröße ist die Keimzahl der aeroben und anaeroben Bakterien.
• Die Probanden haben eine Vorkonditionierung von 3 Tagen mit vorgegebenem Waschgel. Nach Abspülen der Wangen wird das Testprodukt nach Vorschrift aufgetragen. Die Abspülung erfolgt mittels eines Floq Swabs. Es werden 3*10 Striche auf einer 5 cm * 5 cm großen Fläche der Wange in einem definierten Muster (siehe nachstehende Skizze) abgestrichen. Während der Probenabnahmezyklen wird der Floq-Swab im Abspülpuffer getränkt und nach der dritten Probennahme verbleibt der Swab im Abspülpuffer. Die Abspüllösung wird direkt verdünnt und mittels Spiralplater wird jede Probe auf 2 Agar-Platten ausplattiert. Das Abspülen wird dann zu den entsprechenden Zeitpunkten, meistens 1 Woche, wiederholt. Zum Schluss wurde die eine Hälfte der Agar-Platten bei 37°C 5 Tage unter Ausschluss von Sauerstoff bebrütet und die andere Hälfte der Agar-Platten bei 37°C über 24h bebrütet. Anschließend wurden die Agar-Platten mit Hilfe des Countermats ausgewertet.
• In der Auswertung wurde der Reduktionsfaktor bestimmt. Der Reduktionsfaktor ist der Faktor, um den die Zellzahl (CFU) der unterschiedlichen Zeitpunkte im Vergleich zur T0-Kontrolle oder untereinander reduziert wird. $$\frac{\text{CFU}\left(\text{Kontrolle}\right)}{\text{CFU}\left(\text{Testsubstanz}\right)}=\text{Reduktionsfaktor}$$

  
• Das Studiendesign ist so ausgelegt, dass eine antibakterielle Wirksamkeit wie folgt nachgewiesen werden können:
• Vergleich zur unbehandelten Kontrolle => Wirknachweis für Wirkstoff & Formulierung und zeigen eindrucksvoll die erfindungsgemäße selektive Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Kombination (Zubereitung 5) aus Anissäure und Lävulinsäure.
• ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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• Zitierte Patentliteratur
• EP 1541124 A2 [0006]
• EP 2735301 A1 [0009]

Claims (6)

1. Verwendung einer Kombination aus Anissäure und Lävulinsäure zur Reduktion anaerober Bakterien und gleichzeitiger Bewahrung aerober Bakterien auf der Haut.
2. Verwendung nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass als anaerobe Bakterien Propionibacterium acnes auf der Haut reduziert und als aerobe Bakterien Staphylococcus epidermidis unverändert bleiben.
3. Verwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass neben der Lävulinsäure werden auch deren Salze, insbesondere Natriumlävulinat, verwendet werden.
4. Verwendung der Kombination nach Anspruch 1 oder 2 in kosmetischen oder dermatologischen Zubereitungen.
5. Verwendung nach Anspruch 3 dadurch gekennzeichnet, dass der Anteil an Anissäure im Bereich von 0,01 bis 5 Gew.%, insbesondere im Bereich von 0,1 bis 1 Gew.%, bezogen auf die Gesamtmasse der Zubereitung, gewählt wird.
6. Verwendung nach Anspruch 3 oder 4 dadurch gekennzeichnet, dass der Anteil an Lävulinsäure im Bereich von 0,01 bis 5 Gew.%, insbesondere im Bereich von 0,1 bis 1 Gew.%, bezogen auf die Gesamtmasse der Zubereitung, gewählt wird.

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