CN114555040A

CN114555040A - 具有选择性抗微生物活性的带有茴香酸和乙酰丙酸的化妆品制剂

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Publication number: CN114555040A
Application number: CN202080073470.4A
Authority: CN
Inventors: 贝恩德·特劳佩; 黑尔加·比耶日吉塞尔; 安德烈亚斯·菲尔恩; 多米尼克·格德茨; 露西亚·赞弗林·特莱德; 路易斯·阿图罗·卡巴贾尔·阿维拉; 博而泽·阔尔博尔; 海克·福尔斯特; 提那·哈曼; 佩特拉·肖恩迪恩斯特; 丹尼尔·里克特
Original assignee: Beiersdorf AG
Current assignee: Beiersdorf AG
Priority date: 2019-11-20
Filing date: 2020-11-20
Publication date: 2022-05-27
Also published as: ZA202304924B; EP4061310A1; BR112022009820A2; US20220401324A1; MX2022006050A; WO2021099555A1

Abstract

本发明涉及包含乙酰丙酸和茴香酸的组合的化妆品和皮肤病学制剂。根据本发明的制剂特别适合用于皮肤。该制剂通过针对性对抗皮肤菌群的厌氧菌，对皮肤表现出选择性抗菌作用，而对需氧菌几乎没有或没有杀菌作用。因此，根据本发明的组合物适用于美容皮肤护理，也适用于某些皮肤病如痤疮的皮肤病学处理。

Description

具有选择性抗微生物活性的带有茴香酸和乙酰丙酸的化妆品制剂

技术领域

本发明涉及包含乙酰丙酸和茴香酸的组合的化妆品和皮肤病学制剂。根据本发明的制剂特别适合用于皮肤。该制剂通过针对性地对抗皮肤菌群中的厌氧菌对皮肤表现出选择性抗菌作用，而它们对需氧菌几乎没有杀菌作用或没有杀菌作用。因此，根据本发明的组合物适用于美容皮肤护理，也适用于某些皮肤病如痤疮的皮肤病学处理。

背景技术

人体皮肤微生物组是不同微生物群的复杂混合物：厌氧菌，如痤疮皮肤杆菌(Cutibacterium acnes；C.acnes)，在皮肤上与需氧菌(如表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis；S.epidermidis)和人葡萄球菌(Staphylococcus hominis；S.hominis)以及真菌非常接近地定殖。

已知表皮葡萄球菌和痤疮皮肤杆菌之间的相互作用对皮肤健康特别重要。表皮葡萄球菌是一种需氧生长的球形革兰氏阳性细菌，其为过氧化氢酶阳性和凝结酶阴性。痤疮皮肤杆菌是一种厌氧生长的革兰氏阳性细菌。假设这两种微生物在健康皮肤上以相对稳定的平衡出现，并且这种平衡的紊乱，即所谓的菌群失调，可能通过引起皮肤瑕疵甚至皮肤疾病或至少促进其发展而对皮肤状况产生负面影响。因此，对于此类皮肤瑕疵或皮肤病的处理或预防而言，特别重要的是提供这样的药剂：通过它能够有针对性地改变皮肤菌群中厌氧微生物与厌氧微生物的比例，特别是表皮葡萄球菌和痤疮皮肤杆菌的比例。因为特别是厌氧菌如痤疮皮肤杆菌的强化生长可能与皮肤病的发展有关，所以特别需要对选择性地对抗厌氧菌活性的制剂。

茴香酸是一种甲氧基化的苯甲酸(4-甲氧基苯甲酸)，其被认为具有抑菌作用并且还具有抗炎和杀真菌作用。茴香酸尤其在化妆品中用作防腐剂，以防止产品被细菌或真菌污染。为此目的，向这些产品添加0.05-0.3％的量的茴香酸。

乙酰丙酸，也称为4-氧代戊酸或4-氧代缬草酸，是属于γ-酮酸的化合物。这种酸在国际上被称为“乙酰丙酸(levulinic acid)”，它的盐在护肤领域中一方面作为香精添加剂很受欢迎，因为它们的典型气味令人愉快地让人联想到焦糖或香草。此外，已知乙酰丙酸的抗菌和杀真菌效果。这也使得这种物质作为一种用于不洁皮肤的护肤剂变得有意义。由于乙酰丙酸未被宣布为防腐剂，因此它可以理想地用于天然化妆品的防腐。已经充分描述了乙酰丙酸在化妆品中作为防腐剂的用途，其中该物质以0.3-1.0％的量添加到待防腐的产品中。

化妆品中的防腐剂经常用于保护产品免受细菌和真菌的污染。化妆品的微生物稳定性是保质期和消费者健康保护的关键因素。在欧洲化妆品法规中，防腐剂被定义为专门或主要用于抑制化妆品中微生物生长的物质。为此允许的物质列在欧盟KVO附录V中相应的正面清单中。

在现有技术中已经描述了茴香酸和乙酰丙酸作为防腐剂的用途。EP 1 541 124A2描述了用于防腐的两种活性成分之间的协同效应，即茴香酸和C6-14脂肪酸单甘油酯。该混合物应具有可用于化妆品制剂防腐的抗微生物活性。因此在制剂中出现了广谱抗微生物的药剂，同时皮肤相容性良好。在EP 2 735 301 A1中公开了乙酰丙酸、乙酰丙酸的钠盐(乙酰丙酸钠)和茴香酸的组合用于化妆产品的防腐。

虽然茴香酸和乙酰丙酸已广泛用于化妆品的防腐，但迄今为止尚不清楚使用这些物质来有针对性地改变皮肤菌群的组成。如上所述，需要通过有针对性地干涉皮肤菌群的组成而有助于改善皮肤的一般状况和健康的化妆品和皮肤病学组合物。同时，所述组合物应具有良好的皮肤相容性。

发明内容

本发明基于如下令人惊讶的发现：茴香酸可以与乙酰丙酸组合使用，以选择性地降低皮肤菌群中的厌氧菌的浓度，特别是痤疮皮肤杆菌的浓度。因此，本发明涉及使用茴香酸和乙酰丙酸的组合来减少皮肤上的厌氧菌，同时保留需氧菌。因此，根据本发明的组合允许在施用于皮肤后在皮肤上产生选择性抗菌作用。

在第一方面，本发明涉及用于针对性改变皮肤菌群的组合物，其中该组合物包含：

(i)茴香酸或其抗微生物活性的盐，和

(ii)乙酰丙酸或其抗微生物活性的盐。

令人满意的组合物优选包含茴香酸。然而，也可以使用茴香酸盐，只要它们具有足够的抗微生物活性。适用于本发明的茴香酸盐优选具有与相应体外测定中茴香酸活性的至少50％相当的抗微生物活性。这意味着当在体外测定中使用等量的茴香酸和茴香酸盐来确定抗微生物活性时，与茴香酸相比，茴香酸盐必须具有抗微生物活性的至少一半。适用于本发明的盐是茴香酸钠和茴香酸钾。

适用于本发明的乙酰丙酸盐优选具有与相应体外测定中乙酰丙酸活性的至少50％相当的抗微生物活性。这意味着当在体外测定中使用等量的乙酰丙酸和乙酰丙酸盐来确定抗微生物活性时，与乙酰丙酸相比，乙酰丙酸盐必须具有抗微生物活性的至少一半。适用于本发明的盐是乙酰丙酸钠和乙酰丙酸钾。

特别地，本发明涉及用于针对性改变皮肤菌群的组合物，其中该组合物包含

(i)大于0.3％(重量/重量)的茴香酸或其抗微生物活性的盐，以及

(ii)大于1.0％(重量/重量)的乙酰丙酸或其抗微生物活性的盐。

在一个特别优选的实施方案中，该组合物包含至少0.5％(重量/重量)的茴香酸或其抗微生物活性的盐，和至少1.5％(重量/重量)的乙酰丙酸或其抗微生物活性的盐。因此，组合物中茴香酸或茴香酸盐的量优选为至少0.75％、至少1.0％、至少1.5％、至少2.0％、至少2.5％、至少3.0％、至少3.5％、至少4.5％或至少5.0％(重量/重量)。组合物中乙酰丙酸或乙酰丙酸盐的量优选为至少2.0％、至少2.5％、至少3.0％、至少3.5％、至少4.5％或至少5.0％(重量/重量)。

换句话说，本发明的组合物优选包含0.5-5.0％(重量/重量)的茴香酸或其抗微生物活性的盐，和1.5-5.0％(重量/重量)的乙酰丙酸或其抗微生物活性的盐。特别优选的是包含1.0至4.0％(重量/重量)的茴香酸或茴香酸盐和2.0至4.0％(重量/重量)的乙酰丙酸或乙酰丙酸盐的组合物。更优选的是包含1.5至3.0％(重量/重量)的茴香酸或茴香酸盐和2.0至3.0％(重量/重量)的乙酰丙酸或乙酰丙酸盐的组合物。更优选的是包含2.0至3.0％(重量/重量)的茴香酸或茴香酸盐和2.5至3.0％(重量/重量)的乙酰丙酸或乙酰丙酸盐的组合物。

根据本发明的组合物可以作为单一制剂存在或作为在即将施用于皮肤之前彼此组合的组分存在。在后一种提到的情况下，上述量数据适用于在即将施用之前由组分的组合产生的组合物。本发明还包括这样的组合物：其中两种抗微生物活性的组分即茴香酸或其盐和乙酰丙酸或其盐作为分开的制剂存在，所述分开的制剂依次施用于皮肤。可以以约5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、24分钟或30分钟的时间间隔将两种抗微生物活性的组分施用于皮肤。

本发明的组合物可以以各种形式存在。例如作为优选的制剂形式的是溶液、悬浮液、油包水(W/O)型或水包油(O/W)型乳液，或多重乳液，例如水包油包水(W/O/W)型或油包水包油(O/W/O)型乳液，水分散体或脂分散体或气雾剂。根据本发明的组合物优选以乳液形式存在，其除了抗菌活性的组分外还含有其他物质，例如脂肪、油、蜡和/或其他脂肪体，以及水和一种或多种乳化剂，如通常用于这种类型的制剂的乳化剂。这样的乳液可以有利地配制成霜剂或洗剂。此外，将根据本发明的茴香酸和乙酰丙酸的组合引入用于清洁皮肤和/或头发的水性体系或表面活性剂制剂中也是可能且有利的。

本领域技术人员当然知道，如果没有通常的助剂和添加剂，化妆品和治疗组合物大多是不可想象的。这些包括例如增稠剂、填充剂、香料、染料、乳化剂、额外的活性成分如维生素或蛋白质、防晒剂、稳定剂、驱虫剂、酒精、水、盐，以及抗微生物、蛋白水解或角质溶解活性的物质等，只要它们的使用不显著抑制根据本发明的组合的抗微生物活性或以其他方式背道而驰。

根据本发明的茴香酸和乙酰丙酸的组合可以有利地掺入常规的化妆品和皮肤病学制剂中，而这些制剂又可以以各种形式存在。组合物可以例如以霜剂、洗剂、凝胶、软膏、糊剂或固体棒的形式存在。

上述组合物特别适用于皮肤的非治疗性、美容性和/或治疗性处理，特别是人的面部皮肤。在一个具体的实施方案中，本发明涉及用于皮肤病的处理方法的如上所述的组合物。皮肤病优选为皮炎。用上述的组合物处理痤疮(寻常痤疮)是特别优选的。根据本发明的组合物的治疗效果有利地来自于皮肤上厌氧菌浓度的针对性改变。这些厌氧菌的浓度降低了，其中同一生境的厌氧菌浓度没有降低或没有显著降低。由此导致皮肤上厌氧菌与需氧菌的比例发生偏移，特别是痤疮皮肤杆菌与表皮葡萄球菌的比例发生偏移。

根据本发明的组合物也适用于非治疗性的美容用途。这种非治疗性的美容用途可以用于选择性减少皮肤上厌氧菌的数量，特别是选择性减少痤疮皮肤杆菌的数量。这样，可以消除或避免皮肤瑕疵。特别是，可以避免皮脂腺的阻塞，例如在粉刺中发生的。因此，非治疗性的美容用途可以显著改善皮肤的视觉外观。在另一个实施方案中，本发明还涉及如上定义的根据本发明的组合物在痤疮皮肤护理制剂中的非治疗性用途。

在治疗性处理或非治疗性的美容处理的范围内，可以将组合物一次或多次施用于皮肤。在一个实施方案中，根据本发明的组合物被配制用于日常施用于皮肤。在一个替选的实施方案中，根据本发明的组合物被配制用于单次施用于皮肤。令人惊讶的是，根据本发明的组合物中茴香酸和乙酰丙酸的组合选择性地起作用，即减少皮肤上的厌氧菌如痤疮皮肤杆菌并且需氧菌如表皮葡萄球菌没有受到攻击或没有受到显著攻击。

根据本发明的组合物的优点在于高抗微生物选择性。该组合物有针对性地导致定殖在皮肤上的厌氧菌、特别是痤疮皮肤杆菌的细胞数显著减少。同时，该组合物对需氧菌、特别是表皮葡萄球菌没有抑制作用或只有轻微抑制作用，其在皮肤上的数量没有显著减少。如下文描述的实施例中所解释和图1-2中所示，使用根据本发明的组合物导致厌氧菌减少90％，而需氧菌在研究期间甚至继续增加。

目前优选的是，在施用根据本发明的组合物之后，特定皮肤区域中的厌氧菌的数量与施用组合物前相关皮肤区域中的细胞数量相比减少至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。还优选的是该皮肤区域的需氧菌的数量同时与施用组合物前相关皮肤区域中的细胞数量相比减少至多25％、至多20％、至多15％、至多10％、至多5％或更少。

目前特别优选的是，在施用根据本发明的组合物之后，特定皮肤区域中的痤疮皮肤杆菌的数量与施用组合物前相关皮肤区域中的细胞数量相比减少至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。还优选的是该皮肤区域的表皮葡萄球菌的数量同时与施用组合物前相关皮肤区域中的细胞数量相比减少至多25％、至多20％、至多15％、至多10％、至多5％或更少。

根据本发明的组合物的活性在各种研究中得到了证实，这些研究在以下实施例中进行描述。在测试中，通过拭子技术从脸颊获得细菌，并在需氧和厌氧(即氧含量降低)条件下进行培养。使用14天后，再次从受试者身上提取细菌。在对所有受试者数据进行评估后，出现了令人惊讶的画面。需氧培养的细菌没有出现异常，而厌氧培养的细菌在一周后细菌细胞数就显著减少了90％以上。这种选择性表现可以在进一步的体外研究中得到证实。

具体实施方式

实施例

以下实施例旨在阐明本发明而不是限制本发明。除非另有说明，否则所有量、份数和百分比均基于各自制剂和组合物的重量和总量或总重量。

实施例1：细菌悬浮液的制备和生长实验

从冷冻管(EN 12353)中取出表皮葡萄球菌(DSM 1798)，在CASO琼脂板上涂抹并在37℃培养24小时。接着创建了第二代。用第二代接种10ml BHI培养基和5g玻璃珠(直径4mm)并摇动3分钟。此后，将该批次调整至0.1的OD600，然后用稀释剂按1:10稀释。然后将该细菌悬浮液用于生长测定。

测试-表皮葡萄球菌的生长试验

向24孔板的每个孔中加入10μL细菌悬浮液并完全干燥(在无菌工作台下至少45分钟)。干燥后，将10mg待研究的制剂(见表1)移液，并将其通过T型刮刀分布在孔中。对照组保持未处理。将板不加盖在37℃和90％空气湿度的湿式培育箱中储存培养期的时长(6小时/24小时)。培养时间结束后，在每个孔中加入500μL冲洗缓冲液，在超声波浴中冲洗1分钟。将获得的100μL上清液加入到900μL中和剂中，然后通过螺旋板在CASO琼脂上铺板。将琼脂板在37℃下培养24小时，然后用I+L计数器对菌落计数。

将痤疮皮肤杆菌(DSM 1897)从冷冻管(EN 12353)中涂抹在琼脂板(COST琼脂)上，并在厌氧箱中于37℃培养5天。用这种培养物接种CELLSTAR CELL反应管中的10ml厌氧培养基，并在厌氧箱中培养18小时。此后，将该批次调整至0.5的OD600，然后用厌氧培养基按1:10稀释。然后将该细菌悬浮液用于生长测定。

测试-痤疮皮肤杆菌的生长试验

将10μL细菌悬浮液加入24孔板的每个孔中，并使其完全干燥(在无菌工作台下至少45分钟)。干燥后，将10mg待研究的制剂(见表1)移液并将其通过T型刮刀分布在孔中。对照组保持未处理。将板不加盖在37℃的培育箱中的厌氧箱(衬有纤维素+50mL水)中储存培养期的时长(6小时/24小时)。培养时间结束后，在每个孔中加入500μL冲洗缓冲液，在超声波浴中冲洗1分钟。将获得的100μL上清液加入到900μL中和剂中，然后通过螺旋板在COST琼脂上铺板。将琼脂板在37℃下培养5天，然后用I+L计数器对菌落计数。

在评估中，确定减少因子。减少因子是不同时间点的细胞数(CFU)与T0对照组或彼此相比减少的因子。

将研究设计方案设计成使得测试制剂的抗菌活性可以通过与未处理的对照组进行比较来证明。

表1：测试的配制物和生长试验的结果

计数显示需氧的表皮葡萄球菌的数量不受含有茴香酸和乙酰丙酸的配制物的影响或不受显著影响。在表皮葡萄球菌批次中仅测量到小的减少因子。与此相对，通过配制物显著减少了厌氧的痤疮皮肤杆菌的数量。

实施例2：ATA测试

ATA测试用于确定化妆品制剂在每天使用两次后的抗菌效果。测试的持续时间通常为1周。测试配制物的施用和活性测量发生在消费者的相关部位，即脸颊。目标量是需氧菌和厌氧菌的细菌数。

所有受试者都使用指定的洗涤凝胶进行了3天的预处理。冲洗脸颊后，根据说明施加表1中所述的“测试配制物5”。然后通过Floq拭子进行涂抹。在脸颊的5cm x 5cm大的区域上以定义的图案进行3x 10的涂敷。涂抹的图案如图3所示。在采样周期中，将Floq拭子浸泡在冲洗缓冲液中，第三次采样后拭子仍留在冲洗缓冲液中。将溶液直接稀释，并通过螺旋板将每个样品在2个琼脂板上铺板。然后在相应指定的时间点重复涂抹，通常在1周后。最后，将一半琼脂板在37℃无氧条件下培育5天，另一半琼脂板在37℃培育24小时。然后使用计数器评估琼脂板。

ATA测试的结果如图1和图2所示。图1显示了厌氧培养的结果。可以看出，通过用含有茴香酸和乙酰丙酸的组合的测试配制物处理，厌氧菌的细胞数显著降低。图2显示了培养基的结果，在图2中看不到细胞数的这种减少。相反，这里甚至可以记录到细胞数的增加。图1和图2因此令人印象深刻地显示了根据本发明的茴香酸和乙酰丙酸的组合的选择性活性。

实施例3：悬浮液测试

在用表皮葡萄球菌和痤疮皮肤杆菌的悬浮液测试中进一步研究了根据本发明的配制物的效果。根据欧洲标准12353建立的表皮葡萄球菌(DSM 1798)和痤疮皮肤杆菌(DSM1897)的甘油储备培养物储存在5℃的冰箱中。从这些液体储备培养物制备了第一代。在此通过无菌一次性接种环将相应的培养物涂抹在琼脂板上(痤疮皮肤杆菌：COST琼脂，表皮葡萄球菌：COAST琼脂)，然后培育。痤疮皮肤杆菌培养物在37℃培育5天，而表皮葡萄球菌培养物在37℃培育24小时。然后通过用无菌一次性接种环提取几个菌落、然后将它们涂抹到新的琼脂平板上，从该第一代产生第二代。然后将该第二代在适当的温度下培育5天或24小时。然后将获得的第二代用于悬浮液测试。

为了制备悬浮液，用无菌接种环取下第二代的一些菌落，并添加到装有5g玻璃珠

的三角烧瓶中的10mL培养基中，并轻轻摇动3分钟。然后通过光密度(OD)调整每毫升的大致细胞数。用Eppendorf光度计在600nm处测定光密度。将获得的OD调整到大约0.8(±0.01)的值，然后再次按1:50稀释。使用这种稀释策略，获得了大约1x10⁶的细胞数。

分别将50μL的抗微生物原料溶液和450μL的培养基置于灭菌的Eppendorf反应容器中用于测试制剂(痤疮皮肤杆菌：厌氧培养基，表皮葡萄球菌：BHI培养基)。对于阳性对照组，提供了500μL培养基。加入500μL制备的培养悬浮液后，在不同时间(1小时、3小时和6小时后)制备所有样品的1:10稀释液。对于阳性对照组，还在加入培养物后(0分钟)直接制备稀释液，并通过螺旋板铺板。在整个测试期间，将试样储存在1000rpm和30℃或37℃的Eppendorf振荡器中。对于1:10稀释，将900μL中和培养基置于Eppendorf反应容器中，并在收集时加入100μL培养原料悬浮液。测试结束后，将所有琼脂板放入培育箱中进行培育，培养后在计数器上进行评估。

结果如图4和图5所示。可以看出，使用茴香酸、乙酰丙酸或两种物质的组合对需氧菌表皮葡萄球菌的生长没有显著影响。另一方面，在厌氧菌痤疮皮肤杆菌的情况下，单独使用茴香酸或乙酰丙酸不会导致细胞数减少。然而，联合使用导致显著的选择性抗微生物作用。

Claims

1.一种用于针对性改变皮肤菌群的组合物，其中所述组合物包含：

(ii)大于1.0％(重量/重量)的乙酰丙酸或其抗微生物活性的盐。

2.根据权利要求1所述的组合物，其包含：

(i)至少0.75％(重量/重量)的茴香酸或其抗微生物活性的盐，以及

(ii)至少1.5％(重量/重量)的乙酰丙酸或其抗微生物活性的盐。

3.根据权利要求2所述的组合物，其包含：

(i)0.75至5.0％(重量/重量)的茴香酸或其抗微生物活性的盐，以及

(ii)1.5至5.0％(重量/重量)的乙酰丙酸或其抗微生物活性的盐。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中，所述组合物以霜剂、洗剂、凝胶、软膏、糊剂或固体棒的形式存在。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中，所述组合物用于处理皮肤病的方法中，特别是处理痤疮的方法中。

6.(i)茴香酸或其抗微生物活性的盐和(ii)乙酰丙酸或其抗微生物活性的盐的组合用于选择性减少皮肤上厌氧菌数量的非治疗用途。

7.根据权利要求6所述的非治疗用途，其中，所述厌氧菌是皮肤杆菌属的细菌，特别是痤疮皮肤杆菌种的细菌。

8.根据权利要求6至7中任一项所述的非治疗用途，其中，皮肤上的需氧菌的数量没有显著减少。

9.根据权利要求8所述的非治疗用途，其中，所述需氧菌是葡萄球菌属的细菌，特别是表皮葡萄球菌种的细菌。

10.根据权利要求6至9中任一项所述的非治疗用途，其中，所述皮肤是面部皮肤。

11.根据权利要求6至10中任一项所述的非治疗用途，其中，将所述组合的两种组分同时或依次施用于皮肤上。

12.根据权利要求6至11中任一项所述的非治疗用途，其中，所述组合以含有0.01至5.0％(重量/重量)、优选0.1至1.0％(重量/重量)的茴香酸或其抗微生物活性的盐的单一组合物的形式施用。

13.根据权利要求6至12中任一项所述的非治疗用途，其中，所述组合以含有0.01至5.0％(重量/重量)、优选0.1至1.0％(重量/重量)的乙酰丙酸或其抗微生物活性的盐的单一组合物的形式施用。

14.(i)茴香酸或其抗微生物活性的盐和(ii)乙酰丙酸或其抗微生物活性的盐的组合用于痤疮皮肤护理的非治疗用途。