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Gebiet der Erfindung
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Die Erfindung betrifft eine hydroxylapatithaltige Substanz sowie ein Verfahren zu deren Herstellung. Insbesondere betrifft die Erfindung nanokristallines, mit einem Polymer funktionalisiertes Hydroxylapatit, welches beispielsweise zur Transfektion, insbesondere als Träger einer Nukleinsäure, verwendet werden kann.
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Hintergrund der Erfindung.
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Mit einem Polymer funktionalisiertes Hydroxylapatit ist bekannt.
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So zeigt die Offenlegungsschrift
US 2010/0086601 A1 ein Verfahren zur Herstellung von nanokristallinem Hydroxylapatit, bei welchem während des Ausfällens von Hydroxylapatit Polykationen oder Polyanionen hinzu gegeben werden und so das Wachstum der Partikel beendet wird. Die Partikel können beispielsweise als Wirkstoffträger verwendet werden.
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Nachteilig an diesem Verfahren ist die relativ aufwändige Herstellung. So muss bereits während der Herstellung des Hydroxylapatitmaterials das Polymer unter definierten Randbedingungen zugefügt werden.
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Zudem neigen bekannte hydroxylapatithaltige Suspensionen zur Agglomeration der Partikel.
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Die Druckschrift
DE 694 13 513 T2 zeigt die wässrige Lösung von Hydroxyapatit mit einer Konzenttation von 18–36 Gew.-% und einer Partikelgröße von weniger als 60 nm. Die Druckschrift
DE 10 2006 060 910 A1 zeigt ein Material für die Zahnpflege, welches 0,01–20% Hydroxyapatit enthält.
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Das Dokument Datenbank PubMed, Zusammenfassung zu: USKOKOVIC, V. u. a.: Nanosized hydroxyapatite and other calcium phosphates: chemistry of formation and application as drug and gene delivery agents. J. Biomed. Mater. Res. B Appl. Biomater (Januar 2011) 96(1) 152-91 [PMID: 21061364] zeigt die DNA Transfektion unter Zurhilfenahme von Hydroxyapatit.
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Aufgabe der Erfindung
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Der Erfindung liegt demgegenüber die Aufgabe zugrunde, eine hydroxylapatithaltige Substanz bereit zu stellen, welche mit einem Polymer funktionalisiert ist und einfach herstellbar ist.
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Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, die Agglomerationsneigung der Partikel zu reduzieren.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die Erfindung wird bereits durch ein Verfahren zur Herstellung einer hydroxylapatithaltigen Substanz sowie durch eine hydroxylapatithaltigen Substanz nach einem der unabhängigen Ansprüche gelöst.
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Bevorzugte Aus führungsformen und Weiterbildungen sind Gegenstand der jeweiligen Unteransprüche.
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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer hydroxylapatithaltigen Substanz, bei welchem zunächst eine Suspension hergestellt wird, welche nanoskalige Hydroxylapatitpartikel enthält. Unter nanoskaligen Hydroxylapatitpartikeln werden Partikel verstanden, welche in zumindest einer Raumrichtung eine Gröle von weniger als 100 nm aufweisen. Es versteht sich, dass auch auf eine kommerziell erhältliche Suspension zurückgegriffen werden kann.
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Hierzu wird das Polymer einfach zu der Suspension hinzu gegeben. Insbesondere kann ein wasserlösliches Polymer verwendet werden, welches als Lösung hinzugefügt wird.
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Der Anteil an Hydroxylapatit in der Suspension, welche nunmehr auch das Polymer enthält, beträgt weniger als 5, vorzugsweise weniger als 0,5 und besonders bevorzugt weniger als 0,1% (%-Angaben soweit nicht anders angegeben immer in Gewichtsprozenten).
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Die Erfinder haben herausgefunden, dass mittels der Verwendung einer Suspension mit relativ geringem Hydroxylapatitanteil es möglich ist, die Hydroxylapatitpartikel nach deren Herstellung mit einem Polymer zu funktionalisieren. Vorzugsweise wird eine hohe Verdünnungen von unter 0,1%, bevorzugt von unter 0,08% und besonders bevorzugt von unter 0,05% oder unter 0,03% eingestellt. Es hat sich gezeigt, dass bereits bei über 0,1% die Suspension nicht mehr vollständig stabil ist und dass möglicherweise eine vollständige Funktionalisierung nicht mehr stattfindet. Sofern dies für die jeweilige Anwendung keinen Nachteil hat, können aber auch höhere Konzentrationen, insbesondere von weniger als 3% oder 2% verwendet werden.
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Die Erfindung ermöglicht die nachträgliche Funktionalisierung einer hydroxylapaptithaltigen Suspension mit einem Polymer. So ist die Herstellung wesentlich vereinfacht.
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Das Polymer wird vorzugsweise im Überschuss zugegeben, um sicher zu stellen, dass sämtliche Partikel mit dem Polymer funktionalisiert werden.
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Unter „Funktionalisieren” wird jede Veränderung der Eigenschaften der Substanz durch eine Verbindung mit dem Polymer verstanden. Insbesondere kann das Polymer die Transfektion der Partikel verbessern, so dass diese als Träger beispielsweise einer Nukleinsäure dienen können, um diese in die Zelle einzuschleusen.
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Weiter kann das Polymer die Partikel derart funktionalisieren, dass diese in einer Suspension stabiler sind oder sogar in Pulverform vorliegen können, ohne zu agglomerieren oder als Nanopartikel wieder resuspendiert werden können.
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Nach der Zugabe des Polymers wird dieses abgetrennt. So werden eventuell gesundheitsschädliche Bestandteile der Suspension in Form von Polymerbestandteilen, welche keine Verbindung mit den Partikeln eingegangen sind, entfernt.
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Das Abtrennen des Polymers kann beispielsweise durch zentrifugieren der Suspension und Entfernen des Überstands erfolgen.
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Nach dem Abtrennen des Polymers kann der Rückstand, der im Wesentlichen aus den funktionalisierten Hydroylapatitpartikeln besteht, in einer Flüssigkeit, insbesondere Wasser, aufgenommen und sodann redispergiert werden.
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Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein in Wasser gelöstes, kationisches Polymer verwendet. Insbesondere wird Polyethylenimin verwendet, welches aufgrund des hohen Komplexierungsgrades eine gute Affinität zu Nukleinsäuren aufweist.
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Bei einer Weiterbildung der Erfindung wird die Flüssigkeit aus der Suspension, insbesondere aus der redispergierten Suspension, entfernt. Dies erfolgt vorzugsweise durch Lyophilisation in Anwesenheit von Kryoprotektoren.
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Als Kryoprotektor kann insbesondere ein Saccharid, beispielsweise Trehalose oder Laktose, verwendet werden.
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Durch die Kombination von polymerfunktionalisierten Partikeln in Verbindung mit einem Kryoprotektor ist es möglich geworden, ein insbesondere nanoskaliges Pulver bereit zu stellen, welches nicht agglomeriert und sich gegebenenfalls wieder redispergieren lässt.
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Erstellung, Handhabung und Lagerung der hydroxylapatithaltigen Substanz werden so erheblich verbessert.
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Beispielsweise ist es möglich, die Herstellung der hydroxylapatithaltigen Substanz unter nicht sterilen Bedingungen durchzuführen und das hergestellte Pulver erst nach der Lyophilisation zu sterilisieren, insbesondere mittels γ-Strahlung.
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Als hydroxylapatithaltige Suspension wird vorzugsweise eine Suspension mit einer mittleren Partikelgröße von weniger als 200 nm, vorzugsweise in einer Größe von weniger als 200 nm Länge und weniger als 50 nm Breite, verwendet.
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Es kann sich um stäbchen- oder nadelförmige Partikel aber auch um Partikel mit einer anderen Form handeln. Insbesondere können auch im Wesentlichen sphärisch geformte Partikel verwendet werden. Vorzugsweise werden bei Verwendung von sphärischen Partikeln Partikel mit einer mittleren Partikelgröße zwischen 30 und 300, besonders bevorzugt zwischen 50 und 100 nm verwendet.
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Die mittlere Partikelgröße kann beispielsweise mittels dynamischer Lichtstreuung, insbesondere mittels Laserinterferometrie, ermittelt werden. Über ein derartiges Verfahren wird ein Mittelwert gebildet, der ein Maß für die Größe der Partikel ist. Sofern Länge und Breite der einzelnen Partikel bestimmt werden soll, eignen sich hierfür transmissions-elektronenmikroskopische Aufnahmen.
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Die Erfindung ermöglicht die Bereitstellung einer hydroxylapatithaltigen Substanz, welche mit einem Polymer funktionalisierte Hydroxylapatitpartikel mit einer mittleren Größe von weniger als 250 nm umfasst. Insbesondere handelt es sich um nadelförmige Partikel mit einer Länge von weniger als 200 und einer Breite von weniger als 50 nm.
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Durch das erfindungsgemäße verfahren konnte trotz der Funktionalisierung mit einem Polymer die Struktur bekannter nanoskaliger Hydroxylapatitpartikel im Wesentlichen erhalten bleiben.
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Die hydroxylapatithaltige Substanz kann nach Trocknung als Pulver vorliegen, ohne dass die nanoskaligen Eigenschaften verloren gehen.
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Neben einer verbesserten Stabilität der Substanz eignet sich die hydroxylapatithaltige Substanz zur Transfektion, insbesondere als Träger eines anionischen Wirkstoffes wie einer Nukleinsäure.
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Eine hydroxylapatithaltige Substanz kann beispielsweise wie folgt hergestellt werden.
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Zunächst wird ein Gramm einer 6%igen hydroxylapatithaltigen Suspension (beispielsweise kommerziell erhältliches Ostim®) mit 20 ml Reinstwasser verdünnt.
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2 ml dieser verdünnten Suspension werden mit 18 ml einer polyethyleniminhaltigen Lösung verdünnt, so dass eine Suspension mit etwa 0,03% Hydroxylapatit entsteht. Beispielsweise wird als polyethyleniminhaltige Lösung eine Lösung mit 2 g pro Liter Polyethylenimin (pH-Wert von etwa 10, 25 kDa, verzweigt, Sigma) verwendet.
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Die so entstandene Mischung, kann beispielsweise mittels Ultraschall redispergiert werden. Dabei werden die in der Suspension vorhandenen Hydroxylapatitpartikel mit dem Polymer funktionalisiert.
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Sodann wird die Suspension zentrifugiert. Dies erfolgte im vorliegenden Ausführungsbeispiel für 30 Minuten bei 66.000 g. Der das Polymer enthaltende Überstand kann nunmehr entfernt werden.
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Der verbleibende Rückstand kann mit 20 ml Reinstwasser aufgenommen werden.
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Sodann kann der Rückstand mittels Ultraschall redispergiert werden und die erhaltene Suspension mittels dynamischer Lichtstreuung untersucht werden. Überraschenderweise hat sich gezeigt, dass die Struktur der Partikel im Wesentlichen erhalten geblieben ist.
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Insbesondere zur Langzeitlagerung kann die Suspension in Gegenwart eines Kryoprotektors, wie beispielsweise 10 mg Trehalose oder Laktose auf 1 ml der Suspension, lyophilisiert werden. Dies kann beispielsweise durch Einfrieren in flüssigem Stickstoff und Gefriertrocknen über Nacht erfolgen.
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Das so entstandene Pulver lässt sich verpacken und im Nachhinein beispielsweise mittels γ-Strahlen sterilisieren.
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Im Unterschied zu bekannten hydroxylapatithaltigen Suspensionen oder Pasten ist das Pulver nahezu unbegrenzt für eine Langzeitlagerung geeignet. Das Pulver kann jederzeit redispergiert werden.
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Eine Messreihe, bei welcher Suspensionen mit höherem Anteil an Hydroxylapaptit verwendet wurden, hat ergeben, dass bei der redispergierten Suspension bereits bei Verwendung einer Suspension mit einem Anteil an Hydroxylapatit von 0,1% oder mehr sich nach kurzer Zeit ein feiner Niederschlag am Boden absetzt. Mithin scheint eine vollständige Funktionalisierung nicht mehr stattzufinden.
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Beschreibung der Zeichnungen
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1 und 2 zeigen transmissionselektronenmikroskopische Aufnahmen einer entsprechend vorstehend beschriebenen Herstellungsbeispiels hergestellten hydroxylapatithaltigen Suspension.
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Zu erkennen ist, dass die Partikel ihre typische nadelförmige Struktur im Wesentlichen erhalten haben. Insbesondere liegt die mittlere Länge unter 200 nm und die mittlere Breite unter 50 nm.
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Die in 3 dargestellte Kurve 1 gibt die Größenverteilung der Partikel gemessen mittels Laserinterferometrie wieder (Malvern, Zetasizer Nano ZS ZEN 3600).
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Auf der x-Achse ist die Größe in nm und auf der y-Achse die Streulichtintensität, welche ein Maß für Anzahl der Partikel mit der entsprechenden Größe ist, in Prozent angegeben.
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Zu erkennen ist, dass als mittlere Partikelgröße über dieses Messverfahren eine Größe von etwa 200 nm ermittelt wird. Es ergibt sich nahezu eine Gaußverteilung, bei welcher Partikel in der Größe von 100 bis 400 nm über 90% der erfassten Partikel ausmachen.
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4 zeigt eine kolloid-chemische Analyse der DNA-Beladung an polymerfunktionalisierten Partikeln.
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Hierzu wurde 1 ml der gemäß vorstehend beschriebenem Beispiel hergestellten Suspension verwendet und sodann eine DNA-haltige Lösung hinzu gegeben.
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Auf der x-Achse ist das zugegebene Volumen an DNA aufgetragen. Dabei wurde DNA in einer Konzentration von 1 mg/ml zugegeben. Die Kurve 2 zeigt die laserinterferometrisch bestimmte mittlere Partikelgröße in Abhängigkeit von dem zugegebenen DNA-Volumen.
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Die Kurve 3 zeigt das Zeta-Potential in mV, welches als Maß für die DNA-Beladung verstanden werden kann.
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Zu erkennen ist, dass bis zu einem zugegebenen Volumen von etwa 50 μl das Zeta-Potential aufgrund der negativ geladenen DNA leicht abnimmt. Bis zu diesem Volumen bleibt aber die Größe der in der Suspension verwendeten Partikel in etwa konstant und liegt bei etwa 200 nm.
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Ab einem zugegebenen Volumen von über 50 μl steigt die mittlere Partikelgröße sprunghaft an bis auf einen sehr hohen wert von über 5.000 nm. Die Stabilität der Suspension wird durch die vorhandene DNA und die damit einhergehende Herabsetzung des Zeta-Potentials zerstört. Das Trägersystem agglomeriert.
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Ab einem zugegebenen Volumen von 200 μl ist die Suspension wieder stabil und die mittlere Partikelgröße liegt wieder bei etwa 200 nm. Dies liegt vermutlich daran, dass nunmehr die Partikel nahezu vollständig von DNA umhüllt sind, was wiederum die Suspension stabilisiert.
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Es versteht sich, dass bei Verwendung der hydroxylapatithaltigen Substanz als Träger für eine Nukleinsäure in einem Bereich gearbeitet wird, der unterhalb der Schwelle liegt, ab der das kolloidale Gleichgewicht gestört wird.
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Die Transfektion von Zellen wurde mittels siRNA (anti-EGFP) untersucht.
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Hierzu tritt siRNA nach erfolgter Endozytose ins Zytoplasma und inhibiert die Produktion des grün fluoreszierenden Proteins.
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Die Genstummschaltungseffizienz kann sodann durch Auszählen der grün fluoreszierenden Zellen unter dem Mikroskop bestimmt werden.
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Die so gewonnenen Erkenntnisse sind in 5 wieder gegeben.
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In 5 repräsentiert Kurve 2 entsprechend 4 die mittlere Partikelgröße, Kurve 3 ebenfalls entsprechend 4 das Zeta-Potential in mV.
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Auf der x-Achse ist wiederum die zugegebene Menge an DNA in μg angegeben. Statt siRNA wurde bei diesem Versuch aus Kostengründen fragmentierte DNA verwendet, deren Basenlänge in etwa siRNA entspricht.
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Die schwarzen Balken 4 geben die Stummschaltungseffizienz in Prozent wieder, welche durch Auszählen der nicht fluoreszierenden Zellen und fluoreszierenden Zellen unter dem Mikroskop ermittelt wurde.
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Zu erkennen ist, dass die Stummschaltungsquote bis zu einer zugegebenen Menge an DNA von etwa 75 μg stets bei über 20% liegt. Die Transfektionseffizienz ist also relativ gut. Mit Zerstörung des kollodialen Gleichgewichts und entsprechender Agglomeration der Partikel sinkt die Stummschaltungseffizienz auf einen Wert von unter 10% zwischen 100 und 150 μg.
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Bei einer zugegebenen Menge von 200 μg und mehr wird, wie in 4 bereits erläutert, das kolloidale Gleichgewicht wieder hergestellt, was auch mit einer erhöhten Transfektionseffizienz einhergeht.
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Durch die Erfindung konnte ein polymerfunktionalisiertes hydroxylapatitpartikelhaltiges Material bereit gestellt werden, welches sich einfach herstellen lässt und welches sich insbesondere zur Transfektion als Träger von Nukleinsäuren eignet.
