DE102011054413A1

DE102011054413A1 - Monoklonaler anti-Idiotyp-Antikörper Ganglidiomab

Info

Publication number: DE102011054413A1
Application number: DE102011054413A
Authority: DE
Inventors: Holger Lode
Original assignee: Ernst Moritz Arndt Universitaet Greifswald
Current assignee: Universitaet Greifswald
Priority date: 2011-10-12
Filing date: 2011-10-12
Publication date: 2013-04-18
Also published as: WO2013053694A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft einen anti-idiotypischen Antikörper, der das Disialogangliosid GD2 nachahmt. GD2 wird auf neuroektodermalen Tumoren exprimiert. Weiterhin umfasst ist eine entsprechende Hybridomzelllinie und ein korrespondierendes Polynucleotid, sowie eine entsprechende pharmazeutische Zubereitung bzw. einen Impfstoff. Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung des Antikörpers oder Polynucleotids zur Auslösung einer Immunantwort in einem Individuum, ein Verfahren zur Detektion einer gegen GD2 gerichteten Immunantwort und ein Verfahren zur Detektion bzw. quantitativen Bestimmung der Konzentration eines Anti-GD2-Antikörpers sowie zur Detektion von Zellen, die einen anti-GD2 Antikörper oder ein Derivat eines anti-GD2 Antikörpers exprimieren.

Description

Bei neuroektodermalen Tumoren ist das Disialogangliosid GD2 hochexprimiert. Hierzu zählen das Melanom (30% der Fälle), das Neuroblastom (100% der Fälle), das kleinzellinge Lungenkarzinom (15% der Fälle) sowie das Glioblastom (100% der Fälle). Auch bei verschiedenen Sarkomen wurde das GD2 als Antigen beschrieben.
Das Neuroblastom stellt den häufigsten soliden, extrakraniellen Tumor im frühen Kindesalter dar. Es handelt sich hierbei um einen malignen, neuroektodermalen Tumor, der aus entarteten Zellen besteht, die der Neuralleiste entstammen und bei der Bildung des sympathischen Nervensystems in einem unreifen Stadium verblieben sind (Neuroblasten). Ihr Auftreten konzentriert sich auf das frühe Kindesalter; so treten 40% der Tumoren im ersten Lebensjahr auf, während mit zunehmendem Lebensalter die Inzidenz abnimmt
Aufgrund der immer noch schlechten Prognosen bei Hochrisikopatienten sowie einer großen Zahl an auftretenden Rezidiven, hat die Entwicklung von adjuvanten immuntherapeutischen Strategien zur Bekämpfung des Neuroblastoms einen besonderen Stellenwert in der pädiatrischen Onkologie eingenommen. Es lassen sich passive und aktive Immuntherapiekonzepte voneinander unterscheiden, die aber ein gemeinsames Ziel verfolgen: die Aktivierung des körpereigenen Immunsystems zur Zerstörung der malignen Tumorzellen.
Eine wichtige Voraussetzung für die Durchführung von immuntherapeutischen Strategien ist das Vorhandensein von tumorassoziierten Antigenen (TAA), die in hohem Maße auf der Oberfläche von Tumorzellen exprimiert werden und dadurch geeignete Zielstrukturen für derartige Therapiekonzepte darstellen. Ein solches Oberflächenantigen, welches in großer Zahl auf neuroektodermalen Tumoren, wie dem Neuroblastom, gebildet wird, ist das Disialogangliosid GD2 [Schulz et al., 1984], das zuerst von Reiko F. Irie als onkofetales Antigen (OFA-I-2) entdeckt und beschrieben wurde [Irie et. al, 1976]. Hierbei handelt es sich um ein Glykosphingolipid [Cahan et. al, 1982], dessen hydrophober Teil (Ceramid) in der Zellmembran verankert ist und der glykosidisch gebundene Kohlenhydratanteil zur Außenseite der Membran präsentiert wird.
Die physiologische, sehr geringe GD2-Expression in gesunden Geweben ist auf Neuronen, peripheren Nervenenden sowie Melanozyten beschränkt [Svennerholm et al., 1994], wodurch GD2 zu einem geeigneten tumorassoziiertem Zielantigen beim Neuroblastom wird, was wiederum als Grundlage für passive und aktive immuntherapeutische Strategien dient.
Passive Immuntherapie
Im Rahmen einer passiven Immuntherapie werden spezifische monoklonale Antikörper verabreicht, die ein bestimmtes Antigen, wie z.B. GD2 bei neuroektodermalen Tumoren wie dem Neuroblastom, erkennen und mit einer sehr hohen Affinität binden können. Daraufhin werden diverse immunologische Effektormechanismen (z.B. Opsonierung, Neutralisation, Komplementaktivierung, ADCC) ausgelöst, die zu einer effektiven Immunantwort gegen das erkannte Antigen beitragen.
Der erste murine monoklonale anti-GD2 Antikörper 14.18 (IgG3) wurde mittels klassischer Hybridomtechnik nach Immunisierung von BALB/c Mäusen mit humanen LAN-1 Neuroblastomzellen erzeugt [Mujoo et. al, 1987]. Durch einen Klassenwechsel zu IgG2 entstand der murine anti-GD2 Antikörper 14G2a mit gesteigerter ADCC- bzw. CDC-Aktivität, der dann als erster Antikörper beim Neuroblastom klinisch zum Einsatz kam und erste Erfolge erzielte [Handgretinger et al., 1992]. Bei 4 von insgesamt 9 im Stadium 4 befindlichen Patienten konnten hier Komplettremissionen sowie partielle Remissionen erzielt werden. Allerdings traten im Rahmen der Therapie Polyneuropathien mit starken Schmerzen auf, die mit Morphin behandelt werden mussten. Diese Nebenwirkungen sind auf die Expression von GD2 auf peripheren Nervenenden zurückzuführen. Darüber hinaus traten Überempfindlichkeitsreaktionen, wie Juckreiz, Exantheme und Urtikaria auf, die durch die Chimärisierung von 14G2a mit den konstanten Regionen der schweren und leichten Kette eines humanen Immunglobulins der Klasse IgG1 [Gillies et al., 1989] weitgehend gelindert werden konnten. Der daraus entstandene chimäre anti-GD2 Antikörper ch14.18 wurde daraufhin in einer präklinischen [Mueller et al., 1990] sowie in einigen klinischen Studien erfolgreich auf seine Wirksamkeit getestet [Handgretinger et al., 1995], [Yu et al., 1998].
Die zytotoxische Aktivität von ch14.18 konnte zunächst durch eine Kombinationstherapie mit GM-CSF [Ozkaynak et al., 2000], sowie in einer weiteren Phase-I-Pilotstudie durch zusätzliche Gabe von GM-CSF und IL-2 [Gilman et al., 2009] erheblich verbessert werden. Die Kinderonkologin Dr. Alice Yu präsentierte im Mai 2009 die Ergebnisse der randomisierten Children`s Oncology Group (COG) ANBL0032 Phase-III-Studie. Das 2-Jahres-Ereignis-freie Überleben einer Gruppe von Hochrisiko-Neuroblastom Patienten, die nach einer Stammzelltransplantation eine Immuntherapie mit ch14.18 in Kombination mit GM-CSF, IL-2 sowie 13-cis-Retinsäure erhielten wurde mit einer Standardtherapie-Gruppe von Patienten verglichen, die nach der Stammzelltransplantation nur mit 13-cis-Retinsäure weiterbehandelt wurden. 46% der Kinder ohne Immuntherapie und 66% der Kinder mit Immuntherapie zeigten nach zwei Jahren keine Krankheitszeichen. Diese Daten führten zur Aufhebung der Randomisierung, woraufhin alle erkrankten Kinder die Immuntherapie mit ch14.18 erhielten [Yu et al., 2010]. Derzeit wird der Effekt einer adjuvanten Immuntherapie mit ch14.18 in Kombination mit IL-2 und 13-cis-Retinsäure auf die Überlebenswahrscheinlichkeit von Stadium 4 Neuroblastom-Patienten in einer Phase-III-Studie (HR-NBL-1/ESIOP) in Europa getestet, allerdings ohne den Zusatz von GM-CSF, da dieses im europäischem Raum nicht in ausreichender Menge als GMP-Produkt für den klinischen Einsatz zur Verfügung steht. Darüber hinaus wird in der Fachwelt gegenwärtig noch über das tatsächliche therapeutische Potential von GM-CSF diskutiert.
Die zytotoxische Wirkung des chimären anti-GD2 Antikörpers ch14.18 lässt sich über zwei wesentliche Effektorfunktionen erklären: der antikörperabhängigen zellvermittelten Zytotoxizität (ADCC), die vor allem über natürliche Killerzellen vermittelt wird und der komplementabhängigen Zytotoxizität (CDC). Beide Mechanismen führen zur Lyse der Tumorzellen. Bindet ch14.18 auf der Oberfläche von Neuroblastomzellen an GD2, so kann der Fc-Teil des Antikörpers durch Fc-Rezeptor(CD16)-tragende NK-Zellen erkannt und gebunden werden, was wiederum zu einer Kreuzvernetzung der Rezeptoren und zur Ausschüttung zytotoxischer Mediatoren aus den NK-Zellen führt. Die komplementvermittelte Lyse der Tumorzellen wird durch die Komplementbindungsstelle am Fc-Teil des ch14.18 ausgelöst. Nach GD2-Bindung kommt es zur Anlagerung des Faktors C1q an den Antikörper, wodurch die Komplementkaskade eingeleitet und in deren Endphase der zytolytische membrane-attack-complex (C9) gebildet wird [Murphy et al., 2008]. Eine Kombinationstherapie aus ch14.18 und dem immunstimulatorischen Zytokin IL-2 zielt darauf ab, die IL-2-Rezeptor tragenden NK-Zellen zu stimulieren, um den Effekt der antikörperabhängigen zellvermittelten Zytotoxizität zu verstärken.
Da ein Immunglobulin der Klasse G jedoch nur eine Halbwertszeit von circa 21 Tagen [Waldmann et al., 1969], ist für die Aufrechterhaltung einer passiven anti-Tumor Immunantwort die wiederholte Applikation von ch14.18 notwendig. Darüber hinaus bleibt die Bildung eines B- und T-Zell-Gedächtnisses aus, welches eine entscheidende Rolle bei der frühzeitigen Bekämpfung eines Rezidivs spielen könnte. Diese Nachteile können jedoch durch die Einführung einer aktiven Immuntherapiestrategie überwunden werden.
Aktive Immuntherapie
Das Ziel einer aktiven Immunisierung ist die spezifische Aktivierung des Immunsystems mit Hilfe eines Vakzins, das eine humorale und/oder zelluläre Immunantwort induziert. Beim Neuroblastom existieren bisher verschiedene Ansätze zur Herstellung eines Vakzins auf der Grundlage des tumorassoziierten Antigens GD2. Eine aktive Immunisierung mit dem Antigen selbst (GD2/KLH-Konjugat) führte nicht zur Induktion der gewünschten aktiven Immunantwort, denn in der durchgeführten Phase-I-Studie konnten keine anti-GD2 Antikörper detektiert werden, wohingegen aber ein hoher Titer an Antikörpern gegen das Immunadjuvanz KLH verzeichnet worden ist [Becker et al., 2002]. Eine Erklärung dafür liefern die Arbeiten von Mond et al. Aufgrund seiner Glykolipid-Natur handelt es sich bei GD2 um ein ausgesprochen schwaches Immunogen. Es ist ein T-Zell-unabhängiges Antigen, d. h. es wird nicht wie Proteinfragmente durch professionelle antigenpräsentierende Zellen über klassische MHC-Komplexe präsentiert. Die Folge ist eine ineffiziente Immunantwort ohne die Einbeziehung des adaptiven Immunsystems [Mond et al., 1995]. Einzig eine Präsentation durch CD1 ist denkbar. Hierbei handelt es sich um MHC-I-ähnliche Moleküle, die auch auf der Oberfläche von antigenpräsentierenden Zellen wie dendritischen Zellen und B-Zellen exprimiert werden und Lipidantigene präsentieren können [Zeng et al., 1997]. Eine unikale Subpopulation der T-Lymphozyten reagiert besonders auf diese Art der Antigenpräsentation, die natürlichen Killer-T(NKT)-Zellen. Durch die Produktion von Th1- und Th2-Zytokinen [Joyce, 2001] spielen sie bei der Vermittlung zwischen angeborenem und adaptivem Immunsystem eine wichtige Rolle. Die Funktion der NKT-Zellen bei der Tumorabwehr ist allerdings noch nicht eindeutig geklärt. Die Untersuchung der zu einer Anti-Tumor-Antwort beitragenden Mechanismen ist Gegenstand der aktuellen Forschung. Eine Überlegung stellt dabei die Aktivierung von NK-Zellen durch NKT-Zellen dar [Eberl et al., 2000].
Aktive Immunisierungsstrategien können also nur realisiert werden, wenn die Glykolipid-Natur des GD2 so verändert wird, dass aus dem schwachen Immunogen ein klassisches Antigen, also ein Protein bzw. Peptid wird, welches für die Erkennung durch T-Lymphozyten prozessiert und über MHC-Komplexe präsentiert werden kann. Ein Ansatz zur Überwindung der T-Zell-Unabhängigkeit stellt die Herstellung von DNA-Vakzinen dar. Das Prinzip beruht darauf, die DNA-Sequenzen, die für das tumorassoziierte Antigen kodieren, in ein geeignetes Expressionssystem zu integrieren, welches dann nach in vivo Applikation zur Synthese des Proteins führt, das anschließend einer wirkungsvollen Antigenprozessierung und -präsentation zugeführt wird. Für die Entwicklung von DNA-Vakzinen wurden bisher verschiedene wirkungsvolle Ansätze verfolgt. Eine Möglichkeit besteht in der Verwendung von DNA-Vakzinen, die für zyklische, GD2 nachahmende Dekapeptide kodieren [Förster-Waldl et al., 2005]. Die Wirksamkeit dieser sogenannten GD2-Peptid-Mimotope (von griech. Mimos: Nachahmer, Imitator), die Bildung von anti-GD2-Antikörpern zu induzieren, wurde in einem geeigneten Maus-Modell gezeigt [Riemer et al., 2006]. Des Weiteren wurden diese GD2-Peptid-Mimotope gut charakterisiert [Fest et al., 2006] und optimiert [Bleeke et al., 2009].
Eine alternative Grundlage für die Herstellung von DNA-Vakzinen gegen das Neuroblastom bietet die Generierung eines anti-Idiotyp-Antikörpers, der an seiner Antigenbindungsstelle ein „internes Abbild“ von GD2 darstellt und daher anstelle des ursprünglichen Antigens als Vakzin eingesetzt werden kann.
Anti-Idiotyp-Antikörper
Anti-Idiotyp-Antikörper (anti-Id-AK) entstehen, wenn im Rahmen einer Immunreaktion gegen ein bestimmtes Fremd-Antigen der gebildete antigenerkennende Antikörper selbst als Antigen agiert ( ). Die strukturelle Ähnlichkeit des Antigens GD2 und eines solchen anti-Id-Ak kann therapeutisch genutzt werden, um anstelle des Antigens den anti-Id-Ak als Vakzine zur Induktion einer aktiven Immunantwort einzusetzen. Auf diesem Weg ist es möglich, die Glykolipid-Natur des GD2 in ein Protein „umzuwandeln“ und durch die Bildung von anti-anti-Idiotyp-Antikörpern, die in der Lage sind, auch das schwach immunogene GD2 auf den Neuroblastomzellen zu erkennen, eine klinisch relevante anti-Tumor-Immunantwort zu erreichen.
Das therapeutische Potential von anti-Idiotyp-Antikörpern wurde mittlerweile in einigen präklinischen sowie klinischen Studien erforscht. Erste Erfolge erzielten Wissenschaftler durch eine klassische Anti-Idiotyp-Vakzinierung in einem Sarkommodell der Ratte [Dunn et al., 1987]. Die immunisierten Tiere wiesen eine deutlich geringere Anzahl an Lungenmetastasen des anschließend intravenös inokulierten Sarkoms auf. In einem Melanom-Mausmodell konnte eine signifikant bessere Überlebenswahrscheinlichkeit bei Tieren mit einem bereits etablierten Tumor nach der Applikation eines anti-Idiotyp-Antikörpers mit Mimikry des Gangliosids GM3 beobachtet werden [Jinnohara et al., 1998]. Weitere Studien mit ähnlichen Ergebnissen wurden mit tumorassoziierten Antigenen des Nierenzellkarzinoms [Uemura et al., 1994] sowie des Melanoms [Chattopadhyay et al., 1991] erreicht. Der mögliche Einsatz von Anti-Idiotyp-Antikörpern bei Patienten mit malignen Erkrankungen wurde darüber hinaus in diversen klinischen Studien getestet. So konnte bei Patienten mit malignem Melanom, die mit dem anti-Id-Ak MK2-23, der ein Abbild des HMW-MAA-Melanomantigens darstellt, therapiert worden sind, eine signifikant bessere Überlebensdauer beobachtet werden [Mittelman et al., 1995].
Auch auf dem Gebiet der Neuroblastomforschung existieren erste Ansätze zur anti-Idiotyp-Vakzinierung. Eine amerikanische Arbeitsgruppe um Sunil K. Chatterjee entwickelte den anti-Idiotyp-Antikörper 1A7, der ein internes Abbild des Disialogangliosids GD 2 darstellt [Sen et al., 1998; Zeytin et al., 2000]. Durch eine Immunisierung von Mäusen und Kaninchen mit 1A7 konnte eine humorale Immunantwort gegen das ursprüngliche Antigen GD2 erzeugt werden. In einer Phase-II-Studie wurde der anti-Id-Ak 1A7 unter dem Namen TriGem^TM Patienten mit fortgeschrittenem Melanom verabreicht. In 40 der 47 behandelten Erkrankten konnte eine IgG-dominierte Immunantwort nachgewiesen werden [Foon et al., 1998].
Allerdings besteht ein stetiger Bedarf nach weiteren Alternativen. Daher war das der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende technische Problem die Bereitstellung eines alternativen anti-Idiotyp-Antikörpers zum Antigen GD2, welcher im Vergleich zum bekannten 1A7 eine veränderte Bindungsaffinität aufweisen sollte.
Diese Aufgabe wird mit einem anti-idiotypischer Antikörper gemäß Anspruch 1 gelöst. Weitere bevorzugte Ausführungsformen ergeben sich aus den weiteren Ansprüchen.
In anderen Worten wird die Aufgabe mit einem anti-idiotypischen Antikörper gemäß Anspruch 1 gelöst, welcher dadurch gekennzeichnet ist, dass die Aminosäuresequenz der variablen Region der leichten Kette zu mindestens 95% identisch zur SEQ ID Nr 1 und die der variblen Region der schweren Kette zu mindestens 95% identisch zur SEQ ID Nr 3 ist, wobei der Antikörper als Disialogangliosid-GD2-anti-Idiotyp-Antikörper wirksam ist.
Identität zu mindestens 95% bedeutet, dass eine oder mehrere Aminosäuren entfernt, hinzugefügt oder ausgetauscht sind unter Beibehaltung der Funktion des Antikörpers.
Vorzugsweise ist der anti-idiotypischer Antikörper dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäuresequenz der variablen Region der leichten Kette identisch zur SEQ ID Nr 1 und die der variablen Region der schweren Kette identisch zur SEQ ID Nr 3 ist.
Der anti-idiotypische Antikörper ist monoklonal, polyklonal oder rekombinant (erzeugt). Vorzugsweise werden rekombinante oder monoklonale Antikörper genutzt. In einer Ausführungsform ist der Antikörper daher rekombinant. In einer anderen Ausführungsform ist der Antikpörper monoklonal.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ebenfalls eine Hybridomzelllinie, die einen antiidiotypischen Antikörper wie vorangehend beschrieben erzeugt.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Polynucleotid, umfassend Nucleotidsequenzen, welche zu mindestens 95% identisch zur SEQ ID Nr 2 und SEQ ID Nr 4 sind und die für den oben beschriebenen anti-idiotypischen Antikörper kodieren.
Identität zu mindestens 95% bedeutet hier, dass ein oder mehrere Nucleotide entfernt, hinzugefügt oder ausgetauscht unter Beibehaltung der Funktion des resultierenden Antikörpers.
Vorzugsweise umfasst das Polynucleotid Nucleotidsequenzen, welche identisch zur SEQ ID Nr 2 und SEQ ID Nr 4 sind und die für den anti-idiotypischen Antikörper kodieren.
Dass das Polynucleotid die Nucleotidsequenzen welche identisch zur SEQ ID Nr 2 und SEQ ID Nr 4 sind, bzw. welche zu mindestens 95% identisch zur SEQ ID Nr 2 und SEQ ID Nr 4 sind, umfasst, bedeutet, dass auch längere Polynucleotide mit umfasst sind, welche die entsprechenden Sequenzen lediglich als einen Bestandteil enthalten. Dies betrifft insbesondere Fusionsgene, beispielsweise Fusionsgene mit den Nucleotidsequenzen gemäß SEQ ID Nr 2 und SEQ ID Nr 4 (bzw. Sequenzen, welche zu mindestens 95% identisch zu SEQ ID Nr 2 und SEQ ID Nr 4 sind) mit einem Zytokin, beispielsweise GMCSF. Deartige Konstrukte sind explizit mit umfasst. Lediglich in einer eingeschränkten Ausführungsform besteht das erfindungsgemäße Polynucleotid aus Nucleotidsequenzen, welche identisch zur SEQ ID Nr 2 und SEQ ID Nr 4 sind bzw. aus Nucleotidsequenzen, welche zu mindestens 95% identisch zur SEQ ID Nr 2 und SEQ ID Nr 4 und die für den antiidiotypischen Antikörper kodieren.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ebenso eine pharmazeutische Zubereitung, die eine wirksame Menge des anti-idiotypischen Antikörpers oder Polynucleotids wie oben dargestellt enthält. Ebenso umfasst ist ein Impfstoff, enthaltend eine wirksame Menge des anti-idiotypischen Antikörpers oder Polynucleotids. Der Impfstoff enthält in einer bevorzugten Ausführungsform mindestens ein Adjuvanz.
Der anti-idiotypische Antikörper oder das Polynucleotid wird erfindungsgemäß zur Auslösung einer Immunantwort in einem Individuum verwendet. Vorzugsweise wird er zur Auslösung einer gegen das Antigen Disialogangliosid GD2 gerichteten Immunantwort in einem Individuum eingesetzt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird der anti-idiotypische Antikörper oder das Polynucleotid zur Behandlung oder Prävention (Impfung) einer mit GD2-Expression assoziierten Erkrankung verwendet. Die mit GD2 assoziierte Erkrankung ist vorzugsweise ein neuroektodermaler Turmor, welcher GD2 exprimiert. Der neuroektodermale Turmor ist vorzugsweise ausgewählt aus Melanom, Neuroblastom, Sarkom (Ewingsarkom, Osteosarkom), kleinzelligem Lungenkarzinom und Glioblastom. Höchst bevorzugt handelt es sich um Neuroblastome. In anderen Worten stellt der erfindungsgemäße anti-idiotypische Antikörper oder das Polynucleotid einen Krebsimpfstoff dar, d. h. er kann zur aktiven Immunisierung gegen neuroektodermale Tumore genutzt werden.
Ein weiteres erfindungsgemäßes Einsatzgebiet ist ein Verfahren zur Detektion einer gegen GD2 gerichteten Immunantwort, umfassend das in Kontaktbringen einer biologischen Probe des Probanden in vitro mit dem anti-idiotypischen Antikörper und Bestimmen, ob eine gegen GD2 gerichtete Immunantwort auftritt.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform ist ein Verfahren zur Detektion bzw. quantitativen Bestimmung der Konzentration eines anti-GD2-Antikörpers sowie dessen Derivate (anti-GD2-Antikörper-Konjugate (Toxinen oder Radionuklide), Antikörper-Fusionsproteine (Immunzytokine, Immuntoxine), single-chain Varianten) in Proben von Körperflüssigkeit eines Probanden, welchen diese anti-GD2-Antikörper oder dessen Derivate verabreicht wird/werden, wobei die Körperflüssigkeitsprobe in vitro mit dem anti-idiotypischen Antikörper in Kontakt gebracht wird und dass Ausmaß der Reaktion quantitativ bestimmt wird. Bei der Körperflüssigkeit handelt es sich vorzugsweise um Blutserum.
Eine weitere Ausführungsform ist ein Verfahren zur Detektion von Zellen, die genetisch manipuliert wurden, um rekombinante Derivate eines anti-GD2-Antikörpers zu exprimieren. Bei diesen Zellen handelt es sich vorzugsweise um NK-Zellen (Esser 2011) oder T-Zellen (Pule 2008), die einen chimären Antigen-Rezeptor tragen (z.B. NK-92-scFv(ch14.18)-zeta). Zellhaltige Proben werden mit dem anti-idiotypischen Antikörper in Kontakt gebracht und dass Ausmaß der Reaktion wird quantitativ bestimmt.
Nachfolgend wird die Erfindung im Detail erläutert:
Anti-Idiotyp-Antikörper Ganglidiomab
Es wurde das Konzept des GD2-anti-Idiotyp-Antikörpers 1A7 aufgegriffen, um einen neuen, frei verfügbaren anti-Idiotyp-Antikörper zu generieren und die Arbeit auf dem Gebiet der neuroektodermalen Tumore wie dem Neuroblastom voranzutreiben.
Es wurde ein neuer muriner GD2-anti-Idiotyp-Antikörper mittels klassischer Hybridomtechnik erstellt (Zusammenarbeit mit der Firma BioGenes GmbH, Berlin) [Köhler et al., 1975].
BALB/c-Mäuse wurden nach einem festgelegten Immunisierungsprotokoll über 39 Tage mit dem murinen anti-GD2 Antikörper 14G2a in Kombination mit komplettem oder inkomplettem Freudschen Adjuvans immunisiert ( ). Aus den Milzen der Mäuse wurde durch die Fusion mit der Myelomzelllinie SP2/0 Hybridomzellen generiert, die nun in der Lage sind, Antikörper zu produzieren. Diese Klone wurden selektiert sowie nach der Methode der limitierenden Verdünnung vereinzelt und expandiert. Der Subklon, der nach diesen Selektions- und Klonierungsphasen stabil Antikörper gegen den anti-GD2-Antikörper 14G2a produzierte, wurde ausgewählt und als anti-14G2a Klon 17-9 benannt. Die Bestimmung des Antikörper-Isotyps ergab, dass es sich bei dem durch die Hybridomzellen 17-9 produzierten Antikörper um ein Immunglobulin der Klasse IgG1 mit zwei κ leichten Ketten handelt. Dieser Antikörper, d. h. der erfindungsgemäße anti-idiotypische Antikörper, erhielt den Namen Ganglidiomab.
Der mittels Hybridomtechnik neu gewonnene anti-Idiotyp-Antikörper Ganglidiomab wird sowohl als Protein als auch als Grundlage für die Herstellung von DNA-Vakzinen eingesetzt, um eine aktive anti-Tumor-Immunantwort gegen neuroektodermale Tumore, z.B. das Neuroblastom, zu erreichen. Um dieses Ziel zu verfolgen wurde Ganglidiomab auf DNA- und Protein-Ebene untersucht und charakterisiert. Es wurde mit Hilfe der Bindungseigenschaften des anti-GD2-Antikörpers ch14.18 gezeigt, dass es sich bei Ganglidiomab tatsächlich um einen anti-Idiotyp-Antikörper handelt. Weiterhin wurden die DNA-Sequenzen identifiziert, die für die variablen Regionen der schweren und leichten Kette des Antikörpers kodieren. Auf der Basis dieser Sequenzen, kann die Entwicklung von DNA-Impfstoffen zukünftig realisiert werden. Ferner ist mit dieser Sequenzinformation die Herstellung von rekombinanten Varianten von Ganglidiomab möglich. Weiterhin wurde zur rekombinanten Herstellung von Ganglidiomab ein geeignetes Expressionssystem erzeugt. Die Expressionsvektoren pFUSE-CHIg-mG1 sowie pFUSE2-CLIg-mk sind eigens für die Antikörper-Generierung konzipiert worden. pFUSE-CHIg-mG1 kodiert dabei für die konstanten Regionen der schweren Kette eines Antikörpers der Klasse IgG1. Auf dem Vektor pFUSE2-CLIg-mk hingegen ist die DNA-Sequenz integriert, die für die konstante Region der κ leichten Kette kodiert. Durch die Klonierung der variablen Regionen in diese Vektoren und eine Co-Transfektion in CHO-Zellen ist es möglich, ein vollständiges Immunglobulin zu exprimieren. Auf diesem Weg soll festgestellt werden, dass der durch die CHO-Zellen produzierte und sezernierte Antikörper an seinem Paratop ein „internes Abbild“ von GD2 darstellt und durch einen anti-GD2-Antikörper gebunden werden kann. Durch den Nachweis dieses Prinzips können die identifizierten Sequenzen der variablen Regionen von Ganglidiomab für die Herstellung von DNA-Vakzinen genutzt werden, um eine aktive Immunantwort gegen das schwach immunogene GD2 zu erzeugen.
Beispiele
Methoden
Kultivierung von Suspensionszelllinien
Zur Gewinnung der RNA als Ausgangsmaterial für alle folgenden molekularbiologischen und immunologischen Arbeiten, wurden die Hybridomzelllinie anti-14G2A Klon 17-9 sowie transduzierte NK-92-Zellen (NK-92-scFv(ch14.18)-zeta) kultiviert.

Die Hybridomzellen und die NK-92-Zellen wurden ebenfalls in einer 75 cm² Zellkulturflasche in jeweils 15 ml des entsprechenden Mediums, sowie folgenden Zusätzen kultiviert:

Anti-14G2a-Klon 17-9		NK-92-scFv8ch14.18)-zeta(X-VIVO)
DMEM		X-VIVO 10
FCS (inakt.)	10%	Humanserum	5%
Penicillin/Streptomycin	1%	IL-2	100 U/ml
MEM NEAA	1 x	G-418	0,6 mg/ml
β-ME	50 µM

Auch diese Zelllinien wurden regelmäßig unter einem inversen Mikroskop betrachtet. Je nach Zellwachstum wurde alle 2–3 Tage ein Mediumwechsel durchgeführt oder die Zellen passagiert. Bei einem Mediumaustausch sowie beim Splitten der Zellen wurde das gesamte Medium mit den Zellen aus der Flasche abgenommen und in einem 50 ml Falcon Röhrchen gesammelt. Die Zellsuspension wurde anschließend zentrifugiert (5 min, 300 x g, RT) und das Zellpellet in frischem Kulturmedium resuspendiert. Bei einem Mediumwechsel wurde die gesamte Zellsuspension wieder in die Zellkulturflasche übertragen. Um die Zellen jedoch zu passagieren, wurden sie entsprechend ihres Wachstums gesplittet.
Kryokonservierung und Rekultivierung von Zellen
Bei der Kryokonservierung werden Zellen in einem geeigneten Einfriermedium (90% Humanalbumin und 10% DMSO) eingefroren und in flüssigem Stickstoff bei –196°C gelagert. Zur Rekultivierung wurden die Zellen in einem 37°C warmen Wasserbad aufgetaut und in entsprechendem Kulturmedium gewaschen und resuspendiert und die Zellsuspension in eine Zellkulturflasche überführt.
Immunologische Methoden
Durchflusszytometrische Untersuchung der anti-Idiotyp-Eigenschaften
Im ersten Schritt wurden die anti-Idiotyp-Eigenschaften von Ganglidiomab durchflusszytometrisch untersucht. Dabei kamen humane NK-92-Zellen zur Anwendung, die genetisch modifiziert wurden, sodass sie einen GD2-spezifischen chimären Antigenrezeptor auf ihrer Oberfläche exprimieren. Dieser Rezeptor ist ein Fusionsprotein aus einem Einzelketten-variablen Fragment (single chain variable fragment, scFv) des chimären anti-GD2-Antikörpers ch14.18 mit der zeta-Kette des CD3-Komplexes als signaltransduzierender Domäne (NK-92-scFv(ch14.18)-zeta) [Esser et al., 2011] ( ).
Existiert ein molekulares Mimikry zwischen Ganglidiomab und dem Disialogangliosid GD2, kann er durch den Rezeptor der NK-92-Zellen gebunden und detektiert werden.
In der Messung wurde dabei die Bindung durch die NK-92-Zellen mit drei verschiedenen Konzentrationen von Ganglidiomab im Kulturüberstand getestet (1 µg, 0,5 µg und 0,25 µg). Als Positivkontrolle wurde der bereits charakterisierte GD2-anti-Idiotyp-Antikörper 1A7 in den Konzentrationen 1 µg, 0,5 µg und 0,25 µg eingesetzt. Ein Isotyp-Antikörper der Klasse IgG1 kam als Negativkontrolle zum Einsatz. Alle verwendeten Antikörper wurden in FACS-Puffer (1% BSA, 0,1% EDTA, 0,1% NaN₃ in 1 × PBS) verdünnt. Für die Messung wurden pro Ansatz 1 × 10⁶ transduzierte NK-92-Zellen zentrifugiert (7 min, 2300 rpm, RT), in je 100 µl Antikörperlösung (Ganglidiomab, 1A7, Isotyp-Kontrolle) resuspendiert (15 min, 4°C, lichtgeschützt). Im Anschluss wurde 1 ml FACS-Puffer auf die Zellen gegeben, zentrifugiert (7 min, 2300 rpm, RT) und das Zellpellet in je 100 µl einer 1:200 Verdünnung des PE-gekoppelten Sekundärantikörpers (PE-rat-anti-mouse IgG1) resuspendiert (15 min, 4°C, lichtgeschützt). In einem letzten Waschschritt mit 1 ml FACS-Puffer wurde ungebundener Sekundärantikörper entfernt, um unspezifische Signale zu vermeiden. Die Zellen wurden zentrifugiert (7 min, 2300 rpm, RT), in 500 µl FACS-Puffer aufgenommen und die Suspension anschließend in ein 5 ml Rundbodenröhrchen überführt. Durch die Zugabe des DNA-Farbstoffes 7-Aminoactinomycin D (7-AAD), der spezifisch zwischen die Basen Cytosin und Guanin interkaliert, konnte der Anteil lebender Zellen ermittelt werden. Die Messung erfolgte mit dem BD FACS Canto^TM II.
Enzymgekoppelter Immunabsorptionsassay (ELISA)
Der ELISA ist eine sensitive immunologische Methode zum quantitativen Nachweis bestimmter Antigene oder Antikörper in einer Lösung auf der Grundlage einer klassischen Antigen-Antikörper-Reaktion. Bei einem kompetitiven ELISA konkurrieren entweder enzymmarkiertes und unmarkiertes Antigen miteinander um die Bindung an einen beschichteten Antikörper (direkter kompetitiver ELISA) oder ein gebundenes Antigen konkurriert mit dem immobilisierten Antigen um die freien Bindungsstellen der Antikörper (indirekter kompetitiver ELISA).
Indirekter kompetitiver ELISA
Die anti-Idiotyp-Eigenschaften von Ganglidiomab wurden mit Hilfe eines indirekten kompetitiven ELISA untersucht. Dabei wurde eine 96-well Polysorb Mikrotiterplatte mit dem GD2-Antigen (50 ng/well in ≥ 99,9% Methanol) beschichtet (1 h bei 50°C) und dann die freien, ungebundenen Stellen der Platte durch 100 µl/well eines Blockierungspuffers (1% BSA in 1 × PBS) gesättigt (über Nacht bei 4°C). Anschließend wurde die Platte 3 × mit 200 µl/well Waschpuffer (0,1% BSA in PBS) gewaschen und verschiedene Verdünnungen des Kulturüberstandes der Hybridomzellkultur 17-9 (1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600, 0) zusammen mit einer definierten Menge an anti-GD2-Antikörper ch14.18 (500 ng/ml) auf die Platte gegeben (2 h bei 37°C).
Handelt es sich bei Ganglidiomab tatsächlich um einen anti-Idiotyp-Antikörper, der eine strukturelle Ähnlichkeit mit GD2 aufweist, so kommt es zwischen Ganglidiomab und dem gebundenen GD2 zu einer Kompetition um die freien Antigenbindungsstellen von ch14.18. Demzufolge findet eine Inhibition der spezifischen Bindung von ch14.18 an das gebundene GD2 statt ( ).
Je mehr Ganglidiomab dabei im Kulturüberstand vorhanden ist, desto mehr ch14.18 wird durch Ganglidiomab abgefangen. Somit ist weniger ch14.18 für die Bindung an das beschichtete GD2 verfügbar. Zur Detektion des an GD2 gebundenen ch14.18 wurde ein enzymgekoppelter Sekundärantikörper (goat-anti-human-IgG(Fc)-HRP, 1:20000, 1 h bei 37°C) verwendet,. Die Messung der Reaktion erfolgte mittels einer TMB-Lösung (75 µl/well). Hierbei handelt es sich um ein chromogenes Substrat, welches durch die an den Sekundärantikörper gekoppelte Meerrettich-Peroxidase (HRP) in einen blauen Farbstoff umgewandelt wird. Wasserstoffperoxid dient als Substrat für die gebundene Peroxidase. Die beim Abbau entstehenden Sauerstoffradikale führen zur Oxidation des chromogenen Substrates TMB, was sich durch die Bildung eines blauen Farbstoffes zeigt. Zusammensetzung der TMB-Lösung (3,3',5,5'-tetramethylbenzidin), 50 ml:

TMB 0,005 g

DMSO 500 µl

TMB in DMSO lösen

+ 49,5 ml Natriumacetat (0,1 M)

Lösung filtrieren
10 ml TMB-Lösung wurden mit 3,34 µl H₂O₂ versetzt, sofort auf die Platte pipettiert und 30 min im Dunkeln inkubiert. Die Reaktion wurde anschließend mit 50 µl/well H₂SO₄ (2 N Lösung) gestoppt, wobei ein stabiler gelber Farbkomplex entstand. Abschließend konnte die Absorption bei einer Wellenlänge von 450 nm im ELISA-Reader der Firma BioTek gemessen werden.
Molekularbiologische Methoden
Die Isolierung von Gesamt-RNA aus Zellen erfolgte mittels RNeasy^® Mini Kit (siehe Standardprotokoll des Herstellers). Die Bestimmung der Nukleinsäure-Konzentration wurde photometrisch durch Absorption bei einer Wellenlänge von 260 nm bestimmt. Reverse Tramskription der RNA in komplementäre einzelsträngige DNA (cDNA) erfolgte mit dem SuperScript^® II Reverse Transcriptase Kit (siehe Standardprotokoll des Herstellers).
Amplifikation der variablen Regionen von Ganglidiomab:
Alle Primer für die Durchführung der Polymerasekettenreaktionen der vorliegenden Arbeit wurden durch die Firma Eurofins MWG Operon in Ebersberg synthetisiert.
Für die Amplifikation der zu bestimmenden DNA-Sequenzen, die für die variable Region der schweren und leichten Kette von Ganglidiomab kodieren, wurden in verschiedenen Ansätzen, hoch degenerierte 5' Primer verwendet, die an konservierte Strukturen im ersten Framework der variablen Region von leichter und schwerer Kette eines Antikörpers binden [Wang et al., 2000], (Tab. 1) oder an der Leader-Sequenz vor Beginn der variablen Regionen (Tab. 2) laut Protokoll: „Cloning and expression of immunoglobulin variable regions using PCR with redunant primers“ in „Current Protocols in Immunology“ [Coligan et al., 2002]. Bei degenerierten Primern handelt es sich um ein Gemisch aus Oligonukleotiden mit unterschiedlichen Basen an den sogenannten Wobblepositionen eines Tripletts. Jeder dieser Primer besitzt also eine andere Sequenz, wodurch die Synthese der einzigartigen DNA-Sequenzen der variablen Regionen von Ganglidiomab ermöglicht wird. Die eingesetzten isotypspezifischen 3' Primer binden jeweils an die erste konstante Region der IgG1 schweren Kette bzw. der κ leichten Kette.
Mit Hilfe einer Gradienten-PCR, bei der ausgehend von einer mittleren Temperatur ein Gradient von ± 10°C gewählt wurde, konnte die optimale Annealing-Temperatur für die Primer ermittelt werden. Die PCR-Produkte wurden anschließend in einem Agarosegel aufgetrennt. Das Primergemisch, bei dem ein DNA-Fragment entstanden ist, wurde im nächsten Schritt zur Amplifikation der variablen Regionen eingesetzt. Tab. 1: Primersequenzen zur Amplifikation der variablen Regionen von Ganglidiomab (1.Polymerasekettenreaktion)

Der Reaktionsansatz für die PCR zur Amplifikation der DNA-Sequenzen, die für die variable Region der schweren und leichten Kette von Ganglidiomab kodiert, ist im Folgenden aufgeführt. Der gebrauchsfertige Red Taq 1,1 × Master Mix enthält unter anderem 0,11 U/µl der Taq DNA Polymerase sowie 0,22 mM dNTPs. Reaktionsansatz 1. Polymerasekettenreaktion (20 µl):

Schwere Kette:	1x	Red Taq 1,1 × Master Mix (1,5 mM MgCl₂)
	1 µl	10 pmol/µl Primerforward MH1
	1 µl	10 pmol/µl Primerreverse IgG1
	0,5 µl	cDNA
κ-leichte Kette:	1x	Red Taq 1,1 × Master Mix (1,5 mM MgCl₂)
	1 µl	10 pmol/µl Primerforward Mk
	1 µl	10 pmol/µl Primerreverse Kc
	0,5 µl	cDNA

Temperaturprofil der 1. Polymerasekettenreaktion:

Tab. 2: Primersequenzen zur Amplifikation der variablen Regionen von Ganglidiomab (2. Polymerasekettenreaktion)

Die Primer beinhalten Restriktionsschnittstellen für NheI (GCT AGC), EcoRI (GAA TTC), XhoI (CTC GAG) und BstAPI (GCA NNNNN TGC) (unterstrichen) sowie die Ribosomenbindungsstelle (Kozak-Sequenz) (fett gedruckt). Reaktionsansatz 2. Polymerasekettenreaktion (20 µl):

Schwere Kette:	17,5 µl	Red Taq 1,1 × Master Mix (2,0 mM MgCl₂)
	1 µl	10 pmol/µl Primerforward MHALT3.RV
	1 µl	10 pmol/µl Primerreverse RPHJ
	0,5 µl	cDNA
κ-leichte Kette:	17,5 µl	Red Taq1,1 × Master Mix (2,0 mM MgCl₂)
	1 µl	10pmol/µl Primerforward MLALT5.RV
	1 µl	10pmol/µl Primerreverse RPLJ
	0,5 µl	cDNA

Temperaturprofil der 2. Polymerasekettenreaktion:

Um die Reinheit der PCR-Produkte zu gewährleisten, wurden sie mit Hilfe eines Agarosegels aufgetrennt und anschließend aus diesem Gel aufgereinigt.
DNA-Extraktion aus Agarosegelen
Die Aufreinigung der aufgetragenen PCR-Prdoukte aus dem Agarosegel erfolgte mit dem Nucleo Spin^® Extract II Kit nach dem Standardprotokoll des Herstellers.
TA-Klonierung der PCR-Produkte in den pCR^®2.1-TOPO Vektor
Um die DNA-Sequenzen der variablen Region der schweren und leichten Kette von Ganglidiomab mittels Sequenzierung zu identifizieren, wurden die PCR-Produkte in den pCR^®2.1-TOPO Vektor (Vektorkarte in ) kloniert und anschließend in elektrokompetente E. coli-Bakterien transformiert. Für die Klonierung wurde das TOPO TA cloning^® Kit verwendet (siehe Standardprotokoll des Herstellers).

Zunächst wurde die im Kit enthaltene Salzlösung (1,2 M NaCl; 0,06 M MgCL₂) 1:4 mit A. dest. verdünnt. Mit folgendem Reaktionsansatz wurden die PCR-Produkte in den pCR^®2.1-TOPO Vektor ligiert: Reaktionsansatz:

Schwere Kette:	2 µl	PCR-Produkt: variable Region der schweren Kette (SK)
	1 µl	Salzlösung
	2 µl	A. dest.
	10 ng	pCR^®2.1-TOPO Vektor
κ-leichte Kette:	2 µl	PCR-Produkt: variable Region der leichten Kette (LK)
	1 µl	Salzlösung
	2 µl	A. dest.
	10 ng	pCR^®2.1-TOPO Vektor

Der Ansatz wurde vorsichtig gemischt, 5 min bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend auf Eis abgekühlt.
Transformation von One Shot^® TOP10 elektrokompetenten Bakterien
Unter einer Transformation versteht man die Aufnahme von frei vorliegender DNA in kompetente Bakterienzellen. Bei den im TOPO TA cloning^® Kit vorhandenen One Shot^® Top10 Bakterien handelt es sich um einen elektrokompetenten E.coli-Stamm (siehe Herstellerbeschreibung) mit folgendem Genotyp:
Für die Transformation wurden zwei Röhrchen à 50 µl One Shot^® TOP10 elektrokompetente E.coli langsam auf Eis aufgetaut und mit 2 µl des jeweiligen Reaktionsansatzes vorsichtig vermischt. Der gesamte Ansatz wurde anschließend in eine auf Eis vorgekühlte Elektroporationsküvette (2 mm Spaltbreite) überführt, in den Multiporator eingesetzt und der Impuls mit folgenden Geräteeinstellungen gestartet:

Spannung U: 2500 V

Zeitkonstante(τ): 5 ms

Anzahl der Pulse(n): 1
Sofort nach dem Impuls wurden die Bakterien in der Küvette mit 350 µl auf 37°C vorgewärmten S.O.C. Medium versetzt, in ein 1,5 ml Röhrchen überführt und eine Stunde bei 37°C schüttelnd (600 rpm) inkubiert, um die Antibiotika-Resistenz aufzubauen. 50 µl der Zellsuspensionen wurden auf selektiven LB-Agar-Platten (50 µg/ml Ampicillin), die zuvor mit 40 µl X-Gal (40 mg/ml in DMF) beschichtet worden sind, ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Zusammensetzung LB (Luira/Miller)-Agarplatten:

Trypton 10 g/l

Hefeextrakt 5 g/l

Natriumchlorid 10 g/l

Agar 15 g/l

pH-Wert 7,0 ± 0,2
Herstellung:

40 g Trockenmedium in 1 l A. dest.
15 min bei 121°C autoklavieren

Mini-Plasmidpräparation
Für eine Mini-Plasmidpräparation wurden die auf den selektiven Agarplatten gewachsenen Einzelkolonien gepickt und in 3 ml LB-Medium mit 50 µg/ml Ampicillin über Nacht im Schüttelinkubator bei 37°C und 160 rpm inkubiert. Zusammensetzung LB (Luria/Miller)-Medium:

Trypton 10 g/l

Hefeextrakt 5 g/l

Natriumchlorid 10 g/l

pH-Wert 7,0 ± 0,2
Herstellung:

25 g Trockenmedium in 1 l A. dest.
15 min bei 121°C autoklavieren

Die Isolation der Plasmide erfolgte am nächsten Tag mit Hilfe des QIAprep^® Spin Miniprep Kits nach dem Standardprotokoll des Herstellers.
Restriktionsanalyse

Durch eine Restriktionsanalyse wurde anhand der Größe des PCR-Produktes eine erfolgreiche Ligation des Inserts überprüft. Im pCR^®2.1-TOPO Plasmid befinden sich vor und nach der MCS die Erkennungssequenzen für die Restriktionsendonuklease EcoRI. Um eine erfolgreiche Insertion der DNA-Sequenzen, die für die variable Region der schweren und κ-leichten Kette kodieren, zu überprüfen, wurden die Plasmide mit EcoRI in dem vom Hersteller empfohlenen dazugehörigen Puffer geschnitten. Die Auswertung erfolgte anschließend durch die elektrophoretische Auftrennung der entstandenen Banden in einem Agarosegel (2%). Reaktionsansatz Restriktionsanalyse (20 µl):

Schwere Kette(SK):	1 µg	pC^®R2.1-TOPO Vektor-SK
	2 µl	10 × NEB Puffer EcoRI
	2 U	EcoRI
	ad 20 µl	A. dest.
κ-leichte Kette(LK):	1 µg	pC^®R2.1-TOPO Vektor-LK
	2 µl	10 × NEB Puffer EcoRI
	2 U	EcoRI
	ad 20 µl	A. dest.

Sequenzierung der Plasmide erfolgte durch die Firma LGC Genomics. Die Auswertung der Sequenzen erfolgte mit Hilfe der 5. Auflage der KABAT Datenbank „Sequences of Proteins of Immunological Interest" [Kabat et al., 1991].
Herstellung der Expressionssysteme

Durch eine Ligation der variablen Regionen in die Vektoren pFUSE-CHIg-mG1 und pFUSE2-CLIg-mk wurde das Expressionssystem für die nachfolgende Transfektion in CHO-Zellen hergestellt (Vektorkarten pFUSE-CHIg-mG1 und pFUSE2-CLIg-mk siehe Produktbeschreibung des Herstellers). Restriktionsansatz pFUSE-CHIg-mG1 und pCR^®2.1-TOPO Vektor-SK:

Komponente	pFUSE-CHIg-mG1	pCR^®2.1-TOPO Vektor-SK
Menge Vektor	3 µg	5 µg
10 × NEB-Puffer 4	3 µl	5 µl
BSA	100 µg/ml	100 µg/ml
EcoRI	4 U	4 U
NheI	4 U	4 U
A. dest.	dd 30 µl	dd 50 µl

Die Ansätze wurden 2 h bei 37°C inkubiert und die Restriktionsenzyme anschließend 20 min bei 65°C hitzeinaktivert. Um die Religation des Expressionsvektors zu vermeiden, wurden die 5'-Phosphatreste durch die Zugabe einer alkalischen Phosphatase (0,5 U/µg Vektor- DNA) 1 h bei 37°C entfernt. Restriktionsansatz pFUSE2-CLIg-mk und pCR^®2.1-TOPO Vektor-LK:

Komponente	pFUSE2-CLIg-mk	pCR^®2.1-TOPO Vektor-LK
Menge Vektor	3 µg	5 µg
10 × NEB-Puffer 4	3 µl	5 µl
BSA	100 µg/ml	100 µg/ml
XhoI	4 U	4 U
BstAPI	4 U	4 U
A. dest.	dd 30 µl	dd 50 µl

Die Ansätze wurden zunächst 2 h bei 37°C (XhoI) und anschließend 2 h bei 60°C (BstAPI) inkubiert, hitzeinaktivert und die 5'-Phosphatreste durch das Enzym alkalische Phosphatase (s. o.) entfernt. Die geschnittenen Produkte wurden anschließend mittels Agarosegelelektrophorese aufgereinigt und ligiert.
Für die Ligation wurde der Expressionsvektor mit der entsprechenden variablen Region in verschiedenen molaren Verhältnissen von 1:1, 1:3 und 1:9 in einem Ligationspuffer gemischt und durch die Zugabe der T4 DNA-Ligase ligiert. Mit folgender Formel konnte die Menge des einzusetzenden Inserts ausgehend von 50 ng Vektor berechnet werden. ng Insert = ng Vektor × kb Insert / kb Vektor × Ratio Insert / Vektor Ligationsansatz EcoRI/NheI-CIP-pFUSE-CHIg-mG1 + EcoRI/NheI-SK (21 µl):

50 ng EcoRI/NheI-CIP-pFUSE-CHIg-mG1

15 ng EcoRI/NheI-SK

ad 10 µl A. dest.

10 µl 2 × Quick Ligation Reaction Puffer

1 µl Quick T4 DNA-Ligase

Ligationsansatz XhoI/BstAPI-CIP-pFUSE2-CLIg-mk + XhoI/BstAPI-SK (21 µl):

50 ng XhoI/BstAPI-CIP-pFUSE2-CLIg-mk

15 ng XhoI/BstAPI-SK

ad 10 µl A. dest.

10 µl 2 × Quick Ligation Reaction Puffer

1 µl Quick T4 DNA-Ligase
Die Ligationsansätze wurden 1 h lang bei RT inkubiert. Anschließend erfolgte die Transformation in chemisch kompetente E.coli JM109 mit folgendem Genotyp:
endA1, recA1, gyrA96, thi, hsdR17, (rk-, mk-), relA1, supE44, (lac-proAB), [Φ, traD36, proAB, laqI q Z M15]
Hierzu wurden 50 µl der Bakterien mit 10 µl Ligationsansatz vorsichtig vermischt und 20 min auf Eis inkubiert. Im Anschluss erfolgte 60 s lang ein Hitzeschock bei 42°C in einem nicht sprudelnden Wasserbad. Die Bakterien wurden dann 2 min auf Eis abgekühlt und mit 300 ml S.O.C. Medium versetzt. Nach einer einstündigen Inkubation bei 37°C und 650 rpm wurden die Bakterien auf selektiven LB-Agarplatten mit 50 µg/ml Zeocin für erfolgreich transformierte Bakterien mit pFUSE-CHIg-mG1-SK bzw. 100 µg/ml Blasticidin für die mit pFUSE2-CLIg-mk-LK transformierten Bakterien ausplattiert.
Am darauf folgenden Tag wurden Kolonien gepickt und mittels einer Kolonie-PCR auf eine erfolgreiche Ligation des entsprechenden Inserts überprüft. Dafür wurde etwa die Hälfte der Bakterienkolonie in 50 µl steriles A. dest. überführt, für 2 min auf 96°C erhitzt und zentrifugiert. Der Überstand konnte dann als Template für die folgende PCR eingesetzt werden. Als Positivkontrolle wurde an Stelle des Überstandes die cDNA eingesetzt, die als Template zur Synthese und Amplifikation der variablen Regionen eingesetzt wurde. Reaktionsansatz Kolonie-PCR pFUSE-CHIg-mG1-SK (50 µl):

17,5 µl Red Taq 1,1 × Master Mix (2,0 mM MgCl₂)

1 µl 10 pmol/µl Primer_forwardMHALT3.RV

1 µl 10 pmol/µl Primer_reverse RPHJ

30,5 µl Template

Reaktionsansatz Kolonie-PCR pFUSE2-CLIg-mk-LK (50 µl):

17,5 µl Red Taq 1,1 × Master Mix (2,0 mM MgCl₂)

1 µl 10 pmol/µl Primer_forwardMLALT5.RV

1 µl 10 pmol/µl Primer_reverseRPLJ

30,5 µl Template

Temperaturprofil der Kolonoie – PCR:
Mittels Agarose-Gelelektrophorese wurden die PCR-Produkte anschließend aufgetrennt, um sie auf die erfolgreiche Insertion der variablen Regionen zu analysieren. Das restliche Material von 5 positiven Kolonien wurde erneut gepickt und in 3 ml LB-Medium mit 50 µg/ml Zeocin bzw. 100 µg/ml Blasticidin über Nacht im Schüttelinkubator bei 37°C und 160 rpm vermehrt. Am darauffolgenden Tag konnten die Plasmide isoliert und durch einen Restriktionsverdau zusätzlich auf das Vorhandensein des Inserts überprüft werden.
Proteinanalytische Methoden
Herstellung von Zelllysaten
Für die Durchführung proteinanalytischer Untersuchungen mussten zunächst die Zellproteine gewonnen werden. Dafür wurden 1 × 10⁶ anti-14G2A Hybridomzellen 17-9 mit PBS gewaschen und in 300 µl Lysispuffer (10 mM Tris, 10 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 0,5% Triton X-100, 0,02% NaN₃) der mit 1 µl eines Protease-Inhibitor-Cocktails versetzt war, 30 min auf Eis lysiert. Der Protease-Inhibitor-Cocktail setzt sich aus den Inhibitoren 4-(2-Aminoethyl)-benzensulfonylfluorid (AEBSF), Pepstatin A, E-64, Bestatin, Leupetin und Aprotinin zusammen und wird zur Inaktivierung von Serin-, Cystein-, Aspartatproteasen sowie Aminopeptidasen eingesetzt, damit der Abbau der Proteine verhindert wird.
Im Anschluss an die Zelllyse wurde das Lysat zentrifugiert (15 min, 10000 × g, 4°C). Der proteinhaltige Überstand wurde vorsichtig abgenommen, die Proteinkonzentration nach Bradford gemessen und bis zur weiteren Analyse bei –20°C gelagert.
SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) und Western Blot

Für den Nachweis von Ganglidiomab im Zelllysat und Kulturüberstand wurde ein 8% Trenngel sowie ein 4% Sammelgel verwendet (Tab. 3). Eine definierte Menge des Proteins (20 µg bzw. 40 µg) wurden in einem Verhältnis von 1:2 mit Laemmli-Probenpuffer versetzt. Für reduzierende Bedingungen mit β-Mercaptoethanol wurden 950 µl Laemmli-Probenpuffer mit 50 µl β-Mercaptoethanol versetzt und ebenfalls im Verhältnis 1:2 mit der Probe vermischt. Diese Ansätze wurden anschließend 5 min bei 95°C erhitzt, um die Proteine vollständig zu denaturieren. Das polymerisierte SDS-PAGE-Gel wurde anschließend vertikal in die Elektrophoresekammer eingespannt. Der Tank wurde mit 1 × Laufpuffer (25 mM Tris, 192 mM Glycin, 0,1% SDS, pH 8,3) vollständig gefüllt, der Kamm entfernt und die Proben in die Taschen pipettiert. Als Größenstandard wurde der Precision Plus Protein^TM WesternC^TM Standard mitgeführt. Für die Konzentrierung der Proben im Sammelgel wurde für die ersten 20 min ein elektrisches Feld mit einer Spannung von 80 V angelegt. Mit dem Eintritt in das Trenngel wurde diese auf 110 V erhöht. Nach ca. 1,5 h wurde die Gelelektrophorese beendet. Tab. 3: Zusammensetzung von Trenn- und Sammelgel

Komponente	Trenngel (8%)	Sammelgel (4%)
1,5 M Tris-HCl (Sammelgelpuffer), 0,4% SDS, pH 6,8	-	925 µl
0,5 M Tris-HCl (Trenngelpuffer), 0,4% SDS, pH 8,8	3000 µl	-
40% Acrylamid/Bisacrylamid	2400 µl	415 µl
A. dest.	6550 µl	2400 µl
Lösung mischen
12,5% APS	96 µl	30 µl
TEMED	10 µl	3,75 µl

Transfer auf eine Polyvinylidenfluorid-Membran (PVDF)
Nach der gelelektrophoretischen Auftrennung der Proteine in einem Natriumdodecyl-Polyacrylamidgel erfolgte der Transfer der Proteine im Nass-Blot-Verfahren auf eine proteinbindende PVDF-Membran (0,2 µm Porengröße). Der Proteintransfer erfolgte unter ständigem Rühren des Puffers 1 h bei konstanten 100 V.
Immundetektion
Unspezifische Proteinbindestellen der PVDF-Membran wurden direkt nach dem Proteintransfer 50 min bei RT mit 5% Magermilch geblockt. Im Anschluss erfolgte die Inkubation mit dem Primärantikörper ch14.18 (1 µg/ml in TTBS (20 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,1% Tween 20, pH 7,5)) bei 4°C über Nacht. Am darauffolgenden Tag wurde die Membran zur Entfernung nicht gebundener Antikörper 6 × 10 min mit TTBS gewaschen. Im weiteren Schritt wurde die Membran mit dem Sekundärantikörper goat-anti-human (Fc-spezifisch)-HRP in einer Verdünnung von 1:20000 in TTBS für 45 min bei RT unter leichtem Schwenken inkubiert. In diese Antikörperlösung wurde zur Visualisierung des Markers das Precision Protein^TM StrepTactin-HRP-Konjugat in einer Verdünnung von 1:10000 gegeben. Nach der Entfernung ungebundenen Sekundärantikörpers durch mehrere Waschschritte (6 × 10 min mit TTBS), konnte das Substrat zur Visualisierung der detektierten Proteine vorbereitet werden. Dafür wurde 6 ml Immun-Star^TM HRP Luminol/Enhancer mit 6 ml Immun-Star^TM HRP Peroxide Buffer gemischt und anschließend für 5 min auf die Membran gegeben. Die an den Sekundärantikörper gekoppelte Peroxidase kann das Luminol oxidieren, wodurch ein Chemilumineszenzsignal entsteht, das dann mit Hilfe des ChemieDoc^TM XRS⁺ Molecular Imager aufgenommen wurde.
Coomassie-Färbung
Eine Coomassie-Färbung wird zur Färbung der in einem SDS-PAGE-Gel aufgetrennten Proteine oder zur Kontrolle des Gels auf nicht transferierte Proteine nach dem Transfer auf eine Trägermembran benutzt (50 ml BioSafe^TM Coomassie G-250 Stain-Färbelösung für 1 h). Durch das nachfolgende Waschen des Gels mit A. dest (3 × 10 min), wurde das Gel entfärbt und die Proteinbanden erscheinen blau.
Nachweis der anti-Idiotyp-Eigenschaften von Ganglidiomab
Im ersten Schritt wurde der neue Antikörper Ganglidiomab auf seine anti-Idiotyp-Eigenschaften getestet.
Beispiel 1: Durchflusszytometrische Untersuchung der anti-Idiotyp-Eigenschaften
Eine Möglichkeit die Spezifität eines Antikörpers zu bestimmen, ist eine Messung von fluoreszenzmarkierten Zellen, die ein für den zu untersuchenden Antikörper spezifisches Antigen auf ihrer Oberfläche exprimieren. Mit Hilfe von genetisch veränderten NK-92-Zellen, die einen GD2-spezifischen chimären Antigenrezeptor auf ihrer Oberfläche tragen, sollte durchflusszytometrisch bestimmt werden, ob es sich bei dem neu generierten Ganglidiomab um einen anti-Idiotyp-Antikörper handelt. Die genetisch modifizierte NK-Zelllinie NK92-scFv(ch14.18)-zeta exprimiert ein Einzelketten-variables Fragment (scFv) des Antikörpers ch14.18 und bindet spezifisch an GD2 [Esser et al., 2011]. Demnach sollte Ganglidiomab im Kulturüberstand der Hybridomzellen den chimären Rezeptor binden. Zunächst wurde der Anteil lebender Zellen durch die Zugabe des DNA-Farbstoffs 7-Aminoactinomycin D (7-AAD), der sich in die DNA apoptotischer Zellen einlagert, bestimmt. Nur dieser Anteil der Zellen wurde für die Messung und Auswertung der Daten verwendet. Durch die Messung der Isotyp-Kontrolle wurde der Schwellenwert für das Analysenfenster festgelegt. Demnach wurden alle Signale ab einer Fluoreszenzintensität von 10² für positiv bewertet. In , A sind die Daten zur Analyse der Bindung von Ganglidiomab durch die humanen, genetisch modifizierten NK-Zellen im Vergleich zu dem bereits in der Literatur beschriebenen GD2-anti-Idiotyp-Antikörper 1A7 [Sen et al., 1998; Zeytin et al., 2000] dargestellt. Es konnte gezeigt werden, dass Ganglidiomab durch die NK-Zellen gebunden werden kann ( , A). Weiterhin konnte eine konzentrationsabhängige Abnahme der Signalstärke von Ganglidiomab verzeichnet werden ( , B).
NK-Zellen, die genetisch modifiziert wurden, tragen auf ihrer Zelloberfläche einen GD2-spezifischen Rezeptor, der aus der antigenbindenden Domäne des chimären anti-GD2-Antikörpers ch14.18 und der zeta-Kette des CD3-Komplexes als signaltransduzierender Domäne besteht (NK-92-scFv(ch14.18)-zeta) [Esser et al., 2011]. In der Analyse wurde gezeigt, dass Ganglidomab durch die NK-Zellen spezifisch gebunden werden kann. Ein Vergleich mit dem bereits in der Literatur beschriebenen GD2-anti-Idiotyp-Antikörper 1A7 [Sen et al., 1998; Zeytin et al., 2000], der als Positivkontrolle beim Assay diente, erbrachte den Nachweis, dass es sich bei Ganglidiomab tatsächlich um einen anti-Idiotypen handelt, der strukturelle Ähnlichkeit mit dem Disialogangliosid GD2 besitzt und dementsprechend durch den GD2-spezifischen Rezeptor der transduzierten NK-92-Zellen spezifisch gebunden wird. Interessanterweise zeigte Ganglidiomab eine höhere Bindungsaffinität zum chimären Rezeptor der transduzierten, humanen NK-92-Zellen, als der bekannte anti-Idiotyp-Antikörper 1A7, was Ganglidiomab zu einem effektiveren anti-Idiotyp-Antikörper für eine aktive Immuntherapie machen könnte. Um die Bindungsaffinität von Ganglidiomab zu ch14.18 im Vergleich mit 1A7 besser beurteilen zu können, ist es möglich, mit Hilfe der Biacore-Technologie eine Echtzeitmessung der jeweiligen Bindungsstärken durchzuführen. Mit diesem Verfahren lassen sich labelfreie Analysen der Proteininteraktionen sowie Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen realisieren.
Beispiel 2: Indirekter kompetitiver ELISA
Im nächsten Schritt der Charakterisierung des anti-Idiotyp-Antikörpers sollte mit Hilfe eines indirekten kompetitiven ELISA der Antikörper Ganglidiomab im Kulturüberstand der Hybridomzelllinie anti-14G2A Klon 17-9 auf seine anti-Idiotyp-Eigenschaften untersucht und die konzentrationsabhängige Inhibition der spezifischen Bindung von ch14.18 an GD2 durch Ganglidiomab dargestellt werden. Das Reaktionsprinzip bestand dabei in der Kompetition des im Kulturüberstand befindlichen Ganglidiomabs mit immobilisiertem GD2 um die freien Antigenbindungsstellen des anti-GD2-Antikörpers ch14.18. Die Intensität des gemessenen Signals ist dabei umgekehrt proportional zur Menge des Antikörpers Ganglidiomab im Kulturüberstand. In ist die Inhibition in Abhängigkeit von der Verdünnungsstufe des Hybridom-Kulturüberstandes 17-9 dargestellt.
Eine 100%ige Inhibition der Bindung von ch14.18 an GD2 konnte durch den Einsatz des unverdünnten Kulturüberstandes erreicht werden. Selbst bei einer Verdünnung von 1:25 war nur eine leichte Abnahme der Hemmung zu verzeichnen. Dieser Effekt nahm jedoch mit stärkerer Verdünnung des Kulturüberstandes zu. Bei der entsprechenden Isotyp-Kontrolle, also einem Antikörper der gleichen Immunglobulinklasse mit einer anderen Epitopspezifität, konnte dieser Effekt nicht gezeigt werden.
Das durchflusszytometrische Ergebnis aus Beispiel 1 wird durch die Daten des kompetitiven ELISA bekräftigt. Es konnte eine 100%ige Inhibition der spezifischen Bindung des chimären anti-GD2-Antikörpers ch14.18 an das beschichtete Antigen GD2 durch Ganglidiomab im Kulturüberstand der Hybridomzellen 17-9 nachgewiesen werden. Der Antikörper ch14.18 wird durch Ganglidiomab zu 100% spezifisch gebunden. Aus diesem Grund findet keine Bindung ch14.18 an das beschichtete GD2 statt.
Beispiel 3: Immunologischer Nachweis von Ganglidiomab mittels Western Blot
Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war es, im Anschluss an die Transfektion in CHO-Zellen, die Antikörper-Expression durch die pFUSE-Vektoren im Kulturüberstand bzw. auch in den Zellen nachzuweisen. Dafür ist ein geeigneter Western Blot für den immunologischen Nachweis von Ganglidiomab im Zelllysat sowie im Kulturüberstand etabliert worden. Zur Detektion dient der monoklonale anti-GD2-Antikörper ch14.18 als Primärantikörper, dessen humaner Fc-Teil wiederum durch einen HRP-gekoppelten goat-anti-human-Sekundärantikörper erkannt und gebunden werden kann.
zeigt das Ergebnis einer Proteinanalyse mittels Western Blot, bei dem Ganglidiomab sowohl im Zelllysat, als auch im Kulturüberstand der Hybridomzelllinie anti-14G2A Klon 17-9 nachgewiesen wurde. Es zeigt sich je eine Bande bei 250 kDa.
Beispiel 4: Vergleichende Untersuchung der Affinität der anti-Idiotyp Antikörper Ganglidiomab und 1A7 an den nominalen Antikörper ch14.18 mittel Biacore Messungen
Die vergleichende Messung der Affinitäten von anti-Idiotyp Antikörper Ganglidiomab und 1A7 an den nominalen Antikörper ch14.18 mittels Biacore Messungen beruht auf dem Prinzip der Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie. Auf der Goldschicht des Sensor-Chips befindet sich eine dünne Schicht aus carboxymethylierten Dextranen, welche nach ihrer Aktivierung die zu untersuchenden Liganden binden können (Immobilisation des Liganden). Die Menge des Liganden spielt für die Analyse eine entscheidende Rolle. Verschiedene Konzentrationen der beiden Liganden (ch14.18 und Rituximab als Negativkontrolle) wurden getestet. Für die Immobilisation wurde jeweils eine Konzentration von 2,3 µg/ml verwendet.
Auf den Chip wurden zwei Liganden immobilisiert:

1. Kanal: Negativkontrolle (Rituximab)
2. Kanal: ch14.18

Ganglidiomab und 1A7 werden über die beiden Kanäle in festgelegten Konzentrationen injiziert. Dabei sind folgende Parameter relevant: Flussrate (wie schnell der Antikörper über die Liganden gegeben wird), Kontaktzeit oder Assoziation (zwischen dem Liganden und dem Antikörper) und Dissoziationszeit. Nach Vorversuchen wurden folgende Parameter als optimal gefunden:

Flussrate: 5 µl/min

Kontaktzeit: 1080 s

Dissoziationszeit: 780 s
Folgende Konzentrationen der zu untersuchenden Antikörper (Ganglidiomab und 1A7) wurden für die Analyse verwendet:

1. 193,33 µg/ml
2. 96,67 µg/ml
3. 46,77 µg/ml
4. 23,39 µg/ml
5. 11,6 µg/ml
6. 5,8 µg/ml
7. 2,9 µg/ml
8. 1,46 µg/ml
9. 0,73 µg/ml

Die Affinität der ch14.18 und Ganglidiomab bzw. ch14.18 und 1A7 wird zunächst mithilfe der „steady state“ Analyse evaluiert. K_D-Werte:

1. ch14.18 und Ganglidiomab: 3,18E–07

2. ch14.18 und 1A7: 1,76E–07
Es ist festzustellen, dass die K_Ds der beiden Antiidiotyp-Antikörper sich voneinander unterscheiden.
Für die Erfassung der einzelnen Assoziations- bzw. Dissoziationskonstanten wurden drei mathematische Modelle analysiert: Monovalente Bindung, bivalente Bindung und Heterogene Bindung. Das Modell der „bivalente Bindung“ beschreibt das Bindungsverhalten am besten. Entsprechend dieses Modells werden während der Assoziationsphase zwei Komplexe gebildet: AB und AB₂. Die Assoziationskonstante des ersten Komplexes heißt ka1, des zweiten ka2. Bei der Dissoziation sind ebenfalls zwei Komplexe von einander zu unterscheiden: AB und AB₂. Dementsprechend gibt es auch zwei Dissoziationskonstanten: kd1 und kd2. (siehe ). Entsprechend des bivalenten Bindungsmodells ergeben sich die in Tabelle 4 dargestellten Werte. Tab. 4 Assoziationskonstanten der beiden Komplexe:

ch14.18-Ganglidiomab ch14.18-1A7

AB 5,77E+03 9,99E+03

AB₂ 2,99E–03 3,96E–04

Dissoziationskonstanten der beiden Komplexe:

ch14.18-Ganglidiomab ch14.18-1A7

AB 6,60E–04 3,36E–03

AB₂ 1,52E–02 9,69E–03
Im Vergleich zu einander ergibt sich folgendes Ergebnis: Bei der AB Bindung assoziiert 1A7 mit ch14.18 um 1,7-fach stärker als Ganglidiomab. Jedoch dissoziiert 1A7 von ch14.18 5-fach stärker als Gangdlidiomab. Bei der AB₂ von Ganglidiomab und ch14.18 ist die Assoziation um 7-fach und die Dissoziation um 1,62-fach stärker, als von 1A7 und ch14.18.
Hieraus ergibt sich ein klarer Unterschied zwischen ganglidiomab und 1A7.
Beispiel 5: Induktion einer humoralen anti-GD2 Immunantwort nach Immunisierung mit Ganglidiomab
Die Wirkung von ganglidiomab als Antigen zur Induktion einer anti-GD2 Immunantwort wurde in immunkompetenten Mäusen untersucht. Zu diesem Zweck wurden Balb/c Mäuse mit an Al(OH)₃ adsorbiertem Ganglidiomab immunisiert. Dieses erfolgte durch intraperitoneale Injektion von 100 µg Ganglidiomab (Al(OH)₃) an den Tagen 3, 17 und 31. Das Serum zur Bestimmung einer anti-GD2 Immunantwort wurde an den Zeitpunkten 0, 10, 25, 38 und 55 aus der Schwanzvene entnommen.
Eine Anti-GD2 Immunantwort wurde durch einen ELISA-Assay getestet, bei dem GD2 auf der Platte immobilisiert vorlag (50 ng/well). Zu diesem Zweck werden 50 ng GD2 in 50 µl Methanol pro well einer 96 Lochplatte (Nunc 96well Polysorp Plate) pipettiert. Das Methanol wird bei 50°C verdampft (1 h). Unspezifische Bindung wird durch Zugabe von 100 µl 1% BSA/PBS Puffer (pH 7,4) blockiert (4°C, über Nacht). Blockingpuffer wird vorbereitet.
Das Serum der immunisierten Mäuse wurde mit dem immobilisierten GD2 in folgenden Arbeitsschritten inkubiert:

1. Blotten: Platte auf Papiertuch leicht ausklopfen
2. 3 × mit 0,1% BSA-PBS-Waschpuffer waschen
3. Pro Probe 6 × 100 µl PBS in ein 1,5 ml Röhrchen vorlegen
4. Proben vorbereiten: 10 µl Mausserum + 190 µl PBS (Verdünnung 1:20) [Proben 1–8]
5. Platte dreimal waschen (siehe oben)
6. 50µl Proben (Probe 1–8), Positivkontrolle (PK, 14G2a), Negativkontrolle (NK, IgG2a Isotypkontrolle) oder Blanks werden nach folgendem Schema in die Vertiefungen der 96 Lochplatte pipettiert:

7. Platte mit einer Folie abdecken
8. Bei 37°C 2 Stunden inkubieren (oder über Nacht bei +4°C)
9. Sekundärantikörper Goat-anti-Mouse-Fc-HRP (Sigma, A9309) vorbereiten: 1:20000 in PBS (1,1 µl + 22 ml für 2 Platten), vortexen
10. Platte fünfmal waschen (siehe oben)
11. 50 µl Sekundärantikörper pro Well pipettieren:
12. 1 Stunde bei 37°C inkubieren (lichtgeschützt)
13. Platte fünfmal waschen (siehe oben)
14. 75 µl TMB-Lösung pro Well pipettieren
s15. 30 min im Dunkeln bei RT inkubieren (Positivkontrollen werden intensiv blau)
16. 50 µl von 2NH₂SO₄ pro Well pipettieren, um die Reaktion zu stoppen
17. bei 450 nm die Absorption messen

Der relative Anstieg der Absorption wurde berechnet, indem der Wert an Tag 0 (vor Immunisierung) = 1 gesetzt wurde.
Alle mit ganglidiomab immunisierten Mäuse zeigten eine antiGD2 spezifische Immunantwort. Der Titerverlauf ist in gezeigt. In diesem Beispiel ist gezeigt, dass Ganglidiomab eine humorale Immunantwort auslösen kann, die gegen GD2 gerichtet ist und somit als Vakzine bei neuroetodermalen Tumoren ausgenutzt werden kann.
Beispiel 6: Identifizierung der DNA-Sequenzen der variablen Regionen von Ganglidiomab
6.1 RNA-Qualitätskontrolle
Nachdem die anti-Idiotyp-Eigenschaften von Ganglidiomab gezeigt werden konnten, sollten im nächsten Schritt die DNA-Sequenzen identifiziert werden, die für die variablen Regionen der schweren und leichten Kette des anti-Idiotyp-Antikörpers kodieren. Dafür wurde zunächst die Gesamt-RNA aus den antikörperproduzierenden Hybridomzellen gewonnen. Die Integrität der isolierten RNA (2 µg) wurde in einem Agarosegel (1%) überprüft ( ).
Mit einem Anteil von mehr als 80% macht die ribosomale RNA den größten Anteil der Gesamt-RNA aus. Aus diesem Grund lässt sie sich mittels Agarose-Gelelektrophorese leicht detektieren. In sind zwei deutlich voneinander getrennte Banden sichtbar, die der 28S rRNA der 60S Untereinheit bzw. der 18S rRNA der 40S Untereinheit der 80S Ribosomen entsprechen und für eine intakte, nicht degradierte RNA stehen. Das Vorhandensein von intakter RNA war die Voraussetzung für die nachfolgende Synthese der komplementären cDNA.
6.2 Amplifikation der variablen Regionen von Ganglidiomab
Der erste Ansatz, die variablen Regionen der schweren und leichten Kette zu amplifizieren bestand darin, hoch degenerierte 5'-Primer zu verwenden, die an konservierte Strukturen im ersten Framework des Antikörpers binden (Tab. 1) sowie 3'-Primer, die jeweils an der ersten konstanten Region der IgG schweren Kette und der κ-leichten Kette binden. Mit diesen Primern konnten die ersten Sequenzen der variablen Regionen erhalten werden, die jedoch aufgrund der unterschiedlichen Basen an den Wobblepositionen der Primergemische im ersten Framework einige Variationen der Nukleotidsequenz aufwiesen. Auch aus dem Vergleich von 20 Sequenzen pro Kette ergab sich keine Übereinstimmung. Alle erhaltenen Sequenzen unterschieden sich an den Wobblepositionen und somit auch in der resultierenden Aminosäuresequenz. Im zweiten Ansatz kamen dann degenerierte 5'-Primer zur Anwendung, die den Vorteil hatten, an eine höher konservierte Struktur im Antikörper, der Signalsequenz, zu binden (Tab. 2). Diese Sequenz kodiert für das so genannte Signalpeptid und ist nach der Translation für den Transport des gebildeten Immunglobulins verantwortlich. Bei diesen Primern handelte es sich um ein Gemisch aus nicht degenerierten (ohne Wobblepositionen) und degenerierten (mit Wobblepositionen) Oligonukleotiden. Da nur die Aminosäurensequenz des Framework 1 der variablen Regionen durch die Wobblepositionen nicht eindeutig identifiziert werden konnten, wurden die 3'-Primer für die 2.
Polymerasekettenreaktion anhand der Sequenz des Famework 4 neu erstellt. Im Hinblick auf die im weiteren Verlauf der Arbeit folgende Klonierung in ein eukaryotisches Expressionssystem zur Charakterisierung des Antikörpers auf Proteinebene, wurden geeignete Restriktionsschnittstellen sowie die Kozak-Sequenz (CACC) als Ribosomenbindungsstelle für die Expression in die Primer integriert. Der Aufbau der zur Amplifikation verwendeten Primer ist in schematisch dargestellt.
Aufgrund der unterschiedlichen Schmelztemperaturen der Primer-Paare wurden die optimalen Annealing-Temperaturen mittels Gradienten-PCR ermittelt und die PCR so optimiert, sodass sie zur Synthese der variablen Region der leichten und schweren Kette von Ganglidiomab eingesetzt werden konnte.
zeigt die PCR-Produkte der beiden durchgeführten Polymerasekettenreaktionen zur Synthese der variablen Regionen nach Auftrennung in einem Agarosegel. Beide Bilder zeigen ein PCR-Produkt bei ca. 450 bp. Diese Produkte wurden aus dem Agarosegel aufgereinigt und für die TA-Klonierung in die pCR^®2.1-TOPO-Vektoren weiterverwendet.
6.3 Restriktionsanalyse
Die DNA-Fragmente, die für die variablen Regionen der schweren und leichten Kette von Ganglidiomab kodieren, wurden für die Sequenzierung in die Plasmide pCR^®2.1-TOPO kloniert (siehe oben). Die Selektion der rekombinanten Plasmide erfolgte mittels Blau/Weiß-Screening, wobei die erfolgreiche Ligation der PCR-Produkte in die pCR^®2.1-TOPO-Plasmide durch das Wachstum von weißen Kolonien auf den Selektionsplatten angezeigt wurde. Nach Isolierung der Plasmide aus den Bakterien, erfolgte eine Kontrollrestriktion mittels des Enzyms EcoRI. Bei einer erfolgreichen Ligation der PCR-Produkte ergibt sich neben der Bande für die Plasmide eine zweite für das klonierte PCR-Produkt bei ca. 450 bp. zeigt die im Agarosegel aufgetragenen Restriktionsansätze nach der elektrophoretischen Auftrennung. Es konnte nachgewiesen werden, dass bei allen isolierten Plasmiden das Insert vorhanden war. Die rekombinanten Plasmide wurden anschließend durch die Firma LGC Genomics sequenziert.
6.4 Sequenzanalyse der variablen Regionen von Ganglidiomab
Die Analyse der Sequenzen erfolgte mit dem Programm DNAStar^® Lasergene^® Version 8.1. Für die leichte und schwere Kette von Ganglidiomab wurden je 10 Sequenzen ausgewertet. 7 von 10 Sequenzen für die variable Region der leichten Kette stimmten dabei überein und 4 von 10 bei der schweren Kette, die dann letztendlich als die richtigen Sequenzen für die variablen Regionen angesehen wurden. Die bei der Amplifikation eingesetzte Taq-Polymerase weist zwar eine hohe Prozessivität auf, besitzt aber keine 3'-5'-Exonucleaseaktivität (proof-reading). Damit werden falsch eingebaute Nukleotide von der Polymerase nicht erkannt und entfernt. Dies ist der Grund dafür, dass einige Sequenzen Punktmutationen aufwiesen. Die Sequenzen wurden mittels der Kabat-Datenbank: „Sequences of Proteins of Immunological Interest“ ausgewertet. In dieser Datenbank sind unter anderem die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen der verschiedenen Signalpeptide sowie der variablen und konstanten Regionen von Immunglobulinen unterschiedlicher Spezies aufgelistet. Anhand dieser Daten konnten die erhaltenen Sequenzen in die unterschiedlichen Abschnitte der Frameworks und hypervariablen Bereiche (CDRs) eingeteilt werden. In den und 16 sind die identifizierten Sequenzen der variablen Region der leichten Kette (A) sowie der schweren Kette (B) aufgeführt. Es konnte anhand der Sequenzen festgestellt werden, dass das für die variable Region kodierende Gen eine Länge von 399 bp aufweist und die DNA-Sequenz, die für die variable Region der schweren Kette von Ganglidiomab kodiert, aus insgesamt 426 Nukleotiden besteht (ohne Restriktionsschnittstellen und Kozak-Sequenz).
Mit Hilfe der KABAT-Datenbank wurden die erhaltenen Sequenzen von Ganglidiomab identifiziert und mit dem auf gleiche Weise generierten anti-Idiotyp-Antikörper 1A7 verglichen. Dabei fielen einige Abweichungen der Aminosäuresequenzen in den hybervariablen Regionen besonders bei der schweren Kette auf, was die unterschiedlichen Bindungsaffinitäten zu ch14.18 erklären könnte.
Durch einen weiteren V-Quest-Abgleich [Giudicelli et al., 2004; Giudicelli et al., 2006] mit den bekannten Maus-Keimbahngenen der IMGT-Datenbank (ImMunoGeneTics Information System) konnte ermittelt werden, dass es sich bei Ganglidiomab nicht um einen hypermutierten Antikörper handelt. Die Analyse des V-Elementes der variablen Region der leichten Kette ergab eine Übereinstimmung von 99,32% mit der Keimbahnkonfiguration einer Maus (Mus musculus) des Stammes Balb/c. 292 von 294 Nukleotiden stimmen überein. Das V-Element der variablen Region der schweren Kette zeigt eine Übereinstimmung von 98,25% mit der Keimbahnkonfiguration. 280 von 285 Nukleotiden stimmen hier überein.
Herstellung der Expressionssysteme
Restriktion der Expressionsvektoren und der Sequenzierungsplasmide
Zur Generierung der rekombinanten Expressionsvektoren wurden pFUSE-CHIg-mG1 sowie pFUSE2-CLIg-mk mit den entsprechenden Restriktionsenzymen geschnitten, um sie für die nachfolgende Ligation zu linearisieren ( ). Die Vektoren wurden nach der Restriktion enzymatisch mittels einer alkalischen Phosphatase dephosphoryliert, um eine Religation der Vektoren zu verhindern.
Die für die variable Region der leichten und schweren Kette von Ganglidiomab kodierenden Sequenzen, wurden aus dem Sequenzierungsvektor pCR^®2.1-TOPO herausgeschnitten ( ). Das Herausschneiden des DNA-Fragments für die variable Region der leichten Kette (LK) erfolgte durch einen Doppelverdau von pCR^®2.1-TOPO-LK mit BstAPI und XhoI, wobei der Ansatz zunächst für 2 h bei 37°C und anschließend für weitere 2 h bei 60°C inkubiert wurde, da das Restriktionsenzym BstAPI nur bei dieser Temperatur eine optimale Aktivität von 100% besitzt. Für das DNA-Fragment ergab sich eine Bande bei 400 bp. Da der pCR^®2.1-TOPO-Vektor zwei weitere Erkennungssequenzen für die Enzyme BstAPI und XhoI aufweist, wurde bei der Restriktion ein zusätzliches DNA-Fragment mit einer Größe von 665 bp aus dem Vektor geschnitten, welches im Agarosegel auf der entsprechenden Höhe erkennbar ist. Nur das DNA-Fragment mit der korrekten Größe wurde anschließend aus dem Gel aufgereinigt, daher bestand also nicht die Gefahr, dass im Anschluss das falsche Fragment in die Expressionsvektoren kloniert wird. Das andere rekombinante Plasmid pCR^®2.1-TOPO-SK, in dem die Sequenz für die variable Region der schweren Kette (SK) integriert ist, wurde ebenfalls durch einen Doppelverdau mit EcoRI/NheI geschnitten. Da es im Vektor keine weiteren Erkennungssequenzen für diese Enzyme gibt, entsteht nur ein Fragment mit einer Größe von 426 bp.
Die aufgereinigten DNA-Fragmente sollten im Anschluss in die Expressionsvektoren ligiert und transformiert werden.
Ligation und Transformation in Escherichia coli
Für die Selektion erfolgreich transformierter Bakterien kamen die Antibiotika Zeocin (pFUSE-CHIg-mG1) und Blasticidin (pFUSE2-CLIg-mk) zur Anwendung. Die Analyse der Bakterienkolonien erfolgte mittels Kolonie-PCR. Bei einer erfolgreichen Transformation der Bakterien mit den rekombinanten Expressionsvektoren, ergeben sich nach elektrophoretischer Auftrennung in einem Agarosegel spezifische Banden bei 400 bp für die leichte Kette und 426 bp bei der schweren Kette. zeigt das Ergebnis einer Kolonie-PCR mit dem Koloniematerial mit pFUSE-CHIg-mG1-SK transformierter E. coli. Insgesamt wurden 84 Kolonien mit dieser Methode analysiert, wobei 80 eine Bande der richtigen erwarteten Größe von 426 bp aufwiesen. Als Positivkontrolle diente die cDNA, die als Template für die Synthese und Amplifikation der variablen Regionen verwendet wurde.
Um die Insertion durch einen Restriktionsverdau zu überprüfen, wurden 5 der positiven Kolonien in einer über-Nacht-Kultur vermehrt, am darauf folgenden Tag die Plasmide isoliert und mittels Doppelverdau durch EcoRI/NheI auf das Vorhandensein des Inserts und die Integrität der Schnittstellen überprüft. Bei allen 5 Proben konnte das Insert mit der richtigen Größe aus dem Vektor herausgeschnitten werden ( ).
Bei 4 von 5 Plasmiden stellte sich die Frage nach einer weiteren unspezifischen Bande bei ca. 1,2 kb. Es wurde vermutet, dass es sich um ein unspezifisches Produkt des Restriktionsenzyms EcoRI handelt. Daher wurde ein sequentieller Verdau des Leervektors pFUSE-CHIg-mG1 mit EcoRI und NheI durchgeführt, bei dem das Bandenmuster nach unterschiedlicher Inkubationszeiten (15, 30, 45, 60 und 120 min) mit EcoRI und NheI überprüft werden sollte. Die zeigt das Ergebnis der elektrophoretischen Auftrennung aller Ansätze.
Es ist deutlich zu sehen, das das Enzym EcoRI bereits nach 15 min Inkubationszeit bei 37°C beginnt, unspezifisch zu schneiden. Die Intensität dieser Bande nimmt mit zunehmender Inkubationszeit zu. Es konnte also davon ausgegangen werden, dass die Bande mit der Größe von ca. 1,2 kb der unspezifischen Bande in entspricht.
Beschreibung der Abbildungen
: Jerne's Netzwerkmodell der idiotypischen Wechselwirkungen am Beispiel von GD2
Im Rahmen einer Immunreaktion gegen GD2, kommt es zur Bildung eines spezifischen Antikörpers (Ak 1), dessen Paratop zum einen das Antigen erkennt und zum anderen selbst immunogen wirkt, wodurch ein anti-Idiotyp-Antikörper (Ak 2) erzeugt wird, der ein „internes Abbild“ des ursprünglichen Antigens GD2 bildet. Konsekutiv führt dieser Antikörper zu einer weiteren Immunreaktion und die daraus resultierenden Antikörper (Ak 3) können aufgrund des „molekularen Mimikry“ zwischen GD2 und anti-Idiotyp (Ak 2) mit dem Antigen GD2 kreuz reagieren und so einen therapeutischen Effekt induzieren.
: Generierung eines Antikörpers mittels klassischer Hybridomtechnologie am Beispiel von Ganglidiomab
Nach der Immunisierung von Balb/c Mäusen mit dem anti-GD2-Ak-14G2a wurden die B-Zellen der Maus isoliert (1.) und durch die Fusion mit der Myelomzelllinie SP2/0 immortalisiert. Die daraus hervorgehenden Hybridomzellen (2.) wurden auf ihre Antikörperspezifität getestet (3.). Das Ganglidiomab-produzierende Hybridom wurde selektiert (4.) und für die Antikörpergewinnung weiterkultiviert (5.).
: Chimärer Rezeptor der NK-92-scFv(ch14.18)-zeta
: Prinzip des indirekten kompetitiven ELISA am Beispiel der Inhibition der spezifischen Bindung von ch14.18 an GD2 durch Ganglidiomab.
: Vektorkarte pCR^®2.1-TOPO.
: Durchflusszytometrische Analyse der Bindung von Ganglidiomab und 1A7 an den chimären Rezeptor auf humanen NK92-scFv(ch14.18)-zeta-Zellen
Dargestellt ist die Bindung von Ganglidiomab an den chimären Rezeptor auf humanen NK92-scFv(ch14.18)-zeta-Zellen im Vergleich zum bekannten anti-Idiotyp-Antikörper 1A7 (A). Eine Abnahme der Konzentration von Ganglidiomab im Kulturüberstand der Hybridomzellen 17-9 von 0,5 µg auf 0,25 µg korreliert mit einer Abnahme der Fluoreszenzintensität (B).
: Indirekter kompetitiver ELISA
Konzentrationsabhängige Inhibition der spezifischen Bindung des anti-GD2-Antikörpers ch14.18 an GD2 durch die Anwesenheit von Ganglidiomab im Kulturüberstand der Hybridomzellen 17-9.
: Western Blot zum immunologischen Nachweis von Ganglidiomab
Nachweis von Ganglidiomab im Zelllysat (1) sowie im Kulturüberstand (2) mittels dem anti-GD2-Antikörper ch14.18. M: Precision Plus ProteinTM WesternCTM Standard.
: Schematische Darstellung der Komplexe zwischen anti-Idiotyp Antikörper Ganglidiomab sowie 1A7 und dem nominalen Antikörper ch14.18.
: GD2 spezifische anti-Ganglidiomab Immunantwort in BALB/c Mäusen.
: Auftrennung der isolierten Gesamt-RNA (2 µg) mittels Agarose-Gelelektrophorese
Die beiden großen 28S rRNA- und 18S rRNA-Moleküle der 60S bzw. 40S Untereinheit stehen für eine intakte, nicht degradierte RNA.
: Bindungsstellen der Primer zur Amplifikation der variablen Region am Beispiel der leichten Kette von Ganglidomab
: PCR-Produkte: Variable Region der leichten Kette (A) und schweren Kette (B) von Ganglidiomab [M: Marker (100 bp)]
: Auftrennung der DNA-Fragmente mittels Agarose-Gelelektrophorese nach Restriktionskontrolle der rekombinanten pCR^®2.1-TOPO Plasmide mit EcoRI
Die DNA-Fragmente, die für die variablen Regionen der leichten Kette (A) sowie der schweren Kette (B) kodieren, konnten erfolgreich mittels des Restriktionsenzyms EcoRI aus je 5 pCR^®2.1-TOPO Plasmiden heraus geschnitten werden (Spur 1–5). M: Marker (100 bp).
: Nukleotid- und Aminosäuresequenzen für die variablen Regionen der leichten (A) Kette von Ganglidiomab.
: Nukleotid- und Aminosäuresequenzen für die variablen Regionen der schweren (B) Kette von Ganglidiomab.
Gezeigt sind die Nukleotidsequenzen und die dazu gehörigen Aminosäuresequenzen im Einbuchstabencode der variablen Regionen von leichter Kette (A) und schwerer Kette (B) von der Leadersequenz bis zum Framework 4.
: Linearisierung von pFUSE-CHIg-mG1 und pFUSE2-CLIg-mk
Doppelverdau von pFUSE-CHIg-mG1 durch EcoRI/NheI (A). Spur 1: ungeschnittener Vektor. Spur 2: geschnittener Vektor. (B) Doppelverdau von pFUSE2-CLIg-mk durch XhoI/BstAPI. Spur1: ungeschnittener Vektor. Spur 2: geschnittener Vektor. M: Marker (10 kb).
: Restriktionsverdau der rekombinanten Sequenzierungsplasmide pCR^®2.1-TOPO
Bandenmuster nach Restriktionsverdau der rekombinanten pCR^®2.1-TOPO-Vektoren-LK mit BstAPI/XhoI (A) sowie der pCR^®2.1-TOPO-Vektoren-SK mit EcoRI/NheI (B). M: Marker (10 kb)
: Elektrophoretische Auftrennung der PCR-Produkte einer Kolonie-PCR Beispielhaft sind 18 der 84 untersuchten Kolonien gezeigt (Spur 1–18). M: Marker (100 bp), PK: Positivkontrolle
: Restriktionsverdau der rekombinanten Vektoren pFUSE-CHIg-mG1-SK Bandenmuster nach Restriktionsverdau der 5 rekombinanten Vektoren pFUSE-CHIg-mG1-SK mit EcoRI/NheI. M: Marker (100 bp)
: Sequentieller Verdau von pFUSE-CHIg-mG1 mit NheI (A) und EcoRI (B)
(A): Sequentieller Verdau von pFUSECHIg-mG1 mit NheI nach 15, 30, 45, 60 und 120 min (Spur 1–5). Spur 6: Leervektor ungeschnitten. M: Marker (100 bp).
(B): Sequentieller Verdau von pFUSE-CHIg-mG1 mit EcoRI nach 15, 30, 45, 60 und 120 min (Spur 1–5). Spur 6: Leervektor ungeschnitten. M: Marker (100 bp)
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Abkürzungsverzeichnis

7-AAD

7-Aminoactinomycin D

ADCC

antikörperabhängige zellvermittelte Zytotoxizität (antibody-dependent cellular cytotoxicity)

A. dest.

destilliertes Wasser (Aqua destillata)

Abb.

Abbildung

Ak

Antikörper

Anti-Id-Ak

anti-Idiotyp-Antikörper

APS

Ammoniumpersulfat

AS

Aminosäure

β-ME

beta-Mercaptoethanol

bp

Basenpaare

BSA

Rinderserumalbumin (bovine serum albumine)

bzw.

beziehungsweise

Ca²⁺

Calcium

CD

cluster of differentiation

CDC

komplementabhängige Zytotoxizität (complement-dependent cytotoxicity)

CDRs

hypervariable Regionen (complementarity determining regions)

CHO-Zellen

Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (chinese hamster ovary)

CIP

alkalische Phosphatase (calf intestine alkaline phosphatase)

cDNA

komplementäre DNS (complementary DNA)

COG

Children's Oncology Group

DEPC

Diethylpyrocarbonat

DMEM

Dulbecco’s Modified Eagle Medium

DMF

Dimethylformamid

DMSO

Dimethylsulfoxid

DSMZ

Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH

DNA

Desoxyribonukleinsäure (deoxyribonucleic acid)

dNTPs

Desoxyribonukleotidtriphosphate

DTT

Dithiothreitol

E.coli

Escherichia coli

EDTA

Ethylendiamintetraessigsäure

ELISA

enzymgekoppelter Immunabsorptionsassay (enzyme-linked immunosorbent assay)

Fab

antigen-bindendes Fragment (fragment of antigen binding)

FACS

fluorescence activated cell sorting

Fc

konstanter Teil (f)

FCS

fetales Kälberserum (fetal calf serum)

GM-CSF

Granulozyten-Makrophagen Kolonie-stimulierender Faktor (Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor)

GMP

Good Manufacturing Practice

HRP

Meerrettichperoxidase (horseradish peroxidase)

Ig

Immunglobulin

IL-2

Interleukin-2

inakt.

inaktiviert

INRG

International Neuroblastoma Risk Group

INSS

International Neuroblastoma Staging System

ITS

Insulin-Transferrin-Selen

IUB

International Union of Biochemistry

IUPAC

International Union of Pure and Applied Chemistry

KLH

Hämocyanin der Großen Kalifornischen Schlüssellochnapfschnecke (keyhole limpet hemocyanin)

LB-Medium

lysogeny broth-Medium

MCS

multiple Klonierungsstelle (multiple cloning site)

MEM-NEAA

Minimum Eessential Medium – Non Essential Amino Acids

Mg²⁺

Magnesium

MHC

Haupthistokompatibilitäskomplex (major histocompatibility complex)

MMLV-RT

Moloney Murine Leukemia Virus-Reverse Transkriptase

mycN

v-myc myelocytomatosis viral related oncogene, neuroblastoma derived

NB-Zelle

Neuroblastom-Zelle

NK-Zellen

natürliche Killerzellen

PBS

phosphatgepufferte Kochsalzlösung (phosphate buffered saline)

PCR

Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction)

PE

Phycoerythrin

PVDF

Polyvinylidenfluorid

RNA

Ribonukleinsäure (ribonucleic acid)

RT

Raumtemperatur

RT-PCR

Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion

scFv

single chain variable fragments

SDS

Natriumdodecylsulfat (sodium dodecyl sulfate)

SDS-PAGE

Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (Sodium-Dodecyl-Sulfate-Polyacrylamid Gel Electrophoresis)

SIOPEN R NET

International Society of Paediatric Oncology European Neuroblastoma Research Network

TAA

tumorassoziiertes Antigen

TAE-Puffer

Tris-Acetat-EDTA-Puffer

Taq-Polymerase

Thermus aquaticus Polymerase

TEMED

Tetramethylethandiamin

Th

T-Helferzellen

TMB

3,3',5,5'-tetramethylbenzidin

Tris

Trishydroxymethylaminomethan

u. a.

unter anderem

UV

Ultraviolett

WB

Western Blot

WHO

Weltgesundheitsorganisation (World Health Organization)

X-Gal

5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-ß-D-galactopyranosid

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur

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Irie et. al, 1976 [0004]
Cahan et. al, 1982 [0004]
Svennerholm et al., 1994 [0005]
Mujoo et. al, 1987 [0007]
Handgretinger et al., 1992 [0007]
Gillies et al., 1989 [0007]
Mueller et al., 1990 [0007]
Handgretinger et al., 1995 [0007]
Yu et al., 1998 [0007]
Ozkaynak et al., 2000 [0008]
Gilman et al., 2009 [0008]
Yu et al., 2010 [0008]
Murphy et al., 2008 [0009]
Waldmann et al., 1969 [0010]
Becker et al., 2002 [0011]
Mond et al., 1995 [0011]
Zeng et al., 1997 [0011]
Joyce, 2001 [0011]
Eberl et al., 2000 [0011]
Förster-Waldl et al., 2005 [0012]
Riemer et al., 2006 [0012]
Fest et al., 2006 [0012]
Bleeke et al., 2009 [0012]
Jinnohara et al., 1998 [0015]
Uemura et al., 1994 [0015]
Chattopadhyay et al., 1991 [0015]
Mittelman et al., 1995 [0015]
Sen et al., 1998 [0016]
Zeytin et al., 2000 [0016]
Foon et al., 1998 [0016]
Köhler et al., 1975 [0036]
Esser et al., 2011 [0043]
Wang et al., 2000 [0053]
Coligan et al., 2002 [0053]
5. Auflage der KABAT Datenbank „Sequences of Proteins of Immunological Interest“ [Kabat et al., 1991] [0067]
Esser et al., 2011 [0083]
Sen et al., 1998 [0083]
Zeytin et al., 2000 [0083]
Esser et al., 2011 [0084]
Sen et al., 1998 [0084]
Zeytin et al., 2000 [0084]
Giudicelli et al., 2004 [0113]
Giudicelli et al., 2006 [0113]
M: Marker (100 bp) [0133]

Claims

Anti-idiotypischer Antikörper, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäuresequenz der variablen Region der leichten Kette zu mindestens 95% identisch zur SEQ ID Nr 1 und die der variblen Region der schweren Kette zu mindestens 95% identisch zur SEQ ID Nr 3 ist, wobei der Antikörper als Disialogangliosid-GD2-anti-Idiotyp-Antikörper wirksam ist.
Anti-idiotypischer Antikörper gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäuresequenz der variablen Region der leichten Kette identisch zur SEQ ID Nr 1 und die der variablen Region der schweren Kette identisch zur SEQ ID Nr 3 ist.
Anti-idiotypischer Antikörper gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper monoklonal oder rekombinant, vorzugsweise monoklonal, ist.
Hybridomzelllinie, die einen Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1–3 erzeugt.
Polynucleotid, umfassend Nucleotidsequenzen, welche zu mindestens 95% identisch zur SEQ ID Nr 2 und SEQ ID Nr 4 sind und die für den Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1–3 kodieren.
Polynucleotid gemäß Anspruch 5, umfassend Nucleotidsequenzen, welche identisch zur SEQ ID Nr 2 und SEQ ID Nr 4 sind und die für den Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1–3 kodieren.
Pharmazeutische Zubereitung, enthaltend eine wirksame Menge des anti-idiotypischen Antikörpers gemäß einem der Ansprüche 1–3 oder eines Polynucleotids gemäß einem der Ansprüche 5 oder 6.
Impfstoff, enthaltend eine wirksame Menge des anti-idiotypischen Antikörpers gemäß einem der Ansprüche 1–3 oder eines Polynucleotids gemäß einem der Ansprüche 5 oder 6.
Impfstoff gemäß Anspruch 8, weiterhin enthaltend mindestens ein Adjuvanz.
Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1–3 oder Polynucleotid gemäß einem der Ansprüche 5 oder 6 zur Auslösung einer Immunantwort in einem Individuum.
Antikörper oder Polynucleotid zur Verwendung gemäß Anspruch 10 zur Auslösung einer gegen das Antigen Disialogangliosid GD2 gerichteten Immunantwort in einem Individuum.
Antikörper oder Polynucleotid zur Verwendung gemäß einem Ansprüche 10 oder 11 zur Behandlung oder Prävention (Impfung) einer mit GD2-Expression assoziierten Erkrankung.
Antikörper oder Polynucleotid zur Verwendung gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die mit GD2 assoziierte Erkrankung ein neuroektodermaler Turmor ist, welcher GD2 exprimiert.
Antikörper oder Polynucleotid zur Verwendung gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass der neuroektodermale Turmor ausgewählt ist aus Melanom, Neuroblastom, Sarkom, kleinzelligem Lungenkarzinom und Glioblastom.
Verfahren zur Detektion einer gegen GD2 gerichteten Immunantwort, umfassend das in Kontaktbringen einer biologischen Probe des Probanden in vitro mit einem Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1–3 und Bestimmen, ob eine gegen GD2 gerichtete Immunantwort auftritt.
Verfahren zur Detektion bzw. quantitativen Bestimmung der Konzentration eines Anti-GD2-Antikörpers oder dessen Derivats in Proben von Körperflüssigkeit eines Probanden, welchem dieser Anti-GD2-Antikörper oder dessen Derivat verabreicht wird, wobei die Körperflüssigkeitsprobe in vitro mit einem Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1–3 in Kontakt gebracht wird und dass Ausmaß der Reaktion quantitativ bestimmt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 16, wobei die Körperflüssigkeit Blutserum ist.
Verfahren zur Detektion von Zellen, die genetisch manipuliert wurden, um rekombinante Derivate eines anti-GD2-Antikörpers zu exprimieren, wobei zellhaltige Proben mit einem Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1–3 in Kontakt gebracht werden und dass Ausmaß der Reaktion quantitativ bestimmt wird.