CN110035768A

CN110035768A - 嵌合抗原受体

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Publication number: CN110035768A
Application number: CN201780059507.6A
Authority: CN
Inventors: J·E·康诺利; D·L·邬
Original assignee: Tessa Treatment Private Ltd
Current assignee: Tessa Treatment Private Ltd
Priority date: 2016-07-26
Filing date: 2017-07-24
Publication date: 2019-07-19
Also published as: JP2019530431A; KR20190038567A; US20190262397A1; TW201806969A; CA3031846A1; EP3490589A1; AU2017301826A1; SG11201900634VA; WO2018019772A1

Abstract

本发明公开了一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含共刺激序列，所述共刺激序列是或衍生自CD226的细胞内结构域或其片段。还公开了包含所述CAR的组合物，以及使用所述组合物的用途和方法。

Description

嵌合抗原受体

发明领域

本发明涉及嵌合抗原受体(CAR)、其编码核酸和表达所述CAR的细胞，及其医药用途。

发明背景

用基因修饰的T细胞进行免疫治疗显示了治疗血液肿瘤的巨大希望。已证实了添加嵌合抗原受体(CAR)是产生肿瘤特异性T细胞的特别有用的方法。

基本的CAR由衍生自单链可变片段(scFV)或重组亲和配体的胞外结构域、结构铰链区、跨膜结构域和具有衍生自CD3ζ的信号传导结构域、具有或不具有额外的共刺激分子的细胞质内结构域组成。

尽管CAR-T细胞在治疗CD19阳性血液肿瘤的早期临床研究中取得了成功，但由于缺乏独特的肿瘤相关抗原，T细胞向肿瘤部位的归巢效率低下以及无法克服实体瘤的免疫抑制微环境，CAR在实体瘤中的成功受到很大阻碍。

GPC3(磷脂酰肌醇蛋白聚糖3也称为DGSX、GTR2-2、MXR7、OCI-5、SDYS、SGB、SGBS和SGBS1)是一种硫酸乙酰肝素蛋白多糖的磷脂酰肌醇蛋白聚糖家族的细胞表面蛋白。GPC3在正常成年肝组织中不表达,但是在肝细胞癌中表达(Shirakawa等人，2009Intl J Oncol34:649-656；Ho等人，2011Eur J Cancer 47(3):333-338)。在其他癌症中，例如黑素瘤、卵巢透明细胞癌、卵黄囊肿瘤、神经母细胞瘤、肝母细胞瘤和肾母细胞瘤，也观察到GPC3表达(Ho等人，2011Eur J Cancer 47(3):333-338)。因此GPC3是一种癌症治疗的候选靶标。

EP 2995 682A1,Gao等人,Clin Cancer Res 20(24):6418-6428和WO 2016/049459A1公开了包含GPC3结合结构域的CAR，和包含所述CAR的细胞。

发明概述

本发明提供了嵌合抗原受体(CAR)和表达CAR的细胞，其具有所需或改善的性质。

本发明提供了一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含一个共刺激序列，所述共刺激序列是或衍生自CD226的细胞内结构域或其片段。在一些实施方式中，是或衍生自CD226的细胞内结构域或其片段的共刺激序列包含或由以下氨基酸序列组成：与SEQ ID NO：16、58或59所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方式中，所述CAR还包含一个共刺激序列，所述共刺激序列包含或由以下氨基酸序列组成：是或衍生自CD28的细胞内结构域的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述CAR还包含一个共刺激序列，所述共刺激序列包含或由以下氨基酸序列组成：是或衍生自4-1BB的细胞内结构域的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述CAR包含一个共刺激序列，所述共刺激序列包含或由以下氨基酸序列组成：与SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述CAR包含一个共刺激序列，所述共刺激序列包含或由以下氨基酸序列组成：与SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方式中，所述CAR还包含二聚化结构域。在一些实施方式中，所述二聚化结构域为诱导型二聚化结构域。在一些实施方式中，所述二聚化结构域包含或由以下氨基酸序列组成：与SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方式中，所述CAR包含跨膜结构域，所述跨膜结构域包含或由以下氨基酸序列组成：是或衍生自CD28、CD8α或CD226的跨膜结构域的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述CAR包含跨膜结构域，所述跨膜结构域包含或由以下氨基酸序列组成：与SEQ IDNO：11、10或57所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方式中，所述CAR还包含铰链区。在一些实施方式中，所述铰链区是或衍生自人IgG1铰链区。在一些实施方式中，所述铰链区包含或由以下氨基酸序列组成：与SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方式中，所述CAR包含抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含：

重链可变区序列，所述重链可变区序列与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性，和

轻链可变区序列，所述轻链可变区序列与SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性。

重链可变区序列，所述重链可变区序列与SEQ ID NO：48所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性，和

轻链可变区序列，所述轻链可变区序列与SEQ ID NO：52所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性。

在另一方面，本发明提供了如表1所示的A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L或M，或如表3所示V、W、X、Z、AA、BB、CC、DD、EE、FF、GG、HH、II、JJ、KK、LL或MM中任一所述的嵌合抗原受体(CAR)。

在另一方面，本发明提供了一种嵌合抗原受体(CAR),所述嵌合抗原受体包含或由以下氨基酸序列组成：与SEQ ID NO：22、23、24、25、26、27、28、29、38、39、40、41、42、81、83、84、85、86、88、89、90、92、93、94、95、96、97或98所示的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的氨基酸序列。

在另一方面，本发明提供了一种嵌合抗原受体(CAR),所述嵌合抗原受体包含或由以下氨基酸序列组成：与SEQ ID NO：30、31、32、33、34、35、36、37、43、44、45、46、47、62、64、65、66、67、69、70、71、73、74、75、76、77、78或79所示的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的氨基酸序列。

在另一方面，本发明提供了一种能够与GPC3结合的嵌合抗原受体(CAR)，包括：GPC3结合结构域、铰链区、跨膜结构域和信号传导结构域；其中所述铰链区包含或由以下氨基酸序列组成：是或衍生自人IgG1铰链区的氨基酸序列，和；其中所述跨膜结构域包含或由以下氨基酸序列组成：是或衍生自CD8α的跨膜结构域的氨基酸序列。

在一些实施方式中，所述铰链区包含或由以下氨基酸序列组成：与SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；并且其中所述跨膜结构域包含或由以下氨基酸序列组成：与SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。

在另一方面，本发明提供了一种能够结合GPC3的嵌合抗原受体(CAR)，包含：GPC3结合结构域、跨膜结构域、信号传导结构域和诱导型二聚化结构域。

在一些实施方式中，所述二聚化结构域包含或由以下氨基酸序列组成：是或衍生自F36V-FKBP的氨基酸序列。

在一些实施方式中，本发明所述的CAR包含一个二聚化结构域，所述二聚化结构域包含或由以下氨基酸序列组成：与SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。

在另一方面，本发明提供了一种能够与GPC3结合的嵌合抗原受体(CAR)，包括：GPC3结合结构域、跨膜结构域和信号传导结构域；其中所述信号传导结构域包含共刺激序列，所述共刺激序列包含或由以下氨基酸序列组成：是或衍生自CD226的细胞内结构域的氨基酸序列。

在一些实施方式中，本发明所述的CAR包括含有共刺激序列的信号传导结构域，所述共刺激序列包含或由以下氨基酸序列组成：与SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方式中，本发明所述的CAR包括含有共刺激序列的信号传导结构域，所述共刺激序列包含或由以下氨基酸序列组成：是或衍生自CD28的细胞内结构域的氨基酸序列。在一些实施方式中，本发明所述的CAR包括含有共刺激序列的信号传导结构域，所述共刺激序列包含或由以下氨基酸序列组成：是或衍生自4-1BB的细胞内结构域的氨基酸序列。

在一些实施方式中，本发明所述的CAR包括含有共刺激序列的信号传导结构域，所述共刺激序列包含或由以下氨基酸序列组成：与SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方式中，本发明所述的CAR包括含有共刺激序列的信号传导结构域，所述共刺激序列包含或由以下氨基酸序列组成：与SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。

在另一方面，本发明提供了一种能够结合GPC3的嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体如本文表1所示的A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L或M中任一所述。

在另一方面，本发明提供了一种能够结合GPC3的嵌合抗原受体(CAR),所述嵌合抗原受体包含或由以下氨基酸序列组成：与SEQ ID NO：38、39、40、22、23、41、42、24、25、26、27、28或29所示的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的氨基酸序列。

在另一方面，本发明提供了一种能够结合GPC3的嵌合抗原受体(CAR),所述嵌合抗原受体包含或由以下氨基酸序列组成：与SEQ ID NO：43、44、45、30、31、46、47、32、33、34、35、36或37所示的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的氨基酸序列。

在另一方面，本发明提供了一种编码本发明所述的嵌合抗原受体(CAR)的核酸。

在另一方面，本发明提供了一种含有本发明所述的核酸的载体。

在另一方面，本发明提供了一种细胞，所述细胞包含本发明所述的嵌合抗原受体(CAR)、核酸或载体。

在另一方面，本发明提供了一种制备表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞的方法，包括将本发明所述的核酸或载体导入细胞，并在适合细胞表达所述核酸或载体的条件下培养细胞。

在另一方面，本发明提供了一种通过本发明所述的方法获得或可获得的细胞。

在另一方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括本发明所述的嵌合抗原受体(CAR)、核酸、载体或细胞，以及药学上可接受的载体、佐剂、赋形剂或稀释剂。

在另一方面，本发明提供了本发明所述的嵌合抗原受体(CAR)、核酸、载体、细胞或药物组合物用于治疗或预防疾病或病症的方法。

在另一方面，本发明提供了本发明所述的嵌合抗原受体(CAR)、核酸、载体、细胞或药物组合物在制备用于治疗或预防疾病或病症的药物中的用途。

在另一方面，本发明提供了一种治疗或预防疾病或病症的方法，包括向受试者施用治疗或预防有效量的本发明所述的嵌合抗原受体(CAR)、核酸、载体、细胞或药物组合物。

在另一方面，本发明提供了一种治疗或预防受试者的疾病或病症的方法，包括：

(a)从受试者中分离至少一个T细胞；

(b)修饰所述至少一个T细胞以表达或包含本发明所述的嵌合抗原受体(CAR)、核酸或载体，和；

(c)向受试者施用所述修饰的至少一个T细胞。

(a)从受试者中分离至少一个T细胞；

(b)将本发明所述的核酸或载体导入所述至少一个T细胞，从而修饰所述至少一个T细胞和；

(c)向受试者施用所述修饰的至少一个T细胞。

在一些本发明所述应用的CAR、核酸、载体、细胞或药物组合物、用途或方法的实施方式中，所述疾病或病症是癌症。在一些实施方式中，所述癌症是表达GPC3的癌症或表达EpCAM的癌症。在一些实施方式中，所述表达GPC3的癌症或表达EpCAM的癌症为肝细胞癌。

在另一方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含预定量的本发明所述的嵌合抗原受体(CAR)、核酸、载体、细胞或药物组合物。

发明详述

CD226

CD226(也称为DNAM-1、PTA1、TLiSA1)是一种由CD226基因在人体内编码的蛋白质。CD226是约65KDa的跨膜糖蛋白，其在多种细胞类型的细胞表面表达，所述细胞类型包括自然杀伤(NK)细胞、血小板、单核细胞(树突细胞和巨噬细胞)和T细胞。

CD226的配体是CD112(也称为nectin-2)和CD155(也称为脊髓灰质炎病毒受体；PVR)。

研究表明，CD226触发NK细胞介导的表达CD155和CD112的肿瘤细胞的杀伤(Bottino等，2003J Exp Med 198：1829-1839)。CD226还促进CD4+和CD8+T细胞的共刺激，并可以通过非专职抗原呈递细胞促进CD8+T细胞的活化(Gilfillan等，2008J Exp Med 205:2965-2973)。

具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)是一种共抑制免疫受体，其与CD226竞争结合CD112和CD155(Lozano等，2012J Immunol 188(8)：3869-3875)。已显示TIGIT可抑制抗肿瘤和其他CD8+T细胞依赖性慢性免疫反应，这可能涉及TIGIT对CD226同源二聚化的损害(Johnston等，2014癌细胞(Cancer Cell)26：923-937)

嵌合抗原受体

本发明提供了一种嵌合抗原受体(CAR)。本发明还提供了一种能够结合GPC3的嵌合抗原受体(CAR)。

嵌合抗原受体(CAR)是提供抗原结合和T细胞活化功能的重组受体分子。例如，在Dotti等，Immunol Rev(2014)257(1)中综述了CAR结构和设计，该文献通过引用整体并入本文。

CAR包含与跨膜结构域连接的抗原结合结构域和信号传导结构域。任选的铰链结构域可以分离抗原结合结构域和跨膜结构域，并且可以作为柔性接头。

CAR的抗原结合结构域可以基于抗体的抗原结合结构域，其对CAR靶向的抗原具有特异性。例如，CAR的抗原结合结构域可以包含特异性结合靶蛋白的抗体的互补决定区(CDR)的氨基酸序列。CAR的抗原结合结构域可包含或由特异性结合靶蛋白的抗体的轻链和重链可变区氨基酸序列组成。所述抗原结合结构域可以作为单链可变片段(scFv)提供，包含抗体的轻链和重链可变区氨基酸序列的序列。CAR的抗原结合结构域可基于其他蛋白：蛋白相互作用来靶向抗原，例如配体：受体结合；例如，已经使用基于IL-13的抗原结合结构域开发了靶向IL-13Rα2的CAR(参见如Kahlon等,2004Cancer Res 64(24):9160-9166)。

本发明提供了在CAR的抗原结合结构域和信号传导结构域之间的跨膜结构域。所述跨膜结构域将CAR锚定到表达CAR的细胞的细胞膜，抗原结合结构域位于胞外空间,以及信号传导结构域在细胞内。CAR的跨膜结构域可以衍生自CD3-ζ、CD4、CD8或CD28的跨膜区序列。

所述信号传导结构域可用于激活T细胞。CAR信号传导结构域可以包含CD3-ζ的细胞内结构域的氨基酸序列，所述CD3-ζ的细胞内结构域提供基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)，用于磷酸化和激活表达CAR的T细胞。包含其他含有ITAM的蛋白质序列的信号传导结构域也已用于CAR，例如，包含含有ITAM的FcγRI区域的结构域(Haynes等，2001JImmunol 166(1)：182-187)。包含衍生自CD3-ζ的细胞内结构域的信号传导结构域的CAR通常被称为第一代CAR。

CAR的信号传导结构域还可以包含衍生自共刺激分子的信号传导结构域的共刺激序列，以促进与靶蛋白结合后表达CAR的T细胞的活化。合适的共刺激分子包括CD28、OX40、4-1BB、ICOS和CD27。具有包括额外共刺激序列的信号传导结构域的CAR通常被称为第二代CAR。

在一些情况下，CAR被设计为提供不同细胞内信号传导途径的共刺激。例如，与CD28共刺激相关的信号传导优先激活磷脂酰肌醇3-激酶(P13K)途径，而41BB介导的信号传导是通过TNF受体相关因子(TRAF)衔接蛋白进行的。因此，CAR的信号传导结构域有时含有来自多于一种共刺激分子的信号传导结构域的共刺激序列。包含具有多个共刺激序列的信号传导结构域的CAR通常被称为第三代CAR。

任选的铰链区域域可以分离抗原结合结构域和跨膜结构域，并且可以作为柔性接头。铰链区域可以是柔性域，其允许结合部分在不同方向上取向。铰链区可以衍生自IgG1或免疫球蛋白的CH2CH3区。

抗原结合结构域

本发明的嵌合抗原受体(CAR)包含抗原结合结构域。

本发明的CAR的抗原结合结构域优选显示特异性结合靶分子，例如，靶蛋白。“特异性结合”是相互作用，所述相互作用不是非特异性的。特异性结合由非共价相互作用介导，例如范德华力、静电相互作用，氢键和疏水相互作用。本发明的CAR的抗原结合结构域可以来自针对靶分子的抗体，或其他靶分子结合剂，例如靶分子结合肽或核酸适体、配体或其他分子。

所述抗原结合结构域可以针对任何靶分子。在一些实施方式中，抗原结合结构域能够结合靶蛋白，所述靶蛋白的表达或其上调的表达与疾病或病症正相关。也就是说，靶蛋白可以是疾病或病症的标志物。

靶蛋白优选在表达靶蛋白的细胞的细胞表面表达。

在一些实施方式中，所述靶蛋白由细胞或组织细胞表达，期望针对它们介导免疫应答，例如细胞介导的免疫反应，如细胞毒性免疫反应。

在一些实施方式中，靶蛋白与感染性疾病、自身免疫疾病或癌症相关。在一些实施方式中，靶蛋白由被致病原感染的细胞、自身免疫效应细胞(即自身免疫病理的效应物)或癌细胞表达。在一些实施方式中，靶蛋白在响应致病原(例如病毒或细胞内病原体)感染的细胞中表达或表达上调。在一些实施方式中，靶蛋白在自身免疫效应细胞(如自身反应性T细胞)中表达或表达上调。在一些实施方式中，靶细胞在癌细胞(如肿瘤细胞)中表达或表达上调。

在一些实施方式中，本发明CAR的抗原结合结构域可以针对选自Sadelain等，2013，Cancer Discov 3(4)：388-398(其在此通过引用整体并入)的表1中公开的靶分子：α-叶酸受体、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44v7/8、CEA、EGFRvIII、EGP-2、EGP-40、EphA2、erbB2、erb-B 2,3,4、FBP、胎儿乙酰胆碱e受体、GD2、GD3、Her-2、HMW-MAA、IL11Rα、IL-13R-α2、KDR、κ-轻链、Lewis Y、L1-细胞粘附分子、MAGE-A1、间皮素、小鼠CMV感染细胞、MUC1、MUC16、NKG2D、NY-ESO-1、癌胚抗原(h5T4)、PSCA、PSMA、ROR1、通过mAbIgE靶向、TAG-72、VEGF-R2和生物素化分子。

所述抗原结合结构域可以包括靶向靶分子的抗体的重链和轻链可变区序列。可以以提供的任何合适的形式提供重链和轻链可变区序列，条件是抗原结合结构域可以与CAR的其他结构域连接。与本发明的抗原结合结构域有关的考虑的形式包括Carter，Nat.Rev.Immunol 2006,6：343-357中所描述的，例如scFv、dsFV、(scFv)₂双抗体、三抗体、四抗体、Fab、微抗体和F(ab)₂形式。

在一些实施方式中，可以在CAR中以特定的相对取向提供重链可变区序列和轻链可变区序列。在一些实施方式中，所述重链可变区序列可以位于轻链可变区序列的N端。在一些实施方式中，所述轻链可变区序列可以位于重链可变区序列的N端。

在一些实施方式中，所述靶分子结合结构域可以包括或由单链可变片段(scFv)组成，所述单链可变片段包含重链可变区序列和轻链可变区序列。在一些实施方式中，所述重链可变区和轻链可变区序列通过柔性接头序列连接。柔性接头序列是本领域技术人员已知的，并且描述于例如Chen等人，Adv Drug Deliv Rev(2013)65(10)：1357-1369中，其全部内容通过引用并入本文。在一些实施方式中，所述柔性接头序列包含丝氨酸和甘氨酸残基。在一些实施方式中，所述柔性接头序列包含1-100、550、10-30或12-20个氨基酸残基。

在一些实施方式中，所述靶蛋白为GPC3。即，在一些实施方式中，所述抗原结合结构域是GPC3结合结构域。

所述GPC3结合结构域能够结合GPC3多肽。GPC3结合结构域能够结合的GPC3多肽可以包含或由人GPC3基因或非人动物中的同源基因编码的氨基酸序列组成。非人动物可以是非人类哺乳动物(例如兔子、豚鼠、大鼠、小鼠或其他啮齿动物(包括啮齿目中的任何动物)、猫、狗、猪、绵羊、山羊、牛(包括乳牛，例如奶牛、或牛目中的任何动物)、马(包括马目的任何动物)、驴和非人灵长类动物。

本发明的CAR的GPC3结合结构域优选显示特异性结合于GPC3多肽。GPC3结合结构域可以来自抗GPC3抗体或其他GPC3结合剂，例如GPC3结合肽或结合GPC3的小分子，例如WO2013/174783A1中公开的结合GPC3的脂质运载蛋白突变蛋白。

所述GPC3结合结构域可以衍生自抗GPC3抗体的抗原结合区。抗GPC3抗体描述于例如Feng和Ho，2014FEBS Lett 588(2)：377-382中，其全部内容通过引用并入本文。抗GPC3抗体包括人单克隆抗GPC3抗体MDX-1414(Medarex)、HN3(例如在WO2012/145469A1中公开)、人源化小鼠单克隆抗GPC3抗体GC33(也称为RO5137382、RG7686；描述于例如WO 2006/046751A1)和YP7(描述于例如WO 2013/181543A1)，和WO 2009/012394A1、WO 2006/046751A1、WO 2013/181543A1、WO 2012/145469A1、WO 2016/036973A1、WO2006/006693A1、WO 2013/070468、WO 2007/047291中公开的抗GPC3抗体，各自通过引用整体并入本文。

本发明的GPC3结合结构域优选包含抗GPC3抗体的重链和轻链可变区序列，或包含衍生自抗GPC3抗体的重链和轻链可变区序列的重链和轻链可变区序列。

可以以提供的任何合适的形式提供重链和轻链可变区序列，条件是GPC3结合结构域可以与CAR的其他结构域连接。

在一些实施方式中，GPC3结合结构域包含如本文所述的抗GPC3抗体的CDR。在一些实施方式中，GPC3结合结构域包含如本文所述的抗GPC3抗体的重链和轻链可变区序列。在一些实施方式中，CAR包含抗GPC3抗体GC33的CDR。对于抗体GC33,重链和轻链可变区序列以及根据Kabat编号体系(Kabat等，(1991)免疫学目的蛋白序列(Sequences ofProteins ofImmunological Interest))定义的重链和轻链CDR 1-3如下所示：

GC33重链可变区序列：

QVQLQQSGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTDYEMHWVKQTPVHGLKWIGALDPKTGDTAYSQKFKGKATLTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO:1)

HC-CDR1:DYEMH(SEQ ID NO:2)

HC-CDR2:ALDPKTGDTAYSQKFKG(SEQ ID NO:3)

HC-CDR3:FYSYTY(SEQ ID NO:4)

GC33轻链可变区序列：

DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQNTHVPPTFGSGTKLEIK(SEQ ID NO:5)

LC-CDR1:RSSQSLVHSNGNTYLH(SEQ ID NO:6)

LC-CDR2:KVSNRFS(SEQ ID NO:7)

LC-CDR3:SQNTHVPPT(SEQ ID NO:8)

在一些实施方式中，所述GPC3结合结构域包含以下氨基酸序列i)-vi)：

或其变体，其中序列i)至vi)中一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。

在一些实施方式中，所述GPC3结合结构域包含重链可变区序列和轻链可变区序列，其中：

所述重链序列与SEQ ID NO:1所示的重链序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性，和；

所述轻链序列与SEQ ID NO:5所示的轻链序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性。

用于确定氨基酸或核苷酸序列同一性百分比的比对可以通过本领域技术人员已知的各种方式实现，例如，使用公众可获得的计算机软件，例如Clustal Omega、T-coffee或Megalign(DNASTAR)软件。使用此类软件时，优选使用默认参数，例如,空位罚分(gappenalty)和延伸罚分(extension penalty)。

在一些实施方式中，所述GPC3结合结构域可以包括或由单链可变片段(scFv)组成，所述单链可变片段包含如本文所述的重链可变区序列和轻链可变区序列。所述重链可变区序列和轻链可变区序列可以通过共价键连接。在一些实施方式中，所述重链可变区和轻链可变区序列通过柔性接头序列连接，优选共价键合至重链可变区序列和轻链可变区序列的末端。

在一些实施方式中，所述GPC3结合结构域包含或由以下序列组成：与SEQ ID No:9所示的氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性的氨基酸序列。

QVQLQQSGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTDYEMHWVKQTPVHGLKWIGALDPKTGDTAYSQKFKGKATLTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQNTHVPPTFGSGTKLEIK(SEQ ID NO:9)

本文所述的轻链和重链CDR也可以特别适用于与许多不同的框架区的结合。因此，包含LC-CDR1-3和/或HC-CDR1-3的轻链和/或重链可变区序列可以分别具有与SEQ ID No：1和5中所示的那些替代框架区。合适的框架区是本领域熟知的，并且描述于例如M.Lefranc和G.Lefranc(2001)“免疫球蛋白概况(The Immunoglobulin FactsBook)”，学术出版社，通过引用并入本文。

包含GPC3结合结构域的CAR或表达包含GPC3结合结构域的CAR的细胞能够结合GCP3。在一些实施方式中，所述CAR/细胞能够结合GPC3的C末端结构域。在一些实施方式中，所述CAR/细胞能够结合GPC3的表位,该表位被抗体GC33结合，例如，根据UniProt编号:P51654(GPC3_HUMAN)(Ho 2011BioDrugs 25(5)：275-284，通过引用整体并入本文)的人GCP3多肽的氨基酸位置524-563的区域内。

结合GPC3可通过本领域技术人员所熟知的技术，例如通过ELISA、免疫沉淀、SPR、生物薄膜干涉技术、流式细胞术或放射免疫测定(RIA)来分析。

在一些实施方式中，所述靶蛋白为EpCAM。即，在一些实施方式中，本发明CAR的抗原结合结构域是EpCAM结合结构域。

EpCAM(上皮细胞粘附分子，也称为DIAR5、EGP-2、EGP314、EGP40、ESA、HNPCC8、KS1/4、KSA、M4S1、MIC18、MK-1、TACSTD1和TROP1)是一种仅在上皮细胞和上皮衍生的肿瘤(即癌)中表达的跨膜糖蛋白。EpCAM结构、功能和生物学特征在例如Schnell等人Biochim BiophysActa.2013；1828(8)：1989-2001中进行了综述，其全部内容通过引用并入本文。EpCAM被认为参与癌症的肿瘤发生和转移性发展，并且高EpCAM表达与不良存活相关,例如乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、尿路上皮癌和胆囊癌。

所述EpCAM结合结构域能够结合EpCAM多肽。EpCAM结合结构域能够结合的EpCAM多肽可以包含或由人EpCAM基因或非人动物中的同源基因编码的氨基酸序列组成。非人动物可以是非人类哺乳动物(例如兔子、豚鼠、大鼠、小鼠或其他啮齿动物(包括啮齿目中的任何动物)、猫、狗、猪、绵羊、山羊、牛(包括乳牛，例如奶牛，或牛目的任何动物)、马(包括马目的任何动物)、驴和非人灵长类动物)。

本发明的CAR的EpCAM结合结构域优选显示特异性结合EpCAM多肽。所述GPC3结合结构域可以衍生自抗-EpCAM抗体或其他EpCAM结合剂，例如，EpCAM结合肽或核酸适体，或结合EpCAM的小分子。

所述EpCAM结合结构域可以衍生自抗EpCAM抗体的抗原结合区。抗-EpCAM抗体描述于例如在Munz等人，Cancer Cell Int.(2010)10:44中，其通过引用整体并入本文。抗EpCAM抗体包括依决洛单抗(Panorex；17-1A)、MOC31、3622W94、ING-1、阿德木单抗(MT201；Naundorf等，Int J Cancer(2002)100(1)：101-10)，和描述于WO2004106383 A1、WO2005080428 A2、WO2008122551 A2、WO2010142990 A1、WO2011079283 A1、WO2012153186A2、WO2013131001 A1、WO2015048901 A1的抗EpCAM抗体，其各自通过引用整体并入本文。

本发明的EpCAM结合结构域优选包含抗EpCAM抗体的重链和轻链可变区序列，或包含衍生自抗EpCAM抗体的重链和轻链可变区序列的重链和轻链可变区序列。

可以以提供的任何合适的形式提供重链和轻链可变区序列，条件是EpCAM结合结构域可以与CAR的其他结构域连接。

在一些实施方式中，EpCAM结合结构域包含如本文所述的抗EpCAM抗体的CDR。在一些实施方式中，EpCAM结合结构域包含如本文所述的抗EpCAM抗体的重链和轻链可变区序列。在一些实施方式中，所述CAR包含抗EpCAM抗体克隆3-17I的CDR。对于抗EpCAM抗体克隆3-17I,重链和轻链可变区序列以及根据Kabat编号体系(Kabat等，(1991)免疫学目的蛋白序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest))定义的重链和轻链CDR 1-3如下所示：

3-17I重链可变区序列：

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGLLWNYWGQGTLVTV(SEQ ID NO:48)

HC-CDR1:SYAIS(SEQ ID NO:49)

HC-CDR2:GIIPIFGTANYAQKFQG(SEQ ID NO:50)

HC-CDR3:GLLWNY(SEQ ID NO:51)

3-17I轻链可变区序列：

EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLIIYGASTTASGIPARFSASGSGTDFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNWPPAYTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO:52)

LC-CDR1:RASQSVSSNLA(SEQ ID NO:53)

LC-CDR2:GASTTAS(SEQ ID NO:54)

LC-CDR3:QQYNNWPPAYT(SEQ ID NO:55)

在一些实施方式中，所述EpCAM结合结构域包含以下氨基酸序列i)-vi)：

在一些实施方式中，所述EpCAM结合结构域包含重链可变区序列和轻链可变区序列，其中：

所述重链序列与SEQ ID NO:48所示的重链序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性，和；

所述轻链序列与SEQ ID NO:52所示的轻链序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性。

在一些实施方式中，所述EpCAM结合结构域可以包括或由单链可变片段(scFv)组成，所述单链可变片段包含如本文所述的重链可变区序列和轻链可变区序列。所述重链可变区序列和轻链可变区序列可以通过共价键连接。在一些实施方式中，所述重链可变区和轻链可变区序列通过柔性接头序列连接，优选共价键合至重链可变区序列和轻链可变区序列的末端。

在一些实施方式中，所述EpCAM结合结构域包含或由以下氨基酸序列组成：与SEQIDNo:56所示的氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性的氨基酸序列。

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGLLWNYWGQGTLVTVSSKLSGSASAPKLEEGEFSEARVEIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLIIYGASTTASGIPARFSASGSGTDFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNWPPAYTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO:56)

本文所述的轻链和重链CDR也可以特别适用于与许多不同的框架区的结合。因此，包含LC-CDR1-3和/或HC-CDR1-3的轻链和/或重链可变区序列可以分别具有与SEQ ID No：48和52中所示的那些替代框架区。合适的框架区描述于例如M.Lefranc和G.Lefranc(2001)“免疫球蛋白概况”，学术出版社，在此引入作为参考。

包含EpCAM结合结构域的CAR或表达包含EpCAM结合结构域的CAR的细胞能够结合EpCAM。在一些实施方式中，所述CAR/细胞能够结合EpCAM的胞外结构域。在一些实施方式中，所述CAR/细胞能够结合EpCAM的表位，该表位被抗-EpCAM抗体克隆3-17I结合。

结合EpCAM可通过例如通过ELISA、免疫沉淀、SPR、生物薄膜干涉技术、流式细胞术或放射免疫测定(RIA)技术来分析。

跨膜结构域

本发明的嵌合抗原受体包含跨膜结构域。

跨膜结构域是指由在生物膜(例如，细胞膜)中热力学稳定的氨基酸序列形成的任何三维结构。

结合本发明，跨膜结构域可以是跨越表达CAR的细胞的细胞膜的氨基酸序列。

跨膜结构域可包含或由形成疏水α螺旋或β-桶状结构的氨基酸序列组成。本发明CAR的跨膜结构域的氨基酸序列可以是或可以衍生自包含跨膜结构域的蛋白的跨膜结构域的氨基酸序列。跨膜结构域记录在数据库中，例如GenBank、UniProt、Swiss-Prot、TrEMBL、蛋白质信息资源、蛋白质数据库、Ensembl和InterPro，和/或可以使用氨基酸序列分析工具，如TMHMM(Krogh等，2001J Mol Biol 305：567-580)进行鉴定/预测。

在一些实施方式中，本发明CAR的跨膜结构域的氨基酸序列可以是或可以衍生自表达于细胞表面的蛋白的跨膜结构域的氨基酸序列。在一些实施方式中，在细胞表面表达的蛋白是受体或配体，例如，免疫受体或配体。在一些实施方式中，跨膜结构域的氨基酸序列可以是或衍生自ICOS、ICOSL、CD86、CTLA-4、CD28、CD80、MHC-I类α、MHC-II类α、MHC-II类β、CD3ε、CD3δ、CD3γ、CD3-ζ、TCRαTCRβ、CD4、CD8α、CD8β、CD40、CD40L、PD-1、PD-L1、PD-L2、4-1BB、4-1BBL、OX40、OX40L、GITR、GITRL、TIM-3、半乳凝素9、LAG3、CD27、CD70、LIGHT、HVEM、TIM-4、TIM-1、ICAM1、LFA-1、LFA-3、CD2、BTLA、CD160、LILRB4、LILRB2、VTCN1、CD2、CD48、2B4、SLAM、CD30、CD30L、DR3、TL1A、CD226、CD155、CD112和CD276之一的跨膜结构域的氨基酸序列。在一些实施方式中，跨膜是或衍生自CD3-ζ、CD4、CD8α、CD8β、CD28或CD226的跨膜结构域的氨基酸序列。

在一些实施方式中，本发明所述CAR的跨膜结构域包含或由以下氨基酸序列组成：与SEQ ID No:10或11所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性的氨基酸序列:CD28跨膜结构域:

FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFII(SEQ 10N0:10)

CD8a跨膜结构域:

IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRN(SEQ 10N0:11)

在一些实施方式中，本发明所述CAR的跨膜结构域包含或由以下氨基酸序列组成：与SEQ ID No:57所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性的氨基酸序列。

信号传导结构域

本发明的嵌合抗原受体包含信号传导结构域。在本发明的嵌合抗原受体中，典型地信号传导结构域中提供了是或来自CD226的细胞内结构域或其片段的共刺激序列。信号传导结构域提供了用于在表达CAR的细胞中启动细胞内信号传导的序列。

含有ITAM的序列

信号传导结构域包含含有一种或多种基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)的氨基酸序列。ITAM包含氨基酸序列YXXL/I(SEQ ID NO：12)，其中“X”表示任何氨基酸。在含有ITAM的蛋白质中，如SEQ ID NO：12所示的序列通常被6至8个氨基酸分开；YXXL/I(X)_6- ₈YXXL/I(SEQ ID NO：13)。当酪氨酸激酶将磷酸基团添加到ITAM的酪氨酸残基上时，细胞内启动信号级联放大。

在一些实施方式中，本发明所述的CAR的信号传导结构域包含一个或多个拷贝的如SEQ ID NO：12或SEQ ID No：13所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述信号传导结构域包含至少1、2、3、4、5或6个拷贝的如SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述信号传导结构域包含至少1、2或3个拷贝的如SEQ ID No：13所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述信号传导结构域包含1-10、2-8、3-7或4-6个拷贝的如SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述信号传导结构域包含至少1-6、2-5、或3-4个拷贝的如SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列。

在一些实施方式中，所述信号传导结构域包含氨基酸序列，所述氨基酸序列是或衍生自具有含有ITAM氨基酸序列的蛋白的含有ITAM的序列的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述信号传导结构域包含氨基酸序列，所述氨基酸序列是或衍生自CD3ε、CD3δ、CD3γ、CD3-ζ、CD79α、CD79β、FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIC、FcγRIIIA、FcγRIV或DAP12之一的含有ITAM的序列(例如细胞内结构域)的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述信号传导结构域包含氨基酸序列，所述氨基酸序列是或衍生自CD3-ζ的含有ITAM的序列(例如细胞内结构域)的氨基酸序列。

在整个说明书中，“衍生自”给定氨基酸序列的氨基酸序列可以保留其衍生自的氨基酸序列的结构和/或功能特性。氨基酸序列可以与衍生它的氨基酸序列具有高度序列同一性。例如，衍生自给定序列的氨基酸序列可以与衍生它的氨基酸序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性。

可以从本领域技术人员已知的数据库中检索、或由从数据库中检索的核酸序列确定给定蛋白或其结构域的氨基酸序列。这些数据库包括GenBank、EMBL、DDBJ、UniProt、Swiss-Prot、TrEMBL、蛋白质信息资源、蛋白质数据库、Ensembl和InterPro。

举例来说，本发明的CAR，包含含有是或衍生自CD3-ζ细胞内结构域的氨基酸序列的信号传导结构域，可以包含与CD3-ζ细胞内结构域(由UniProt：P20963-1(CD3Z_HUMAN)的氨基酸序列的第52-164位表示)具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方式中，本发明所述CAR的信号传导结构域包含含有ITAM的氨基酸序列，所述含有ITAM的氨基酸序列包含或由以下氨基酸序列组成：与SEQ ID No:14所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性的氨基酸序列。

CD3-ζ胞内结构域：

RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:14)

共刺激序列

信号传导结构域还可以包含一种或多种共刺激序列。在一些实施方式中，本发明的嵌合抗原受体包含共刺激序列，所述共刺激序列是或衍生自CD226的细胞内结构域或其片段。

共刺激序列是提供表达CAR的细胞的共刺激的氨基酸序列。共刺激促进表达CAR的细胞的增殖和存活，并且还可以促进细胞因子产生、分化、细胞毒性功能和记忆形成。在Chen和Flies 2013Nat Rev Immunol 13(4)：227-242中综述了T细胞共刺激的分子机制。

本发明CAR的信号传导结构域的共刺激序列可以是或可以衍生自共刺激蛋白的氨基酸序列。是或衍生自CD226的细胞内结构域或其片段的共刺激序列能够启动CD226介导的信号传导。也就是说，本发明的CAR包含能够递送CD226共刺激信号的共刺激序列。

通过CD226的共刺激信号传导描述于例如Martinet和Smyth，Nat Rev Immunol(2015)15：243-254中，其通过引用整体并入本文。通过CD226的丝氨酸329和酪氨酸322的磷酸化启动信号传导，并且磷酸化的残基促进蛋白激酶C(PKC)的活化和与LFA1的结合，这反过来促进FYN介导的CD226的酪氨酸322的磷酸化和下游信号传导。

可以例如通过分析由于CD226介导的信号传导而激活或表达上调或下调的分子的激活或表达,来研究给定的氨基酸序列是否能够启动CD226介导的信号传导。例如，可以通过分析丝氨酸329和/或酪氨酸322的磷酸化、与PKC的结合/活化PKC、与LFA1的结合/活化LFA1、与FYN的结合/活化FYN、或被CD226介导的信号传导上调的任何其他分子的表达上调中的一种或多种来研究给定的氨基酸序列是否能够启动CD226介导的信号传导。可以使用表达包含氨基酸序列的CAR的细胞在体外进行分析。

CD226可以是人CD226。人CD226可具有如SEQ ID NO：15所示的UniProt Q15762(CD226_HUMAN)的氨基酸序列。

人CD226；UniProt Q15762(CD226_HUMAN):

MDYPTLLLALLHVYRALCEEVLWHTSVPFAENMSLECVYPSMGILTQVEWFKIGTQQDSIAIFSPTHGMVIRKPYAERVYFLNSTMASNNMTLFFRNASEDDVGYYSCSLYTYPQGTWQKVIQVVQSDSFEAAVPSNSHIVSEPGKNVTLTCQPQMTWPVQAVRWEKIQPRQIDLLTYCNLVHGRNFTSKFPRQIVSNCSHGRWSVIVIPDVTVSDSGLYRCYLQASAGENETFVMRLTVAEGKTDNQYTLFVAGGTVLLLLFVISITTIIVIFLNRRRRRERRDLFTESWDTQKAPNNYRSPISTSQPTNQSMDDTREDIYVNYPTFSRRPKTRV(SEQ ID NO:15)

人CD226的细胞内结构域对应于SEQ ID NO：15的氨基酸位置271至336，即如SEQID NO：16所示的序列。

CD226细胞内结构域：

IVIFLNRRRRRERRDLFTESWDTQKAPNNYRSPISTSQPTNQSMDDTREDIYVNYPTFSRRPKTRV(SEQ ID NO:16)

在一些实施方式中，本发明所述CAR的信号传导结构域包含共刺激序列，所述共刺激序列包含或由以下氨基酸序列组成：与SEQ ID No:16所示的氨基酸序列或其片段具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性的氨基酸序列。

人CD226的细胞内结构域对应于SEQ ID NO：15的氨基酸位置276至336，即如SEQIDNO：58所示的序列，在本文中称为“CD226ICD v1”。

在一些实施方式中，本发明所述CAR的信号传导结构域包含共刺激序列，所述共刺激序列包含或由以下氨基酸序列组成：与SEQ ID No:58所示的氨基酸序列或其片段具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性的氨基酸序列。

人CD226的细胞内结构域对应于SEQ ID NO：15的氨基酸位置274至336，即如SEQID NO：59所示的序列，在本文中称为“CD226ICD v2”。

在一些实施方式中，本发明所述CAR的信号传导结构域包含共刺激序列，所述共刺激序列包含或由以下氨基酸序列组成：与SEQ ID No:59所示的氨基酸序列或其片段具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方式中，本发明的CAR的信号传导结构域除了是或衍生自CD226的细胞内结构域的共刺激序列外还包含其他共刺激序列。

在一些实施方式中，所述信号传导结构域包含一种以上的共刺激序列。在一些实施方式中，所述信号传导结构域包含2、3、4或5个共刺激序列。在一些实施方式中，本发明的CAR的信号传导结构域的共刺激序列可以是或可以衍生自共刺激蛋白的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述序列可以是或可以衍生自共刺激蛋白的细胞内结构域。在一些实施方式中，所述共刺激蛋白可以是B7-CD28超家族的成员(例如CD28、ICOS)，或TNF受体超家族的成员(例如4-1BB、OX40、CD27、DR3、GITR、CD30、HVEM)。在一些实施方式中，所述CAR的信号传导结构域包含共刺激序列，所述共刺激序列是或衍生自CD28、ICOS、4-1BB、CD27、OX40、HVEM、CD2、SLAM、TIM-1、CD30、GITR、DR3、LIGHT和CD226之一的细胞内结构域。在一些实施方式中，所述信号传导结构域包含共刺激序列，所述共刺激序列是或衍生自CD28或4-1BB的细胞内结构域。在一些实施方式中，所述信号传导结构域包含共刺激序列，所述共刺激序列是或来自CD28或4-1BB和CD226之一的细胞内结构域。

共刺激蛋白通过几种转导途径上调促进细胞生长、效应功能和存活的基因的表达。例如，CD28和ICOS通过磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)和AKT发出信号，通过NF-κB、mTOR、NFAT和AP1/2上调促进细胞生长、效应功能和存活的基因的表达。CD28还通过CDC42/RAC1激活AP1/2和通过RAS激活ERK1/2，并且ICOS激活C-MAF。4-1BB、OX40和CD27募集TNF受体相关因子(TRAF)并通过MAPK途径以及通过PI3K发出信号。

在一些实施方式中，本发明所述CAR的信号传导结构域包含共刺激序列，所述共刺激序列包含或由以下氨基酸序列组成：与SEQ ID No:17或18所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性的氨基酸序列。

CD28细胞内结构域：

FWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO:17)

4-1BB细胞内结构域：

KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO:18)

在一些实施方式中，所述CAR的信号传导结构域包括：(i)与SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的共刺激序列；和ii)与SEQ ID No：17所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的共刺激序列。

在一些实施方式中，所述CAR的信号传导结构域包括：(i)与SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的共刺激序列；和ii)与SEQ ID No：18所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的共刺激序列。

在一些实施方式中，所述CAR的信号传导结构域包括：(i)与SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的共刺激序列；ii)与SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的共刺激序列；和iii)与SEQ ID No：18所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的共刺激序列。

铰链区

本发明的嵌合抗原受体可包含抗原结合结构域和跨膜结构域之间的铰链区。铰链区是提供CAR的抗原结合和跨膜结构域的柔性连接的氨基酸序列。

已经显示铰链区的存在、不存在和长度影响CAR功能(例如在Dotti等，ImmunolRev(2014)257(1)同上)。

在一些实施方式中，CAR包含铰链区，所述铰链区包含或由以下氨基酸序列组成：是或衍生自人IgG1铰链区、IgG1的CH₂CH₃(即Fc)区、IgG1的CH₂区、IgG1、IgG4的CH₃区，人IgD的氨基酸187-189(Wilkie等，2008J IMmunol 180(7)：4901-4909)，衍生自CD8α的铰链区(例如，如WO2012/031744A1中所述)，或衍生自CD28的铰链区(例如，如WO2011/041093A1中所述)。

在一些实施方式中，本发明所述CAR的铰链结构域包含或由以下氨基酸序列组成：与SEQ ID No:19所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性的氨基酸序列。

人IgG1铰链区：

EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:19)

二聚化结构域

本发明的嵌合抗原受体包含二聚化结构域。

如本文所用，“二聚化结构域”指一段氨基酸序列，蛋白质可以通过该序列与另一种蛋白质结合形成二聚体、寡聚体或多聚体。在一些实施方式中，另一种蛋白质可以是膜结合分子，例如，受体或配体。在一些实施方式中，所述二聚化结构域可以提供CAR的自聚合(self-association)以形成同型二聚体，或者可以提供与另一种不同蛋白质聚合以形成异二聚体。

CAR单体也可以形成更高级的低聚物/多聚体，例如三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体等。在一些实施方式中，CAR单体可通过二聚化结构域聚合以形成更高级的寡聚体/多聚体。因此，在一些实施方式中，二聚化结构域可以是寡聚化结构域或多聚化结构域，例如三聚化结构域、四聚化结构域、五聚化结构域、六聚化结构域、七聚化结构域、八聚化结构域等。

二聚化结构域已被用于CAR中以调节CAR活性。Wu等人，2015Science 350(6258)(通过引用整体并入本文)描述了“ONswitch CAR”，其中抗原结合和信号转导结构域以单独的分子提供，每个分子包括可以使用小分子控制二聚化以形成功能性CAR的结构域。

本发明的CAR的二聚化结构域可以是自发的或诱导型的。

在没有外界因子/信号的情况下，自发二聚化结构域通过所述结构域提供聚合以形成二聚体。例如在自发形成同源二聚体或异二聚体的蛋白质中发现自发二聚化结构域。

诱导型二聚化结构域响应例如试剂/信号提供聚合以形成二聚体，从而可以控制二聚化。

在一些实施方式中，二聚化可以响应于化学处理而可诱导。化学诱导二聚化的实例包括：用FK1012诱导的FKBP/FKBP同源二聚化(Spencer等，1993Science 262(5136)：10191024)；用FKCsA诱导的FKBP/CyP-Fas异二聚化(Belshaw等，1996PNAS 93(10)：4604-4607)；用FK506诱导的FKBP/CNA异二聚化(Ho等，1996Nature 382(6594)：822-826)；用雷帕霉素诱导的mTOR的FKBP/FRB结构域异二聚化(Rivera等，1996Nature Medicine 2(9)：1028-1032)；用赤霉素诱导的GAI/GID1异二聚化(Miyamoto等，2012Nature ChemicalBiology 8(5)：465-470)；用库马霉素诱导的GyrB/GyrB同源二聚化(Farrar等，1996Nature383(6596)：178-181)；用HaXS诱导的HalTag/SNAP-标签异二聚化(Erhart等，2013ChemBiol 20(4)：549-557)；和用AP1903诱导的F36V-FKBP/F36V-FKBP同源二聚化(Clackson等，1998 95(18)：10437-10442)。

诱导型二聚化结构域提供通过CAR的信号传导的选择性上调。例如，可以通过用合适的试剂处理来刺激包含化学诱导型二聚化结构域的CAR二聚化，导致CAR介导的信号传导增强。以这种方式，可以选择性地刺激包含本发明CAR的细胞的增殖(即生长和分裂)。

可以使用合适的试剂选择性地刺激表达具有化学诱导型二聚化结构域的CAR的细胞的增殖和存活。例如，可以通过用AP1903处理选择性地刺激表达具有SEQ ID NO：19所示的二聚化结构域的CAR的细胞的生长和分裂,因此通过CAR的信号传导增强。重要的是，用AP1903处理不会刺激不包含所述CAR的细胞的生长和分裂，因此表达所述CAR的细胞可以从包含表达CAR的细胞和不表达CAR的细胞的异源群体中扩增。

在一些实施方式中，本发明CAR的二聚化结构域的氨基酸序列可以是或可以衍生自已知或预测形成同源二聚体或异二聚体的蛋白的氨基酸序列。本发明CAR的二聚化结构域的氨基酸序列可以是或可以衍生自包含二聚化结构域的蛋白的二聚化结构域的氨基酸序列。蛋白通过其形成二聚体的氨基酸序列记录在数据库中，例如GenBank、UniProt、Swiss-Prot、TrEMBL、蛋白质信息资源、蛋白质数据库、Ensembl和InterPro，和/或可以使用氨基酸序列分析工具，如meta-PPISP(Qin等，2007Bioinformatics 23：3386-3387)。

在一些实施方式中，本发明CAR的二聚化结构域的氨基酸序列可以是或可以衍生自FKBP或其突变体(例如，F36V、F36M)的氨基酸序列。

在一些实施方式中，本发明所述CAR的二聚化结构域包含或由以氨基酸下序列组成：与SEQ ID No:20所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性的氨基酸序列。

F36V-FKBP:

GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLE(SEQ ID NO:20)

二聚化结构域可以位于CAR的跨膜结构域的N末端、或跨膜结构域的C末端。也就是说，当CAR在细胞表面表达时，二聚化结构域可以在CAR的细胞外部分或CAR的细胞内部分中。

信号序列

在一些实施方式中，本发明的CAR可包含信号序列(也称为信号肽或前导序列)。信号序列通常由5-30个疏水性氨基酸序列组成，其形成单个α螺旋。分泌的蛋白和在细胞表面表达的蛋白通常包含信号序列。

信号序列可以存在于CAR的N末端，并且可以存在于新合成的CAR中。信号序列提供CAR向细胞表面的有效运输。信号序列通常通过切割除去，因此不包含在细胞表面表达的成熟CAR中。

对于许多蛋白,信号序列是已知的并记录在数据库中，例如GenBank、UniProt、Swiss-Prot、TrEMBL、蛋白质信息资源、蛋白质数据库、Ensembl和InterPro，和/或可以使用氨基酸序列分析工具，如SignalP(Petersen等,2011Nature Methods 8:785-786)或Signal-BLAST(Frank和Sippl,2008Bioinformatics 24:2172-2176)。

在一些实施方式中，本发明所述CAR的信号序列包含或由以下氨基酸序列组成：与SEQ ID No:21所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性的氨基酸序列:

人Ig重链信号序列：

MDWIWRILFLVGAATGAHS(SEQ ID NO:21)

接头序列

在一些实施方式中，本发明的CAR可包含CAR的区域/结构域之间的一个或多个接头序列。例如，CAR可以包括以下结构：

N端-[…]-[铰链区]-{接头序列}-[跨膜结构域]-[…]-C端

接头序列是本领域技术人员已知的，并且描述于例如Chen等人，Adv Drug DelivRev(2013)65(10)：1357-1369，在此引入作为参考。

在一些实施方式中，接头序列可以包含刚性接头序列。在一些实施方式中，接头序列可以包含柔性接头序列。在一些实施方式中，接头序列可以包含可切割接头序列。

在一些实施方式中，接头序列包含1-25、1-20、1-15、1-10或1-5个氨基酸。在一些实施方式中，接头序列包含少于25、20、15、10或5个氨基酸。

额外的序列

在一些实施方式中，所述嵌合抗原受体可进一步地包含功能性氨基酸序列。

例如，CAR可以包含氨基酸序列以促进CAR的表达、折叠、运输、加工或纯化。例如，CAR可包含编码任选地在N-或C-末端的蛋白标签的序列，例如His(例如6XHis)、Myc、GST、MBP、FLAG、HA，E或生物素标签。

示例性CAR

本发明的嵌合抗原受体可以具有结构域的特定组合和相对排列。

设计抗原结合、跨膜和信号传导结构域，使得当CAR在细胞表面表达时，抗原结合结构域位于细胞外空间，信号传导结构域位于细胞内。

在一些实施方式中，本发明CAR的结构域/序列可以具有以下之一的相对排列：

N端-[信号序列]-[抗原结合结构域]-[铰链区]-[跨膜结构域]-[信号传导结构域]-C端

N端-[信号序列]-[抗原结合结构域]-[铰链区]-[跨膜结构域]-[二聚化结构域]-[信号传导结构域]-C端

N端-[信号序列]-[GPC3结合结构域]-[铰链区]-[跨膜结构域]-[信号传导结构域]-C端

N端-[信号序列]-[GPC3结合结构域]-[铰链区]-[跨膜结构域]-[二聚化结构域]-[信号传导结构域]-C端

N端-[信号序列]-[EpCAM结合结构域]-[铰链区]-[跨膜结构域]-[信号传导结构域]-C端

N端-[信号序列]-[EpCAM结合结构域]-[铰链区]-[跨膜结构域]-[二聚化结构域]-[信号传导结构域]-C端

在一些实施方式中，在信号传导结构域内，含有ITAM的序列和共刺激序列可以具有以下之一的相对排列：

N端-[…]-[共刺激序列]-[含有ITAM的序列]-[…]-C端

N端-[…]-[共刺激序列1]-[共刺激序列2]-[含有ITAM的序列]-[…]-C端

N端-[…]-[共刺激序列1]-[共刺激序列2]-[共刺激序列3]-[含有ITAM的序列]-[…]-C端

根据本发明的各方面，其中CAR包含共刺激序列，其是或衍生自CD226的细胞内结构域或其片段，在共刺激序列中是或衍生自CD226的细胞内结构域或其片段可以与跨膜结构域相邻。

在一些实施方式中，是或衍生自CD226的细胞内结构域或其片段的共刺激序列在信号传导结构域内其他共刺激序列和/或含有ITAM的序列的N末端。

N端-[…]-[CD226共刺激序列]-[含有ITAM的序列]-[…]-C端

N端-[…]-[CD226共刺激序列]-[共刺激序列2]-[含有ITAM的序列]-[…]-C端

N端-[…]-[CD226共刺激序列]-[共刺激序列2]-[共刺激序列3]-[含有ITAM的序列]-[…]-C端

在一些实施方式中，CAR可以包含如表1中所示的A至M中任一的结构域/序列的组合：

应理解，表1提供了CAR A至M的结构域/序列的组合的简短表示。CAR A至M包含以下结构域/序列的组合：

表1

	抗原结合结构域	跨膜结构域	二聚化结构域	信号传导结构域
					A	结合GPC3的scFV	CD8α	-	CD226,CD3ζ
B	结合GPC3的scFV	CD8α	F36V-FKBP	CD226,CD3ζ
					C	结合GPC3的scFV	CD8α	-	CD226,CD28,CD3ζ
D	结合GPC3的scFV	CD8α	F36V-FKBP	CD226,CD28,CD3ζ
					E	结合GPC3的scFV	CD8α	-	CD226,4-1BB,CD3ζ
F	结合GPC3的scFV	CD8α	F36V-FKBP	CD226,4-1BB,CD3ζ
					G	结合GPC3的scFV	CD8α	-	CD226,CD28,4-1BB,CD3ζ
H	结合GPC3的scFV	CD8α	F36V-FKBP	CD226,CD28,4-1BB,CD3ζ
					I	结合GPC3的scFV	CD28	F36V-FKBP	4-1BB,CD3ζ
J	结合GPC3的scFV	CD8α	-	4-1BB,CD3ζ
					K	结合GPC3的scFV	CD8α	F36V-FKBP	4-1BB,CD3ζ
L	结合GPC3的scFV	CD8α	-	CD28,CD3ζ
					M	结合GPC3的scFV	CD8α	F36V-FKBP	CD28,CD3ζ

应理解，表1提供了CAR A至M的结构域/序列组合的简写表示。CAR A至M包含以下结构域/序列的组合：

(A)GPC3结合结构域，其包含或由是或衍生自结合GPC3的scFV的氨基酸序列组成；

跨膜结构域，其包含或由是或衍生自CD8α的跨膜结构域的氨基酸序列组成；

信号传导结构域，其包含：

共刺激序列，其包含或由是或衍生自CD226的细胞内结构域的氨基酸序列组成，和

含有ITAM的序列，其包含或由是或衍生自CD3ζ的细胞内结构域的氨基酸序列组成。

(B)GPC3结合结构域，其包含或由是或衍生自结合GPC3的scFV的氨基酸序列组成；

二聚化结构域，其包含或由以下氨基酸序列组成：是或衍生自F36V-FKBP的氨基酸序列；

信号传导结构域，其包含：

(C)GPC3结合结构域，其包含或由是或衍生自结合GPC3的scFV的氨基酸序列组成；

信号传导结构域，其包含：

共刺激序列，其包含或由是或衍生自CD226的细胞内结构域的氨基酸序列组成，

共刺激序列，其包含或由是或衍生自CD28的细胞内结构域的氨基酸序列组成，和

(D)GPC3结合结构域，其包含或由是或衍生自结合GPC3的scFV的氨基酸序列组成；

信号传导结构域，其包含：

(E)GPC3结合结构域，其包含或由是或衍生自结合GPC3的scFV的氨基酸序列组成；

信号传导结构域，其包含：

共刺激序列，其包含或由是或衍生自4-1BB的细胞内结构域的氨基酸序列组成，和

(F)GPC3结合结构域，其包含或由是或衍生自结合GPC3的scFV的氨基酸序列组成；

二聚化结构域，其包含或由以下序列组成：是或衍生自F36V-FKBP的氨基酸序列；

信号传导结构域，其包含：

(G)GPC3结合结构域，其包含或由是或衍生自结合GPC3的scFV的氨基酸序列组成；

信号传导结构域，其包含：

共刺激序列，其包含或由是或衍生自CD28的细胞内结构域的氨基酸序列组成，

(H)GPC3结合结构域，其包含或由是或衍生自结合GPC3的scFV的氨基酸序列组成；

信号传导结构域，其包含：

(I)GPC3结合结构域，其包含或由是或衍生自结合GPC3的scFV的氨基酸序列组成；

跨膜结构域，其包含或由是或衍生自CD28的跨膜结构域的氨基酸序列组成；

信号传导结构域，其包含：

(J)GPC3结合结构域，其包含或由是或衍生自结合GPC3的scFV的氨基酸序列组成；

信号传导结构域，其包含：

(K)GPC3结合结构域，其包含或由是或衍生自结合GPC3的scFV的氨基酸序列组成；

信号传导结构域，其包含：

(L)GPC3结合结构域，其包含或由是或衍生自结合GPC3的scFV的氨基酸序列组成；

信号传导结构域，其包含：

(M)GPC3结合结构域，其包含或由是或衍生自结合GPC3的scFV的氨基酸序列组成；

信号传导结构域，其包含：

在一些实施方式中，根据A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L或M中任一的CAR还包含如本文所述的抗原结合结构域和跨膜结构域之间的铰链区。在一些实施方式中,所述CAR包含铰链区，所述铰链区包含或由是或衍生自人IgG1铰链区的氨基酸序列组成。

在一些实施方式中，根据A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L或M中任一的CAR还包含如本文所述的信号序列。在一些实施方式中，所述CAR包含信号序列，所述信号序列包含或由是或衍生自人Ig重链信号序列的氨基酸序列组成。

在一些实施方式中，所述CAR可以包含如下(1)至(13)之一所述排列的结构域/序列的组合。任选地，在一些实施例中，CAR可以无信号序列。在一些优选的实施方式中，结构域和序列以所述顺序从N末端到C末端存在于CAR中。

(1)N端-[信号序列]-[GPC3结合结构域]-[铰链区]-[跨膜结构域]-[二聚化结构域]-[信号传导结构域]-C端；

其中信号序列包含或由与SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列组成；

其中GPC3结合结构域包括：

重链可变区序列，其与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性，和

轻链可变区序列，其与SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性；

其中铰链区包含或由与SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列组成；

其中跨膜结构域包含或由与SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列组成；

其中二聚化结构域包含或由与SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列组成；和

其中，信号传导结构域包括：

共刺激序列，包含或由与SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列组成；和

含有ITAM的氨基酸序列，包含或由与SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列组成。

(2)N端-[信号序列]-[GPC3结合结构域]-[铰链区]-[跨膜结构域]-[信号传导结构域]-C端；

其中GPC3结合结构域包括：

其中跨膜结构域包含或由与SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列组成；和

其中，信号传导结构域包括：

(3)N端-[信号序列]-[GPC3结合结构域]-[铰链区]-[跨膜结构域]-[二聚化结构域]-[信号传导结构域]-C端；

其中GPC3结合结构域包括：

其中跨膜结构域包含或由与SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列组成；

其中，信号传导结构域包括：

(4)N端-[信号序列]-[GPC3结合结构域]-[铰链区]-[跨膜结构域]-[信号传导结构域]-C端；

其中GPC3结合结构域包括：

其中，信号传导结构域包括：

共刺激序列，包含或由与SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列组成；和

(5)N端-[信号序列]-[GPC3结合结构域]-[铰链区]-[跨膜结构域]-[二聚化结构域]-[信号传导结构域]-C端；

其中GPC3结合结构域包括：

其中，信号传导结构域包括：

(6)N端-[信号序列]-[GPC3结合结构域]-[铰链区]-[跨膜结构域]-[信号传导结构域]-C端；

其中GPC3结合结构域包括：

其中，信号传导结构域包括：

共刺激序列，包含或由与SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列组成；和

(7)N端-[信号序列]-[GPC3结合结构域]-[铰链区]-[跨膜结构域]-[二聚化结构域]-[信号传导结构域]-C端；

其中GPC3结合结构域包括：

其中，信号传导结构域包括：

(8)N端-[信号序列]-[GPC3结合结构域]-[铰链区]-[跨膜结构域]-[信号传导结构域]-C端；

其中GPC3结合结构域包括：

其中，信号传导结构域包括：

共刺激序列，包含或由与SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列组成；

(9)N端-[信号序列]-[GPC3结合结构域]-[铰链区]-[跨膜结构域]-[二聚化结构域]-[信号传导结构域]-C端；

其中GPC3结合结构域包括：

其中，信号传导结构域包括：

(10)N端-[信号序列]-[GPC3结合结构域]-[铰链区]-[跨膜结构域]-[信号传导结构域]-C端；

其中GPC3结合结构域包括：

其中，信号传导结构域包括：

(11)N端-[信号序列]-[GPC3结合结构域]-[铰链区]-[跨膜结构域]-[二聚化结构域]-[信号传导结构域]-C端；

其中GPC3结合结构域包括：

其中，信号传导结构域包括：

(12)N端-[信号序列]-[GPC3结合结构域]-[铰链区]-[跨膜结构域]-[信号传导结构域]-C端；

其中GPC3结合结构域包括：

其中，信号传导结构域包括：

共刺激序列，包含或由与SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列组成；

(13)N端-[信号序列]-[GPC3结合结构域]-[铰链区]-[跨膜结构域]-[二聚化结构域]-[信号传导结构域]-C端；

其中，GPC3结合结构域包括：

其中二聚化结构域包含或由与SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列组成；

其中，信号传导结构域包括：

在一些实施方式中，本发明所述的嵌合抗原受体包含或由以下氨基酸序列组成：与SEQ ID NO:22、23、24、25、26、27、28、29、38、39、40、41或42所示的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性的氨基酸序列。

scFV GC33/hIgG1铰链/CD8αTMD/CD226/CD3ζ：

QVQLQQSGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTDYEMHWVKQTPVHGLKWIGALDPKTGDTAYSQKFKGKATLTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQNTHVPPTFGSGTKLEIKEPKSCDKTHTCPPCPDPKIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNIVIFLNRRRRRERRDLFTESWDTQKAPNNYRSPISTSQPTNQSMDDTREDIYVNYPTFSRRPKTRVRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:22)

scFV GC33/hIgG1铰链/CD8αTMD/F36V-FKBP/CD226/CD3ζ：

QVQLQQSGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTDYEMHWVKQTPVHGLKWIGALDPKTGDTAYSQKFKGKATLTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQNTHVPPTFGSGTKLEIKEPKSCDKTHTCPPCPDPKIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLEIVIFLNRRRRRERRDLFTESWDTQKAPNNYRSPISTSQPTNQSMDDTREDIYVNYPTFSRRPKTRVRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:23)

scFV GC33/hIgG1铰链/CD8αTMD/CD226/CD28/CD3ζ：

QVQLQQSGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTDYEMHWVKQTPVHGLKWIGALDPKTGDTAYSQKFKGKATLTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQNTHVPPTFGSGTKLEIKEPKSCDKTHTCPPCPDPKIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNIVIFLNRRRRRERRDLFTESWDTQKAPNNYRSPISTSQPTNQSMDDTREDIYVNYPTFSRRPKTRVFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:24)

scFV GC33/hIgG1铰链/CD8αTMD/F36V-FKBP/CD226/CD28/CD3ζ：

QVQLQQSGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTDYEMHWVKQTPVHGLKWIGALDPKTGDTAYSQKFKGKATLTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQNTHVPPTFGSGTKLEIKEPKSCDKTHTCPPCPDPKIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLEIVIFLNRRRRRERRDLFTESWDTQKAPNNYRSPISTSQPTNQSMDDTREDIYVNYPTFSRRPKTRVFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:25)

scFV GC33/hIgG1铰链/CD8αTMD/CD226/4-1BB/CD3ζ：

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scFV GC33/hIgG1铰链/CD8αTMD/F36V-FKBP/CD226/41BB/CD3ζ：

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scFV GC33/hIgG1铰链/CD8αTMD/CD226/CD28/4-1BB/CD3ζ：

QVQLQQSGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTDYEMHWVKQTPVHGLKWIGALDPKTGDTAYSQKFKGKATLTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQNTHVPPTFGSGTKLEIKEPKSCDKTHTCPPCPDPKIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNIVIFLNRRRRRERRDLFTESWDTQKAPNNYRSPISTSQPTNQSMDDTREDIYVNYPTFSRRPKTRVFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:28)

scFV GC33/hIgG1铰链/CD8αTMD/F36V-FKBP/CD226/CD28/41BB/CD3ζ：

QVQLQQSGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTDYEMHWVKQTPVHGLKWIGALDPKTGDTAYSQKFKGKATLTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQNTHVPPTFGSGTKLEIKEPKSCDKTHTCPPCPDPKIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLEIVIFLNRRRRRERRDLFTESWDTQKAPNNYRSPISTSQPTNQSMDDTREDIYVNYPTFSRRPKTRVFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:29)

scFV GC33/hIgG1铰链/CD28TMD/F36V-FKBP/41BB/CD3ζ：

QVQLQQSGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTDYEMHWVKQTPVHGLKWIGALDPKTGDTAYSQKFKGKATLTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQNTHVPPTFGSGTKLEIKEPKSCDKTHTCPPCPDPKFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLEKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:38)

scFV GC33/hIgG1铰链/CD8αTMD/41BB/CD3ζ：

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scFV GC33/hIgG1铰链/CD8αTMD/F36V-FKBP/41BB/CD3ζ:

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scFV GC33/hIgG1铰链/CD8αTMD/CD28/CD3ζ：

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scFV GC33/hIgG1铰链/CD8αTMD/F36V-FKBP/CD28/CD3ζ：

QVQLQQSGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTDYEMHWVKQTPVHGLKWIGALDPKTGDTAYSQKFKGKATLTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQNTHVPPTFGSGTKLEIKEPKSCDKTHTCPPCPDPKIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLEFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:42)

在一些实施方式中，本发明所述的嵌合抗原受体包含或由以下氨基酸序列组成：与SEQ ID NO:30、31、32、33、34、35、36、37、43、44、45、46或47所示的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性的氨基酸序列。

hIgG重链信号序列/scFV GC33/hIgG1铰链/CD8αTMD/CD226/CD3ζ:

MDWIWRILFLVGAATGAHSQVQLQQSGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTDYEMHWVKQTPVHGLKWIGALDPKTGDTAYSQKFKGKATLTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQNTHVPPTFGSGTKLEIKEPKSCDKTHTCPPCPDPKIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNIVIFLNRRRRRERRDLFTESWDTQKAPNNYRSPISTSQPTNQSMDDTREDIYVNYPTFSRRPKTRVRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:30)

hIgG重链信号序列/scFV GC33/hIgG1铰链/CD8αTMD/F36VFKBP/CD226/CD3ζ:MDWIWRILFLVGAATGAHSQVQLQQSGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTDYEMHWVKQTPVHGLKWIGALDPKTGDTAYSQKFKGKATLTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQNTHVPPTFGSGTKLEIKEPKSCDKTHTCPPCPDPKIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLEIVIFLNRRRRRERRDLFTESWDTQKAPNNYRSPISTSQPTNQSMDDTREDIYVNYPTFSRRPKTRVRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:31)

hIgG重链信号序列/scFV GC33/hIgG1铰链/CD8αTMD/CD226/CD28/CD3ζ:MDWIWRILFLVGAATGAHSQVQLQQSGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTDYEMHWVKQTPVHGLKWIGALDPKTGDTAYSQKFKGKATLTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQNTHVPPTFGSGTKLEIKEPKSCDKTHTCPPCPDPKIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNIVIFLNRRRRRERRDLFTESWDTQKAPNNYRSPISTSQPTNQSMDDTREDIYVNYPTFSRRPKTRVFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ IDNO:32)

hIgG重链信号序列/scFV GC33/hIgG1铰链/CD8αTMD/F36V-FKBP/CD226/CD28/CD3ζ:

MDWIWRILFLVGAATGAHSQVQLQQSGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTDYEMHWVKQTPVHGLKWIGALDPKTGDTAYSQKFKGKATLTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQNTHVPPTFGSGTKLEIKEPKSCDKTHTCPPCPDPKIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLEIVIFLNRRRRRERRDLFTESWDTQKAPNNYRSPISTSQPTNQSMDDTREDIYVNYPTFSRRPKTRVFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:33)

hIgG重链信号序列/scFV GC33/hIgG1铰链/CD8αTMD/CD226/4-1BB/CD3ζ:MDWIWRILFLVGAATGAHSQVQLQQSGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTDYEMHWVKQTPVHGLKWIGALDPKTGDTAYSQKFKGKATLTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQNTHVPPTFGSGTKLEIKEPKSCDKTHTCPPCPDPKIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNIVIFLNRRRRRERRDLFTESWDTQKAPNNYRSPISTSQPTNQSMDDTREDIYVNYPTFSRRPKTRVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ IDNO:34)

hIgG重链信号序列/scFV GC33/hIgG1铰链/CD8αTMD/F36V-FKBP/CD226/41BB/CD3ζ:

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hIgG重链信号序列/scFV GC33/hIgG1铰链/CD8αTMD/CD226/CD28/4-1BB/CD3ζ:MDWIWRILFLVGAATGAHSQVQLQQSGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTDYEMHWVKQTPVHGLKWIGALDPKTGDTAYSQKFKGKATLTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQNTHVPPTFGSGTKLEIKEPKSCDKTHTCPPCPDPKIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNIVIFLNRRRRRERRDLFTESWDTQKAPNNYRSPISTSQPTNQSMDDTREDIYVNYPTFSRRPKTRVFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:36)

hIgG重链信号序列/scFV GC33/hIgG1铰链/CD8αTMD/F36V-FKBP/CD226/CD28/41BB/CD3ζ:

MDWIWRILFLVGAATGAHSQVQLQQSGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTDYEMHWVKQTPVHGLKWIGALDPKTGDTAYSQKFKGKATLTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQNTHVPPTFGSGTKLEIKEPKSCDKTHTCPPCPDPKIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLEIVIFLNRRRRRERRDLFTESWDTQKAPNNYRSPISTSQPTNQSMDDTREDIYVNYPTFSRRPKTRVFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ IDNO:37)

hIgG重链信号序列/scFV GC33/hIgG1铰链/CD28TMD/F36V-FKBP/41BB/CD3ζ:MDWIWRILFLVGAATGAHSQVQLQQSGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTDYEMHWVKQTPVHGLKWIGALDPKTGDTAYSQKFKGKATLTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQNTHVPPTFGSGTKLEIKEPKSCDKTHTCPPCPDPKFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLEKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:43)

hIgG重链信号序列/scFV GC33/hIgG1铰链/CD8αTMD/41BB/CD3ζ:MDWIWRILFLVGAATGAHSQVQLQQSGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTDYEMHWVKQTPVHGLKWIGALDPKTGDTAYSQKFKGKATLTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQNTHVPPTFGSGTKLEIKEPKSCDKTHTCPPCPDPKIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ IDNO:44)

hIgG重链信号序列/scFV GC33/hIgG1铰链/CD8αTMD/F36V-FKBP/41BB/CD3ζ:MDWIWRILFLVGAATGAHSQVQLQQSGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTDYEMHWVKQTPVHGLKWIGALDPKTGDTAYSQKFKGKATLTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQNTHVPPTFGSGTKLEIKEPKSCDKTHTCPPCPDPKIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLEKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:45)

hIgG重链信号序列/scFV GC33/hIgG1铰链/CD8αTMD/CD28/CD3ζ:

MDWIWRILFLVGAATGAHSQVQLQQSGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTDYEMHWVKQTPVHGLKWIGALDPKTGDTAYSQKFKGKATLTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQNTHVPPTFGSGTKLEIKEPKSCDKTHTCPPCPDPKIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:46)

hIgG重链信号序列/scFV GC33/hIgG1铰链/CD8αTMD/F36V-FKBP/CD28/CD3ζ:

MDWIWRILFLVGAATGAHSQVQLQQSGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTDYEMHWVKQTPVHGLKWIGALDPKTGDTAYSQKFKGKATLTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQNTHVPPTFGSGTKLEIKEPKSCDKTHTCPPCPDPKIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLEFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:47)

在一些实施方式中，本发明的CAR不包含表2中所示的N、O、P、Q、R、S、T或U的结构域/序列的组合：

表2

	抗原结合结构域	铰链区	跨膜结构域	信号传导结构域
					N	结合GPC3的scFV	CD8α	CD8α	CD3ζ
O	结合GPC3的scFV	CD8α	CD8α	4-1BB,CD3ζ
					P	结合GPC3的scFV	CD8α	CD28	CD28,CD3ζ
Q	结合GPC3的scFV	CD8α	CD28	CD28,4-1BB,CD3ζ
					R	结合GPC3的scFV	人IgG1	CD28	CD3ζ
S	结合GPC3的scFV	人IgG1	CD28	CD28,CD3ζ
					T	结合GPC3的scFV	人IgG1	CD28	4-1BB,CD3ζ
U	结合GPC3的scFV	人IgG1	CD28	CD28,4-1BB,CD3ζ

在一些实施方式中，CAR可以包含如表3中所示的V至MM中任一的结构域/序列的组合：

表3

应理解，表3提供了CAR V至MM的结构域/序列的组合的简短表示。CAR V至M包含以下结构域/序列的组合：

(V)GPC3结合结构域，其包含或由是或衍生自结合GPC3的scFV的氨基酸序列组成；

信号传导结构域，其包含：

共刺激序列，其包含或由是或衍生自CD226的细胞内结构域的氨基酸序列组成。

(W,X)GPC3结合结构域，其包含或由是或衍生自结合GPC3的scFV的氨基酸序列组成；

信号传导结构域，其包含：

(Y,Z)GPC3结合结构域，其包含或由是或衍生自结合GPC3的scFV的氨基酸序列组成；

信号传导结构域，其包含：

(AA,BB)GPC3结合结构域，其包含或由是或衍生自结合GPC3的scFV的氨基酸序列组成；

信号传导结构域，其包含：

(CC)GPC3结合结构域，其包含或由是或衍生自结合GPC3的scFV的氨基酸序列组成；

信号传导结构域，其包含：

(DD,EE)GPC3结合结构域，其包含或由是或衍生自结合GPC3的scFV的氨基酸序列组成；

信号传导结构域，其包含：

共刺激序列，其包含或由是或衍生自CD266的细胞内结构域的氨基酸序列组成，

(FF)GPC3结合结构域，其包含或由是或衍生自结合GPC3的scFV的氨基酸序列组成；

信号传导结构域，其包含：

(GG)GPC3结合结构域，其包含或由是或衍生自结合GPC3的scFV的氨基酸序列组成；

跨膜结构域，其包含或由是或衍生自CD226的跨膜结构域的氨基酸序列组成；

信号传导结构域，其包含：

(HH)EpCAM结合结构域，其包含或由是或衍生自结合EpCAM的scFV的氨基酸序列组成；

跨膜结构域，其包含或由是或衍生自CD226的跨膜结构域的氨基酸序列组成；和

信号传导结构域，其包含：

(II)EpCAM结合结构域，其包含或由是或衍生自结合EpCAM的scFV的氨基酸序列组成；

信号传导结构域，其包含：

(JJ)EpCAM结合结构域，其包含或由是或衍生自结合EpCAM的scFV的氨基酸序列组成；

信号传导结构域，其包含：

(KK)GPC3结合结构域，其包含或由是或衍生自结合GPC3的scFV的氨基酸序列组成；

信号传导结构域，其包含：

共刺激序列，其包含或由是或衍生自4-1BB的细胞内结构域的氨基酸序列组成，

含有ITAM的序列，其包含或由是或衍生自CD3ζ的细胞内结构域的氨基酸序列组成，和

(LL)GPC3结合结构域，其包含或由是或衍生自结合GPC3的scFV的氨基酸序列组成；

信号传导结构域，其包含：

(MM)GPC3结合结构域，其包含或由是或衍生自结合GPC3的scFV的氨基酸序列组成；

跨膜结构域，其包含或由是或衍生自CD226细胞的跨膜结构域的氨基酸序列组成；和

信号传导结构域，其包含：

在一些实施方式中，所述CAR可以包含如BB所述的结构域/序列的组合。在一些实施方式中，所述CAR可以包含如W所述的结构域/序列的组合。在一些实施方式中，所述CAR可以包含如X所述的结构域/序列的组合。

在一些实施方式中，根据V、W、X、Y、Z、AA、BB、CC、DD、EE、FF、GG、HH、II、JJ、KK、LL或MM中任一的CAR还包含如本文所述的抗原结合结构域和跨膜结构域之间的铰链区。在一些实施方式中,所述CAR包含铰链区，所述铰链区包含或由是或衍生自人IgG1铰链区的氨基酸序列组成。

在一些实施方式中，根据V、W、X、Y、Z、AA、BB、CC、DD、EE、FF、GG、HH、II、JJ、KK、LL或MM中任一的CAR还包含如本文所述的信号序列。在一些实施方式中，所述CAR包含信号序列，所述信号序列包含或由是或衍生自人Ig重链信号序列的氨基酸序列组成。

在一些实施方式中，所述CAR可以包含如下(14)至(31)之一所述排列的结构域/序列的组合。任选地，在一些实施例中，CAR可以无信号序列。在一些优选的实施方式中，结构域和序列以所述顺序从N末端到C末端存在于CAR中。

(14)N端-[信号序列]-[GPC3结合结构域]-[铰链区]-[跨膜结构域]-[信号传导结构域]-C端；

其中GPC3结合结构域包括：

其中跨膜结构域包含或由与SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列组成；和

其中，信号传导结构域包括：

共刺激序列，包含或由与SEQ ID NO：59所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列组成。

(15)N端-[信号序列]-[GPC3结合结构域]-[铰链区]-[跨膜结构域]-[信号传导结构域]-C端；

其中GPC3结合结构域包括：

其中，信号传导结构域包括：

共刺激序列，包含或由与SEQ ID NO：58所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列组成；

(16)N端-[信号序列]-[GPC3结合结构域]-[铰链区]-[跨膜结构域]-[信号传导结构域]-C端；

其中GPC3结合结构域包括：

其中，信号传导结构域包括：

共刺激序列，包含或由与SEQ ID NO：59所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列组成；

(17)N端-[信号序列]-[GPC3结合结构域]-[铰链区]-[跨膜结构域]-[信号传导结构域]-C端；

其中GPC3结合结构域包括：

其中，信号传导结构域包括：

共刺激序列，包含或由与SEQ ID NO：58所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列组成；和

(18)N端-[信号序列]-[GPC3结合结构域]-[铰链区]-[跨膜结构域]-[信号传导结构域]-C端；

其中GPC3结合结构域包括：

其中，信号传导结构域包括：

共刺激序列，包含或由与SEQ ID NO：59所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列组成；和

(19)N端-[信号序列]-[GPC3结合结构域]-[铰链区]-[跨膜结构域]-[信号传导结构域]-C端；

其中GPC3结合结构域包括：

其中，信号传导结构域包括：

(20)N端-[信号序列]-[GPC3结合结构域]-[铰链区]-[跨膜结构域]-[信号传导结构域]-C端；

其中GPC3结合结构域包括：

其中，信号传导结构域包括：

(21)N端-[信号序列]-[GPC3结合结构域]-[铰链区]-[跨膜结构域]-[信号传导结构域]-C端；

其中GPC3结合结构域包括：

其中，信号传导结构域包括：

(22)N端-[信号序列]-[GPC3结合结构域]-[铰链区]-[跨膜结构域]-[信号传导结构域]-C端；

其中GPC3结合结构域包括：

其中，信号传导结构域包括：

(23)N端-[信号序列]-[GPC3结合结构域]-[铰链区]-[跨膜结构域]-[信号传导结构域]-C端；

其中GPC3结合结构域包括：

其中，信号传导结构域包括：

(24)N端-[信号序列]-[GPC3结合结构域]-[铰链区]-[跨膜结构域]-[信号传导结构域]-C端；

其中，GPC3结合结构域包括：

其中，信号传导结构域包括：

(25)N端-[信号序列]-[GPC3结合结构域]-[铰链区]-[跨膜结构域]-[信号传导结构域]-C端；

其中GPC3结合结构域包括：

其中铰链区包含或由

与SEQ ID No：19所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列组成；

其中跨膜结构域包含或由与SEQ ID NO：60所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列组成；和

其中，信号传导结构域包括：

(26)N端-[信号序列]-[EpCAM结合结构域]-[铰链区]-[跨膜结构域]-[信号传导结构域]-C端；

其中EpCAM结合结构域包括：

重链可变区序列，其与SEQ ID NO：48所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性，和

轻链可变区序列，其与SEQ ID NO：52所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性；

其中，信号传导结构域包括：

共刺激序列，包含或由与SEQ ID NO：58所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列组成。

(27)N端-[信号序列]-[EpCAM结合结构域]-[铰链区]-[跨膜结构域]-[信号传导结构域]-C端；

其中EpCAM结合结构域包括：

其中，信号传导结构域包括：

(28)N端-[信号序列]-[EpCAM结合结构域]-[铰链区]-[跨膜结构域]-[信号传导结构域]-C端；

其中EpCAM结合结构域包括：

其中，信号传导结构域包括：

(29)N端-[信号序列]-[GPC3结合结构域]-[铰链区]-[跨膜结构域]-[信号传导结构域]-C端；

其中GPC3结合结构域包括：

其中，信号传导结构域包括：

共刺激序列，包含或由与SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列组成；

含有ITAM的氨基酸序列，包含或由与SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列组成；和

(30)N端-[信号序列]-[GPC3结合结构域]-[铰链区]-[跨膜结构域]-[信号传导结构域]-C端；

其中GPC3结合结构域包括：

其中，信号传导结构域包括：

(31)N端-[信号序列]-[GPC3结合结构域]-[铰链区]-[跨膜结构域]-[信号传导结构域]-C端；

其中GPC3结合结构域包括：

其中，信号传导结构域包括：

共刺激序列，其包含或由与SEQ ID NO：58所示的氨基酸序列具有至少80％

序列同一性的氨基酸序列组成。

在一些实施方式中，所述CAR可以包含如上文(15)所述排列的结构域/序列的组合。在一些实施方式中，所述CAR可以包含如上文(20)所述排列的结构域/序列的组合。

在一些实施方式中，本发明所述的嵌合抗原受体包含或由以下氨基酸序列组成：与SEQ ID NO:61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、118、119或120所示的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方式中，本发明所述的嵌合抗原受体包含或由以下氨基酸序列组成：与SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，本发明所述的嵌合抗原受体包含或由以下氨基酸序列组成：与SEQ ID NO:64所示的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方式中，本发明所述的嵌合抗原受体包含或由以下氨基酸序列组成：与SEQ ID NO:80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、121、122或123所示的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方式中，本发明所述的嵌合抗原受体包含或由以下氨基酸序列组成：与SEQ ID NO:89所示的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，本发明所述的嵌合抗原受体包含或由以下氨基酸序列组成：与SEQ ID NO:83所示的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，本发明所述的嵌合抗原受体包含或由以下氨基酸序列组成：与SEQ ID NO:84所示的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性的氨基酸序列。

编码CAR的核酸

本发明提供了一种编码本发明所述的嵌合抗原受体的核酸。在一些实施方式中，核酸被纯化或分离，例如，来自其他核酸或天然存在的生物材料。

本发明还提供了包含编码本发明所述的嵌合抗原受体的核酸的载体。

如本文所用，“载体”是用作将外源核酸转移到细胞中的载体的核酸(DNA或RNA)。载体可以是用于在细胞中表达核酸的表达载体。此类载体可包括可操作地连接于编码待表达序列的核酸的启动子序列。载体还可包括终止密码子和表达增强子。本领域已知的任何合适的载体、启动子、增强子和终止密码子可用于从本发明所述的载体表达本发明所述的CAR。

合适的载体包括质粒、二元载体、DNA载体、mRNA载体、病毒载体(例如γ逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体)、转座子载体和人工染色体(如酵母人工染色体)，例如描述于Maus等，Annu Rev Immunol(2014)32：189-225的，其通过引用整体并入本文。在一些实施方式中，病毒载体可以是慢病毒、逆转录病毒、腺病毒或单纯疱疹病毒载体。在一些实施方式中，慢病毒载体可以是pELNS，或可以衍生自pELNS。在一些实施方式中，载体可以是编码CRISPR/Cas9的载体。

在本说明书中，术语“可操作地连接”可以包括这种情形，其中所选择的核酸序列和调节核酸序列(例如启动子和/或增强子)以这样的方式共价连接以将核苷酸序列的表达置于调控序列的影响或控制下(从而形成表达盒)。因此，如果调控序列能够影响核酸序列的转录，则调控序列可操作地连接到所选择的核苷酸序列。在合适的情况下，所得到的转录物然后可以翻译成所需的多肽。

在一些实施方式中，本发明所述的核酸包含或由以下核酸序列组成：与SEQ IDNO:99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、124、125或126所示的核酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性的核酸序列，或由于密码子简并性，编码与SEQ ID NO:99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、124、125或126之一相同的氨基酸序列的核酸序列。

在一些实施方式中，本发明所述的核酸包含或由以下核酸序列组成：与SEQ IDNO:108所示的核酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性的核酸序列，或由于密码子简并性，编码与SEQ ID NO：108之一相同的氨基酸序列的核酸序列。在一些实施方式中，本发明所述的核酸包含或由以下核酸序列组成：与SEQ ID NO:102所示的核酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性的核酸序列，或由于密码子简并性，编码与SEQ ID NO：102之一相同的氨基酸序列的核酸序列。在一些实施方式中，本发明所述的核酸包含或由以下核酸序列组成：与SEQ ID NO:103所示的核酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性的核酸序列，或由于密码子简并性，编码与SEQ ID NO：103之一相同的氨基酸序列的核酸序列。

表达CAR的细胞

本发明还提供了表达本发明所述CAR的细胞。还提供了包含本发明所述的核酸或载体的细胞。

细胞可以是真核细胞，例如，哺乳动物细胞。哺乳动物可以是人或非人哺乳动物(例如兔子、豚鼠、大鼠、小鼠或其他啮齿动物(包括啮齿目中的任何动物)、猫、狗、猪、绵羊、山羊、牛(包括乳牛，例如奶牛，或牛目的任何动物)、马(包括马目的任何动物)、驴和非人灵长类动物)。

在一些实施方式中，细胞可以来自或获得自人类受试者。

细胞可以是造血来源的细胞，例如，中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞或单核细胞。淋巴细胞可以是例如T细胞、B细胞、NK细胞或前体。细胞可表达例如CD3多肽(例如CD3γCD3εCD3ζ或CD3δ)、TCR多肽(TCRα或TCRβ)、CD27、CD28、CD4或CD8。

在一些实施方式中，细胞是T细胞。在一些实施方式中，T细胞是CD3+T细胞。在一些实施方式中，T细胞是CD3+、CD8+T细胞。在一些实施方式中，T细胞是细胞毒性T细胞(例如细胞毒性T淋巴细胞(CTL))。

在一些实施方式中，细胞是靶蛋白反应性CAR-T细胞。在本文的实施方式中，“靶蛋白反应性”CAR-T细胞是响应于靶蛋白而显示T细胞的某些功能特性的细胞，其中所述靶蛋白对例如表达在细胞表面的CAR的抗原结合结构域具有特异性。在一些实施方式中，所述性质是与效应T细胞相关的功能特性，例如，细胞毒性T细胞。

在一些实施方式中，靶蛋白反应性CAR-T细胞可显示一种或多种以下性质：对包含或表达靶蛋白的细胞的细胞毒性；增殖、增加IFNγ表达、增加CD107a表达、增加IL-2表达、增加TNFα表达、增加穿孔素表达、增加颗粒酶表达、增加颗粒溶素表达、和/或增加FAS配体(FASL)表达以响应靶蛋白或包含或表达靶蛋白的细胞。

本文中，IFNγ、CD107a、IL-2、TNFα、穿孔素、颗粒酶和/或FASL的“表达”可以指基因表达或蛋白表达。基因表达可以通过本领域技术人员已知的各种方法测量，例如通过定量实时PCR(qRT-PCR)或基于报道分子的方法测量mRNA的水平。类似地，蛋白表达可以通过本领域熟知的各种方法测量，例如，通过基于抗体的方法，例如通过蛋白印迹、免疫组织化学、免疫细胞化学、流式细胞术、ELISA、ELISPOT或基于报道分子的方法。“增加的表达”是指表达水平高于未与靶蛋白或包含或表达靶蛋白的细胞接触的T细胞的基因/蛋白表达水平，或响应不包含或表达靶蛋白的细胞的T细胞的表达水平。

本发明还提供了用于产生包含本发明的核酸或载体的细胞的方法，包括将本发明的核酸或载体导入细胞中。本发明还提供了用于产生表达本发明CAR的细胞的方法，包括将本发明的核酸或载体导入细胞中。在一些实施方式中，所述方法还包括在适于细胞表达核酸或载体的条件下培养细胞。在一些实施方式中，所述方法在体外进行。

在一些实施方式中，将本发明的分离的核酸或载体引入细胞包括转导，例如，逆转录病毒转导。因此，在一些实施方式中，分离的核酸或载体包含在病毒载体中，或载体是病毒载体。在一些实施方式中，该方法包括通过电穿孔引入根据本发明的核酸或载体，例如，如Koh等人，Molecular Therapy-Nucleic Acids(2013)2，e114中所述，其通过引用整体并入本文。

本发明还提供了通过本发明的细胞的制备方法获得或可获得的细胞。

组合物

本发明还提供了包含本发明的嵌合抗原受体、核酸、载体或细胞的组合物。

本发明的CAR、核酸、载体和细胞可以配制成用于临床应用的药物组合物，并且可以包含药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或佐剂。

根据本发明，还提供了生产药学上有用的组合物的方法，这种生产方法可包括选自以下的一个或多个步骤：分离如本文所述的CAR、细胞、核酸或载体；和/或将本文所述的CAR、细胞、核酸或载体与药学上可接受的载体、佐剂、赋形剂或稀释剂混合。

例如，本发明的另一方面涉及配制或生产用于治疗癌症的药物或药物组合物的方法，所述方法包括通过将本文所述的CAR、细胞、核酸或载体与药学上可接受的载体、佐剂、赋形剂或稀释剂混合配制药物组合物或药物。

CAR/表达CAR的细胞的性质

本发明的CAR也可以通过参考CAR的性质来定义。表达CAR的细胞也可以通过表达CAR的细胞的参考性质来定义。

与其他CAR(例如不含是或衍生自CD226的细胞内结构域的共刺激序列的CAR)在表面表达的水平相比，本发明的CAR在细胞中表达时可以显示表面表达水平增加。本发明CAR在细胞表面的表达水平增加与本发明的CAR的一个或多个结构域或结构域的特定组合相关。

对细胞中表达的CAR的细胞表面表达的分析，可以通过本领域技术人员熟知的方法，包括例如流式细胞术或免疫荧光分析，例如使用抗原结合结构域的标记配体。

与不含二聚化结构域的可比较CAR的细胞表面的表达水平相比，包含二聚化结构域的本发明CAR可以在表达CAR的细胞的细胞表面显示表达增加。在一些实施方式中，细胞可以在用药剂处理后在细胞表面表现出表达增加。例如，在其中二聚化结构域是诱导型二聚化结构域的实施方式中，与不含二聚化结构域的可比较CAR相比，用适当的试剂处理以诱导CAR的二聚化、寡聚化或多聚化后，细胞显示表面表达增加。

与表达其他CAR(例如不含是或衍生自CD226的细胞内结构域的共刺激序列的CAR)的细胞的活性水平相比，表达本发明CAR的细胞可以具有某种特性，或者可以显示某种活性水平增加。

例如，与表达其他CAR(例如不含是或衍生自CD226的细胞内结构域的共刺激序列的CAR)的细胞相比，表达本发明CAR的细胞可以显示以下一种或多种性质：

(a)增殖率增加

(b)一种或多种生长因子(例如IL-2)的表达增加

(c)存活率提高

(d)一种或多种细胞毒性/效应因子(例如IFNγ、颗粒酶、穿孔素、颗粒溶素、CD107a、TNFα、FASL)的表达增加

(e)细胞毒性增加(例如对抗表达靶蛋白的细胞)

(f)对一种或多种免疫抑制因子的敏感性降低，例如肿瘤来源的免疫抑制因子(如IL-10、TGF-β、IDO、VEGF、IL-6)

(g)存续性(从而提供更持久/持续的T细胞反应)和耐久性(承受压力的能力)增加

(h)肿瘤渗透增加

(i)对转移信息的敏感性增加(例如对细胞因子/趋化因子梯度/环境的敏感性增加)

(j)响应于靶蛋白表达细胞的一种或多种促炎和/或效应因子的产生水平降低

(k)对靶蛋白表达细胞的细胞毒性增加，并且响应于靶蛋白表达的细胞的一种或多种促炎和/或效应因子的产生水平降低

(l)响应于靶蛋白表达细胞的增殖增加

(m)在不存在靶蛋白表达细胞的情况下增殖减少

(n)在不存在靶蛋白表达细胞的情况下增殖增加

可以通过技术人员熟知的方法分析这些性质。增殖率的测定可以通过例如，测量不同时间点的细胞数，或通过分析³H-胸苷的引入或CFSE稀释实验，例如，如Fulcher和Wong，Immunol Cell Biol(1999)77(6)：559-564中所述。生长因子和细胞毒性/效应因子的基因或蛋白表达的测定可以通过例如，qPCR分析mRNA水平，和/或通过基于免疫测定的方法检测相关蛋白，例如ELISA、流式细胞术、免疫印迹等。细胞的存活可以通过标记细胞并随时间监测细胞数来确定。例如，可以使用Zaritskaya等人，Expert RevVaccines(2011)，9(6)：601-616中综述的任何方法研究细胞毒性，例如，通过⁵¹Cr释放试验该文献通过引用整体并入本文。可以通过分析在免疫抑制因子存在下表达CAR的细胞的增殖率/生长因子的表达/存活/细胞毒性或效应因子的表达/细胞毒性来确定对免疫抑制因子的敏感性。

可以通过分析一段时间内细胞分裂来确定细胞增殖。可以分析给定细胞或细胞群的细胞分裂，例如，通过体外分析³H-胸苷的引入或通过CFSE稀释实验，例如Fulcher和Wong，Immunol Cell Biol(1999)77(6)：559-564中所述，该文献通过引用整体并入本文。增殖细胞也可以通过适当的测定分析5-乙炔基-2’-脱氧尿苷(EdU)的引入来鉴定，如Buck等人，Biotechniques.2008Jun；44(7)：927-9，Sali和Mitchison，PNAS USA 2008Feb 19；105(7):2415-2420，两者均通过引用整体并入本文。

在一些实施方式中，细胞可以在CAR活化后表现出(a)-(n)的一种或多种性质。在一些实施方式中，细胞可以在暴露于靶分子后表现出(a)-(n)的一种或多种性质，其中所述靶分子对CAR的抗原结合结构域是特异性的，例如以表达/过表达靶蛋白的细胞的形式。

在可比较的测定中，表达本发明CAR的细胞的基因或蛋白表达、存活、细胞毒性或增殖的增加可以是表达其他CAR(例如不含是或衍生自CD226的细胞内结构域的共刺激序列的CAR)的细胞显示的表达、存活、细胞毒性或增殖水平的1倍以上、1.1倍以上、1.2倍以上、1.3倍以上、1.4倍以上、1.5倍以上、1.6倍以上、1.7倍以上、1.8倍以上、1.9倍以上、2倍以上、2.1倍以上、2.2倍以上、2.3倍以上、2.4倍以上、2.5倍以上、2.6倍以上、2.7倍以上、2.8倍以上、2.9倍以上、3倍以上、3.1倍以上、3.2倍以上、3.3倍以上、3.4倍以上、3.5倍以上、3.6倍以上、3.7倍以上、3.8倍以上、3.9倍以上、4倍以上、4.1倍以上、4.2倍以上、4.3倍以上、4.4倍以上、4.5倍以上、4.6倍以上、4.7倍以上、4.8倍以上、4.9倍以上、或5倍以上之一。

在可比较的测定中，表达本发明CAR的细胞的增殖减少可以是表达其他CAR(例如不含是或衍生自CD226的细胞内结构域的共刺激序列的CAR)的细胞增殖水平的小于1倍、小于0.95倍、小于0.9倍、小于0.85倍、小于0.8倍、小于0.75倍、小于0.7倍、小于0.65倍、小于0.6倍、小于0.55倍、小于0.5倍、小于0.45倍、小于0.4倍、小于0.35倍、小于0.3倍、小于0.25倍、小于0.2倍、小于0.15倍、或小于0.1倍之一。

表达本发明CAR的细胞对一种或多种免疫抑制因子的敏感性降低，可以通过观察响应于免疫抑制因子的增殖/生长因子的表达/细胞毒性或效应因子的表达/细胞毒性的抑制水平,在可比较的测定中小于表达其他CAR(例如表1的CAR)的细胞观察到的相关性质的抑制水平来确定。在一些实施方式中，在可比较的测定中，所述抑制水平是表达其他CAR(例如不含是或衍生自CD226的细胞内结构域的共刺激序列的CAR)的细胞观察到的相关性质的抑制水平的小于1倍、小于0.95倍、小于0.9倍、小于0.85倍、小于0.8倍、小于0.75倍、小于0.7倍、小于0.65倍、小于0.6倍、小于0.55倍、小于0.5倍、小于0.45倍、小于0.4倍、小于0.35倍、小于0.3倍、小于0.25倍、小于0.2倍、小于0.15倍。或小于0.1倍之一。

在一些实施方式中，在可比较的测定中，与表达其他CAR(例如不含是或衍生自CD226的细胞内结构域的共刺激序列的CAR(例如根据表1的CAR))的细胞相比，表达本发明CAR的细胞可显示出对TGFβ的敏感性降低。在实施例16中描述了用于分析T细胞对TGFβ介导的效应因子功能抑制的敏感性的合适实验的实例。

与表达其他CAR(例如不含是或衍生自CD226的细胞内结构域的共刺激序列的CAR(例如根据表1的CAR))的细胞和表达靶蛋白的细胞共培养后检测到的因子水平相比，通过检测例如表达本发明CAR的细胞与表达靶蛋白的细胞共培养后的细胞培养上清液的因子水平降低，可以确定由表达本发明CAR的细胞产生的促炎/效应因子水平降低。在一些实施方式中，在可比较的测定中，产生水平降低是在用表达靶蛋白的细胞与表达其他CAR(例如不含是或衍生自CD226的细胞内结构域的共刺激序列的CAR(例如根据表1的CAR))的细胞共培养后检测到的因子的产生水平的小于1倍、小于0.99倍、小于0.98倍、小于0.97倍、小于0.96倍、小于0.95倍、小于0.9倍、小于0.85倍、小于0.8倍、小于0.75倍、小于0.7倍、小于0.65倍、小于0.6倍、小于0.55倍、小于0.5倍、小于0.45倍、小于0.4倍、小于0.35倍、小于0.3倍、小于0.25倍、小于0.2倍、小于0.15倍、或小于0.1倍之一。

表达本发明CAR的细胞的特定活性或功能特性可以与本发明的CAR的一个或多个结构域或结构域的特定组合相关。

例如，与不含是或衍生自CD226的细胞内结构域的共刺激序列的CAR相比，表达包含信号传导结构域的CAR的细胞，其中所述信号传导结构域包含是或衍生自CD226的细胞内结构域的共刺激序列，可以表现出一种或多种细胞毒性因子的表达增加、细胞毒性因子增加和/或对免疫抑制因子的敏感性降低。在一些实施方式中，表达包含信号传导结构域的CAR的细胞，其中所述信号结构域包含是或衍生自CD226的细胞内结构域的共刺激序列，可以表现出一种或多种促炎因子或效应因子的表达降低。在一些实施方式中，促炎因子或效应因子可选自以下一种或多种：IL-2、IFNγ、TNFα、GM-CSF、MIP-1α、MIP-1β、RANTES和TNFβ。

与表达不含二聚化结构域的CAR的细胞相比，表达包含二聚化结构域的CAR的细胞可表现出增殖速率增加、一种或多种生长因子的表达增加和/或存活增加。在一些实施方式中，细胞可以在用药剂处理后表现出一种或多种这些性质。例如，在其中二聚化结构域是诱导型二聚化结构域的实施方式中，细胞可以在用适当的试剂处理以诱导CAR的二聚化、寡聚化或多聚化后表现出一种或多种这些性质。

与不含二聚化结构域的CAR相比，包含二聚化结构域的CAR可以更容易地形成二聚体，或者可以形成更稳定的二聚体。

二聚体形成可以促进CAR介导的信号传导，因此与不含二聚化结构域的CAR相比，包含本发明二聚化结构域的CAR可以表现出CAR介导的信号传导水平增加。类似地，与表达不含二聚化结构域的可比较的CAR的细胞相比，表达包含二聚化结构域的CAR的细胞可以表现出与CAR介导的信号传导水平增加相关的表型。

CAR、核酸、细胞和组合物的用途和使用方法

本发明的CAR、核酸、载体、细胞和药物组合物可用于治疗和预防的方法。

本发明提供了本发明的嵌合抗原受体、核酸、载体、细胞或药物组合物用于医学治疗或预防的方法。

本发明还提供了本发明所述的嵌合抗原受体、核酸、载体、细胞或药物组合物在制备用于治疗或预防疾病或病症的药物中的用途。

本发明还提供了一种治疗或预防疾病或病症的方法，包括向受试者施用治疗或预防有效量的本发明所述的嵌合抗原受体、核酸、载体、细胞或药物组合物。

特别地，本发明的CAR、核酸、载体、细胞或药物组合物可用于预防或治疗与靶蛋白的表达/上调表达相关的疾病或病症。

施用

本发明的CAR、核酸、载体、细胞或组合物的施用优选为“治疗有效”或“预防有效”量，这足以显示对受试者的益处。实际施用的量、施用的速率和时间过程将取决于疾病或病症的性质和严重性。治疗的处方，例如关于剂量等的决定在全科医生和其他医生的责任范围内，并且通常考虑待治疗的疾病/病症、个体受试者的状况、递送的位置、施用方法以及医师已知的其他因素。上述技术和方案的实例可以参见雷明顿药物科学(Remington’sPharmaceutical Sciences),第20版,2000,Lippincott,Williams&Wilkins出版。

本发明各方面所述的CAR、核酸、载体、细胞、组合物和其他治疗剂、药物和药物组合物可以配制用于通过多种途径施用，包括但不限于肠胃外、静脉内、动脉内、肌肉内、皮下、皮内、瘤内和口服。所述CAR、核酸、载体、细胞、组合物和其他治疗剂和治疗剂可以配制成流体或固体形式。可以将流体制剂配制成注射剂，以通过注射给人或动物体的选定区域，或通过输液至血液来施用。施用可以通过注射或输液至血液，例如静脉内或动脉内施用。

根据待治疗的病症，施用可以单独施用或与其它治疗组合施用，或者同时或依次施用。本发明的CAR、核酸、载体、细胞或组合物和治疗剂可以同时或依次施用。

在一些实施方式中，用本发明的CAR、核酸、载体、细胞或组合物进行治疗可以伴随其他治疗性或预防性干预，例如化学疗法、免疫疗法、放射疗法、手术、疫苗接种和/或激素疗法。

同时施用是指将CAR、核酸、载体、细胞或组合物和治疗剂一起施用，例如作为含有两种药剂的药物组合物(组合制剂)，或者彼此紧密衔接，并且任选地经由相同的施用途径，例如施用到同一动脉、静脉或其他血管。依次施用是指施用CAR、核酸、载体、细胞或组合物或治疗剂之一随后在给定的时间间隔之后，分开施用其它药剂。不要求两个试剂通过相同的途径施用，尽管在一些实施方案中是这种情况。时间间隔可以是任何时间间隔。

化学疗法和放射疗法分别指用药物或用电离辐射治疗癌症(例如使用X射线或γ射线的放射疗法)。

所述药物可以是化学实体，例如，小分子药物、抗生素、DNA嵌入剂、蛋白质抑制剂(例如激酶抑制剂)或生物制剂，例如抗体、抗体片段、核酸或肽适体、核酸(例如DNA、RNA)、肽、多肽或蛋白质。所述药物可以配制成药物组合物或药物。制剂可以包含一种或多种药物(例如一种或多种活性剂)以及一种或多种药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体。

治疗可涉及一种以上药物的施用。根据待治疗的病症，所述药物可以单独施用或与其他治疗组合施用，或者同时或依次施用。例如，化学疗法可以是涉及施用两种药物的联合治疗，其中一种或多种可以用于治疗癌症。

化学疗法可以通过一种或多种给药途径施用，例如肠胃外、静脉内注射、口服、皮下、皮内或肿瘤内。

化学疗法可以根据治疗方案执行。治疗方案可以是可由内科医师或医师准备的预定时间表、计划、方案或化疗方案，并且可以被定制以适合需要治疗的患者。

治疗方案可以指示以下的一种或多种：施用于患者的化学疗法的类型；每种药物或辐射的剂量；施用之间的时间间隔；每次治疗的时间长度；任何治疗间歇(如果有的话)的数量和性质等。对于联合治疗，可以提供单一治疗方案，其指示每种药物如何施用。

化学治疗药物和生物制剂可选自：烷化剂，如顺铂、卡铂、氮芥、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺；嘌呤或嘧啶抗代谢物，如硫唑嘌呤或巯嘌呤；生物碱和萜类化合物，例如长春花生物碱(例如长春新碱、长春花碱、长春瑞滨、长春地辛)、鬼臼毒素、依托泊苷、替尼泊苷、紫杉烷类如紫杉醇(Taxol^TM)、多西他赛；拓扑异构酶抑制剂如I型拓扑异构酶抑制剂喜树碱伊立替康和拓扑替康，或II型拓扑异构酶抑制剂安吖啶、依托泊苷、磷酸依托泊苷、替尼泊苷；抗肿瘤抗生素(例如蒽环类抗生素)，例如放线菌素、多柔比星(Adriamycin^TM)、表柔比星、博来霉素、雷帕霉素；基于抗体的药物，如抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗TIM-3抗体、抗CTLA-4、抗-4-1BB、抗GITR、抗CD27、抗BLTA、抗-OX43、抗VEGF、抗TNFα、抗IL-2、抗GpIIb/IIIa、抗CD-52、抗CD20、抗RSV、抗HER2/neu(erbB2)、抗TNF受体、抗EGFR抗体，单克隆抗体或抗体片段，实例包括：西妥昔单抗、帕尼单抗、英夫利昔单抗、巴利昔单抗、贝伐单抗()、阿昔单抗、达利珠单抗、吉妥珠单抗、阿仑单抗、利妥昔单抗()、帕利珠单抗、曲妥珠单抗、依那西普、阿达木单抗、尼妥珠单抗；EGFR抑制剂如厄洛替尼、西妥昔单抗和吉非替尼；抗血管生成剂如贝伐单抗()；癌症疫苗，如西普鲁塞-T(Sipuleucel-T)()。

其他化学治疗药物可选自：13-顺式维甲酸、2氯脱氧腺苷、5-氮杂胞苷5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、白蛋白结合型紫杉醇(Abraxane)、放线菌素阿地白介素、阿仑单抗、爱宁达(ALIMTA)、阿利维A酸、全反式视黄酸、α干扰素、六甲蜜胺(Altretamine)、氨甲蝶呤、氨磷汀、氨鲁米特，阿那格雷、阿那曲唑、阿拉伯糖基胞嘧啶、三氧化二砷、天冬酰胺酶、ATRA阿扎胞苷、BCG、BCNU、苯达莫司汀、贝伐单抗、蓓萨罗丁、比卡鲁胺、BiCNU、博来霉素、硼替佐米、白消安、甲酰四氢叶酸钙、喜树碱-11、卡培他滨、Carac^TM、卡铂、卡莫司汀、CC-5013、CCI-779、CCNU、CDDP、CeeNU、西妥昔单抗，、苯丁酸氮芥、顺铂、柠胶因子(Citrovorum Factor)、克拉屈滨、可的松、CPT-11、环磷酰胺、Cytarabine达克金(Dacogen)、放线菌素D、达依泊汀α、达沙替尼、道诺霉素、柔红霉素、盐酸柔红霉素、柔红霉素脂质体、地卡特隆、地西他滨、地尼白介素(Denileukin)、Diftitox、DepoCyt^TM、地塞米松(Dexamethasone)、醋酸地塞米松、地塞米松磷酸钠、地塞米松(Dexasone)、右丙亚胺、DHAD、DIC、地塞米松(Diodex)、多西他赛、阿霉素、阿霉素脂质体、Droxia^TM、DTIC、Eligard^TM、Ellence^TM、Eloxatin^TM、表柔比星、阿法依伯汀、爱必妥、厄洛替尼、欧文氏菌L-天冬酰胺酶、雌莫司汀、Ethyol依托泊苷、依托泊苷磷酸盐、依维莫司、依西美坦、非格司亭、氟尿苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、氟甲睾酮、氟他胺、亚叶酸、氟维司群、吉非替尼、吉西他滨、吉妥珠单抗奥唑米星(Gemtuzumabozogamicin)、Gleevec^TM、Wafer、戈舍瑞林、粒细胞集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、地塞米松(Hexadrol)、六甲基三聚氰胺、HMM、Hydrocort氢化可的松、氢化可的松磷酸钠、氢化可的松琥珀酸钠、磷酸氢化可的松、羟基脲、替伊莫单抗(Ibritumomab)、替坦异贝莫单抗(Ibritumomab Tiuxetan)、伊达比星、IFN-α、异环磷酰胺、IL-11、IL-2、甲磺酸伊马替尼、咪唑甲酰胺、干扰素α、干扰素α-2b(PEG缀合物)、白介素-2、白介素-11、(干扰素α-2b)、伊立替康、异维A酸、伊沙匹隆、Ixempra^TM、天门冬酰胺酶(Kidrolase)、拉帕替尼、L-天冬酰胺酶、LCR、来那度胺、来曲唑、甲酰四氢叶酸、瘤可宁、Leukine^TM、亮丙瑞林、长春新碱、Leustatin^TM、脂质体Ara-C、Liquid洛莫司汀、L-PAM、L-溶肉瘤素(L-Sarcolysin)、Lupron地塞米松(Maxidex)、二氯甲基二乙胺、氮芥盐酸盐、甲地孕酮、醋酸甲地孕酮、美法仑、巯基嘌呤、美司那、Mesnex^TM、甲氨蝶呤、甲氨蝶呤钠、甲基强的松龙、丝裂霉素、丝裂霉素C、米托蒽醌、MTC、MTX、氮芥(Mustine)、Mylocel^TM、奈拉滨、Neulasta^TM、尼鲁米特、氮芥(Nitrogen Mustard)、奥曲肽、醋酸奥曲肽、Onxal^TM、奥普瑞白介素(oprevelkin)、奥沙利铂、紫杉醇、紫杉醇蛋白结合、帕米磷酸二钠、帕尼单抗、 PEG干扰素、培门冬酶、培非格司亭、PEGINTRON^TM、PEG-L-天冬酰胺酶、培美曲塞、喷司他丁、苯丙氨酸氮芥(Phenylalanine Mustard)、泼尼松龙、泼尼松、甲基苄肼、具有卡莫司汀植入物的Prolifeprospan 20(Prolifeprospan 20with Carmustine Implant)雷洛昔芬、利妥昔单抗、(干扰素Alfa-2a)、红比霉素盐酸盐、Sandostatin沙格司亭、索拉非尼、SPRYCEL^TM、STI-571、链脲霉素、SU11248、舒尼替尼、他莫昔芬、替莫唑胺、替西罗莫司(Temsirolimus)、替尼泊苷、TESPA、沙利度胺、硫鸟嘌呤、硫鸟嘌呤硫代磷酰胺(Thiophosphoamide)、噻替哌、拓扑替康、托瑞米芬、托西莫单抗、曲妥珠单抗、维甲酸、Trexall^TM、TSPA、VCR、Vectibix^TM、 Viadur^TM、长春花碱、长春花碱硫酸盐、Vincasar长春新碱、长春瑞滨、长春瑞滨酒石酸盐、VLB、VM-26、伏立诺他(Vorinostat)、VP-16、Zevalin^TM、唑来膦酸、伏立诺他(Zolinza)、

可以提供CAR、核酸、载体、细胞或组合物的多个剂量。剂量中的一种或多种或每种可伴随着同时或依次施用另一种治疗剂。

多个剂量可以分开预定的时间间隔，其可以选择为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、或31天、或1、2、3、4、5或6个月中之一。例如，可以每7、14、21或28天(加或减3、2或1天)给予剂量一次。

癌症

在一些实施方式中，根据本发明待治疗或预防的疾病或病症是癌症。在各种癌症中GPC3表达上调。因此，待治疗或预防的疾病或病症可以是其中GPC3表达上调的癌症。

在各种癌症中EpCAM表达上调。因此，待治疗或预防的疾病或病症可以是其中EpCAM表达上调的癌症。

癌症可以是任何不想要的细胞增殖(或任何通过不想要的细胞增殖表现的疾病)、赘生物或肿瘤，或增加的不想要的细胞增殖、赘生物或肿瘤的风险或倾向。癌症可能是良性或恶性的，可能是原发性或继发性的(转移性)。赘生物或肿瘤可以是细胞的任何异常生长或增殖，并且可以位于任何组织中。组织实例包括肾上腺、肾上腺髓质、肛门、阑尾、膀胱、血液、骨骼、骨髓、脑、乳腺、盲肠、中枢神经系统(包括或不包括脑)小脑、子宫颈、结肠、十二指肠、子宫内膜、上皮细胞(例如肾上皮细胞)、胆囊、食道、胶质细胞、心脏、回肠、空肠、肾、泪腺、喉、肝、肺、淋巴、淋巴结、淋巴母细胞、上颌、纵隔、肠系膜、子宫肌层、鼻咽、网膜、口腔、卵巢、胰腺、腮腺、周围神经系统、腹膜、胸膜、胸膜、前列腺、唾液腺、乙状结肠、皮肤、小肠、软组织、脾脏、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、舌头、扁桃体、气管、子宫、外阴、白细胞。

待治疗的肿瘤可以是神经系统或非神经系统肿瘤。神经系统肿瘤可能起源于中枢或周围神经系统，例如神经胶质瘤、成神经管细胞瘤、脑膜瘤、神经纤维瘤、室管膜瘤、神经鞘瘤、神经纤维肉瘤、星形细胞瘤和少突神经胶质瘤。非神经系统癌症/肿瘤可能起源于任何其他非神经组织，例如黑素瘤、间皮瘤，淋巴瘤、骨髓瘤、白血病、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、霍奇金淋巴瘤、慢性骨髓性白血病(CML)、急性骨髓性白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(MDS)、皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、肝癌、表皮样癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌、胰腺癌、胸腺癌、NSCLC、血液癌和肉瘤。

在一些实施方式中，根据本发明待治疗/预防的癌症可以是肝癌(hepaticcancer)/肝癌(liver cancer)(例如肝细胞癌、肝母细胞瘤)。肝癌可能表达或过表达GPC3。肝癌可能表达或过表达EpCAM。

在一些实施方式中，根据本发明待治疗/预防的癌症可以是肺癌(例如非小细胞肺癌(NSCLC))。肺癌可能表达或过表达GPC3。肺癌可能表达或过表达EpCAM。

在一些实施方式中，癌症是表达所述CAR的抗原结合结构域特异性针对的靶蛋白的癌症(例如表达GPC3的癌症)。可以通过本领域技术人员熟知的任何合适的方法确定癌症表达靶蛋白。可以通过检测靶蛋白的表达来鉴定表达靶蛋白的癌症。在一些实施方式中，癌症过表达靶蛋白。靶蛋白的过表达可以通过检测靶蛋白的表达水平大于等同的非癌细胞/非肿瘤组织的靶蛋白的表达水平来确定。

表达可以是基因表达或蛋白表达。例如可以通过检测编码相关靶蛋白的mRNA(例如通过定量实时PCR(qRT-PCR))来确定基因表达。例如可以通过检测靶蛋白，例如通过基于抗体的方法，例如通过蛋白质印迹、免疫组织化学、免疫细胞化学、流式细胞术或ELISA，来确定蛋白表达。

在一些实施方式中，可以基于检测表达靶蛋白或过表达靶蛋白的癌症(例如从受试者获得的样品中)选择患者根据本发明进行治疗。

在一些实施方式中，靶蛋白是GPC3，并且癌症可以表达或过表达GPC3。可能表达GPC3的癌症包括黑素瘤、卵巢透明细胞癌、卵黄囊肿瘤、神经母细胞瘤、肝母细胞瘤和肾母细胞瘤(Ho等人，2011Eur J Cancer 47(3)：333-338)。

在一些实施方式中，靶蛋白是EpCAM并且癌症可以表达或过表达EpCAM。可能表达EpCAM的癌症包括上皮细胞癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、尿路上皮癌、胃癌、食道癌、结肠直肠癌、肝细胞癌和胆囊癌。

过继转移

在本发明的实施方式中，治疗或预防的方法可包括免疫细胞(如T细胞)的过继转移。过继性T细胞转移通常是指通过从受试者获得T细胞的过程，通常是通过抽出血液样品从中分离T细胞。然后通常以某种方式处理或改变T细胞，任选地扩增，然后将其施用于相同的受试者或不同的受试者。该治疗通常旨在为受试者提供具有某些所需特征的T细胞群，或增加该受试者中具有这种特征的T细胞的频率。CAR-T细胞的过继转移描述于例如Kalos和June 2013，Immunity 39(1)：49-60中，其全部内容通过引用并入本文。

在本发明中，进行过继转移的目的是在受试者中引入或增加靶蛋白反应性T细胞的频率，特别是靶蛋白反应性CD8⁺T细胞和/或CD4⁺T细胞。

因此，本发明提供治疗或预防受试者的疾病或病症的方法，包括：

(a)从受试者中分离至少一个T细胞；

(b)修饰所述至少一个T细胞以表达或包含本发明的嵌合抗原受体或核酸，

(c)任选地扩增所述修饰的至少一个T细胞，和；

(d)向受试者施用所述修饰的至少一个T细胞。

在一些实施方式中，T细胞分离来源的受试者是施用经修饰的T细胞的受试者(即，过继转移是自体T细胞)。在一些实施方式中，T细胞分离来源的受试者是与施用经修饰的T细胞的受试者不同的受试者(即，过继转移是同种异体T细胞)。

本发明修饰的至少一个T细胞可以根据技术人员熟知的方法进行修饰。修饰可以包括核酸转移，用于永久或瞬时表达转移的核酸。

可以使用任何合适的基因工程平台来修饰本发明的T细胞。用于修饰T细胞的合适方法包括使用基因工程平台，例如γ逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、DNA转染、基于转座子的基因传递和RNA转染，例如，如Maus等，Annu Rev Immunol(2014)32：189-225中所述，其通过引用并入本文。

在一些实施方式中，所述方法可包括以下步骤中的一个或多个：从受试者中取血液样品；从血液样品中分离和/或扩增至少一个T细胞；在体外或离体细胞培养中培养至少一个T细胞；向所述至少一个T细胞中引入本发明的CAR、核酸或载体，从而修饰所述至少一个T细胞；扩增所述至少一种修饰的T细胞，收集所述至少一种修饰的T细胞；将修饰的T细胞与佐剂、稀释剂或载体混合；将修饰的T细胞施用于受试者。

在一些实施方式中，例如其中CAR包含化学诱导的二聚化结构域，该方法可还包括用合适的二聚化诱导剂处理修饰的T细胞。在一些实施方式中，通过将药剂施用于培养中的经修饰的T细胞，可以体外或离体进行治疗。在一些实施方式中，通过将药剂施用于已经施用本发明的经修饰的T细胞的受试者，可以在体内进行治疗。以这种方式，可以刺激包含本发明CAR的经修饰的T细胞增殖，从而体外/离体和/或体内扩增。

技术人员能够确定用于本发明的过继转移靶蛋白反应性CAR-T细胞的合适试剂和程序，例如，参考Dai等，2016J Nat Cancer Inst 108(7)：djv439，其通过引用整体并入本文。

在相关方面，本发明提供了制备修饰的T细胞的方法，该方法包括将本发明的CAR、核酸或载体导入T细胞，从而修饰至少一个T细胞。该方法优选在体外或离体进行。

在一个方面，本发明提供治疗或预防受试者的疾病或病症的方法，包括：

(a)从受试者中分离至少一个T细胞；

(b)将本发明分离的核酸或载体导入所述至少一个T细胞，从而修饰所述至少一个T细胞；和

(c)向受试者施用所述修饰的至少一个T细胞。

在本发明的实施方式中，受试者优选是人受试者。在一些实施方式中，根据本发明的治疗或预防方法待治疗的受试者是患有或有风险发展以靶蛋白的表达或上调表达为特征的疾病或病症的受试者。在一些实施方式中，待治疗的受试者是患有癌症或有发展为癌症风险的受试者，例如，表达靶蛋白的癌症，或靶蛋白表达上调的癌症。

在本发明的实施方式中，可以基于对这种疾病/病症的某些标志物的表征，例如靶蛋白表达，选择受试者根据本发明方法进行治疗。受试者可能已被诊断患有需要治疗的疾病或病症，或疑似患有此类疾病或病症。

在一些实施方式中，该方法还包括治疗性或预防性干预，用于治疗或预防疾病或病症，例如化学疗法、免疫疗法、放射疗法、手术、疫苗接种和/或激素疗法。在一些实施方式中，该方法还包括治疗性或预防性干预，用于治疗或预防癌症，例如肝癌，如肝细胞癌。

受试者

本发明待治疗的受试者可以是任何动物或人。受试者优选为哺乳动物，更优选为人。受试者可以是非人哺乳动物，但更优选是人。受试者可以是男性或女性。受试者可以是患者。受试者可能已经被诊断患有需要治疗的疾病或病症，可能疑似患有这种疾病或病症，或者可能有发展这种疾病或病症的风险。

编号的发明陈述

以下编号的段落(段)描述了本发明的特定方面和实施例：

1.一种能够与GPC3结合的嵌合抗原受体(CAR)，包括：GPC3结合结构域、铰链区、跨膜结构域和信号传导结构域；其中所述铰链区包含或由以下氨基酸序列组成：是或衍生自人IgG1铰链区的氨基酸序列，和；其中所述跨膜结构域包含或由以下序列组成：是或衍生自CD8α的跨膜结构域的氨基酸序列。

2.如第1段所述的CAR，其中，所述铰链区包含或由以下氨基酸序列组成：与SEQIDNO：19所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；并且所述跨膜结构域包含或由以下氨基酸序列组成：与SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。

3.一种能够结合GPC3的嵌合抗原受体(CAR)，包含：GPC3结合结构域、跨膜结构域、信号传导结构域和诱导型二聚化结构域。

4.如第3段所述的CAR，其中，所述二聚化结构域包含或由以下氨基酸序列组成：是或衍生自F36V-FKBP的氨基酸序列。

5.如第1至4段中任一所述的CAR，其中，所述CAR包含二聚化结构域，所述二聚化结构域包含或由以下氨基酸序列组成：与SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。

6.一种能够与GPC3结合的嵌合抗原受体(CAR)，包括：GPC3结合结构域、跨膜结构域和信号传导结构域；其中所述信号传导结构域包含共刺激序列，所述共刺激序列包含或由以下氨基酸序列组成：是或衍生自CD226的细胞内结构域的氨基酸序列。

7.如第1至6段中任一所述的CAR，其中，所述信号传导结构域包含共刺激序列，所述共刺激序列包含或由以下氨基酸序列组成：与SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。

8.如第1至7段中任一所述的CAR，其中，所述信号传导结构域包含一个共刺激序列，所述共刺激序列包含或由以下氨基酸序列组成：是或衍生自CD28的细胞内结构域的氨基酸序列。

9.如第1至8段中任一所述的CAR，其中，所述信号传导结构域包含共刺激序列，所述共刺激序列包含或由以下氨基酸序列组成：是或衍生自4-1BB的细胞内结构域的氨基酸序列。

10.如第1至9段中任一所述的CAR，其中，所述信号传导结构域包含共刺激序列，所述共刺激序列包含或由以下氨基酸序列组成：与SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。

11.如第1至10段中任一所述的CAR，其中，所述信号传导结构域包含共刺激序列，所述共刺激序列包含或由以下氨基酸序列组成：与SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。

12.一种能够结合GPC3的嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体如表1所示的A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L或M中任一所述。

13.一种能够结合GPC3的嵌合抗原受体(CAR),所述嵌合抗原受体包含或由以下氨基酸序列组成：与SEQ ID NO：38、39、40、22、23、41、42、24、25、26、27、28或29所示的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的氨基酸序列。

14.一种能够结合GPC3的嵌合抗原受体(CAR),所述嵌合抗原受体包含或由以下氨基酸序列组成：与SEQ ID NO：43、44、45、30、31、46、47、32、33、34、35、36或37所示的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的氨基酸序列。

15.一种编码如第1至14段中任一所述的嵌合抗原受体(CAR)的核酸。

16.一种包含第15段所述的核酸的载体。

17.一种细胞，所述细胞包含如第1至14段中任一所述的嵌合抗原受体(CAR)、如第15段所述的核酸，或如第16段所述的载体。

18.一种制备表达能够结合GPC3的嵌合抗原受体(CAR)的细胞的方法，包括将第15段所述的核酸或第16段所述的载体导入细胞，并在适合细胞表达所述核酸或载体的条件下培养细胞。

19.一种通过如第18段所述的方法获得或可获得的细胞。

20.一种药物组合物，所述药物组合物包含如第1-14段中任一所述的嵌合抗原受体(CAR)、第15段所述的核酸、第16段所述的载体、或第17段或19段所述的细胞，以及药学上可接受的载体、佐剂、赋形剂或稀释剂。

21.如第1-14段中任一所述的嵌合抗原受体(CAR)、第15段所述的核酸、第16段所述的载体、或第17段或19段所述的细胞、或第20段所述的药物组合物，用于治疗或预防疾病或病症的方法中。

22.如第1-14段中任一所述的嵌合抗原受体(CAR)、第15段所述的核酸、第16段所述的载体、或第17段或19段所述的细胞、或第20段所述的药物组合物在制备用于治疗或预防疾病或病症的药物中的用途。

23.一种治疗或预防疾病或病症的方法，包括向受试者施用治疗或预防有效量的如第1-14段中任一所述的嵌合抗原受体(CAR)、第15段所述的核酸、第16段所述的载体、或第17段或19段所述的细胞、或第20段所述的药物组合物。

24.一种治疗或预防受试者的疾病或病症的方法，包括：

(a)从受试者中分离至少一个T细胞；

(b)修饰所述至少一个T细胞以表达或包含如第1-14段中任一所述的嵌合抗原受体(CAR)、第15段所述的核酸、第16段所述的载体，和；

(c)向受试者施用所述修饰的至少一个T细胞。

25.一种治疗或预防受试者的疾病或病症的方法，包括：

(a)从受试者中分离至少一个T细胞；

(b)将如第15段所述的核酸或第16段所述的载体导入所述至少一个T细胞，从而修饰所述至少一个T细胞和；

(c)向受试者施用所述修饰的至少一个T细胞。

26.如第21段所述的应用的CAR、核酸、载体、细胞或药物组合物，如第22段所述的用途，或如第23至25段中任一所述的方法，其中所述疾病或病症是表达GPC3的癌症。

27.如第26段所述的应用的CAR、核酸、载体、细胞或药物组合物、用途或方法，其中表达GPC3的癌症是肝细胞癌。

28.一种试剂盒，所述试剂盒包含预定量的如第1-14段中任一所述的嵌合抗原受体(CAR)、第15段所述的核酸、第16段所述的载体、或第17段或19段所述的细胞、或第20段所述的药物组合物。

序列

***

本发明包括所描述的方面和优选特征的组合，除非这样的组合是明显不允许或明确避免的。

本文使用的章节标题仅用于组织目的，并且不应被解释为限制所描述的主题。

现在将参考附图通过示例来说明本发明的方面和实施例。其它方面和实施例对于本领域技术人员将是显而易见的。本文中提及的所有文件通过引用并入本文。

在整个说明书(包括所附权利要求书)中，除非上下文另有要求，否则词语“包括”及其变体例如“包含(comprises)”和“包括有(comprises)”将被理解为暗示包括所述整数或步骤或整数或步骤，但不排除任何其它整数或步骤，或整数或步骤组。

必须注意，如说明书和所附权利要求中所使用的，除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数形式。本发明的范围可以用“约”某个特定值，和/或另一个特定值“左右”来表示。表示这样的范围时，另一个例子，包括从一个特定的值和/或其他特定值。同样，当值表示为近似值时，通过使用先行词“约”，可以理解，该特定值形成另一个例子。

附图简要说明

现在将参考附图来讨论说明本发明的原理的实施例和实验，其中：

图1A和1B。pELNS慢病毒载体中本发明的GPC3靶向CAR构建物的示意图。

图2A和2B。散点图显示了通过流式细胞术测定的，用抗GPC3CAR构建物转导的T细胞的细胞表面上抗-GPC3的表达。图2A显示了非转导T细胞(阴性对照)、用编码GFP的构建物转导的T细胞(转导对照)，或用T、KK、LL、W或X(图2A)或S、CC、FF、U、Z、BB或EE(图2B)GPC3-CAR构建物转导的T细胞的分析结果。

图3A至3C。柱状图显示了通过Delfia细胞毒性试验测定的，用具有不同结构域的抗GPC3CAR构建物转导的T细胞对表达GPC3的细胞的细胞杀伤。图3A和3B显示了未转导的T细胞(阴性对照)或用T、KK、LL、W或X GPC3CAR构建物转导的T细胞对HepG2细胞的特异性细胞裂解，靶细胞：CAR-T细胞的比例为10：1(图3A)和20：1(图3B)。图3C显示了用编码GFP的构建物转导的T细胞(阴性对照)或用Z、S、BB、CC、U、EE、FF GPC3-CAR构建物转导的T细胞对HepG2细胞的特异性细胞裂解，靶细胞：CAR-T细胞比例为10：1和20：1。

图4。柱状图显示了用具有不同结构域的抗GPC3CAR构建物转导的T细胞对表达GPC3的细胞的细胞杀伤。显示了通过xCELLigence试验测定的，在不存在T细胞，存在TritonX-100的情况下(阳性对照)，通过用编码GFP的构物转导的T细胞(阴性对照)，或用T或X GPC3-CAR构建物转导的T细胞对HepG2细胞的细胞裂解百分比。

图5A和5B。曲线图和柱状图显示了用具有不同结构域的抗GPC3CAR构建物转导的T细胞对表达GPC3的细胞的细胞杀伤。图5A显示了随时间的细胞裂解。图5B显示了通过xCELLigence试验测定的，在不存在T细胞，未转导的T细胞(阴性对照)，或用T、KK、LL、W或XGPC3-CAR构建物转导的T细胞对HepG2细胞的细胞裂解百分比。

图6A和6B。曲线图和柱状图显示了用具有不同结构域的抗GPC3CAR构建物转导的T细胞对表达GPC3的细胞的细胞杀伤。图6A显示了随时间的细胞裂解。图6B显示了通过xCELLigence试验测定的，在不存在T细胞，用编码GFP的构建物转导的T细胞(阴性对照)，或用T、KK、LL、W、X、GG或MM GPC3-CAR构建物转导的T细胞对HepG2细胞的细胞裂解百分比。

图7A和7B。曲线图和柱状图显示了用具有不同结构域的抗GPC3CAR构建物转导的T细胞对表达GPC3的细胞的细胞杀伤。图7A显示了随时间的细胞裂解。图7B显示了通过xCELLigence试验测定的，通过用编码GFP的构建物转导的T细胞(阴性对照)，或用T、W或XGPC3-CAR构建物转导的T细胞对HepG2细胞的细胞裂解百分比。

图8A至8D。曲线图和柱状图显示了用具有不同结构域的抗GPC3CAR构建物转导的T细胞对表达GPC3的细胞的细胞杀伤。图8A显示了随时间的细胞裂解。图8B至8D显示了通过xCELLigence试验测定的，在(图8B)4小时，(图8C)12小时，和(图8D)36小时，用编码GFP的构建物转导的T细胞(阴性对照)或用Z、S、BB、CC、T、EE或FF GPC3-CAR构建物转导的T细胞对HepG2细胞的特异性细胞裂解。

图9A至9D。曲线图和柱状图显示了用具有不同结构域的抗GPC3CAR构建物转导的T细胞对表达GPC3的细胞的细胞杀伤。图9A显示了随时间的细胞裂解。图9B至9D显示了通过xCELLigence试验测定的，在(图9B)4小时，(图9C)12小时，和(图9D)24小时，用编码GFP的构建物转导的T细胞(阴性对照)，或用Z、S、BB、CC、T、EE或FF GPC3-CAR构建物转导的T细胞对HepG2细胞的特异性细胞裂解。

图10A至10D。曲线图和柱状图显示了用具有不同结构域的抗GPC3CAR构建物转导的T细胞对表达GPC3的细胞的细胞杀伤。图10A显示了随时间的细胞裂解。图10B至10D显示了通过xCELLigence试验测定的，在(图10B)4小时，(图10C)8小时，和(图10D)16小时，用编码GFP的构建物转导的T细胞(阴性对照)，或用Z、S、BB、CC、T、EE或FF GPC3-CAR构建物转导的T细胞对HepG2细胞的特异性细胞裂解。

图11A和7B。曲线图和柱状图显示了用具有不同结构域的抗GPC3CAR构建物转导的T细胞对表达GPC3的细胞的细胞杀伤。图11A显示了随时间的细胞裂解。图11B显示了通过xCELLigence试验测定的，通过用编码GFP的构建物转导的T细胞(阴性对照)，或用S或BBGPC3-CAR构建物转导的T细胞对HepG2细胞的细胞裂解百分比。

图12A和12B。曲线图和柱状图显示了用具有不同结构域的抗GPC3CAR构建物转导的T细胞对表达GPC3的细胞的细胞杀伤。图12A显示了随时间的细胞裂解。图12B显示了通过xCELLigence试验测定的，通过用编码GFP的构建物转导的T细胞(阴性对照)，或用S或BBGPC3-CAR构建物转导的T细胞对HepG2细胞的细胞裂解百分比。

图13A至13H。柱状图显示了表达GPC3的细胞和用抗GPC3CAR构建物转导的T细胞的共培养物中细胞因子的水平。柱状图显示了HepG2细胞与用编码GFP的构建物转导的T细胞(阴性对照)，或用T、W或X GPC3-CAR构建物转导的T细胞共培养16小时后的共培养物的细胞培养物上清液中，IL-2(图13A)、IFNg(图13B)、TNFα(图13C)、GM-CSF(图13D)、MIP-1a(图13E)、MIP-1b(图13F)、RANTES(图13G)和TNFb(图13H)的水平。

图14A至14H。曲线图显示了表达GPC3的细胞和用抗GPC3CAR构建物转导的T细胞的共培养物中细胞因子的水平。柱状图显示了HepG2细胞与用编码GFP的构建物转导的T细胞(阴性对照)，或用T、W或X GPC3-CAR构建物转导的T细胞共培养16小时后的共培养物的细胞培养物上清液中，IL-2(图14A)、IFNg(图14B)、TNFα(图14C)、GM-CSF(图14D)、MIP-1a(图14E)、MIP-1b(图14F)、RANTES(图14G)和TNFb(图14H)的水平。

图15A和15B。柱状图显示了用抗GPC3CAR构建物转导的T细胞在与表达GPC3的细胞共培养后的增殖。柱状图显示了与HepG2共培养5天后，用编码GFP的构建物转导(阴性对照)，或用T、W或X GPC3-CAR构建物转导的CD4+(图15A)和CD8+(图15B)T细胞的增殖。

图16A和16B。柱状图显示了用抗GPC3CAR构建物转导的T细胞在与表达GPC3的细胞共培养后的增殖。柱状图显示了与HepG2共培养5天后，用编码GFP的构建物转导(阴性对照)，或用S、AA或BB GPC3-CAR构建物转导的CD4+(图16A)和CD8+(图16B)T细胞的增殖。

图17A和17B。曲线图和柱状图显示了在存在或不存在TGFβ的情况下，用具有不同结构域的抗GPC3CAR构建物转导的T细胞对表达GPC3的细胞的细胞杀伤。图17A显示了随时间的细胞裂解。图17B显示了通过xCELLigence试验测定的，通过用编码GFP的构建物转导的T细胞(阴性对照)，或用S或BB GPC3-CAR构建物转导的T细胞对HepG2细胞的细胞裂解百分比。

实施例

本发明人在以下实施例中描述了靶向GPC3的CAR的构建，转导到人T淋巴细胞中以产生靶向GPC3的CAR-T细胞，通过GPC3靶向的CAR-T细胞对表达GPC3的细胞的抗原特异性杀伤，和体内靶向GPC3的CAR-T细胞的抗癌活性，与表达不含CD226细胞内结构域的CAR的CAR-T细胞相比，表达包含CD226共刺激区域的CAR的CAR-T细胞对免疫抑制因子的敏感性降低，提高对肿瘤靶标的选择性，改善CTL引发根除肿瘤细胞，改善转移、肿瘤迁移和渗透，以及增加生长因子表达。

实施例1:包含CD226细胞内结构域的CAR的产生和慢病毒转导的人T淋巴细胞

通过PCR扩增GC33scFv和CD226细胞内结构域的cDNA，并使用BamHI和NheI限制性位点插入到慢病毒载体pELN中，以产生具有CD226细胞内结构域的慢病毒载体pELNs/GC33CAR。

对于慢病毒转导，将5×10⁶HEK 293T细胞接种在预涂有0.002％聚-L-赖氨酸(Sigma，St.Louis MO)的10cm²培养皿上。然后用质粒pMD.G、pMDLg/pRRE和pRSV-Rev与慢病毒载体pELNS-CAR共转染。收集含病毒的上清液并通过0.45μm过滤器。然后通过在25,000rpm下超速离心浓缩上清液，滴度测定，然后在-80℃下储存直至使用。

获得从健康供体分离的原代人T淋巴细胞。T细胞在完全培养基(添加有10％灭活的FBS、青霉素和硫酸链霉素的RPMI 1640)中培养，并通过用抗CD3和抗CD28mAb包覆珠(Invitrogen)刺激而活化。活化后12小时，在聚凝胺存在下用慢病毒载体转导T细胞。每隔一天通过加入IL-2扩增和维持人T淋巴细胞。

实施例2:GPC3特异性CAR构建和T淋巴细胞转导

选择GC33scFv以构建具有高抗原结合亲和力的GPC3特异性CAR。通过将编码结构域的cDNA序列亚克隆到载体中，使用慢病毒CAR载体制备包含不同结构域的CAR构建物。产生以下构建物：

表格1

制备含有截短的CD3ζ细胞内结构域的信号传导缺陷构建物作为阴性对照，用于评估构建物的信号转导的引发。

将载体转化到293T细胞中，通过蛋白质印迹分析裂解物以确认载体的成功表达。

为了有效转导，从外周血样品中分离的人T淋巴细胞是通过用CD3/CD28珠刺激而活化的。为了评估转导效率，用表达GFP的慢病毒载体转导T细胞，并在转导后10天观察到稳定一致的GFP表达。

为了分析T细胞膜上的CAR表达，将FLAG标签人工插入CAR的N末端，并在用抗FLAGmAb染色细胞后通过流式细胞术检测表达。结果表明约50％的T细胞被转导并在细胞表面表达CAR受体。

实施例3:表达包含CD226共刺激区域的GPC3CAR的T细胞与表达不含CD226共刺激区的GPC3CAR的T细胞的比较

与不包含CD226的共刺激序列的CAR相比，具有CD226共刺激区域的GPC3CAR T细胞显示出对免疫抑制因子敏感性降低。GC33/CD226CAR在T细胞中的表达足以保护CAR T细胞免受用TGF-β处理的有效抑制作用。

使用概括正常与肿瘤组织的靶标，在体外将表达GC33/CD226CAR的T细胞的选择性与表达不含体外CD226细胞内结构域的GC33CAR的T细胞进行比较。表达GC33/CD226CAR的CAR T细胞选择性地仅消除肿瘤靶标而不是“正常”替代靶标。这些CAR-T细胞的选择性在体内得到证实。

实施例4:表达GPC3/CD226CAR的T细胞在CTL引发根除肿瘤细胞中的功效

在体外引发体系中测试表达具有CD266细胞内结构域的GPC3CAR的T细胞，并与表达不含CD226细胞内结构域的GC33CAR的T细胞进行比较。在存在非工程化T细胞和任选的DC的情况下，将表达CAR的人T细胞与经辐射的肿瘤细胞共培养。

与不含CD226细胞内结构域的CAR相比，表达GPC3/CD226CAR的T细胞显示出改善的CTL引发以根除肿瘤细胞。

实施例5:迁移试验确定输注后的细胞定位

transwell迁移试验表明GPC3/CD226CAR-T细胞能够比不含CD226细胞内结构域的GPC3CAR-T细胞更有效地向肿瘤细胞系上清液迁移。

GPC3CAR-T细胞用GFP标记并置于24孔transwell小室的上室中。将单独的培养基或LCL肿瘤上清液置于底室中。然后将板在37℃下孵育3小时。然后收获底室中的细胞并分析以确定T细胞从上室到下室的迁移。使用以下等式计算特异性迁移：

特异性迁移(％)＝(实验[LCL上清液]-自发[单独的培养基])/(最大[1.5×10⁵个细胞]-自发[单独的培养基])×100。

与不含CD226细胞内结构域的GPC3CAR-T细胞相比，表达包含CD226细胞内结构域的CAR构建物的CAR-T细胞表现出向下室的转移，并显示出更好的肿瘤迁移和渗透。

实施例6:使用多重细胞因子分析的细胞因子试验

通过多重技术分析共表达CD226的CAR T细胞的细胞培养上清液中的白细胞介素-2(IL-2)、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-13、IL-17、干扰素-γ(IFN-γ)、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的水平。细胞内细胞因子染色(ICS)用于检测CD3⁺细胞中的IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-13。

多重分析通过鉴定峰值水平或与峰值水平的良好相关性来检测第7天大多数细胞因子的代表性细胞因子谱。

与不含CD226细胞内结构域的GPC3CAR-T细胞相比，表达包含CD226细胞内结构域的CAR的CAR-T细胞具有增加的生长因子表达。

实施例7:GP3C特异性CAR的产生和慢病毒转导的人T淋巴细胞

通过PCR扩增GC33scFv的cDNA，并使用BamHI和NheI限制性位点插入到慢病毒载体pELN中，以产生慢病毒载体pELNs/GC33CAR。

对于慢病毒转导，将5×10⁶个HEK 293T细胞接种在预涂有0.002％聚-L-赖氨酸(Sigma，St.Louis MO)的10cm²培养皿上。然后用质粒pMD.G、pMDLg/pRRE和pRSV-Rev与慢病毒载体pELNS-CAR共转染。收集含病毒的上清液并通过0.45μm过滤器。然后通过在25,000rpm下超速离心浓缩上清液，滴度测定，然后在-80℃下储存直至使用。

实施例8:验证CAR引导T细胞抗表达G3PC的靶细胞的能力

通过基于荧光的杀伤试验、细胞因子释放试验和高维流式细胞术，体外分析证实转导的T淋巴细胞裂解GPC3阳性肿瘤细胞的能力。

实施例9:CAR+T细胞在体外显示出GPC3特异性细胞毒性

将工程化T细胞与GPC3阳性或GPC3阴性肿瘤细胞共培养，以测定表达CAR的T细胞是否显示抗原特异性细胞毒性。

通过慢病毒载体转导T细胞，并通过FACS评估它们的转导效率，并进一步平衡。包括用GFP慢病毒载体转导的T细胞作为对照。对于靶细胞，选择几种已建立的肿瘤细胞系，并通过FACS测定GPC3蛋白表达水平。还选择了两种肿瘤细胞系hs578T(GPC3阴性细胞系)和HepG2.sh57(显示较低水平的GPC3表达的细胞系)。

结果表明GPC3-CAR转导的T细胞对表达GPC3的靶细胞显示出抗原特异性细胞毒性。

实施例10:在过继转移后改善的GPC3-CAR T细胞的体内增殖和持久性以及增强抗肿瘤功效

将GPC3-CAR T细胞皮下注射到具有GPC3阳性异种移植肿瘤的免疫受损小鼠中。

未处理的对照组中的小鼠在50天后开始死亡。相反，用GPC3-CAR T细胞处理的小鼠继续存活。处理130天后，来自对照组的大多数小鼠已经死亡，但来自CAR T组的约80％的小鼠仍然存活。这些数据表明GPC3-CAR T细胞具有改善的体内持久性和增殖，并且在体内增强了长期抗肿瘤作用。

实施例11:更多的CAR构建物的制备

通过PCR扩增和将编码不同CAR结构域的cDNA亚克隆到慢病毒CAR载体中制备更多的CAR构建物。制备以下构建物:

实施例12:抗GPC3CAR在转导的T细胞上的表达

从外周血样品中获得CD3+细胞，通过抗CD3/抗-CD28珠刺激而活化，然后用实施例11中描述的以下GPC3-CAR构建物转导：T、KK、LL、W或X(图2A)，S、CC、FF、U、Z、BB或EE(图2B)，或编码GFP的慢病毒，作为转导对照。

使用生物素化的抗小鼠-fab’抗体和荧光缀合的链霉亲和素，通过流式细胞术分析转导细胞的细胞表面上GPC3-CAR的表达。

结果显示在图2A和2B中。在转导细胞的细胞表面检测到GPC3-CAR表达。

实施例13:靶向GPC3的CAR-T细胞的细胞杀伤分析

13.1Delfia细胞毒性试验分析

分析表达GPC3特异性CAR构建物的转导T细胞裂解表达GPC3的细胞的能力。

表达GPC3的HepG2肝癌细胞载有Delfia荧光增强剂试剂。通过靶向GPC3的CAR-T细胞裂解靶细胞将增强剂试剂释放到培养基中。

HepG2细胞和GPC3-CAR-T细胞共培养2小时后收集培养基；以靶细胞：CAR-T细胞为10：1和20：1的比例进行实验。

用荧光板读数器测测定荧光，并与自发释放的荧光和通过Delfia负载的HepG2细胞的化学裂解释放的荧光进行比较，计算特异性细胞裂解百分比。

使用用构建物T、KK、LL、W或X构建物(参见实施例11)转导的T细胞进行实验的结果显示在图3A和3B中。

使用用构建物Z、S、BB、CC、U、EE或FF构建物(参见实施例11)转导的T细胞进行实验的结果显示在图3C中。

显示了GPC3-CAR-T细胞能够杀死表达GPC3的细胞。

13.2通过xCELLigence试验分析

使用xCELLigence(ACEA Biosciences Inc)系统测量与细胞和金微电极的粘附性变化相关的电阻变化，进一步分析靶向GPC3的CAR-T细胞对HepG2细胞的裂解。细胞和金微电极之间的相互作用改变了电极之间的电流，并且该阻抗值被计算为“细胞指数”。

简而言之，将HepG2细胞接种在xCELLigence板中并监测生长。当接近汇合或汇合时，将CAR-T细胞以效应物：靶细胞为0.5：1的比例加入培养物中。通过xCELLigence机器监测CAR-T细胞对HepG2细胞的裂解，并使用XIMT软件计算细胞裂解百分比。

使用用靶向GPC3的构建物T或X转导的T细胞进行的结果显示在图4中。图4显示了在实验结束时HepG2细胞的细胞裂解百分比。发现与用T构建物转导的T细胞相比，用X构建物转导的T细胞显示出对表达GPC3的细胞的细胞裂解活性增加。

使用从不同供体获得的血液样品中分离的T细胞进行进一步的实验。

图5A和5B显示在用构建物T、KK、LL、W或X转导后28天来自供体ID1的T细胞获得的结果。发现与用T构建物转导的T细胞相比，用W和X构建物转导的T细胞显示出对表达GPC3的细胞的细胞裂解活性增加。

图6A和6B显示在用构建物T、KK、LL、W、X、GG或MM转导后14天来自供体ID2的T细胞获得的结果。再次发现，与用T构建物转导的T细胞相比，用W和X构建物转导的T细胞显示出对表达GPC3的细胞的细胞裂解活性增加。

图7A和7B显示在用构建物T、W或X转导后19天来自供体ID4的T细胞获得的结果。再次发现，与用T构建物转导的T细胞相比，用W和X构建体转导的T细胞显示出对表达GPC3的细胞的细胞裂解活性增加。

图8A至8D显示了在用构建物Z、S、BB、CC、T、EE、FF转导后10天，来自供体ID3的T细胞在实验的不同时间点获得的结果。

图9A至9D显示了在用构建物Z、S、BB、CC、T、EE、FF转导后12天，来自供体ID3的T细胞在实验的不同时间点获得的结果。

图10A至10D显示了在用构建物Z、S、BB、CC、T、EE、FF转导后20天，来自供体ID3的T细胞在实验的不同时间点获得的结果。

图11A和11B显示了在用构建物S或BB转导后19天来自供体ID4的T细胞获得的结果。发现与用S构建物转导的T细胞相比，用BB构建物转导的T细胞显示出对表达GPC3的细胞的细胞裂解活性增加。

图12A和12B显示了在用构建物S或BB转导后16天来自供体ID5的T细胞获得的结果。再次发现与用S构建物转导的T细胞相比，用BB构建物转导的T细胞显示出对表达GPC3的细胞的细胞裂解活性增加。

实施例14:表达GPC3-CAR的CAR-T细胞的细胞因子产生

用GPC3-CAR慢病毒构建物转导的CAR-T细胞和HepG2细胞的16小时共培养物中分析细胞因子产生。收集无细胞上清液并分析或在-80℃下冷冻以稍后分析。

使用默克免疫检测试剂组(Merck Immuno-monitoring reagent set)和Luminex读板系统进行培养细胞产生的细胞因子MIP-1a、MIP-1b、RANTES和TNFb水平的多重分析。

来自三个不同供体的T细胞获得的结果显示在图13A至13H和14A至14H中。总之，与包含用W和X构建物转导的T细胞的共培养物相比，在包含用T构建物转导的T细胞的共培养物中发现了更高水平的指定细胞因子。

实施例15:表达GPC3-CAR的CAR-T细胞的增殖

在与HepG2细胞共培养5天后，或在不存在HepG2细胞的情况下培养相同时间后，分析用不同GPC3-CAR构建物转导的T细胞的增殖。

简而言之，用CFSE标记T细胞，CFSE是荧光标记，每当标记的细胞分裂为2时，其强度减半。标记后，分析T细胞以确保标记均匀。辐射HepG2细胞以防止进一步增殖并与标记的T细胞共温育。5天后，通过流式细胞术分析T细胞。荧光大约等于原始荧光的细胞被确定为非增殖细胞，并且具有原始荧光强度的一半或小于一半的那些细胞被确定为增殖细胞。

图15A和15B显示在用构建物T、W或X构建物转导后8天来自供体ID4的T细胞的增殖试验的结果。发现与用T构建物转导的T细胞相比，用W和X构建物转导的T细胞在与HepG2细胞共培养后增殖更多。还发现用W和X构建物转导的T细胞在不存在HepG2细胞的情况下比用T构建物转导的T细胞增殖更少。

图16A和16B显示在用构建物S、AA或BB构建物转导后8天来自供体ID4的T细胞的增殖试验的结果。发现与用S构建物转导的CD4+T细胞相比，用BB构建物转导的CD4+T细胞在与HepG2细胞共培养后增殖更多。还发现用BB构建物转导的T细胞在不存在HepG2细胞的情况下显示出大量增殖。

实施例16:对TGFβ的敏感性

分析用不同GPC3-CAR构建物转导的T细胞对TGFβ的免疫抑制的敏感性。

简而言之，将HepG2细胞接种在xCELLigence平板上，24小时后，在存在或不存在125ng/ml TGFβ的情况下，将用GFP构建物转导的T细胞(阴性对照)或用构建物S或BB转导的T细胞加入孔中，使用xCELLigence(ACEA Biosciences Inc)系统测定细胞裂解。

结果显示在图17A和17B中。发现与用S构建物转导的d T细胞相比，用BB构建物转导的T细胞对TGFβ介导的细胞裂解活性抑制更加不敏感(比较图17B第3和第5列与第4和第6列)。

实施例17:结论

出乎意料的是，发现与表达不含CD226细胞内结构域的等同CAR的T细胞相比，表达包含CD226细胞内结构域的CAR的T细胞显示出对表达靶抗原的细胞的细胞毒性增强，同时在与靶抗原表达细胞共培养中促炎/效应细胞因子的产生水平降低。此外，发现与表达不含CD226细胞内结构域的等同CAR的T细胞相比，表达包含CD226细胞内结构域的CAR的T细胞在与靶抗原表达细胞共培养后增殖更多。

例如，与表达构建物T的T细胞相比，用构建物W和X转导的T细胞显示出对表达靶抗原的细胞的细胞毒性增强，并且在与靶抗原表达细胞共培养后增殖增加。

与表达构建物S的T细胞相比，用构建物BB转导的T细胞显示出对表达靶抗原的细胞的细胞毒性增强，并且对TGFβ介导的效应因子功能的抑制更加不敏感。

序列表

<110> 泰莎治疗私人有限公司

理查德·艾·克莱格

<120> 嵌合抗原受体

<130> RIC/FP7291040

<150> US62/366729

<151> 2016-07-26

<150> US62/366731

<151> 2016-07-26

<160> 126

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GC33重链可变区序列

<400> 1

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Glu Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu Lys Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ala

115

<210> 2

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GC33 HC-CDR1

<400> 2

Asp Tyr Glu Met His

1 5

<210> 3

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GC33 HC-CDR2

<400> 3

Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 4

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GC33 HC-CDR3

<400> 4

Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr

1 5

<210> 5

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GC33轻链可变区序列

<400> 5

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Asn

85 90 95

Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 6

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GC33 LC-CDR1

<400> 6

Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His

1 5 10 15

<210> 7

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GC33 LC-CDR2

<400> 7

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser

1 5

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GC33 LC-CDR3

<400> 8

Ser Gln Asn Thr His Val Pro Pro Thr

1 5

<210> 9

<211> 242

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GC33 scFv

<400> 9

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Glu Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu Lys Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser

130 135 140

Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val

145 150 155 160

His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly

165 170 175

Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly

180 185 190

Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

195 200 205

Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser

210 215 220

Gln Asn Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu

225 230 235 240

Ile Lys

<210> 10

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CD28跨膜结构域

<400> 10

Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu

1 5 10 15

Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile

20

<210> 11

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CD8α跨膜结构域

<400> 11

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn

20 25

<210> 12

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ITAM基序

<220>

<222> (2)..(3)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<222> (4)..(4)

<223> Xaa = Leu或Ile

<400> 12

Tyr Xaa Xaa Xaa

1

<210> 13

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ITAM基序

<220>

<222> (2)..(3)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<222> (4)..(4)

<223> Xaa = Leu或Ile

<220>

<222> (5)..(7)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<222> (9)..(10)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<222> (11)..(11)

<223> Xaa = Leu或Ile

<400> 13

Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa

1 5 10

<210> 14

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CD3-zeta细胞内结构域

<400> 14

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 15

<211> 336

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人CD226; UniProt Q15762 (CD226_HUMAN)

<400> 15

Met Asp Tyr Pro Thr Leu Leu Leu Ala Leu Leu His Val Tyr Arg Ala

1 5 10 15

Leu Cys Glu Glu Val Leu Trp His Thr Ser Val Pro Phe Ala Glu Asn

20 25 30

Met Ser Leu Glu Cys Val Tyr Pro Ser Met Gly Ile Leu Thr Gln Val

35 40 45

Glu Trp Phe Lys Ile Gly Thr Gln Gln Asp Ser Ile Ala Ile Phe Ser

50 55 60

Pro Thr His Gly Met Val Ile Arg Lys Pro Tyr Ala Glu Arg Val Tyr

65 70 75 80

Phe Leu Asn Ser Thr Met Ala Ser Asn Asn Met Thr Leu Phe Phe Arg

85 90 95

Asn Ala Ser Glu Asp Asp Val Gly Tyr Tyr Ser Cys Ser Leu Tyr Thr

100 105 110

Tyr Pro Gln Gly Thr Trp Gln Lys Val Ile Gln Val Val Gln Ser Asp

115 120 125

Ser Phe Glu Ala Ala Val Pro Ser Asn Ser His Ile Val Ser Glu Pro

130 135 140

Gly Lys Asn Val Thr Leu Thr Cys Gln Pro Gln Met Thr Trp Pro Val

145 150 155 160

Gln Ala Val Arg Trp Glu Lys Ile Gln Pro Arg Gln Ile Asp Leu Leu

165 170 175

Thr Tyr Cys Asn Leu Val His Gly Arg Asn Phe Thr Ser Lys Phe Pro

180 185 190

Arg Gln Ile Val Ser Asn Cys Ser His Gly Arg Trp Ser Val Ile Val

195 200 205

Ile Pro Asp Val Thr Val Ser Asp Ser Gly Leu Tyr Arg Cys Tyr Leu

210 215 220

Gln Ala Ser Ala Gly Glu Asn Glu Thr Phe Val Met Arg Leu Thr Val

225 230 235 240

Ala Glu Gly Lys Thr Asp Asn Gln Tyr Thr Leu Phe Val Ala Gly Gly

245 250 255

Thr Val Leu Leu Leu Leu Phe Val Ile Ser Ile Thr Thr Ile Ile Val

260 265 270

Ile Phe Leu Asn Arg Arg Arg Arg Arg Glu Arg Arg Asp Leu Phe Thr

275 280 285

Glu Ser Trp Asp Thr Gln Lys Ala Pro Asn Asn Tyr Arg Ser Pro Ile

290 295 300

Ser Thr Ser Gln Pro Thr Asn Gln Ser Met Asp Asp Thr Arg Glu Asp

305 310 315 320

Ile Tyr Val Asn Tyr Pro Thr Phe Ser Arg Arg Pro Lys Thr Arg Val

325 330 335

<210> 16

<211> 66

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CD226细胞内结构域 (amino acid positions 271 to 336 of

UniProt Q15762)

<400> 16

Ile Val Ile Phe Leu Asn Arg Arg Arg Arg Arg Glu Arg Arg Asp Leu

1 5 10 15

Phe Thr Glu Ser Trp Asp Thr Gln Lys Ala Pro Asn Asn Tyr Arg Ser

20 25 30

Pro Ile Ser Thr Ser Gln Pro Thr Asn Gln Ser Met Asp Asp Thr Arg

35 40 45

Glu Asp Ile Tyr Val Asn Tyr Pro Thr Phe Ser Arg Arg Pro Lys Thr

50 55 60

Arg Val

65

<210> 17

<211> 44

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CD28细胞内结构域

<400> 17

Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met

1 5 10 15

Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro

20 25 30

Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

35 40

<210> 18

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 4-1BB细胞内结构域

<400> 18

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 19

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人IgG1铰链 region

<400> 19

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10 15

<210> 20

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> F36V-FKBP二聚化序列

<400> 20

Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe Pro

1 5 10 15

Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met Leu Glu Asp

20 25 30

Gly Lys Lys Val Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys Phe

35 40 45

Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu Gly Val Ala

50 55 60

Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser Pro Asp Tyr

65 70 75 80

Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro His Ala Thr

85 90 95

Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu

100 105

<210> 21

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人Ig重链信号序列

<400> 21

Met Asp Trp Ile Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Gly Ala Ala Thr Gly

1 5 10 15

Ala His Ser

<210> 22

<211> 466

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> scFV GC33/hIgG1铰链/CD8α TMD/CD226/CD3zeta

<400> 22

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Glu Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu Lys Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser

130 135 140

Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val

145 150 155 160

His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly

165 170 175

Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly

180 185 190

Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

195 200 205

Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser

210 215 220

Gln Asn Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu

225 230 235 240

Ile Lys Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

245 250 255

Pro Asp Pro Lys Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly

260 265 270

Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn

275 280 285

Ile Val Ile Phe Leu Asn Arg Arg Arg Arg Arg Glu Arg Arg Asp Leu

290 295 300

Phe Thr Glu Ser Trp Asp Thr Gln Lys Ala Pro Asn Asn Tyr Arg Ser

305 310 315 320

Pro Ile Ser Thr Ser Gln Pro Thr Asn Gln Ser Met Asp Asp Thr Arg

325 330 335

Glu Asp Ile Tyr Val Asn Tyr Pro Thr Phe Ser Arg Arg Pro Lys Thr

340 345 350

Arg Val Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln

355 360 365

Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu

370 375 380

Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly

385 390 395 400

Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu

405 410 415

Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly

420 425 430

Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser

435 440 445

Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro

450 455 460

Pro Arg

465

<210> 23

<211> 573

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> scFV GC33/hIgG1铰链/CD8α TMD/F36V-FKBP/CD226/CD3zeta

<400> 23

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Glu Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu Lys Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser

130 135 140

Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val

145 150 155 160

His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly

165 170 175

Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly

180 185 190

Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

195 200 205

Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser

210 215 220

Gln Asn Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu

225 230 235 240

Ile Lys Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

245 250 255

Pro Asp Pro Lys Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly

260 265 270

Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn

275 280 285

Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe Pro

290 295 300

Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met Leu Glu Asp

305 310 315 320

Gly Lys Lys Val Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys Phe

325 330 335

Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu Gly Val Ala

340 345 350

Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser Pro Asp Tyr

355 360 365

Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro His Ala Thr

370 375 380

Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu Ile Val Ile Phe Leu

385 390 395 400

Asn Arg Arg Arg Arg Arg Glu Arg Arg Asp Leu Phe Thr Glu Ser Trp

405 410 415

Asp Thr Gln Lys Ala Pro Asn Asn Tyr Arg Ser Pro Ile Ser Thr Ser

420 425 430

Gln Pro Thr Asn Gln Ser Met Asp Asp Thr Arg Glu Asp Ile Tyr Val

435 440 445

Asn Tyr Pro Thr Phe Ser Arg Arg Pro Lys Thr Arg Val Arg Val Lys

450 455 460

Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln

465 470 475 480

Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu

485 490 495

Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg

500 505 510

Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met

515 520 525

Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly

530 535 540

Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp

545 550 555 560

Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

565 570

<210> 24

<211> 510

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> scFV GC33/hIgG1铰链/CD8α TMD/CD226/CD28/CD3zeta

<400> 24

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Glu Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu Lys Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser

130 135 140

Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val

145 150 155 160

His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly

165 170 175

Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly

180 185 190

Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

195 200 205

Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser

210 215 220

Gln Asn Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu

225 230 235 240

Ile Lys Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

245 250 255

Pro Asp Pro Lys Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly

260 265 270

Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn

275 280 285

Ile Val Ile Phe Leu Asn Arg Arg Arg Arg Arg Glu Arg Arg Asp Leu

290 295 300

Phe Thr Glu Ser Trp Asp Thr Gln Lys Ala Pro Asn Asn Tyr Arg Ser

305 310 315 320

Pro Ile Ser Thr Ser Gln Pro Thr Asn Gln Ser Met Asp Asp Thr Arg

325 330 335

Glu Asp Ile Tyr Val Asn Tyr Pro Thr Phe Ser Arg Arg Pro Lys Thr

340 345 350

Arg Val Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp

355 360 365

Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr

370 375 380

Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val

385 390 395 400

Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn

405 410 415

Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val

420 425 430

Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg

435 440 445

Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys

450 455 460

Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg

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Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp

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Phe Lys Phe Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu

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Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met

420 425 430

Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala

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Gly

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<220>

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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20

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<212> PRT

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<220>

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<212> PRT

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<220>

<223> CD226 ICD v2

<400> 59

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<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CD226 TMD

<400> 60

Gly Gly Thr Val Leu Leu Leu Leu Phe Val Ile Ser Ile Thr Thr Ile

1 5 10 15

Ile Val Ile Phe Leu

20

<210> 61

<211> 415

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> hIgG重链信号序列/scFV GC33/hIgG1铰链/CD28

TMD/CD3zeta

<400> 61

Met Asp Trp Ile Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Gly Ala Ala Thr Gly

1 5 10 15

Ala His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg

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Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

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Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser

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Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

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Tyr Tyr Cys Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

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Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

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Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu

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Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg

195 200 205

Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

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Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr

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Phe Cys Ser Gln Asn Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr

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275 280 285

Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Arg

290 295 300

Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln

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Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp

325 330 335

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340 345 350

Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp

355 360 365

Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg

370 375 380

Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr

385 390 395 400

Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

405 410 415

<210> 62

<211> 366

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> hIgG重链信号序列/scFV GC33/hIgG1铰链/CD28

TMD/CD226 ICD v2

<400> 62

Met Asp Trp Ile Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Gly Ala Ala Thr Gly

1 5 10 15

Ala His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

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Thr Asp Tyr Glu Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu

50 55 60

Lys Trp Ile Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser

65 70 75 80

Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

115 120 125

Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu

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Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln

165 170 175

Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln

180 185 190

Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg

195 200 205

Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

210 215 220

Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr

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245 250 255

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260 265 270

Pro Pro Cys Pro Asp Pro Lys Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly

275 280 285

Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe

290 295 300

Leu Asn Arg Arg Arg Arg Arg Glu Arg Arg Asp Leu Phe Thr Glu Ser

305 310 315 320

Trp Asp Thr Gln Lys Ala Pro Asn Asn Tyr Arg Ser Pro Ile Ser Thr

325 330 335

Ser Gln Pro Thr Asn Gln Ser Met Asp Asp Thr Arg Glu Asp Ile Tyr

340 345 350

Val Asn Tyr Pro Thr Phe Ser Arg Arg Pro Lys Thr Arg Val

355 360 365

<210> 63

<211> 457

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> hIgG重链信号序列/scFV GC33/hIgG1铰链/CD28

TMD/41BB/CD3zeta

<400> 63

Met Asp Trp Ile Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Gly Ala Ala Thr Gly

1 5 10 15

Ala His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Asp Tyr Glu Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu

50 55 60

Lys Trp Ile Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser

65 70 75 80

Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

100 105 110

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> (核酸) hIgG重链信号序列/scFV GC33/hIgG1

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tgcaaggcct ccggctacac ctttaccgac tacgagatgc actgggtcaa gcagaccccc 180

gtgcacggtc tgaagtggat tggggccctg gatcccaaga ccggcgatac tgcgtactca 240

cagaagttca agggaaaggc cacgctcact gcggacaaat cgtccagcac cgcgtacatg 300

gaactcagga gcctgacttc cgaggatagc gcagtgtact actgcacccg cttttactcc 360

tacacttact ggggacaggg caccttggtg actgtgtcag ccggtggagg cggatcaggg 420

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gtgcacggtc tgaagtggat tggggccctg gatcccaaga ccggcgatac tgcgtactca 240

cagaagttca agggaaaggc cacgctcact gcggacaaat cgtccagcac cgcgtacatg 300

gaactcagga gcctgacttc cgaggatagc gcagtgtact actgcacccg cttttactcc 360

tacacttact ggggacaggg caccttggtg actgtgtcag ccggtggagg cggatcaggg 420

ggtggaggat ccgggggagg aggatccgat gtggtcatga cccagacccc actgtccctt 480

cccgtgtccc tgggtgacca agcctcgatc agctgcagat cctcccagtc actggtccac 540

agcaacggca acacctatct gcattggtac ctccagaagc cgggacaatc ccccaagctc 600

ctgatctaca aggtgtccaa ccggttcagc ggagtgccgg atcgattctc agggtcgggt 660

tcgggaaccg acttcaccct taagatttcc cgggtggaag ccgaggatct cggagtgtac 720

ttctgctccc aaaataccca cgtgccgcct acattcggat cgggaactaa gctggagatc 780

aaggagccca aaagctgcga caagacccac acttgcccac cttgcccgga tccaaagttc 840

tgggtgctgg tggtggtcgg gggagtgctc gcctgctact ctctgctggt gaccgtggcc 900

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<210> 102

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> (核酸) hIgG重链信号序列/scFV GC33/hIgG1

铰链/CD28 TMD/ CD226 ICD v1/41BB/CD3zeta

<400> 102

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<212> DNA

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<220>

<223> (核酸) hIgG重链信号序列/scFV GC33/hIgG1

铰链/CD28 TMD/ CD226 ICD v2/41BB/CD3zeta

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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tag 1383

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> (核酸) hIgG重链信号序列/scFV GC33/hIgG1

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ttctgctccc aaaataccca cgtgccgcct acattcggat cgggaactaa gctggagatc 780

aaggagccca aaagctgcga caagacccac acttgcccac cttgcccgga tccgaagttc 840

tgggtgctgg tggtggtcgg gggagtgctc gcctgctact ctctgctggt gaccgtggcc 900

ttcatcatct tttgggtgag atccaagcgg tctcgcctgc tgcacagcga ctacatgaac 960

atgaccccgc gcagacctgg cccgactagg aagcactacc agccctacgc cccccccagg 1020

gatttcgccg cctacagatc caagcgcggt cggaagaagc tgctgtacat cttcaagcag 1080

cccttcatgc ggcctgtgca gaccacacag gaagaggatg gctgctcctg ccgcttcccg 1140

gaggaagagg agggcggatg cgaactgcgc gtgaagttca gccggagcgc tgatgcccct 1200

gcataccagc aggggcagaa ccagctctac aacgaactga accttggacg gcgggaggaa 1260

tacgatgtgc tggataagcg aagaggccgc gacccagaaa tgggcgggaa gcccagacgc 1320

aagaatcctc aggagggact gtacaacgag ctccagaaag acaagatggc cgaagcgtac 1380

agcgagatcg gcatgaaggg ggaacggaga aggggaaagg gccatgacgg attgtaccag 1440

ggcctgtcga ccgctaccaa agacacctac gacgccctcc atatgcaagc actgccgcca 1500

cgctgatag 1509

<210> 111

<211> 1692

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> (核酸) hIgG重链信号序列/scFV GC33/hIgG1

铰链/CD28 TMD/ CD226 ICD v1/ CD28 ICD/41BB/CD3zeta

<400> 111

atggactgga tctggaggat tttgttcctt gtgggagctg ccaccggtgc acattcgcaa 60

gtgcagttgc agcagtcggg agccgaactg gtccggcctg gagcttccgt gaagcttagc 120

tgcaaggcct ccggctacac ctttaccgac tacgagatgc actgggtcaa gcagaccccc 180

gtgcacggtc tgaagtggat tggggccctg gatcccaaga ccggcgatac tgcgtactca 240

cagaagttca agggaaaggc cacgctcact gcggacaaat cgtccagcac cgcgtacatg 300

gaactcagga gcctgacttc cgaggacagc gcagtgtact actgcacccg cttttactcc 360

tacacttact ggggacaggg caccttggtg actgtgtcag ccggtggagg cggatcaggg 420

ggtggaggat ccgggggagg aggatccgat gtggtcatga cccagacccc actgtccctt 480

cccgtgtccc tgggtgacca agcctcgatc agctgcagat cctcccagtc actggtccac 540

agcaacggca acacctatct gcattggtac ctccagaagc cgggacaatc ccccaagctc 600

ctgatctaca aggtgtccaa ccggttcagc ggagtgccgg atcgattctc agggtcgggt 660

tcgggaaccg acttcaccct taagatttcc cgggtggaag ccgaggatct cggagtgtac 720

ttctgctccc aaaataccca cgtgccgcct acattcggat cgggaactaa gctggagatc 780

aaggagccca aaagctgcga caagacccac acttgcccac cttgcccgga tccgaagttt 840

tgggtgttgg tggtggtcgg aggcgtcctc gcatgctata gcctgctcgt gaccgtggcc 900

ttcatcatca accgcaggcg gagaagggaa cggcgcgacc tgttcactga gtcatgggac 960

acccagaagg ccccgaacaa ctaccgctcc ccgatctcca cctcccaacc gactaatcaa 1020

agcatggacg acaccaggga ggacatctac gtgaactacc ctactttctc ccgccggcct 1080

aagacccgcg tgttctgggt gcgctccaag cgctccagac tgctgcacag cgactacatg 1140

aacatgaccc caagacgccc aggacctact aggaagcatt atcaacctta tgccccgccg 1200

agagacttcg cggcgtatag gtccaagcgc ggtcggaaga agctgctgta catcttcaag 1260

cagcccttca tgcggcctgt gcagaccaca caggaagagg atggctgctc ctgccgcttc 1320

ccggaggaag aggagggcgg atgcgaactg cgcgtgaagt tcagccggag cgctgatgcc 1380

cctgcatacc agcaggggca gaaccagctc tacaacgaac tgaaccttgg acggcgggag 1440

gaatacgatg tgctggataa gcgaagaggc cgcgacccag aaatgggcgg gaagcccaga 1500

cgcaagaatc ctcaggaggg actgtacaac gagctccaga aagacaagat ggccgaagcg 1560

tacagcgaga tcggcatgaa gggggaacgg agaaggggaa agggccatga cggattgtac 1620

cagggcctgt cgaccgctac caaagacacc tacgacgccc tccatatgca agcactgccg 1680

ccacgctgat ag 1692

<210> 112

<211> 1698

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> (核酸) hIgG重链信号序列/scFV GC33/hIgG1

铰链/CD28 TMD/ CD226 ICD v2/ CD28 ICD/41BB/CD3zeta

<400> 112

atggactgga tctggaggat tttgttcctt gtgggagctg ccaccggtgc acattcgcaa 60

gtgcagttgc agcagtcggg agccgaactg gtccggcctg gagcttccgt gaagcttagc 120

tgcaaggcct ccggctacac ctttaccgac tacgagatgc actgggtcaa gcagaccccc 180

gtgcacggtc tgaagtggat tggggccctg gatcccaaga ccggcgatac tgcgtactca 240

cagaagttca agggaaaggc cacgctcact gcggacaaat cgtccagcac cgcgtacatg 300

gaactcagga gcctgacttc cgaggatagc gcagtgtact actgcacccg cttttactcc 360

tacacttact ggggacaggg caccttggtg actgtgtcag ccggtggagg cggatcaggg 420

ggtggaggat ccgggggagg aggatccgat gtggtcatga cccagacccc actgtccctt 480

cccgtgtccc tgggtgacca agcctcgatc agctgcagat cctcccagtc actggtccac 540

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ctgatctaca aggtgtccaa ccggttcagc ggagtgccgg atcgattctc agggtcgggt 660

tcgggaaccg acttcaccct taagatttcc cgggtggaag ccgaggatct cggagtgtac 720

ttctgctccc aaaataccca cgtgccgcct acattcggat cgggaactaa gctggagatc 780

aaggagccca aaagctgcga caagacccac acttgcccac cttgcccgga tccgaagttc 840

tgggtcttgg tggtggtcgg aggcgtcctc gcttgctaca gcctgctcgt gaccgtggcc 900

ttcatcatct tcctgaaccg caggcggaga agggaacggc gcgacctgtt cactgagtca 960

tgggacaccc agaaggcccc gaacaactac cgctccccga tctccacctc ccaaccgact 1020

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cggcctaaga cccgcgtgtt ctgggtgcgc tccaagcgct ccagactgct gcacagcgac 1140

tacatgaaca tgaccccaag acgcccagga cctactagga agcattatca accttatgcc 1200

ccgccgagag acttcgcggc gtataggtcc aagcgcggtc ggaagaagct gctgtacatc 1260

ttcaagcagc ccttcatgcg gcctgtgcag accacacagg aagaggatgg ctgctcctgc 1320

cgcttcccgg aggaagagga gggcggatgc gaactgcgcg tgaagttcag ccggagcgct 1380

gatgcccctg cataccagca ggggcagaac cagctctaca acgaactgaa ccttggacgg 1440

cgggaggaat acgatgtgct ggataagcga agaggccgcg acccagaaat gggcgggaag 1500

cccagacgca agaatcctca ggagggactg tacaacgagc tccagaaaga caagatggcc 1560

gaagcgtaca gcgagatcgg catgaagggg gaacggagaa ggggaaaggg ccatgacgga 1620

ttgtaccagg gcctgtcgac cgctaccaaa gacacctacg acgccctcca tatgcaagca 1680

ctgccgccac gctgatag 1698

<210> 113

<211> 1692

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> (核酸) hIgG重链信号序列/scFV GC33/hIgG1

铰链/CD28 TMD/ CD28 ICD/CD226 ICD v1/41BB/CD3zeta

<400> 113

atggactgga tctggaggat tttgttcctt gtgggagctg ccaccggtgc acattcgcaa 60

gtgcagttgc agcagtcggg agccgaactg gtccggcctg gagcttccgt gaagcttagc 120

tgcaaggcct ccggctacac ctttaccgac tacgagatgc actgggtcaa gcagaccccc 180

gtgcacggtc tgaagtggat tggggccctg gatcccaaga ccggcgatac tgcgtactca 240

cagaagttca agggaaaggc cacgctcact gcggacaaat cgtccagcac cgcgtacatg 300

gaactcagga gcctgacttc cgaggatagc gcagtgtact actgcacccg cttttactcc 360

tacacttact ggggacaggg caccttggtg actgtgtcag ccggtggagg cggatcaggg 420

ggtggaggat ccgggggagg aggatccgat gtggtcatga cccagacccc actgtccctt 480

cccgtgtccc tgggtgacca agcctcgatc agctgcagat cctcccagtc actggtccac 540

agcaacggca acacctatct gcattggtac ctccagaagc cgggacaatc ccccaagctc 600

ctgatctaca aggtgtccaa ccggttcagc ggagtgccgg atcgattctc agggtcgggt 660

tcgggaaccg acttcaccct taagatttcc cgggtggaag ccgaggatct cggagtgtac 720

ttctgctccc aaaataccca cgtgccgcct acattcggat cgggaactaa gctggagatc 780

aaggagccca aaagctgcga caagacccac acttgcccac cttgtccgga tccgaagttc 840

tgggtgctgg tggtggtcgg gggagtgctc gcctgctact ctctgctggt gaccgtggca 900

ttcattatct tctgggtccg ctccaaacgg tcccggctgc tgcactccga ctacatgaac 960

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gacttcgccg cataccgctc aaacagaagg aggcgccggg agcggcgcga cctgttcact 1080

gaatcctggg acacccagaa ggcccccaac aactacaggt cccctatctc aacctcccaa 1140

cccaccaacc agagcatgga cgatactcgc gaggacatct acgtgaacta ccccactttc 1200

tcccggcggc ctaagacccg cgtgaagcgc ggtcggaaga agctgctgta catcttcaag 1260

cagcccttca tgcggcctgt gcagaccaca caggaagagg atggctgctc ctgccgcttc 1320

ccggaggaag aggagggcgg atgcgaactg cgcgtgaagt tcagccggag cgctgatgcc 1380

cctgcatacc agcaggggca gaaccagctc tacaacgaac tgaaccttgg acggcgggag 1440

gaatacgatg tgctggataa gcgaagaggc cgcgacccag aaatgggcgg gaagcccaga 1500

cgcaagaatc ctcaggaggg actgtacaac gagctccaga aagacaagat ggccgaagcg 1560

tacagcgaga tcggcatgaa gggggaacgg agaaggggaa agggccatga cggattgtac 1620

cagggcctgt cgaccgctac caaagacacc tacgacgccc tccatatgca agcactgccg 1680

cctagatgat ag 1692

<210> 114

<211> 1554

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> (核酸) hIgG重链信号序列/scFV GC33/hIgG1

铰链/CD226 TMD/CD226 ICD v1/41BB/CD3zeta

<400> 114

atggactgga tctggaggat tttgttcctt gtgggagctg ccaccggtgc acattcgcaa 60

gtgcagttgc agcagtcggg agccgaactg gtccggcctg gagcttccgt gaagcttagc 120

tgcaaggcct ccggctacac ctttaccgac tacgagatgc actgggtcaa gcagaccccc 180

gtgcacggtc tgaagtggat tggggccctg gatcccaaga ccggcgatac tgcgtactca 240

cagaagttca agggaaaggc cacgctcact gcggacaaat cgtccagcac cgcgtacatg 300

gaactcagga gcctgacttc cgaggatagc gcagtgtact actgcacccg cttttactcc 360

tacacttact ggggacaggg caccttggtg actgtgtcag ccggtggagg cggatcaggg 420

ggtggaggat ccgggggagg aggatccgat gtggtcatga cccagacccc actgtccctt 480

cccgtgtccc tgggtgacca agcctcgatc agctgcagat cctcccagtc actggtccac 540

agcaacggca acacctatct gcattggtac ctccagaagc cgggacaatc ccccaagctc 600

ctgatctaca aggtgtccaa ccggttcagc ggagtgccgg atcgattctc agggtcgggt 660

tcgggaaccg acttcaccct taagatttcc cgggtggaag ccgaggatct cggagtgtac 720

ttctgctccc aaaataccca cgtgccgcct acattcggat cgggaactaa gctggagatc 780

aaggagccca aaagctgcga caagacccac acttgcccac cttgtccgga tccgaagggg 840

ggaactgtgc tcctcctgct gttcgtgatt tcgatcacga ccatcattgt gatcttcctg 900

aaccgccggc gaagacgcga gcggcgcgac ctgttcactg aatcctggga cacccagaag 960

gcccccaaca actacaggtc ccctatctca acctcccaac ccaccaacca gagcatggac 1020

gatactcgcg aggacatcta cgtgaactac cccactttct cccggcggcc taagacccgc 1080

gtgaagcgcg gtcggaagaa gctgctgtac atcttcaagc agcccttcat gcggcctgtg 1140

cagaccacac aggaagagga tggctgctcc tgccgcttcc cggaggaaga ggagggcgga 1200

tgcgaactgc gcgtgaagtt cagccggagc gctgatgccc ctgcatacca gcaggggcag 1260

aaccagctct acaacgaact gaaccttgga cggcgggagg aatacgatgt gctggataag 1320

cgaagaggcc gcgacccaga aatgggcggg aagcccagac gcaagaatcc tcaggaggga 1380

ctgtacaacg agctccagaa agacaagatg gccgaagcgt acagcgagat cggcatgaag 1440

ggggaacgga gaaggggaaa gggccatgac ggattgtacc agggcctgtc gaccgctacc 1500

aaagacacct acgacgccct ccatatgcaa gcactgccgc ctagatgaac gcgt 1554

<210> 115

<211> 1101

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> (核酸) hIgG重链信号序列/scFV 3-17I/hIgG1

铰链/CD226 TMD/CD226 ICD v1

<400> 115

atggactgga tctggagaat tttgttcctt gtcggtgctg ccactggagc ccactcgcaa 60

gtgcagctcg tgcagtctgg agcagaagtc aagaagcctg ggtcctcggt caaagtgtcc 120

tgcaaagcct ccgggggcac tttcagctcg tacgcaatct cctgggtccg ccaagcgccc 180

ggacagggtc tggagtggat gggcgggatt atccccattt tcggcaccgc caactatgct 240

caaaagttcc agggccgcgt gactattacc gcggacgagt caacctccac tgcgtacatg 300

gaactgagct cacttcggtc cgaggacacc gccgtctatt actgtgcgcg gggactcctg 360

tggaactact ggggacaagg caccctcgtg accgtgtcct cgaagctgtc cgggtcggcc 420

agcgccccca agttggaaga gggcgaattc tccgaggccc gggtggaaat cgtgatgacc 480

cagtccccgg ccactctctc cgtgtccccg ggagaaaggg cgaccctgtc atgccgggcc 540

tcgcaatccg tgtcatccaa cctggcctgg taccagcaga agccaggaca ggcgccccgc 600

ctgattatct acggcgccag caccaccgcg agcggaattc cggcccggtt ttccgcctcc 660

ggttcgggaa ctgacttcac gctgactatc agcagcctgc aatcggagga cttcgccgtc 720

tactactgcc agcagtataa caactggccc ccggcttaca cgtttggcca gggaactaag 780

ctggagatca aggagcccaa aagctgcgac aagacccaca cttgcccacc ttgtccggac 840

ccgaaggggg gaaccgtgct cctgctgctg ttcgtgatct ccatcaccac aatcatcgtg 900

atcttcctga accgccggcg aagacgcgaa agacgcgatc tgttcaccga gtcatgggac 960

acccagaagg cccctaacaa ctacagaagc ccgatcagca ccagccagcc tactaatcag 1020

tcgatggatg atacccgcga ggacatctac gtgaattacc caaccttctc ccggcggccg 1080

aaaacccgcg tgtgaacgcg t 1101

<210> 116

<211> 1254

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> (核酸) hIgG重链信号序列/scFV 3-17I/hIgG1

铰链/CD226 TMD/ CD3zeta

<400> 116

atggactgga tctggagaat tttgttcctt gtcggtgctg ccactggagc ccactcgcaa 60

gtgcagctcg tgcagtctgg agcagaagtc aagaagcctg ggtcctcggt caaagtgtcc 120

tgcaaagcct ccgggggcac tttcagctcg tacgcaatct cctgggtccg ccaagcgccc 180

ggacagggtc tggagtggat gggcgggatt atccccattt tcggcaccgc caactatgct 240

caaaagttcc agggccgcgt gactattacc gcggacgagt caacctccac tgcgtacatg 300

gaactgagct cacttcggtc cgaggacacc gccgtctatt actgtgcgcg gggactcctg 360

tggaactact ggggacaagg caccctcgtg accgtgtcct cgaagctgtc cgggtcggcc 420

agcgccccca agttggaaga gggcgaattc tccgaggccc gggtggaaat cgtgatgacc 480

cagtccccgg ccactctctc cgtgtccccg ggagaaaggg cgaccctgtc atgccgggcc 540

tcgcaatccg tgtcatccaa cctggcctgg taccagcaga agccaggaca ggcgccccgc 600

ctgattatct acggcgccag caccaccgcg agcggaattc cggcccggtt ttccgcctcc 660

ggttcgggaa ctgacttcac gctgactatc agcagcctgc aatcggagga cttcgccgtc 720

tactactgcc agcagtataa caactggccc ccggcttaca cgtttggcca gggaactaag 780

ctggagatca aggagcccaa aagctgcgac aagacccaca cttgcccacc ttgtccggac 840

ccgaaggggg gaaccgtgct cctgctgctg ttcgtgatct ccatcaccac aatcatcgtg 900

atcttcctgc gcgtgaagtt cagccggagc gctgatgccc ctgcatacca gcaggggcag 960

aaccagctct acaacgaact gaaccttgga cggcgggagg aatacgatgt gctggataag 1020

cgaagaggcc gcgacccaga aatgggcggg aagcccagac gcaagaatcc tcaggaggga 1080

ctgtacaacg agctccagaa agacaagatg gccgaagcgt acagcgagat cggcatgaag 1140

ggggaacgga gaaggggaaa gggccatgac ggattgtacc agggcctgtc gaccgctacc 1200

aaagacacct acgacgccct ccatatgcaa gcactgccgc cacgctgaac gcgt 1254

<210> 117

<211> 1437

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> (核酸) hIgG重链信号序列/scFV 3-17I/hIgG1

铰链/CD226 TMD/CD226 ICD v1/CD3zeta

<400> 117

atggactgga tctggagaat tttgttcctt gtcggtgctg ccactggagc ccactcgcaa 60

gtgcagctcg tgcagtctgg agcagaagtc aagaagcctg ggtcctcggt caaagtgtcc 120

tgcaaagcct ccgggggcac tttcagctcg tacgcaatct cctgggtccg ccaagcgccc 180

ggacagggtc tggagtggat gggcgggatt atccccattt tcggcaccgc caactatgct 240

caaaagttcc agggccgcgt gactattacc gcggacgagt caacctccac tgcgtacatg 300

gaactgagct cacttcggtc cgaggacacc gccgtctatt actgtgcgcg gggactcctg 360

tggaactact ggggacaagg caccctcgtg accgtgtcct cgaagctgtc cgggtcggcc 420

agcgccccca agttggaaga gggcgaattc tccgaggccc gggtggaaat cgtgatgacc 480

cagtccccgg ccactctctc cgtgtccccg ggagaaaggg cgaccctgtc atgccgggcc 540

tcgcaatccg tgtcatccaa cctggcctgg taccagcaga agccaggaca ggcgccccgc 600

ctgattatct acggcgccag caccaccgcg agcggaattc cggcccggtt ttccgcctcc 660

ggttcgggaa ctgacttcac gctgactatc agcagcctgc aatcggagga cttcgccgtc 720

tactactgcc agcagtataa caactggccc ccggcttaca cgtttggcca gggaactaag 780

ctggagatca aggagcccaa aagctgcgac aagacccaca cttgcccacc ttgtccggac 840

ccgaaggggg gaaccgtgct cctgctgctg ttcgtgatct ccatcaccac aatcatcgtg 900

atcttcctga accgccggcg aagacgcgaa agacgcgatc tgttcaccga gtcatgggac 960

acccagaagg cccctaacaa ctacagaagc ccgatcagca ccagccagcc tactaatcag 1020

tcgatggatg atacccgcga ggacatctac gtgaattacc caaccttctc ccggcggccg 1080

aaaacccgcg tgcgcgtgaa gttcagccgg agcgctgatg cccctgcata ccagcagggg 1140

cagaaccagc tctacaacga actgaacctt ggacggcggg aggaatacga tgtgctggat 1200

aagcgaagag gccgcgaccc agaaatgggc gggaagccca gacgcaagaa tcctcaggag 1260

ggactgtaca acgagctcca gaaagacaag atggccgaag cgtacagcga gatcggcatg 1320

aagggggaac ggagaagggg aaagggccat gacggattgt accagggcct gtcgaccgct 1380

accaaagaca cctacgacgc cctccatatg caagcactgc cgccacgctg aacgcgt 1437

<210> 118

<211> 518

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> hIgG重链信号序列/scFV GC33/hIgG1铰链/CD28

TMD/41BB/CD3zeta /CD226 ICD v1

<400> 118

Met Asp Trp Ile Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Gly Ala Ala Thr Gly

1 5 10 15

Ala His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Asp Tyr Glu Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu

50 55 60

Lys Trp Ile Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser

65 70 75 80

Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

115 120 125

Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu

145 150 155 160

Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln

165 170 175

Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln

180 185 190

Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg

195 200 205

Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

210 215 220

Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr

225 230 235 240

Phe Cys Ser Gln Asn Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr

245 250 255

Lys Leu Glu Ile Lys Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys

260 265 270

Pro Pro Cys Pro Asp Pro Lys Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly

275 280 285

Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Lys

290 295 300

Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg

305 310 315 320

Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro

325 330 335

Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser

340 345 350

Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu

355 360 365

Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg

370 375 380

Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln

385 390 395 400

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Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp

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Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala

435 440 445

Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Asn Arg Arg Arg Arg Arg Glu

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Asn Tyr Arg Ser Pro Ile Ser Thr Ser Gln Pro Thr Asn Gln Ser Met

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<210> 119

<211> 518

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> hIgG重链信号序列/scFV GC33/hIgG1铰链/CD28

TMD/41BB/CD226 ICD v1/CD3zeta

<400> 119

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Arg Pro Lys Thr Arg Val Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala

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Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp

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450 455 460

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465 470 475 480

Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr

485 490 495

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500 505 510

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515

<210> 120

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> hIgG重链信号序列/scFV GC33/hIgG1铰链/CD226

TMD/CD226 ICD v1

<400> 120

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<211> 499

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> scFV GC33/hIgG1铰链/CD28 TMD/41BB/CD3zeta /CD226 ICD v1

<400> 121

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Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly

180 185 190

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195 200 205

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Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln

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Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala

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Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr

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<210> 122

<211> 499

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> scFV GC33/hIgG1铰链/CD28 TMD/41BB/CD226 ICD v1/CD3zeta

<400> 122

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Glu Gly Gly Cys Glu Leu Asn Arg Arg Arg Arg Arg Glu Arg Arg Asp

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Leu Phe Thr Glu Ser Trp Asp Thr Gln Lys Ala Pro Asn Asn Tyr Arg

340 345 350

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370 375 380

Thr Arg Val Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr

385 390 395 400

Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg

405 410 415

Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met

420 425 430

Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu

435 440 445

Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys

450 455 460

Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu

465 470 475 480

Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu

485 490 495

Pro Pro Arg

<210> 123

<211> 342

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> scFV GC33/hIgG1铰链/CD226 TMD/CD226 ICD v1

<400> 123

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

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Glu Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu Lys Trp Ile

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Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val

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His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly

165 170 175

Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly

180 185 190

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195 200 205

Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser

210 215 220

Gln Asn Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu

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Ile Lys Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

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Pro Asp Pro Lys Gly Gly Thr Val Leu Leu Leu Leu Phe Val Ile Ser

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Ile Thr Thr Ile Ile Val Ile Phe Leu Asn Arg Arg Arg Arg Arg Glu

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Arg Arg Asp Leu Phe Thr Glu Ser Trp Asp Thr Gln Lys Ala Pro Asn

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Asn Tyr Arg Ser Pro Ile Ser Thr Ser Gln Pro Thr Asn Gln Ser Met

305 310 315 320

Asp Asp Thr Arg Glu Asp Ile Tyr Val Asn Tyr Pro Thr Phe Ser Arg

325 330 335

Arg Pro Lys Thr Arg Val

340

<210> 124

<211> 1554

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> (核酸) hIgG重链信号序列/scFV GC33/hIgG1

铰链/CD28 TMD/41BB/CD3zeta /CD226 ICD v1

<400> 124

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gtgcagctgc agcagagcgg cgcggaactg gtgcgcccgg gcgcgagcgt gaaactgagc 120

tgcaaagcga gcggctatac ctttaccgat tatgaaatgc attgggtgaa acagaccccg 180

gtgcatggcc tgaaatggat tggcgcgctg gatccgaaaa ccggcgatac cgcgtatagc 240

cagaaattta aaggcaaagc gaccctgacc gcggataaaa gcagcagcac cgcgtatatg 300

gaactgcgca gcctgaccag cgaagatagc gcggtgtatt attgcacccg cttttatagc 360

tatacctatt ggggccaggg caccctggtg accgtgagcg cgggcggcgg cggcagcggc 420

ggcggcggca gcggcggcgg cggcagcgat gtggtgatga cccagacccc gctgagcctg 480

ccggtgagcc tgggcgatca ggcgagcatt agctgccgca gcagccagag cctggtgcat 540

agcaacggca acacctatct gcattggtat ctgcagaaac cgggccagag cccgaaactg 600

ctgatttata aagtgagcaa ccgctttagc ggcgtgccgg atcgctttag cggcagcggc 660

agcggcaccg attttaccct gaaaattagc cgcgtggaag cggaagatct gggcgtgtat 720

ttttgcagcc agaacaccca tgtgccgccg acctttggca gcggcaccaa actggaaatt 780

aaagaaccga aaagctgcga taaaacccat acctgcccgc cgtgcccgga tccgaaattt 840

tgggtgctgg tggtggtggg cggcgtgctg gcgtgctata gcctgctggt gaccgtggcg 900

tttattatta aacgcggccg caaaaaactg ctgtatattt ttaaacagcc gtttatgcgc 960

ccggtgcaga ccacccagga agaagatggc tgcagctgcc gctttccgga agaagaagaa 1020

ggcggctgcg aactgcgcgt gaaatttagc cgcagcgcgg atgcgccggc gtatcagcag 1080

ggccagaacc agctgtataa cgaactgaac ctgggccgcc gcgaagaata tgatgtgctg 1140

gataaacgcc gcggccgcga tccggaaatg ggcggcaaac cgcgccgcaa aaacccgcag 1200

gaaggcctgt ataacgaact gcagaaagat aaaatggcgg aagcgtatag cgaaattggc 1260

atgaaaggcg aacgccgccg cggcaaaggc catgatggcc tgtatcaggg cctgagcacc 1320

gcgaccaaag atacctatga tgcgctgcat atgcaggcgc tgccgccgcg caaccgccgc 1380

cgccgccgcg aacgccgcga tctgtttacc gaaagctggg atacccagaa agcgccgaac 1440

aactatcgca gcccgattag caccagccag ccgaccaacc agagcatgga tgatacccgc 1500

gaagatattt atgtgaacta tccgaccttt agccgccgcc cgaaaacccg cgtg 1554

<210> 125

<211> 1554

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> (核酸) hIgG重链信号序列/scFV GC33/hIgG1

铰链/CD28 TMD/41BB/CD226 ICD v1/CD3zeta

<400> 125

atggattgga tttggcgcat tctgtttctg gtgggcgcgg cgaccggcgc gcatagccag 60

gtgcagctgc agcagagcgg cgcggaactg gtgcgcccgg gcgcgagcgt gaaactgagc 120

tgcaaagcga gcggctatac ctttaccgat tatgaaatgc attgggtgaa acagaccccg 180

gtgcatggcc tgaaatggat tggcgcgctg gatccgaaaa ccggcgatac cgcgtatagc 240

cagaaattta aaggcaaagc gaccctgacc gcggataaaa gcagcagcac cgcgtatatg 300

gaactgcgca gcctgaccag cgaagatagc gcggtgtatt attgcacccg cttttatagc 360

tatacctatt ggggccaggg caccctggtg accgtgagcg cgggcggcgg cggcagcggc 420

ggcggcggca gcggcggcgg cggcagcgat gtggtgatga cccagacccc gctgagcctg 480

ccggtgagcc tgggcgatca ggcgagcatt agctgccgca gcagccagag cctggtgcat 540

agcaacggca acacctatct gcattggtat ctgcagaaac cgggccagag cccgaaactg 600

ctgatttata aagtgagcaa ccgctttagc ggcgtgccgg atcgctttag cggcagcggc 660

agcggcaccg attttaccct gaaaattagc cgcgtggaag cggaagatct gggcgtgtat 720

ttttgcagcc agaacaccca tgtgccgccg acctttggca gcggcaccaa actggaaatt 780

aaagaaccga aaagctgcga taaaacccat acctgcccgc cgtgcccgga tccgaaattt 840

tgggtgctgg tggtggtggg cggcgtgctg gcgtgctata gcctgctggt gaccgtggcg 900

tttattatta aacgcggccg caaaaaactg ctgtatattt ttaaacagcc gtttatgcgc 960

ccggtgcaga ccacccagga agaagatggc tgcagctgcc gctttccgga agaagaagaa 1020

ggcggctgcg aactgaaccg ccgccgccgc cgcgaacgcc gcgatctgtt taccgaaagc 1080

tgggataccc agaaagcgcc gaacaactat cgcagcccga ttagcaccag ccagccgacc 1140

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cgcccgaaaa cccgcgtgcg cgtgaaattt agccgcagcg cggatgcgcc ggcgtatcag 1260

cagggccaga accagctgta taacgaactg aacctgggcc gccgcgaaga atatgatgtg 1320

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caggaaggcc tgtataacga actgcagaaa gataaaatgg cggaagcgta tagcgaaatt 1440

ggcatgaaag gcgaacgccg ccgcggcaaa ggccatgatg gcctgtatca gggcctgagc 1500

accgcgacca aagataccta tgatgcgctg catatgcagg cgctgccgcc gcgc 1554

<210> 126

<211> 1083

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> (核酸) hIgG重链信号序列/scFV GC33/hIgG1

铰链/CD226 TMD/CD226 ICD v1

<400> 126

atggattgga tttggcgcat tctgtttctg gtgggcgcgg cgaccggcgc gcatagccag 60

gtgcagctgc agcagagcgg cgcggaactg gtgcgcccgg gcgcgagcgt gaaactgagc 120

tgcaaagcga gcggctatac ctttaccgat tatgaaatgc attgggtgaa acagaccccg 180

gtgcatggcc tgaaatggat tggcgcgctg gatccgaaaa ccggcgatac cgcgtatagc 240

cagaaattta aaggcaaagc gaccctgacc gcggataaaa gcagcagcac cgcgtatatg 300

gaactgcgca gcctgaccag cgaagatagc gcggtgtatt attgcacccg cttttatagc 360

tatacctatt ggggccaggg caccctggtg accgtgagcg cgggcggcgg cggcagcggc 420

ggcggcggca gcggcggcgg cggcagcgat gtggtgatga cccagacccc gctgagcctg 480

ccggtgagcc tgggcgatca ggcgagcatt agctgccgca gcagccagag cctggtgcat 540

agcaacggca acacctatct gcattggtat ctgcagaaac cgggccagag cccgaaactg 600

ctgatttata aagtgagcaa ccgctttagc ggcgtgccgg atcgctttag cggcagcggc 660

agcggcaccg attttaccct gaaaattagc cgcgtggaag cggaagatct gggcgtgtat 720

ttttgcagcc agaacaccca tgtgccgccg acctttggca gcggcaccaa actggaaatt 780

aaagaaccga aaagctgcga taaaacccat acctgcccgc cgtgcccgga tccgaaaggc 840

ggcaccgtgc tgctgctgct gtttgtgatt agcattacca ccattattgt gatttttctg 900

aaccgccgcc gccgccgcga acgccgcgat ctgtttaccg aaagctggga tacccagaaa 960

gcgccgaaca actatcgcag cccgattagc accagccagc cgaccaacca gagcatggat 1020

gatacccgcg aagatattta tgtgaactat ccgaccttta gccgccgccc gaaaacccgc 1080

gtg 1083

Claims

1.一种嵌合抗原受体(CAR)，其特征在于，包含一个共刺激序列，所述共刺激序列是或衍生自CD226的细胞内结构域或其片段。

2.如权利要求1所述的CAR，其特征在于，所述是或衍生自CD226的细胞内结构域或其片段的共刺激序列包含或由以下氨基酸序列组成：与SEQ ID NO：16、58或59所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。

3.如权利要求1或2中所述的CAR，其特征在于，所述CAR还包含一个共刺激序列，所述共刺激序列包含或由以下氨基酸序列组成：是或衍生自CD28的细胞内结构域的氨基酸序列。

4.如权利要求1-3中任一所述的CAR，其特征在于，所述CAR还包含共刺激序列，所述共刺激序列包含或由以下氨基酸序列组成：是或衍生自4-1BB的细胞内结构域的氨基酸序列。

5.如权利要求1-4中任一所述的CAR，其特征在于，所述CAR包含共刺激序列，所述共刺激序列包含或由以下氨基酸序列组成：与SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。

6.如权利要求1-5中任一所述的CAR，其特征在于，所述CAR包含共刺激序列，所述共刺激序列包含或由以下氨基酸序列组成：与SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。

7.如权利要求1至6中任一所述的CAR，其特征在于，所述CAR还包含二聚化结构域。

8.如权利要求7所述的CAR，其特征在于，所述二聚化结构域是诱导型二聚化结构域。

9.如权利要求7或8所述的CAR，其特征在于，所述二聚化结构域包含或由以下氨基酸序列组成：与SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。

10.如权利要求1-9中任一所述的CAR，其特征在于，所述CAR还包含跨膜结构域，所述跨膜结构域包含或由以下氨基酸序列组成：是或衍生自CD28、CD8α或CD226的跨膜结构域的氨基酸序列。

11.如权利要求1-10中任一所述的CAR，其特征在于，所述CAR包含跨膜结构域，所述跨膜结构域包含或由以下氨基酸序列组成：与SEQ ID NO：11、10或57所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。

12.如权利要求1-11中任一所述的CAR，其特征在于，所述CAR还包含铰链区，所述铰链区是或衍生自人IgG1铰链区。

13.如权利要求12中所述的CAR，其特征在于，所述铰链区包含或由以下氨基酸序列组成：与SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。

14.如权利要求1-13中任一所示的CAR，其特征在于，所述CAR包含抗原结合结构域,所述抗原结合结构域包括：

15.如权利要求1-13中任一所示的CAR，其特征在于，所述CAR包含抗原结合结构域,所述抗原结合结构域包括：

16.一种嵌合抗原受体(CAR),其特征在于，所述嵌合抗原受体(CAR)如表1的A、B、C、D、E、F、G或H、I、J、K、L或M中的任一所示，或如表3的V、W、X、Z、AA、BB、CC、DD、EE、FF、GG、HH、II、JJ、KK、LL或MM中的任一所示。

17.一种嵌合抗原受体(CAR),其特征在于，所述嵌合抗原受体包含或由以下氨基酸序列组成：与SEQ ID NO：22、23、24、25、26、27、28、29、38、39、40、41、42、81、83、84、85、86、88、89、90、92、93、94、95、96、97或98所示的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的氨基酸序列。

18.一种嵌合抗原受体(CAR),其特征在于，所述嵌合抗原受体包含或由以下氨基酸序列组成：与SEQ ID NO：30、31、32、33、34、35、36、37、43、44、45、46、47、62、64、65、66、67、69、70、71、73、74、75、76、77、78或79所示的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的氨基酸序列。

19.一种核酸，其特征在于，所述核酸编码如权利要求1-18中任一所述的嵌合抗原受体(CAR)。

20.一种载体，其特征在于，包含如权利要求19所述的核酸。

21.一种细胞，其特征在于，所述细胞包含如权利要求1-18中任一所述的嵌合抗原受体(CAR)、如权利要求19所述的核酸、或如权利要求20所述的载体。

22.一种制备表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞的方法，其特征在于，包括将如权利要求19所述的核酸或如权利要求20所述的载体导入细胞，并在适合细胞表达所述核酸或载体的条件下培养细胞。

23.一种细胞，其特征在于，所述细胞通过如权利要求22所述的方法获得或可获得。

24.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含如权利要求1-18中任一所述的嵌合抗原受体(CAR)、权利要求19所述的核酸、权利要求20所述的载体，或权利要求21或23所述的细胞，以及药学上可接受的载体、佐剂、赋形剂或稀释剂。

25.如权利要求1-18中任一所述的嵌合抗原受体(CAR)、权利要求19所述的核酸、权利要求20所述的载体、或权利要求21或23所述的细胞、或权利要求24所述的药物组合物，其特征在于，用于治疗或预防疾病或病症的方法中。

26.如权利要求1-18中任一所述的嵌合抗原受体(CAR)、权利要求19所述的核酸、权利要求20所述的载体、或权利要求21或23所述的细胞、或权利要求24所述的药物组合物的用途，其特征在于，用于制备用于治疗或预防疾病或病症的药物。

27.一种治疗或预防疾病或病症的方法，其特征在于，包括向受试者施用治疗或预防有效量的如权利要求1-18中任一所述的嵌合抗原受体(CAR)、权利要求19所述的核酸、权利要求20所述的载体、或权利要求21或23所述的细胞、或权利要求24所述的药物组合物。

28.一种治疗或预防受试者的疾病或病症的方法，其特征在于，包括：

(a)从受试者中分离至少一个T细胞；

(b)修饰所述至少一个T细胞以表达或包含如权利要求1-18中任一所述的嵌合抗原受体(CAR)、权利要求19所述的核酸、权利要求20所述的载体，和；

(c)向受试者施用所述修饰的至少一个T细胞。

29.一种治疗或预防受试者的疾病或病症的方法，其特征在于，包括：

(a)从受试者中分离至少一个T细胞；

(b)将如权利要求19所述的核酸或权利要求20所述的载体导入所述至少一个T细胞，从而修饰所述至少一个T细胞；

(c)向受试者施用所述修饰的至少一个T细胞。

30.如权利要求25所述应用的CAR、核酸、载体、细胞或药物组合物，如权利要求26所述的用途，或如权利要求27-29中任一所述的方法，其特征在于，所述疾病或病症是癌症。

31.如权利要求30所述应用的CAR、核酸、载体、细胞或药物组合物、用途或方法，其特征在于，所述癌症是表达GPC3的癌症或表达EpCAM的癌症。

32.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含预定量的如权利要求1-18中任一所述的嵌合抗原受体(CAR)、权利要求19所述的核酸、权利要求20所述的载体、或权利要求21或23所述的细胞、或权利要求24所述的药物组合物。