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Die vorliegende Erfindung betrifft 3-Aryl- und 3-Heteroaryl-1,2,4-Oxadiazole, die insbesondere Cannabinoid-Rezeptor-Liganden sind und als diagnostische und therapeutische Mittel eingesetzt werden können, insbesondere bei neurologischen, neurodegenerativen und psychiatrischem Erkrankungen, sowie in Verfahren zu deren Herstellung. Die Liganden eignen sich insbesondere als Radiodiagnostika zum Nachweis von Cannabinoid-Rezeptor mittels Positronen-Emissions-Tomographie (PET).
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Das Endocannabinoid-System besteht aus den Cannabinoid-Rezeptoren CB1 und CB2 sowie dem vorgeschlagenen GPR55 (Evens und Bormans 2010, Curr Top Med Chem 10: 1527–1543) und ihren natürlichen Liganden, sowie den nachgeschalteten intrazellulären Signalverarbeitungs- und Effektormechanismen.
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Im Stand der Technik sind drei Cannabinoid-Rezeptoren beschrieben, welche verschiedene Ionenkanäle modulieren und verschiedene Signalwege innerhalb der Zelle beeinflussen. Der Cannabinoid-Rezeptor-1 (CB1-Rezeptor) findet sich vorwiegend in Nervenzellen. Am häufigsten kommt er im Kleinhirn, in den Basalganglien sowie im Hippokampus vor. Der Cannabinoid-Rezeptor-2 (CB2-Rezeptor) findet sich dagegen vorwiegend auf Zellen des Immunsystems und auf Zellen, die am Knochenauf- (Osteoblasten) und -abbau (Osteoklasten) beteiligt sind.
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N-Arylamidoxadiazole sind als wirksame, hoch selektive CB2-Rezeptor-Agonisten beschrieben. Die mehrstufige Synthese der N-Arylamidoxadiazole erfolgt beispielsweise über die Reaktion eines kommerziell erhältlichen oder synthetisierten Nitrils mit Hydoxylamin zum Amidoxim. Dieses wird mittels Succinimid zur Oxadiazolsäure umgesetzt, welches in einer Kupplungsreaktion mit einem Amin zum N-Arylamidoxadiazol umgesetzt wird. (Cheng Y et. al. J. Med. Chem. 51, 5019–5034, (2008)). Cheng beschreibt die Synthese von 3-(3-(2-Chloro-4-fluorophenyl)-1,2,4-oxadiazolen über den oben erläuterten Syntheseweg. Diese Syntheseroute eignet sich jedoch aufgrund der kurzen Halbwertszeit von 18F nicht zur Herstellung der korrespondierenden 18F-markierten Verbindungen.
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Substituierte Oxadiazole sind als Opioid-Rezeptorliganden in
US 2009/0005427 A1 offenbart.
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Substituierte Pyrazole, 1,2,4-Oxadiazole, und 1,3,4-Oxadiazole, die sich für die Diagnose und Therapie von Alzheimererkrankungen eignen, sind in
WO 2009/146343 A1 beschrieben.
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Um die Prozesse des Endocannabinoid-Systems und die möglichen Effekte einer Cannabinoid Therapie besser zu verstehen, sind Untersuchungen bezüglich der Funktion der beiden Cannabinoid-Rezeptoren notwendig.
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Die Positronen-Emissions-Tomographie (PET) eignet sich als bildgebendes Verfahren zur Abbildung biochemischer und physiologischer Funktionen, indem es die Verteilung von Radiodiagnostika im Organismus sichtbar macht Verschiedene Radiodiagnostika zur Abbildung des CB1-Rezeptors im menschlichen Körper sind bereits bekannt. Der aktuelle Stand wird von Horti und Van Laere in einem Übersichtsartikel (Curr Pharm Des. 2008; 14: 3363–83) zusammengefasst.
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Bezüglich des CB2-Rezeptors sieht die Situation jedoch anders aus. Bis heute war die in vivo-Abbildung der CB2-Rezeptoren mittels 18F-markierter Radiodiagnostika nicht erfolgreich, obwohl einige Kandidatenverbindungen dazu synthetisiert wurden. [11C]Methoxy-Sch225336 (Evens et al. 2008. Nucl Med Biol. 35 (7): 793–800) zeigt eine 17-mal höhere Affinität am CB2-Rezeptor (4,5 nmol/L), als am CB1-Rezeptor (78,5 nmol/L), jedoch eine geringe Aufnahme im Gehirn. Ein anderer Ansatz der gleichen Arbeitsgruppe führte zu einem 11C- und einem 18F-markierten 2-Oxoquinolin-Derivat, von denen jedoch nur das 11C-markierte Derivativ eine ausreichende Affinität (9,6 nmol/L) zum CB2-Rezeptor zeigte (Evens et al. 2009. Nucl Med Biol. 36 (4): 455–65). 11C-markierte Radiodiagnostika eignen sich jedoch aufgrund der kurzen Halbwertszeit von 20,4 min des Radionuklids 11C deutlich schlechter zur PET als 18F-markierter Radiodiagnostika.
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Der Stand der Technik zum Imaging des CB2-Rezeptors wird in Evens und Bormans 2010 (Curr Top Med Chem 10: 1527–1543) zusammengefasst. Aktuelle Ansätze zur Optimierung der Wirksamkeit, Selektivität und der physiochemischen Eigenschaften von CB2-Agonisten werden in einem Übersichtsartikel von Worm und Dolle (Curr Pharm Des 2009; 15: 3345–3366) beschrieben.
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Das radioaktive Isotop 18F des Fluor ist aufgrund seiner vorteilhaften physikalischen und chemischen Eigenschaften eines der meist verwendeten Radionuklide in der PET.
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18Fluor markierte Radiodiagnostika werden häufig mittels nukleophiler aromatischer Substitution synthetisiert, da aromatische Ringe häufige Struktureinheiten in bioaktiven Molekülen darstellen. Die 18Fluor-Markierung benzylischer Verbindungen setzt nach Lehrbuchmeinung eine stark elektronenziehende Gruppe in Ortho- oder Parastellung zur Abgangsgruppe voraus.
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Constantinou M et. al. (J Label Comp Radiopharm 44 (Suppl. 1), S889–S891 (2001)) beschreiben die 18Fluor-Markierung von meta-substituierten Nitrobenzolen und Guo et. al. (Appl Radiat Isot, 66 (10), 1396–1402, 2008) die 18Fluor-Markierung von meta-Halo-benzonitril Derivaten. Nachteilig haben Constantinou et al. bei der 18Fluor-Markierung von 1-Brom-3-nitrobenzen neben der Bildung des Zielproduktes [18F]1-Brom-3-fluorbenzen die Bildung von [18F]1-Fluor-3-nitrobenzen beobachtet.
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Aufgabe der Erfindung ist es, Radiodiagnostika mit 18F-markierter 3-Aryl- oder 3-Heteroaryl-1,2,4-oxadiazoleinheit und neue pharmakologische Wirkstoffe, insbesondere als Cannabinoid-Rezeptor-Liganden mit hoher Selektivität für den CB2-Rezeptor, insbesondere den humanen CB2-Rezeptor, und ein Verfahren zu deren Herstellung, bereitzustellen.
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Ferner werden 3-Aryl- und 3-Heteroaryl-1,2,4-Oxadiazol-Derivate offenbart, welche sich zur Herstellung der Radiodiagnostika eignen, aber auch als pharmakologische Wirkstoffe verwendet werden können.
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Erfindungsgemäß wird die Aufgabe in einem ersten Aspekt gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formeln (I) und (II)
ausgehend von den Verbindungen der allgemeinen Formeln (III) oder (IV)
durch nucleophile aromatische Substitution unter Mikrowellenbedingungen mit [
18F]Fluorid. Dabei werden die Verbindungen der Formeln (I) ausgehend von den Verbindungen der Formel (III) und die Verbindungen der Formeln (II) ausgehend von den Verbindungen der Formel (IV) jeweils durch Substitution der X
2-Gruppe durch
18F erhalten.
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Diese nucleophile aromatische Substitution eines Aromaten oder Pyridin in 3-Position eines 1,2,4-Oxadiazolringes ist bisher im Stand der Technik nicht offenbart.
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Das neue Verfahren ermöglicht es vorteilhaft erstmals Radiodiagnostika gemäß Formel (I) und (II) in einer Einschritt- und Eintopf-Reaktion herzustellen.
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In den Formeln I und III steht X1 für eine elektronenziehende Gruppe. Elektronenziehende Gruppen können über eine σ-Bindung einen -I-Effekt, das heißt einen negativen induktiven Effekt, oder über eine π-Bindung einen -M-Effekt, d. h. negativen mesomeren Effekt, auf den Aromaten ausüben. Dadurch wird Elektronendichte von diesem abgezogen
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X1 ist bevorzugt eine Nitro-, Aldehyd-, Nitril-, Alkylester-, Phenylketon-, Fluor-, Fluorisotop-, Chlor-, Brom-, Iod- oder Trifluormethylgruppe, besonders bevorzugt ist eine Nitrilgruppe oder das Bromatom. Der Alkylrest im Alkylester ist bevorzugt ausgewählt aus C1- bis C3-Alkyl.
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X2 steht in den Formeln III und IV für ein Nucleofug. Als Nucleofug werden Substituenten oder Gruppen bezeichnet, die sich während der nucleophilen Reaktionen aus Molekülen unter Mitnahme des bindenden Elektronenpaars lösen. Bevorzugt ist X2 ausgewählt aus Nitro-, Fluor-, Chlor-, Brom-, Iod-, Trialkylammonium- und Phenyliodonium. Die Alkylreste in der Trialkylammonium-Gruppe sind bevorzugt unabhängig voneinander ausgewählt aus C1- bis C5-Alkyl, insbesondere C1- bis C3-Alkyl.
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R steht für einen monozyklischen, dicyclischen oder tricyclischen Rest, bevorzugt mit aromatischen, heterocyclischen und/oder heteroaromatischen Ringen (Cyclen). Umfasst sind Reste, in denen die einzelnen Cyclen anelliert oder isoliert, sowie substituiert oder unsubstituiert sind. Unter anellierten Ringe werden Ringe verstanden, die gemeinsame Atome – bevorzugt 2 gemeinsame Atome – besitzen. Unter isolierten Ringen werden Ringe verstanden, die keine gemeinsamen Atome besitzen, diese sind bevorzugt über Alkylketten miteinander verbunden.
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Besonders bevorzugt umfasst R mindestens zwei anellierte Ringe, wobei ein Ring mindestens ein Stickstoffatom, bevorzugt ein oder zwei Stickstoffatome, enthält.
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Bevorzugte R sind ausgewählt aus Carbazolen, Indolen, Quinolinen, Isooxazaxolen, insbesondere:
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Z steht für eine Alkyl-, Alkylether-, Alkenyl- oder Alkinylkette, die mit R über eine C-C Bindung oder eine funktionelle Gruppe verknüpft ist.
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Die funktionelle Gruppe zwischen R und Z ist bevorzugt eine Amin-, Ether-, Thioether-, Carbonsäureester-, Sulfonsäureester-, Urethan-, Harnstoff-, Thioharnstoff-, Carbonsäureamid- oder Sulfonsäureamidfunktion.
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Besonders bevorzugt ist R mit Z wie in der folgenden Formel dargestellt verknüpft:
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Die Alkyl-, Alkylether-, Alkenyl- oder Alkinylkette Z hat bevorzugt eine Kettenlänge von C1-C12, vorzugsweise C1-C8, insbesondere C1-C5, besonders bevorzugt C1-C3. Besonders bevorzugte Z sind ausgewählt aus -(CH2)n- mit n von 1 bis 5, bevorzugt 2, 3 oder 4.
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Die Erfindung stellt damit ein Verfahren zur Verfügung, mit dessen Hilfe Aromaten mit einer aktivierenden elektronenziehenden Gruppe mit –I Effekt in meta-Stellung zum Nucleofug und Pyridine, dessen Nucleofug orthoständig zum Ringstickstoff steht, durch nucleophile aromatische Substitution mit 18F-Fluorid markierbar sind, obwohl sie (vorzugsweise in para-Stellung zum Nucleofug) mit einem 1,2,4-Oxadiazolring substituiert sind. Da der 1,2,4-Oxadiazolring einen deaktivierenden elektronenschiebenden +I Effekt auf den Aromaten oder Pyridin ausübt, war zu erwarten, dass die nucleophile aromatische Substitution mit [18F]Fluorid nicht zum Erfolg führt und 18F-markierte 3-Aryl- und 3-Pyridyl-1,2,4-oxadiazole nicht darstellbar sind. Überraschend gelang es erstmalig durch Mikrowellenbestrahlung, 18F-markierte 3-Aryl-1,2,4-oxadiazole aus entsprechenden Präkursoren mit einer elektronenziehenden Gruppe mit –I Effekt in meta-Stellung zum Nucleofug und Pyridinderivaten, deren Nucleofug ortho-ständig zum Ringstickstoff steht, durch nucleophile aromatische Substitution mit 18F-Fluorid herzustellen.
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Unter Mikrowellenbedingungen wird die Gegenwart von elektromagnetischer Strahlung im Frequenzbereich von 300 MHz bis 300 GHz, bevorzugt 500 MHz bis 10 GHz, insbesondere 896 MHz bis 2,45 GHz verstanden. Die Leistung des Mikrowellengeräts (z. B. Ofen oder Synthesizer) liegt bevorzugt im Bereich 20 W bis 1000 W, besonders bevorzugt 50 W bis 150 W. Die Bestrahlung mit Mikrowellen erfolgt bevorzugt in einem geschlossenen Behälter. Die Bestrahlung mit Mikrowellen erfolgt kontinuierlich oder bevorzugt in Intervallen, bevorzugt in 5 bis 15 Intervallen mit einer Länge von jeweils 15 Sekunden bis 100 Sekunden.
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Die Umsetzung unter Bestrahlung mit Mikrowellen erfolgt bevorzugt in einem Temperaturbereich zwischen 20°C bis 300°C, bevorzugt 20°C bis 150°C, besonders bevorzugt 30°C bis 130°C.
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Im Falle der Bestrahlung in Intervallen erfolgt zwischen den einzelnen Mikrowellen-Bestrahlungs-Intervallen bevorzugt eine Kühlung auf 0 bis 25°C.
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Besonders bevorzugt erfolgt die Umsetzung, indem zunächst die Reaktionsmischung 3 bis 10 mal für 15 bis 40 Sekunden bei 50 bis 100 W Mikrowellenbestrahlung auf 35 bis 80°C erhitzt wird, die Reaktionsmischung auf 0 bis 25°C gekühlt wird und anschließend 1 bis 5 mal für 10 bis 100 Sekunden bei 100 bis 200 W Mikrowellenbestrahlung auf 35 bis 80°C erhitzt wird.
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Sofern X2 eine NO2-Gruppe ist, erfolgt bevorzugt nach Abkühlung eine Zugabe eines Reduktionsmittels und erneut eine Mikrowellenbestrahlung, bevorzugt wird dazu die Reaktionsmischung 2 bis 5 mal für vorzugsweise 20 bis 100 Sekunden bei bevorzugt 100 bis 200 W auf bevorzugte 100 bis 150°C erhitzt. Als Reduktionsmittel wird bevorzugt ein Zinnsalz, besonders bevorzugt SnCl2, bevorzugt in 3 bis 15 Moläquivalenten (bezogen auf die Verbindung der allgemeinen Formeln (3) bzw. (4)) eingesetzt.
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Bevorzugt erfolgt die Umsetzung der Verbindungen der allgemeinen Formeln (3) und (4) unter basischen Bedingungen, bevorzugt bei pH 9 bis 14. Bevorzugt dient als Base ein Carbonat-, ein Hydrogencarbonat-, ein Hydrid-, ein Hydroxid-Ion oder eine organische Base. Bevorzugt wird die Base in einer Konzentration von 2 bis 10 μmol/GBq eingesetzt.
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Die Umsetzung erfolgt bevorzugt in einem dipolaren aprotischen Lösungsmittel beziehungsweise in einem Lösungsmittelgemisch. Das Lösungsmittel- bzw. Lösungsmittelgemisch ist vorzugweise getrocknet.
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Bevorzugt liegt das Gegenion (meist K+) des radioaktiven 18F-Fluorids im erfindungsgemäßen Verfahren in einer Komplexverbindung vor.
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Bevorzugt wird der Komplex durch einen Kronenether oder Kryptand, das heißt ein bi- oder polycyclischer multidentaler Ligand, gebildet. Ein besonders bevorzugter Kryptand ist K2.2.2. (4,7,13,16,21,24-Hexaoxa-1,10-diazabicyclo[8.8.8]hexacosane, CAS Nr. 23978-09-8). Bevorzugt wird der Kryptand in einer Konzentration von 5 bis 15 μmol/GBq eingesetzt.
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Die 18Fluor-Markierung benzylischer Verbindungen setzt nach Lehrbuchmeinung eine stark elektronenziehende Gruppe in Ortho- oder Parastellung zur Abgangsgruppe und die Abwesenheit elektronenschiebender Gruppen am Aromaten oder Heteroaromaten voraus.
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Völlig unerwartet wurde bei der 18F-Markierung eines Aromaten mit einer zum 1,2,4-Oxadiazolring para-ständigen Nucleofug X2 (bevorzugt eine Nitrogruppe) und einer ortho-ständigen elektronenziehenden Gruppe X1 (bevorzugt Brom), die selektive Substitution der Position X2 gefunden. Die Substitution der Gruppe X1 (insbesondere mit X1 = Brom) wurde vorteilhafterweise im erfindungsgemäßen Verfahren nicht beobachtet.
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Vorteilhaft erfolgt die 18F-Markierung der 3-Aryl- und 3-Heteroaryl-1,2,4-oxadiazole nach dem erfindungsgemäßen Verfahren in einer Einschritt- bzw. Eintopfreaktion. Dementgegen beschreibt Cheng die Synthese von analogen nicht 18F-markierten 3-Aryl-1,2,4-oxadiazol-Derivaten mittels eines mehrstufigen Verfahrens, welches sich aufgrund der kurzen Halbwertszeit von 18F nicht zur Herstellung der korrespondierenden 18F-markierten Verbindungen eignet.
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Das neue Verfahren ermöglicht es, neue Radiodiagnostika herzustellen und deren funktionsabhängige Verteilung durch Positronen-Emissions-Tomographie im Organismus zu untersuchen. Dadurch ist es ebenfalls möglich, genaue Kenntnisse über die Wirkung der Referenzverbindungen zu gewinnen und neben den Radiodiagnostika, Zugang oder Bewertung zu weiteren Medikamenten zu erhalten.
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Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich insbesondere zur Herstellung der nachfolgenden radioaktiv markierten erfindungsgemäßen Verbindungen.
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Gegenstand der Erfindung sind auch Verbindungen gemäß der allgemeinen Formel (I) und (II):
sowie Verbindungen gemäß der allgemeinen Formel (III) und (IV):
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In den Formeln steht X1 für eine elektronenziehende Gruppe. X1 ist bevorzugt Fluor-, Fluorisotop-, Chlor- oder Iod, insbesondere Nitro-, Aldehyd-, Nitril-, Alkylester-, Phenylketon-, oder eine Trifluormethylgruppe. Besonders bevorzugt ist X1 eine Nitrilgruppe oder Brom.
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X2 steht für ein Nucleofug. Bevorzugt ist X2 ein Chlor-, Brom-, Iodatom oder eine Nitro-, Trialkylammonium-, NH2- oder eine Phenyliodoniumgruppe, weniger bevorzugt ist nicht radioaktives Fluor. Wenn X2 für F steht, ist X1 nicht Cl. Besonders bevorzugt ist X2 eine Nitro- oder Trialkylammoniumgruppe.
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R steht für einen monozyklischen, dicyclischen oder tricyclischen Rest, der bevorzugt wie oben definiert ausgewählt ist.
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Z steht für eine Alkyl-, Alkylether-, Alkenyl- oder Alkinylkette, die mit R über eine C-C Bindung oder eine funktionelle Gruppe verknüpft ist. Z und die funktionelle Gruppe zwischen R und Z sind bevorzugt wie oben definiert ausgewählt.
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Wenn X1 für F und X2 für F steht, sind R und Z über eine funktionelle Gruppe, d. h. nicht über eine unsubstituierte C-C-Bindung, verknüpft.
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Ausgenommenen ist die Verbindung nach Formel (V)
insbesondere mit nicht radioaktivem F.
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Bevorzugt sind Verbindungen, der Formeln (VI), (VII), (VIII) und (IX):
wobei X
1 und X
2, R und Z, sowie die funktionelle Gruppe (oder C-C Bindung) zwischen R und Z wie oben definiert sind. Bevorzugt sind Verbindungen mit X
1 ausgewählt aus Br, -CN, F und
18F und X
2 ausgewählt aus F, NO
2, NH
2 und Trialkylammonium-, besonders bevorzugt NO
2.
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Weiter bevorzugt sind Verbindungen der allgemeinen Formeln 1 bis 7:
wobei X
1 und X
2 wie oben definiert und ausgewählt sind und X
3 ausgewählt ist aus C und N.
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Bevorzugt sind Verbindungen, welche selektiv an den CB2-Rezeptor, insbesondere den humanen CB2-Rezeptor, binden und deren Bindung an den CB2-Rezeptor um Größenordnungen höher ist als an den CB1-Rezeptor.
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Die Affinität hängt insbesondere von der Substitution des Aromaten in 3-Position des 1,2,4 Oxadiazolringes ab. Die Affinität ist zudem vom Aromaten am N-Arylamidoxadiazol abhängig.
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Besonders bevorzugt sind daher Verbindungen nach den Formeln (X) und (XI)
wobei X
1 für Br, -CN, F oder
18F steht und wobei X
2 für F, NO
2 oder NH
2 steht. Diese Verbindungen zeigen vorteilhaft eine besonders hohe Affinität zum CB
2 Rezeptor (K
i hCB2 < 10 nM) und binden diesen besonders selektiv (K
i hCB1/K
i hCB2 > 100) an diesen.
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Bevorzugte Einzelverbindungen sind:
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Besonders bevorzugte Einzelverbindungen mit hoher Selektivität für den CB
2-Rezeptor sind:
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Gegenstand der Erfindung sind auch Salze, Solvate und Solvate der Salze der oben beschriebenen erfindungsgemäßen Verbindungen.
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Die vorliegende Erfindung umfasst auch die stereoisomeren Formen der erfindungsgemäßen Verbindungen, das heißt die Enantiomeren und/oder Diastereomeren und ihre jeweiligen Mischungen. Bei erfindungsgemäßen Verbindungen, die in tautomeren Formen vorkommen, umfasst die vorliegende Erfindung sämtliche tautomeren Formen.
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Bevorzugt sind physiologisch unbedenkliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen. Diese umfassen Salze von Carbonsäuren, Mineralsäuren, Hydroxycarbonsäuren und Sulfonsäuren, z. B. Salze der Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure, Schwefelsäure, Perchlorsäure, Methansulfonsäure, Toluolsulfonsäure, Benzolsulfonsäure, Naphthalindisulfonsäure, Ethansulfonsäure, Essigsäure, Trifluoressigsäure, Milchsäure, Weinsäure, Propionsäure, Äpfelsäure, Zitronensäure, Fumarsäure, Benzoesäure, Salicylsäure und Maleinsäure.
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Physiologisch unbedenkliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen umfassen auch Salze üblicher Basen, wie beispielhaft und vorzugsweise Alkalimetallsalze (z. B. Natriumsalze), Erdalkalisalze (z. B. Calcium- und Magnesiumsalze) und Ammoniumsalze, abgeleitet von Ammoniak oder organischen Aminen mit 1 bis 16 C-Atomen, wie beispielhaft und vorzugsweise Ethylamin, Diethylamin, Triethylamin, Ethyldiisopropylamin, Monoethanolamin, Diethanolamin, Triethanolamin, Dicyclohexylamin, Dimethylaminoethanol, Dibenzylamin, N-Methylmorpholin, Arginin, Lysin, Ethylendiamin und N-Methylpiperidin.
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Salze, welche für pharmazeutische Anwendungen selbst nicht geeignet sind, aber beispielsweise für die Isolierung oder Reinigung der erfindungsgemäßen Verbindungen verwendet werden können, sind ebenfalls umfasst.
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Solvate bezeichnen erfindungsgemäße Verbindungen in festem oder flüssigen Zustand, welche durch Koordination mit Molekülen des Lösungsmittels einen Komplex bilden. Bevorzugte Solvate sind die Hydrate, bei welchen die Komplexierung mit Wassermolekülen erfolgt.
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Außerdem umfasst die vorliegende Erfindung auch Verbindungen, welche selbst biologisch aktiv oder inaktiv sein können, jedoch während ihrer Verweilzeit im Körper, bevorzugt durch ein oder zwei enzymatische oder hydrolytische Schritte, zu den erfindungsgemäßen Verbindungen umgesetzt werden. Solche Verbindungen werden als Prodrugs bezeichnet.
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Die nicht-radioaktiven erfindungsgemäßen Verbindungen, insbesondere nach den Formeln (III), (IV), (VIII), (IX) und (XI), sind durch nucleophile aromatische Substitution mit 18F-Fluorid substituierbar, so dass nach dem erfindungsgemäßen Verfahren neue pharmakologische Wirkstoffe und Radiodiagnostika mit 18F-markierter 3-Aryl- und 3-Heteroaryl-1,2,4-oxadiazoleinheit erhalten werden. Die nicht-radioaktiven erfindungsgemäßen Verbindungen eignen sich somit als Ausgangsstoffe zur Herstellung der radioaktiven (18F-markierten) erfindungsgemäßen Verbindungen.
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Die radioaktiven erfindungsgemäßen Verbindungen, insbesondere gemäß Formel (I), (II), (VI), (VII) und (X), eignen sich insbesondere für die Detektion der Verteilung der Cannabinoid-Rezeptoren in Zellen, Gewebeschnitten und insbesondere durch Positronen-Emissions-Tomographie im Organismus, für Mikrodosierungsstudien, zur Indikation und Diagnose von Rezeptormodifikationen, Diagnose von neurologischen, neurodegenerativen und psychiatrischen Erkrankungen, sowie Erkrankungen oder Veränderungen der T-Zellen, B-Zellen, Monozyten aber auch des Pankreas, zur Detektion der Funktionalität des Immunsystems, Entzündungsreaktionen, sowie für die in viva- und in vitro-Autoradiographie. Dadurch ist es ebenfalls möglich, genaue Kenntnisse über die Wirkung anderer Cannabinoid-Rezeptorliganden, einschließlich der aus dem Stand der Technik bekannten Referenzverbindungen (CP55,940, SR141716A und SR144528) zu gewinnen und neben den Radiodiagnostika, Zugang und Bewertung zu weiteren Medikamenten zu erhalten.
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Die nicht-radioaktiven erfindungsgemäßen Verbindungen, insbesondere nach den Formeln (III), (IV), (VIII), (IX) und (XI), eignen sich sowohl als pharmakologische Wirkstoffe als auch zur Herstellung pharmakologischer Wirkstoffe und Radiodiagnostika mit 18F-markierter 3-Aryl- oder 3-Heteroaryl-1,2,4-oxadiazoleinheit durch nucleophile Substitution mit 18F-Fluorid. Des weiteren eignen sich die nicht-radioaktiven erfindungsgemäßen Verbindungen zur Therapie von neurologischen, neurodegenerativen und psychiatrischen Erkrankungen, sowie Erkrankungen oder Veränderungen der T-Zellen, B-Zellen, Monozyten aber auch des Pankreas, sowie zur Immunomodulation, Therapie von Entzündungsreaktionen sowie damit verbundenen Schmerzen, sowie zur Therapie von Neoplasien.
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Die vorliegende Erfindung umfasst auch ein Arzneimittel, welches mindestens eine erfindungsgemäße Verbindung, deren Salze oder Prodrugs als Wirkstoff enthält. Das Arzneimittel ist bevorzugt eine pharmazeutische Formulierung, welche neben dem Wirkstoff nicht toxische pharmazeutisch geeignete Hilfsstoffe enthält. Die Hilfsstoffe sind insbesondere feste, halbfeste oder flüssige Verdünnungsmittel und Füllstoffe, welche nicht toxisch und pharmazeutisch geeignet sind. Die vorliegende Erfindung umfasst auch pharmazeutische Formulierungen, welche neben mindestens einer erfindungsgemäßen Verbindung deren Salze oder Prodrugs zusätzlich noch weitere pharmakologisch aktive Verbindungen oder Wirkstoffe enthalten.
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Bevorzugte pharmazeutische Formulierungen sind Tabletten, Dragees, Kapseln, Pillen, Mikrokapseln, Granulat, Lösungen und Sprays. Gegebenenfalls sind zudem Zusätze zur gezielten Wirkstofffreisetzung enthalten, so dass der oder die Wirkstoffe in bestimmten Bereichen des Intestinaltraktes und/oder einer verzögerten Art und Weise, z. B. durch Anbindung und Eindringung an bzw. in polymere Substanzen (wie Polyethylenglykol) und Wachse freigesetzt werden.
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Anhand der folgenden Ausführungsbeispiele soll die Erfindung näher erläutert werden ohne die Erfindung auf diese zu beschränken.
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Folgende Verbindungen wurden hergestellt:
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Beispiel 1:
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2 mg 1f in 0,5 ml wasserfreiem N-N-Dimethylformamid werden unter diffusem Licht mit 787,0 MBq (11:22 Uhr) [18F]Fluorid, 11,3 μmol/GBq K2.2.2. (4,7,13,16,21,24-Hexaoxa-1,10-diazabicyclo[8.8.8]hexacosane, CAS Nr. 23978-09-8) und (4,9 μmol/GBq) K2CO3 in 1,5 ml (Gesamtvolumen) wasserfreiem N-N-Dimethylformamid versetzt. Daraufhin wird die Reaktionsmischung unter Argon im Mikrowellensynthesizer (Discover, CEM, Kamp-Lintfort, DE) in verschlossenen Behältern unter Pressluftkühlung 8 mal bei 75 W, 20 s lang auf 40°C erhitzt und auf 8°C abgekühlt und 3 mal bei 150 W, 20 s lang auf 70°C erhitzt und auf 9°C abgekühlt. Daraufhin wird zur Reaktionsmischung 7,8 mg (10 Mol-Äquivalente) SnCl2 gegeben und im Mikrowellensynthesizer 3 mal bei 150 W, 35 s lang auf 110°C erhitzt und auf 9°C abgekühlt.
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Die Reaktionskontrolle und die Bestimmung der Ausbeute erfolgt durch Radiodünnschichtchromatographie (Dichlormethan/Methanol = 20/1 und Essigester/Petrolether = 2/1).
RF 1e (Dichlormethan/Methanol = 20/1): 0,74,
RF 1e (Essigester/Petrolether = 2/1): 0,50.
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Die Kartusche Sep-Pak®Plus C18 wird mit 5 ml Methanol und 100 ml Wasser eluiert. Die Probe wird mit 200 ml Wasser verdünnt und portioniert über eine Spritze auf die Kartusche gegeben. Daraufhin werden mit 100 ml Wasser und 1 ml Acetonitril/Triethylamin/Essigsäure (0,057 M) = 65/35 eluiert.
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Das Rohprodukt wird mit 5 ml Acetonitril/MeOH = 1/1 eluiert (13,2 MBq; 12:22 Uhr), eingeengt, mit 2 ml Acetonitril und 1 ml Triethylamin/Essigsäure (0,057 M) verdünnt und in die HPLC injiziert. Die HPLC Trennung (ReproSil-Pur 120 ODS3,C18, endc.) erfolgt isochratisch mit Acetonitril/Triethylamin/Essigsäure (0,057 M) = 65/35. Das Produkt wird zwischen 11 und 14 min abgetrennt.
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Die Kartusche WAT023561 Sep-Pak®Light Alum N wird mit 5 ml Methanol und 20 ml Wasser eluiert. Die abgetrennte Fraktion wird mit 200 ml Wasser verdünnt und portioniert über eine Spritze auf die Kartusche gegeben. Daraufhin wird mit 20 ml Wasser eluiert.
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[18F]1e wird mit 7 ml CH2Cl2/MeOH = 1/1 eluiert, eingeengt (1,4 MBq; 13:17 Uhr) und mit DMSO auf 60 μl verdünnt.
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Die Bestimmung der radiochemischen Reinheit erfolgt durch Radiodünnschichtchromatographie (Dichlormethan/Methanol = 20/1 und Essigester/Petrolether = 2/1).
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1 zeigt mittels Radiodünnschichtchromatographie (A) mit Dichlormethan/Methanol = 20/1 die Reaktionskontrolle vor Reduktion der Vorstufe mit SnCl2, die Referenz 1e, und die Reaktionskontrolle nach Reduktion der Vorstufe mit SnCl2 sowie (B) mit Essigester/Petrolether = 2/1 die Reaktionskontrolle vor Reduktion der Vorstufe mit SnCl2, die Referenz 1e, und die Reaktionskontrolle nach Reduktion der Vorstufe mit SnCl2 sowie (C) mit Dichlormethan/Methanol = 20/1 die Zusätzliche Kontrolle der Rf Werte des isolierten Produktes [18F]1e und der Referenz 1e nach gemeinsamen Auftragens der Referenz 1e und des isolierten Produktes sowie (D) mit Essigester/Petrolether = 2/1 die Zusätzliche Kontrolle der Rf Werte des isolierten Produktes [18F]1e und der Referenz 1e nach gemeinsamen Auftragens der Referenz 1e und des isolierten Produktes [18F]1e.
Ausbeute: ~3% [18F]1e,
Radiochemische Reinheit: 99%.
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Beispiel 2:
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2 mg 1b in 0,5 ml wasserfreiem N-N-Dimethylformamid werden unter diffusem Licht und Argon mit 293 MBq [18F]Fluorid, 7,4 μmol/GBq K2.2.2. und 3,2 μmol/GBq K2CO3 in 1,5 ml (Gesamtvolumen) wasserfreiem N-N-Dimethylformamid versetzt. Daraufhin wird die Reaktionsmischung im Mikrowellensynthesizer (Discover, CEM) in verschlossenen Behältern unter Pressluftkühlung 6 mal bei 45 bis 75 W (durchschnittlich 52 W), 30 s lang auf 52°C bis 60°C erhitzt und auf 20°C abgekühlt und 3 mal bei 150 W, 60 s lang auf 98°C bis 132°C erhitzt und auf 20°C abgekühlt. Daraufhin wird zur Reaktionsmischung 3,6 mg (5 Mol-Aquivalente) SnCl2 gegeben und im Mikrowellensynthesizer 3 mal bei 150 W, 60 s lang auf 120°C bis 143°C erhitzt und auf 20°C abgekühlt.
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Die Reaktionskontrolle und die Bestimmung der Ausbeute erfolgt durch Radiodünnschichtchromatographie (Essigester/Petrolether = 2/1). Zusätzlich erfolgt die Bestimmung der Ausbeute durch HPLC (RP 18 AQ; Acetonitril/aq. NH4ac Gradient).
RF 1a (Dichlormethan/Methanol = 20/1): 0,75
RF 1a (Essigester/Petrolether = 2/1): 0,57
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2 zeigt die Reaktionskontrolle mittels Radiodünnschichtchromatographie vor (A) und nach (B) Reduktion der Vorstufe mit SnCl2 sowie die zusätzliche Kontrolle (C) der Rf Werte des Produktes [18F]1a und der Referenz 1a sowie 1d (s. unten) nach gemeinsamen Auftragen der Referenz 1a und des Reaktionsgemisches und nach gemeinsamen Auftragen von 1d und des Reaktionsgemisches.
Ausbeute: ~3% [18F]1a.
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3 zeigt die Reaktionskontrolle mittels HPLC mit Radioaktivitätsdetektion vor (A) und nach (B) Reduktion der Vorstufe mit SnCl2.
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4 zeigt die Reaktionskontrolle mittels HPLC mit UV-VIS Detektion vor (A) und nach (B) Reduktion der Vorstufe mit SnCl2 und nach (C) Reduktion der Vorstufe mit SnCl2 und gleichzeitiger Injektion der Referenz 1a.
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Beispiel 3:
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2 mg 1h in 0,5 ml wasserfreiem N-N-Dimethylformamid werden unter diffusem Licht mit 303,2 MBq (14:52 Uhr) [18F]Fluorid, K2.2.2. (7,4 μmol/GBq) und K2CO3 (3,2 μmol/GBq) in 1,5 ml (Gesamtvolumen) wasserfreiem N-N-Dimethylformamid versetzt. Daraufhin wird die Reaktionsmischung unter Argon im Mikrowellensynthesizer (Discover, CEM) unter Pressluftkühlung 4 mal bei 75 W, 30 s lang auf 60°C erhitzt und auf 8°C abgekühlt. Daraufhin wird die Reaktionsmischung im Mikrowellensynthesizer 1 mal bei 150 W, 60 s lang auf 130°C erhitzt. Die Reaktionskontrolle und die Bestimmung der Ausbeute erfolgt durch Radiodünnschichtchromatographie (Dichlormethan/Methanol = 20/1 und Essigester/Petrolether = 2/1). Zusätzlich erfolgt die Bestimmung der Ausbeute durch HPLC (RP 18 AQ; Acetonitril/aq. NH4ac Gradient).
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Die Kartusche Sep-Pak®Plus C18 wird mit 5 ml Methanol und 100 ml Wasser eluiert. Die Probe wird mit 200 ml Wasser verdünnt und portioniert über eine Spritze auf die Kartusche gegeben. Daraufhin werden mit 100 ml Wasser und 1 ml Acetonitril/Triethylamin/Essigsäure (0,057 M) = 65/35 eluiert.
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Das Rohprodukt wird mit 5 ml Acetonitril/MeOH = 1/1 eluiert (18,9 MBq; 15:33 Uhr), eingeengt, mit 2 ml Acetonitril und 1 ml Triethylamin/Essigsäure (0,057 M) verdünnt und in die HPLC injiziert. Die HPLC Trennung (ReproSil-Pur 120 ODS3,C18, endc.) erfolgt isochratisch mit Acetonitril/Triethylamin/Essigsäure (0,057 M) = 65/35. Das Produkt wird zwischen 10 und 14 min abgetrennt.
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Die Kartusche WAT02356q1 Sep-Pak®Light Alum N wird mit 5 ml Methanol und 20 ml Wasser eluiert. Die abgetrennte Fraktion wird mit 200 ml Wasser verdünnt und portioniert über eine Spritze auf die Kartusche gegeben. Daraufhin wird mit 20 ml Wasser eluiert.
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[18F]1g wird mit 5 ml CH2Cl2/MeOH = 1/1 eluiert, eingeengt (0,4 MBq; 16:18 Uhr) und mit 9%iger NaCl-Lösung auf 500 μl verdünnt.
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Die Bestimmung der radiochemischen Reinheit erfolgt durch Radiodünnschichtchromatographie (Dichlormethan/Methanol = 20/1 und Essigester/Petrolether = 2/1). Zusätzlich erfolgt die Bestimmung der radiochemischen Reinheit durch HPLC (RP 18 AQ; Acetonitril/aq. NH4ac Gradient).
RF 1g (Dichlormethan/Methanol = 20/1): 0,63,
RF 1g (Essigester/Petrolether = 2/1): 0,45.
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5 zeigt mittels Radiodünnschichtchromatographie (A) mit Dichlormethan/Methanol = 20/1 die Referenz 1g und die Reaktionskontrolle nach beendeter Reaktion sowie (B) mit Essigester/Petrolether = 2/1 die Referenz 1g und die Reaktionskontrolle nach beendeter Reaktion sowie (C) mit Dichlormethan/Methanol = 20/1 die Zusätzliche Kontrolle der Rf Werte des isolierten Produktes [18F]1g und der Referenz 1g nach gemeinsamen Auftragen der Referenz 1g und des isolierten Produktes sowie (D) mit Essigester/Petrolether = 2/1 die Zusätzliche Kontrolle der Rf Werte des isolierten Produktes [18F]1g und der Referenz 1g nach gemeinsamen Auftragens der Referenz 1g und des isolierten Produktes [18F]1g.
Ausbeute: ~13% [18F]1g,
Radiochemische Reinheit 93%.
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6 zeigt mittels HPLC mit Radioaktivitätsdetektion (A) die Reaktionskontrolle nach beendeter Reaktion und (B) das isolierte Produkt [18F]1g.
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7 zeigt mittels HPLC mit UV-VIS Detektion (A) die Reaktionskontrolle nach beendeter Reaktion und (B) das isolierte Produkt [18F]1g und (C) die Referenz 1g und (D) die Vorstufe 1h.
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Beispiel 4 – Synthese nicht-radioaktiver Verbindungen:
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Die Verbindung 1i wird nach folgender Vorschrift hergestellt:
Zu 0,042 mmol (1 Moläquivalent) 1d werden unter Stickstoff 1 ml Ethanol und 0,211 mmol (5 Moläquivalente) wasserfreies Zinn(II)-chlorid gegeben und 30 min unter Rückfluss erhitzt. Daraufhin werden zum Reaktionsgemisch unter Stickstoff 1 ml Ethanol und 0,211 mmol (5 Moläquivalente) wasserfreies Zinn(II)-chlorid gegeben und 30 min unter Rückfluss erhitzt. Unter Eiskühlung wird 2 ml gesättigte Natriumhydrogencarbonat-Lösung zugegeben. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit Wasser gewaschen, in Chloroform/Methanol gelöst, filtriert und eingeengt.
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Zusätzlich erfolgt die Reinigung durch Flashchromatographie mit Chloroform/Methanol = 10/0,1 und Kristallisation in Acetonitril.
Ausbeute 1i: 0,026 mmol, 62%.
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Die Verbindung 5a wird nach folgender Vorschrift hergestellt:
Zu 0,043 mmol (1 Moläquivalent) 6a und 0,430 mmol (10 Moläquivalente) Kaliumcarbonat wird unter Stickstoff 0,056 mmol (1,3 Moläquivalente) Iodmethan in 0,5 ml wasserfreiem N,N-Dimethylformamid gegeben und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Daraufhin wird das Reaktionsgemisch eingeengt, in heißem Methanol gelöst, filtriert und eingeengt. Zusätzlich erfolgt die Reinigung durch HPLC (ReproSil-Pur 120 ODS, C18, endc.) mit Acetonitril/Wasser = 85/15 und Kristallisation in Methanol.
Ausbeute 5a: 0,017 mmol, 39%.
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Die nicht-radioaktiven Verbindungen 1a bis 1h, 2g, 3c, 4e, 4g, 4h, 6a, 7e und 7g werden analog der folgenden Vorschrift für 1b hergestellt:
Zu 0,292 mmol (1 Moläquivalent) Carbonsäure (3-(3-(2-Brom-4-nitrophenyl)-1,2,4-oxadiazol-5-yl)propansäure) und 0,322 mmol (1,1 Moläquivalente) Amin (9-Ethyl-9H-carbazol-3-amin) in 2,5 ml wasserfreiem Dichlormethan wird unter Stickstoff und unter Eiskühlung 0,322 mmol (1,1 Moläquivalente) N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimid in 2,5 ml wasserfreiem Dichlormethan gegeben und eine Stunde unter Eiskühlung und eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Daraufhin wird zum Reaktionsgemisch eine Spatelspitze 4-(Dimethylamino)pyridin gegeben und eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Daraufhin wird zum Reaktionsgemisch 0,322 mmol (1,1 Moläquivalente) N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimid in 2,5 ml wasserfreiem Dichlormethan gegeben und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wird eingeengt und durch Flashchromatographie mit Dichlormethan/Methanol = 100/1 und Kristallisation in Dichlormethan/Methanol gereinigt.
Ausbeute 1b: 0,198 mmol, 68%.
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Die Strukturen der hergestellten Verbindungen wurden durch hochaufgelöste ESI-Massenspektrometrie (Tabelle 1) bestätigt. Tabelle 1
Verbindung/Referenzverbindung | Summenformel | Exakte Massen | Gemessene Massen |
1a | C25H20BrFN4O2 | M + H+ 507,08264 M + Na+ 529,06459 2M + H+ 1013,15801 2M + Na+ 1035,13995 | M + H+ 507,08249 M + Na+ 529,06444 2M + H+ 1013,15637 2M + Na+ 1035,13966 |
1b | C25H20BrN5O4 | M + Na+ 556,05909 2M + H+ 1067,14701 2M + Na+ 1089,12895 | M + Na+ 556,05940 2M + H+ 1067,14721 2M + Na+ 1089,12816 |
1c | C25H20F2N4O2 | M + H+ 447,16271 M + Na+ 469,14465 2M + H+ 893,31814 2M + Na+ 915,30009 | M + H+ 447,16279 M + Na+ 469,14455 2M + H+ 893,31771 2M + Na+ 915,29946 |
1d | C25H20FN5O4 | M + Na+ 496,13915 2M + Na+ 969,28909 | M + Na+ 496,13901 2M + Na+ 969,28932 |
1e | C26H20FN5O2 | M + Na+ 476,14932 2M + Na+ 929,30943 | M + Na+ 476,14902 2M + Na+ 929,30835 |
1f | C26H20N6O4 | M + Na+ 503,14382 2M + Na+ 983,29843 | M + Na+ 503,14351 2M + Na+ 983,29765 |
1g | C24H20FN5O2 | M + Na+ 452,14932 2M + H+ 859,32748 2M + Na+ 881,30943 | M + Na+ 452,14902 2M + H+ 859,32705 2M + Na+ 881,30861 |
1h | C24H20BrN5O2 | M + H+ 490,08731 M + Na+ 512,06926 2M + H+ 979,16735 2M + Na+ 1001,14930 | M + H+ 490,08770 M + Na+ 512,06951 2M + H+ 979,16767 2M + Na+ 1001,14935 |
1l | C25H22FN5O2 | M + Na+ 466,16497 2M + Na+ 909,34073 | M + Na+ 466,16522 2M + Na+ 909,34029 |
2g | C20H18FN5O2 | M + H+ 380,15173 M + Na+ 402,13367 2M + H+ 759,29618 2M + Na+ 781,27813 | M + H+ 380,15202 M + Na+ 402,13403 2M + H+ 759,29638 2M + Na+ 781,27720 |
3c | C26H20F2N4O2 | M + Na+ 481,14465 2M + Na+ 939,30009 | M + Na+ 481,14447 2M + Na+ 939,29960 |
4e | C21H14FN5O2 | M + H+ 388,12043 M + Na+ 410,10237 2M + H+ 775,23358 2M + Na+ 797,21553 | M + H+ 388,12051 M + Na+ 410,10243 2M + H+ 775,23385 2M + Na+ 797,21557 |
4g | C19H14FN5O2 | M + H+ 364,12043 M + Na+ 386,10237 2M + H+ 727,23358 2M + Na+ 749,21553 | M + H+ 364,12066 M + Na+ 386,10258 2M + H+ 727,23464 2M + Na+ 749,21527 |
4h | C19H14BrN5O2 | M + H+ 424,04036 M + Na+ 446,02231 2M + H+ 847,07345 2M + Na+ 869,05540 | M + H+ 424,04075 M + Na+ 446,02267 2M + H+ 847,07404 2M + Na+ 869,05547 |
5a | C24H18BrFN4O2 | M + Na+ 515,04894 2M + H+ 1007,10865 | M + Na+ 515,04893 2M + Na+ 1007,10847 |
6a | C23H16BrFN4O2 | M + Na+ 501,03329 2M + Na+ 979,07735 | M + Na+ 501,03343 2M + Na+ 979,07777 |
7e | C19H18FN5O3 | M + H+ 384,14664 M + Na+ 406,12859 2M + Na+ 789,26796 | M + H+ 384,14693 M + Na+ 406,12877 2M + Na+ 789,26763 |
7g | C17H18FN5O3 | M + H+ 360,14664 M + Na+ 382,12859 2M + H+ 719,28601 2M + Na+ 741,26796 | M + H+ 360,14680 M + Na+ 382,12896 2M + H+ 719,28664 2M + Na+ 741,26859 |
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Für die hergestellten Verbindungen wurden die in Tabelle 2 enthaltenen Affinitäten zum humanen CB
2- und CB
1-Rezeptor (hCB
2 und hCB
1) ermittelt. Tabelle 2
Verbindung/Referenzverbindung | Ki hCB2 in nM | Ki hCB1 in nM |
1a | 4,3 | > 1,000 |
1b | 1,9 | 541 |
1c | 39 | > 1,000 |
1d | 11 | > 1,000 |
1e | 7,0 | > 1,000 |
1f | 5,9 | > 1,000 |
1g | 135 | > 1,000 |
1h | > 1,000 | nicht bestimmt |
2g | > 1,000 | > 1,000 |
3c | > 1,000 | > 1,000 |
4e | 722 | nicht bestimmt |
4g | > 1,000 | nicht bestimmt |
4h | > 1,000 | nicht bestimmt |
CP55,940 (CAS Nr. 83002-04-4) | 1,3 | 2,4 |
SR141716A (Rimonabant, CAS Nr. 158681-13-1) | - | 1,3 |
SR144528 (CAS Nr. 192703-06-3) | 12 | - |
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Zur Bestimmung der Affinitäten der hergestellten Verbindungen zum CB2- und CB1-Rezeptor wurden Radioligand-Verdrängungstests an hCB2 bzw. hCB1 transfizierten CHO-Zellen (abgekürzt von engl. Chinese Hamster Ovary, Zelllinie aus Ovarien des chinesischen Hamsters) durchgeführt.
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Dazu wurde das hCB-CHO Zellhomogenat mit 0,5 nM (M = mol/l) [3H]CP55,940 (Referenz-CB-Ligand) und verschieden konzentrierten Lösungen der zu untersuchenden Verbindungen (10 mM Stammlösung in DMSO; Konzentrationsbereich 10 pM–1 μM) in einem Inkubationspuffer (50 mM TRIS-HCl, pH 7,4, 5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 0,1% BSA) bei Raumtemperatur für 90 min inkubiert. Die Trennung des hCB-gebundenen und ungebundenen [3H]CP55,940 erfolgte durch Filtrieren über einen GF-B Glasfaserfilter (48-well BRANDEL Cell Harvester). Die Menge an adsorbiertem hCB-[3H]CP55,940 wurde mittels Flüssigszintillationsmessung bestimmt. Die unspezifische Bindung des [3H]CP55,940 wurde durch Koinkubation mit 10 μM CP55,940 bestimmt. Die Bindungsaffinität Ki,hCB2 bzw. Ki,hCB1 der hergestellten Verbindungen wurde mithilfe der Cheng-Prusoff-Gleichung bestimmt.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- US 2009/0005427 A1 [0005]
- WO 2009/146343 A1 [0006]
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- Evens und Bormans 2010, Curr Top Med Chem 10: 1527–1543 [0002]
- Cheng Y et. al. J. Med. Chem. 51, 5019–5034, (2008) [0004]
- Horti und Van Laere in einem Übersichtsartikel (Curr Pharm Des. 2008; 14: 3363–83) [0008]
- Evens et al. 2008. Nucl Med Biol. 35 (7): 793–800 [0009]
- Evens et al. 2009. Nucl Med Biol. 36 (4): 455–65 [0009]
- Evens und Bormans 2010 (Curr Top Med Chem 10: 1527–1543) [0010]
- Worm und Dolle (Curr Pharm Des 2009; 15: 3345–3366) [0010]
- Constantinou M et. al. (J Label Comp Radiopharm 44 (Suppl. 1), S889–S891 (2001)) [0013]
- Guo et. al. (Appl Radiat Isot, 66 (10), 1396–1402, 2008) [0013]