DE102009010503B4

DE102009010503B4 - Hochbrechende Immersionsflüssigkeiten und ihre Verwendung

Info

Publication number: DE102009010503B4
Application number: DE102009010503.4A
Authority: DE
Inventors: Hans-Joachim Weippert
Original assignee: Carl Zeiss AG
Current assignee: Carl Zeiss AG
Priority date: 2009-02-25
Filing date: 2009-02-25
Publication date: 2017-02-16
Anticipated expiration: 2029-02-26
Also published as: US20100212547A1; JP5623098B2; DE102009010503A1; US8647878B2; JP2010211201A

Abstract

Immersionsflüssigkeit, umfassend zumindest eine Verbindung der allgemeinen Formel Ibei welcher: R1 und R2 jeweils wenigstens eine ungesättigte und/oder aromatische Ringstruktur umfassen; und X: NR3 mit R3 ausgewählt aus Wasserstoff oder Kohlenwasserstoff,bedeutet, wobei Y unabhängig voneinander O, S oder NR4 mit R4 ausgewählt aus Wasserstoff oder Kohlenwasserstoff bedeutet, wobei die Verbindung der allgemeinen Formel I bei 20°C im Wellenlängenbereich zwischen 435 nm und 645 nm einen Brechungsindex n von wenigstens 1,52 besitzt.

Description

Technisches Gebiet
Die Erfindung betrifft hochbrechende Immersionsflüssigkeiten, eine hochbrechende Verbindung sowie deren Verwendungen.
Stand der Technik
Lichtsammeleffizienz und Auflösung in der Mikroskopie hängen direkt von der numerischen Apertur (NA) des verwendeten Objektives ab. Ein Hauptproblem beispielsweise der Einzelmolekülmikroskopie in lebenden Zellen besteht in der Autofluoreszenz diverser Zellbestandteile wie beispielsweise Proteinen, Zellmetaboliten und dergleichen. Zur Untersuchung derartiger Zellen wird häufig die sogenannte Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie (Total Internal Reflection Microscopy (TIRF)) verwendet, bei welcher es sich um eine Weitfeldtechnik handelt. Bei der Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie bestimmt die NA einschließlich der Brechungsindizes von Immersionsöl und Deckglas darüber hinaus auch die Eindringtiefe des Anregungslichtes, wenn die Beleuchtung durch das Objektiv erfolgt. Eine besonders große NA erlaubt es dann extrem dünne Schichten (unter 100 nm) zu beleuchten.
Um die bisher mit klassischem Immersionsöl erreichbaren NAs von etwa 1,49 weiter zu vergrößern, sind für die Entwicklung von Immersionsobjektiven mit hoher NA für die Nahfeldmikroskopie Verbindungen oder Verbindungsgemische mit größerem Brechungsindex bzw. mit größerer Brechzahl n notwendig. Die Verbindungen sollen zudem verschiedene weitere Anforderungen erfüllen. So ist neben dem möglichst hohen Brechungsindex vor allem eine niedrige Eigenfluoreszenz, eine ausreichende Transmission bis ca. 380 nm, eine geringe Flüchtigkeit sowie eine geringe Toxizität wünschenswert.
Aus dem Stand der Technik sind verschiedene hochbrechende Verbindungen und Immersionsflüssigkeiten bekannt. Beispielsweise offenbart die US 2008/0135808 A1 ein Immersionsöl, welches aus einem Gemisch von Diiodmethan und Schwefel besteht und einen Brechungsindex n von etwa 1,78 besitzt.
Auf vergleichbare Gemische wird zudem bereits 1934 von Anderson und Payne hingewiesen (Liquids of High Refractive Index (Nature (1934), Bd. 133, S. 66). Auch aus dem Handbook of Chemistry and Physics (The Chemical Rubber Co. (1968), Ohio, Robert C. Weast, 49. Auflage, E-219) sind unter anderem Diiodmethan sowie mit Schwefel gesättigtes Diiodmethan als hochbrechende Immersionsflüssigkeiten bekannt.
In eigenen Untersuchungen wurden hierzu folgende Messdaten ermittelt:
Diiodmethan:

Brechzahl n_e (546,1 nm) = 1,7495 (bei 20°C)
Transmission (d = 10 mm) bei 420 nm: 4%
Viskosität (bei 20°C): 9 mm²/s
Schlechte Glasbenetzung

Diiodmethan-Schwefel (90:10 Gewichtsteile):

Brechzahl n_e (546,1 nm) = 1,7896
Transmission (d = 10 mm) bei 450 nm: 2%

Diese Immersionsflüssigkeiten sind für viele Anwendungen unzureichend, da sie beispielsweise eine sehr schlechte Glasbenetzung besitzen. Zudem sind längere Aufnahmezeiten mit der sogenannten „Live Cell Imaging”-Technik unmöglich. Gerade die ”Live Cell Imaging”-Technik ist jedoch von besonderem Interesse für die moderne Zellbiologie, da hierüber mikroskopische Zeitraffer-Aufnahmen sich bewegender Zellen angefertigt werden können. Darüber hinaus ist das Immersionsöl äußerst geruchsintensiv, unterhalb von 450 nm nicht mehr ausreichend transparent und zeigt starke Eigenfluoreszenz. Diese Eigenschaft ist besonders bei Mikroskopiertechniken von Nachteil, welche Einzelmoleküldetektion in der Fluoreszenz voraussetzen. Als Beispiel für derartige Mikroskopiertechniken ist die sogenannte „Photo Activated Lokalization Microscopy(PALM)”-Technik zu nennen, welche grundsätzlich eine Auflösung bis hin zu 20 nm erlaubt. Mit Hilfe dieser Technik kann durch Lokalisation von Einzelmolekülen, die viel genauer bestimmt werden kann als die klassische Beugungsbegrenzung, sukzessiv ein extrem hochauflösendes Bild erzeugt werden. Diiodmethan ist zudem aufgrund seiner derzeit ungeklärten Toxizität als zu vermeidende Verbindung eingestuft. Weiterhin besitzt Diiodmethan trotz eines Siedepunkts von etwa 181°C eine relativ hohe Flüchtigkeit, wodurch sich der Schwefel in Diiodmethan-Schwefel-Gemischen anreichert und ab einem Gewichtsanteil von etwa 12% auskristallisiert. Hierdurch wird eine Fortsetzung der mikroskopischen Untersuchung erschwert oder sogar verunmöglicht. Zusätzlich entsteht ein hoher Reinigungsaufwand der betreffenden Geräteteile.
Aus der Publikation J. Am. Chem. Soc., Vol. 115, No. 16, 1993, S. 7219–7225 sind Palladium-katalysierte Thioborieriungen von terminalen Alkinen zu entnehmen.
Die DE 297 24 199 U1 offenbart Immersionsflüssigkeiten, die gesättigte Tricyclodecan-Derivate oder Derivate von Stoffen mit Grundstrukturen des Tricyclodecans als Hauptbestandteil enthalten.
Aus der US 4 526 711 A sind Flüssigkeiten mit hohem Brechungsindex bekannt, die unter anderem bromiertes Diphenyloxid enthalten können.
Die US 3 437 402 A offenbart Arylthioether wie beispielsweise 2,3'-bis(Phenylthio)diphenylsulfid, die als Immersionsflüssigkeit verwendbar sind.
Darstellung der Erfindung
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Immersionsflüssigkeit bereitzustellen, welche einen möglichst hohen Brechungsindex bei gleichzeitig verbesserter Eignung für die Mikroskopie besitzt.
Diese Aufgabe wird gelöst durch eine Immersionsflüssigkeit gemäß Patentanspruch 1, eine Immersionsflüssigkeit gemäß Patentanspruch 13 sowie eine Verwendung der Immersionsflüssigkeit gemäß Patentanspruch 15. Vorteilhafte Ausgestaltungen mit zweckmäßigen Weiterbildungen sind in den jeweiligen Unteransprüchen angegeben.
Eine erfindungsgemäße Immersionsflüssigkeit, welche einen möglichst hohen Brechungsindex bei gleichzeitig verbesserter Eignung für die Mikroskopie besitzt, umfasst zumindest eine Verbindung der allgemeinen Formel I
bei welcher R₁ und R₂ jeweils wenigstens eine ungesättigte und/oder aromatische Ringstruktur umfassen und X: NR₃ mit R₃ ausgewählt aus Wasserstoff oder Kohlenwasserstoff,
bedeutet, wobei Y unabhängig voneinander O, S oder NR₄ mit R₄ ausgewählt aus Wasserstoff oder Kohlenwasserstoff bedeutet, wobei die Verbindung der allgemeinen Formel I bei 20°C im Wellenlängenbereich zwischen 435 nm und 645 nm einen Brechungsindex n von wenigstens 1,52 besitzt. Dabei sind alle Enantiomere und racemischen Gemische der Verbindung als mitumfasst anzusehen. Die Immersionsflüssigkeit eignet sich dabei insbesondere für Immersionsobjektive mit hoher NA für Mikroskope, insbesondere Nahfeldmikroskope, und besitzt eine Vielzahl von vorteilhaften Eigenschaften. So weist die Verbindung der allgemeinen Formel I einen hohen Brechungsindex n auf, wobei aufgrund des variablen chemischen Aufbaus der Verbindung eine einfache Brechungsindexanpassung – beispielsweise an das verwendete Deckglasmaterial – ermöglicht ist. Die optischen Eigenschaften der Immersionsflüssigkeit sind daher optimal an unterschiedliche Arbeitstemperaturen, beispielsweise 23°C und 37°C, anpassbar. Darüber hinaus weist die Immersionsflüssigkeit eine besonders niedrige Eigenfluoreszenz F auf, die bei einer Anregungswellenlänge von 405 nm und einer Fluoreszenzemission bei 485 nm bei unter 10 mg/l Chininsulfatäquivalente liegt. Aufgrund der mindestens zwei Ringstrukturen ist die Immersionsflüssigkeit hochsiedend und verdunstet bei den genannten Arbeitstemperaturen nicht bzw. nicht in nennenswertem Umfang. Hierdurch wird einerseits sichergestellt, dass während der Anwendung im Mikroskop keine Brechzahländerungen auftreten, andererseits werden auch die Immissionswerte im Arbeitsbereich erheblich verringert. Weitere Vorteile liegen in einer ausreichenden Benetzung von Glasoberflächen (Deckgläser etc.) sowie einer hohen Farbstabilität von gängigen Mikroskopiefarbstoffen, da die Immersionsflüssigkeit bei Arbeiten ohne Deckglas keine störende Entfärbung von Präparaten verursacht. Die erfindungsgemäß benannten Verbindungen sind im Vergleich zu Diiodmethan und Diiodmethan-Schwefel-Mischungen mittel- bis hochviskos. Die Immersionsflüssigkeit eignet sich somit aufgrund ihrer verschiedenen Vorteile sehr gut für unterschiedlichste Mikroskopietechniken, insbesondere für die Fluoreszenzmikroskopie. Dabei kann grundsätzlich vorgesehen sein, dass die Immersionsflüssigkeit zwei oder mehr Verbindungen der allgemeinen Formel I umfasst, wodurch eine besonders einfache und präzise Anpassbarkeit der optischen und mechanischen Eigenschaften der Immersionsflüssigkeit an unterschiedliche Anforderungsprofile gegeben ist. Dabei haben sich insbesondere aromatische Ringstrukturen als vorteilhaft zur Erhöhung des Brechungsindex gezeigt.
In einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung ist vorgesehen, dass R₁- in der allgemeinen Formel I die allgemeine Formel II R₅-Z- (Formel II) besitzt, wobei R₅ die wenigstens eine ungesättigte und/oder aromatische Ringstruktur umfasst und Z (CR₆R₆)_n bedeutet, wobei R₆ jeweils unabhängig aus Wasserstoff oder Kohlenwasserstoff ausgewählt und n eine ganze Zahl zwischen 1 und 10 ist. Hierdurch können die beiden Ringstrukturen R₁ und R₂ durch einen einstellbaren Spacer (Z) voneinander getrennt werden, wodurch neben den optischen Eigenschaften der Verbindung der allgemeinen Formel I insbesondere auch deren Viskosität und Flüchtigkeit gezielt veränderbar ist.
In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung ist vorgesehen, dass die Verbindung der allgemeinen Formel I bei 20°C im Wellenlängenbereich zwischen 435 nm und 645 nm einen Brechungsindex n von wenigstens 1,60 besitzt. Vorzugsweise ist vorgesehen, dass die Verbindung der allgemeinen Formel I bei 20°C und 589 nm Wellenlänge einen Brechungsindex n_D > 1,60, insbesondere n_D > 1,64 besitzt. Hierdurch eignet sich die Immersionsflüssigkeit für Immersionsobjektive mit hoher NA und kann zur mikroskopischen Untersuchung besonders dünner Schichten verwendet werden.
In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung ist vorgesehen, dass die Verbindung der allgemeinen Formel I bei 20°C und einer Schichtdicke von 10 mm im Wellenlängenbereich zwischen 370 nm und 400 nm eine Transmission von wenigstens 1%, insbesondere von wenigstens 2%, und/oder im Wellenlängenbereich zwischen 400 nm und 420 nm eine Transmission von wenigstens 15%, insbesondere von wenigstens 20%, und/oder im Wellenlängenbereich zwischen 420 nm und 450 nm eine Transmission von wenigstens 40%, insbesondere von wenigstens 50%, und/oder im Wellenlängenbereich zwischen 450 nm und 800 nm eine Transmission von wenigstens 70%, insbesondere von wenigstens 80%, besitzt.
Weitere Vorteile ergeben sich, indem die Immersionsflüssigkeit im Temperaturbereich zwischen 20°C und 40°C eine Viskosität ν von wenigstens 50 mm²/s, insbesondere von wenigstens 100 mm²/s, besitzt. Auf diese Weise besitzt die Immersionsflüssigkeit eine optimale Fließfähigkeit, insbesondere für mikroskopische Anwendungen.
In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung ist vorgesehen, dass die Immersionsflüssigkeit im Temperaturbereich zwischen 20°C und 40°C eine Abbe-Zahl V_e von wenigstens 18, insbesondere von wenigstens 20, besitzt. Auf diese Weise werden etwaige Abbildungsfehler vorteilhaft minimiert bzw. zumindest weitgehend ausgeschlossen.
In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung ist vorgesehen, dass R₁ und/oder R₂ der zumindest einen Verbindung wenigstens eine monocyclische und/oder bicyclische und/oder tricyclische Ringstruktur umfasst.
Hierdurch können die optischen und mechanischen Eigenschaften der Verbindung und damit der Immersionsflüssigkeit optimal an den jeweiligen Einsatzzweck angepasst werden. Dabei haben sich insbesondere bi- und tricyclische Ringstrukturen als vorteilhaft zur Erhöhung des Brechungsindex gezeigt.
Weitere Vorteile ergeben sich, wenn R₁ und/oder R₂ der zumindest einen Verbindung wenigstens eine Ringstruktur mit zumindest einem Heteroatom, insbesondere O, N und/oder S, umfasst. Mit Hilfe zumindest eines Heteroatoms bzw. einer Heteroringstruktur kann der Brechungsindex der Verbindung bzw. der Immersionsflüssigkeit vorteilhaft erhöht werden.
Dabei hat es sich in weiterer Ausgestaltung als vorteilhaft gezeigt, wenn welcher R₁ und/oder R₂ der zumindest einen Verbindung wenigstens eine weitere funktionelle Gruppe umfasst. Auch dies stellt eine einfache und flexible Möglichkeit dar, die optischen, chemischen und mechanischen Eigenschaften der Immersionsflüssigkeit optimal an den jeweiligen Einsatzzweck anzupassen.
Dabei hat es sich als vorteilhaft gezeigt, wenn die wenigstens eine weitere funktionelle Gruppe eine Carbonsäure, eine Thiocarbonsäure, einen Carbonsäureester, insbesondere einen Alkyl- und/oder Arylcarbonsäureester, einen Thiocarbonsäureester, insbesondere einen Alkyl- und/oder Arylthiocarbonsäureester, einen Ether, insbesondere einen Alkyl- und/oder Arylether, einen Thioether, insbesondere einen Alkyl- und/oder Arylthioether, ein Halogenid, insbesondere ein Chlorid, Bromid und/oder Iodid, ein Keton, ein Thioketon, einen Aldehyd, einen Thioaldehyd, einen Alkohol, ein Thiol und/oder ein Amin umfasst. Hierdurch kann der Brechungsindex optimal an die jeweiligen Anforderungen angepasst werden. Dabei wirken insbesondere schwefelhaltige funktionelle Gruppen und Halogene brechungsindexerhöhend.
In einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung hat es sich als vorteilhaft gezeigt, wenn die Immersionsflüssigkeit zumindest einen Zusatzstoff umfasst, mittels welchem die Viskosität ν und/oder der Brechungsindex n der Immersionsflüssigkeit auf einen vorbestimmten Parameterwert eingestellt ist. Hierdurch ist eine einfache Möglichkeit geschaffen, die Viskosität ν optimal an die gewünschte Arbeitstemperatur anzupassen. Alternativ oder zusätzlich kann durch geeignete Wahl der Art und Menge des Zusatzstoffs eine besonders exakte und reproduzierbare Einstellung des Brechungsindex der Immersionsflüssigkeit vorgenommen werden.
In weiterer vorteilhafte Ausgestaltung umfasst der zumindest eine Zusatzstoff ein Alkylnaphthalin, ein Chlornaphthalin, ein Bromnaphthalin, ein Jodnaphthalin, ein Phenylnaphthalin und/oder ein Benzylnaphthalin. Dabei sind alle Stellungsisomere der genannten Zusatzstoffe als mitoffenbart anzusehen. Unter Alkylnaphthalin ist beispielsweise Methyl-, Ethyl-, n-Propyl- oder iso-Propylnaphthalin zu verstehen. Es können jedoch auch Alkylnaphthaline mit längerkettigen verzweigten und/oder unverzweigten Alkylketten sowie mehrfachsubstituierte Naphthaline vorgesehen sein. Durch Verwendung eines oder mehrerer der genannten Zusatzstoffe werden die Anforderungen an die Immersionsflüssigkeit hinsichtlich Dispersion, Viskosität, Schwerflüchtigkeit und Benetzungsfähigkeit von Objektträgern zuverlässig und kostengünstig erfüllt. Da die genannten Zusatzstoffe zudem jeweils über wenigstens eine Ringstruktur und teilweise über brechungsindexsteigernde funktionelle Gruppen verfügen, ist sichergestellt, dass die Immersionsflüssigkeit auch bei höheren Massenanteilen an Zuschlagstoff über einen hohen Brechungsindex verfügt. Die genannten Zuschlagstoffe sind zudem kommerziell zuverlässig und langfristig verfügbar und können mit gängigen präparativen Verfahren (z. B. Vakuumdestillation) einfach und kostengünstig in eine hohe optische Qualität überführt werden.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine Immersionsflüssigkeit, welche zumindest eine Verbindung der allgemeinen Formel I
umfasst, bei welcher R₁ und R₂ jeweils wenigstens eine ungesättigte und/oder aromatische Ringstruktur umfassen, X: NR₃ mit R₃ ausgewählt aus Wasserstoff oder Kohlenwasserstoff,
bedeutet, wobei Y unabhängig voneinander O, S oder NR₄ mit R₄ ausgewählt aus Wasserstoff oder Kohlenwasserstoff bedeutet. Dabei sind alle Enantiomere und racemischen Gemische der Verbindung als mitumfasst anzusehen. Die Verbindung der allgemeinen Formel I besitzt bei 20°C im Wellenlängenbereich zwischen 435 nm und 440 nm einen Brechungsindex n von mindestens 1,60. Die Immersionsflüssigkeit eignet sich insbesondere für Immersionsobjektive mit hoher NA für Mikroskope, insbesondere Nahfeldmikroskope, und besitzt eine Vielzahl von vorteilhaften Eigenschaften. So weist die Verbindung der allgemeinen Formel I einen hohen Brechungsindex n von mindestens 1,60 auf, wobei aufgrund des variablen chemischen Aufbaus der Verbindung eine einfache Brechungsindexanpassung – beispielsweise an das verwendete Deckglasmaterial – ermöglicht ist. Die optischen Eigenschaften der Immersionsflüssigkeit sind daher optimal an unterschiedliche Arbeitstemperaturen, beispielsweise 23°C und 37°C, anpassbar. Darüber hinaus weist die Immersionsflüssigkeit eine besonders niedrige Eigenfluoreszenz F auf, die bei einer Anregungswellenlänge von 405 nm und einer Fluoreszenzemission bei 485 nm bei unter 10 mg/l Chininsulfatäquivalente liegt. Weitere Vorteile liegen in einer ausreichenden Benetzung von Glasoberflächen (Deckgläser etc.) sowie einer hohen Farbstabilität von gängigen Mikroskopiefarbstoffen, da die Immersionsflüssigkeit bei Arbeiten ohne Deckglas keine Entfärbung von Präparaten verursacht. Die Immersionsflüssigkeit eignet sich somit aufgrund ihrer verschiedenen Vorteile sehr gut für verschiedene Mikroskopietechniken, insbesondere für die Fluoreszenzmikroskopie. Dabei kann grundsätzlich vorgesehen sein, dass die Immersionsflüssigkeit zwei oder mehr Verbindungen der allgemeinen Formel I umfasst, wodurch eine besonders einfache und präzise Anpassbarkeit der optischen und mechanischen Eigenschaften der Immersionsflüssigkeit an unterschiedliche Anforderungsprofile gegeben ist. Aufgrund der Ringstrukturen ist die Immersionsflüssigkeit hochsiedend und verdunstet bei den genannten Arbeitstemperaturen nicht bzw. nicht in nennenswertem Umfang. Hierdurch wird einerseits zuverlässig sichergestellt, dass während der Anwendung keine Brechzahländerungen auftreten, andererseits werden auch die Immissionswerte im Arbeitsbereich erheblich verringert.
Weitere Vorteile ergeben sich, indem die Verbindung der allgemeinen Formel I bei 20°C im Wellenlängenbereich zwischen 440 nm und 645 nm einen Brechungsindex n von mindestens 1,52 und vorzugsweise von mindestens 1,57 besitzt. Hierdurch besitzt die Immersionsflüssigkeit über einen großen Wellenlängenbereich einen hohen Brechungsindex, wodurch verschiedenste Mikroskopietechniken mit hoher Auflösung durchführbar sind.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft eine Verwendung einer der Immersionsflüssigkeiten gemäß einem der vorhergehenden Ausführungsbeispiele als Immersionsöl für ein Mikroskop, insbesondere für ein Nahfeldmikroskop. Die sich hieraus ergebenden Merkmale und deren Vorteile sind den vorhergehenden Beschreibungen zu entnehmen und gelten entsprechend für die erfindungsgemäße Verwendung.
Weitere Merkmale der Erfindung ergeben sich aus den Ansprüchen und den Ausführungsbeispielen. Die vorstehend in der Beschreibung genannten Merkmale und Merkmalskombinationen sowie die nachfolgend in den Ausführungsbeispielen genannten Merkmale und Merkmalskombinationen sind nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar, ohne den Rahmen der Erfindung zu verlassen.
Bevorzugte Ausführung der Erfindung
Die folgenden Beispiele stellen Ausführungsbeispiele für Verbindungen der allgemeinen Formeln I und II dar, die einzeln oder in Kombination mit weiteren Verbindungen der allgemeinen Formeln I und II als Immersionsflüssigkeit für Mikroskope verwendbar sind. Bedarfsweise kann zusätzlich ein Zusatzstoff zum Einstellen der Viskosität ν und/oder des Brechungsindex n der Immersionsflüssigkeit auf einen vorbestimmten Parameterwert vorgesehen sein. Geeignete Zusatzstoffe umfassen beispielsweise Alkylnaphthaline wie Methyl-, Ethyl-, n-Propyl- oder iso-Propyl-Naphthalin, sowie Chlornaphthaline, Bromnaphthaline, Jodnaphthaline, Phenylnaphthaline und/oder Benzylnaphthaline.
Alle Beispiele erfüllen dabei folgende Anforderungen:

– Brechzahl n > 1,60 (bei 20°C)
– Abbe-Zahl (Dispersion) V_e ≥ 20
– Ausreichende Transmission im Bereich 380 nm bis 1000 nm
– Niedrige Eigenfluoreszenz: F (405 nm/485 nm) < 10 mg/l Chininsulfatäquivalent
– Viskosität bei Arbeitstemperatur > 80 mm²/s
– Bei üblichen Arbeitstemperatur nicht bzw. praktisch nicht flüchtig
– Ausreichende Benetzung von Glasoberflächen (Deckgläser etc.)
– Farbstabil gegenüber Mikroskopiefarbstoffen, so dass keine Entfärbung von Präparaten bei Arbeiten ohne Deckglas auftritt
– Langfristige Verfügbarkeit
– Optimierung der optischen Eigenschaften durch gängige und kostengünstige präparative Verfahren (z. B. Kurzweg-Vakuumdestillation)

Durch geeignete Auswahl und/oder Kombination der Verbindungen der allgemeinen Formeln I und II sowie gegebenenfalls eines oder mehrerer Zusatzstoffe können Immersionsflüssigkeiten bereitgestellt werden, welche unter anderem folgende Eigenschaften aufweisen:

– Immersionsflüssigkeit auf unterschiedliche Arbeitstemperaturen, insbesondere 23°C und 37°C, einstellbar (insbesondere hinsichtlich Brechungsindex und Viskosität)
– Reproduzierbarkeit der Brechzahl n auf ±.0,0005
– Möglichkeit der Brechzahlanpassung an das verwendete Deckglasmaterial

Beispiel 1
1-Naphthylessigsäure-Benzylester

(Benzyl-2-(naphthalin-1-yl)acetat)
Molekulargewicht 276 g/mol

Bezüglich der allgemeinen Formel I sind dabei:
Y = O, R₁ = R₅-Z-, R₅ = Naphthalinyl-, Z = CH₂ und R₂ = Benzyl, so dass R₁ und R₂ jeweils zumindest eine – vorliegend aromatische – Ringstruktur umfassen. 1-Naphthylessigsäure-Benzylester besitzt folgende Eigenschaften:

Brechzahlen bei 20°C: – n_g (435,8 nm) = 1,6476 – n_F' (480,0 nm) = 1,6331 – n_e (546,1 nm) = 1,6192 – n_D (589,3 nm) = 1,6130 – n_C' (643,8 nm) = 1,6072
Abbezahl (Dispersion): V_e = 23,9

Die Abbezahl wird wie folgt berechnet: V_e = (n_e – 1)/(n_F' – n_C')

Viskosität (bei 20°C): 86 mm²/s

Alternativ oder zusätzlich zur gezeigten Naphthalinyl- bzw. Phenyl-Ringstruktur kann die Verbindung der allgemeinen Formeln I, II und III grundsätzlich ein oder mehrere Ringstrukturelemente aus der nicht abschließenden Gruppe Acridinyl-, Adamantanyl-, Anthracenyl-, Azepinyl-, Azulenyl-, Benoxadiazinyl-, Benzofuranyl-, Benzopyran-onyl-, Benzopyranyl-, Benzothiophenyl-, Benzoxazinyl-, Benzyl-, Biphenyl-, Carbazolyl-, Cinnolinyl-, Coumaranyl-, Diazepinyl-, Dioxazolyl-, Dioxinyl-, Dithianyl-, Fluorenyl-, Furyl-, Guinazolinyl-, Imidazoline-2-thionyl-, Imidazolyl-, Indenyl-, Indolinyl-, Isobenzofuranyl-, Isoquinolinyl-, Isothiazolyl-, Isoxazolyl-, Morpholinyl-, Naphthyl-, Naphthyridinyl-, Norbornanyl-, Norpinanyl-, Oxadiazinyl-, Oxadiazolyl-, Oxathiazinyl-, Oxathiazolyl-, Oxathiolyl-, Oxatriazolyl-, Oxazinyl-, Oxazolonyl-, Oxazolyl-, Oxepinyl-, Phenalenyl-, Phenanthrenyl-, Phenazinyl-, Phenothiazinyl-, Phenoxazinyl-, Phenyl-, Phthalazinyl-, Pteridinyl-, Pyranyl-, Pyrazinyl-, Pyrazolyl-, Pyridazinyl-, Pyridinyl-, Pyrimidinyl-, Pyronyl-, Pyrrolyl-, Quinolinyl-, Quinolizinyl-, Quinoxalinyl-, Quinuclidinyl-, Thiadiazolyl-, Thiazolyl-, Thiepinyl-, Thiomorpholinyl-, Thiophenyl-, Thiophenyl-, Triazinyl-, Triazolyl-, Tricyclodecanyl-, Trithianyl- oder Xanthenyl- als Ringstruktur umfassen. Ebenfalls kann grundsätzlich vorgesehen sein, dass Z ein längerkettiger verzweigter oder unverzweigter Alkylrest mit 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 Kohlenstoffatomen in der Alkylkette ist. Weiterhin kann grundsätzlich vorgesehen sein, dass die Immersionsflüssigkeit halogen- und/oder schwermetallfrei und/oder ohne Zusatz von elementarem Schwefel ausgebildet ist.
Beispiel 2
1-Naphthylessigsäure-[2-(phenylthio)-ethyl]ester

(2-(Phenylthio)ethyl-2-(naphthalin-1-yl)acetat)
Molekulargewicht 322 g/mol
Brechzahlen bei 20°C: – n_g (435,8 nm) = 1,6609 – n_F' (480,0 nm) = 1,6466 – n_e (546,1 nm) = 1,6327 – n_D (589,3 nm) = 1,6262 – n_C' (643,8 nm) = 1,6202
Abbezahl (Dispersion): V_e = 24,0

Beispiel 3
1-Naphthylessigsäure-(2-methylolthienyl)ester

(Thiophen-2-ylmethyl-2-(naphthalin-1-yl)acetat)
Molekulargewicht 282 g/mol
Brechzahlen bei 20°C: – n_g (435,8 nm) = 1,6618 – n_F' (480,0 nm) = 1,6468 – n_e (546,1 nm) = 1,6327 – n_D (589,3 nm) = 1,6261 – n_C' (643,8 nm) = 1,6201
Abbezahl (Dispersion): V_e = 23,7

Beispiel 4
1-Naphthylessigsäure-(2-biphenyl)ester

Molekulargewicht 338 g/mol
Brechzahlen bei 20°C: – n_g (435,8 nm) = 1,6810 – n_F' (480,0 nm) = 1,6650 – n_e (546,1 nm) = 1,6496 – n_D (589,3 nm) = 1,6427 – n_C' (643,8 nm) = 1,6360
Abbezahl (Dispersion): V_e = 22,4

1-Naphthylessigsäure-(2-biphenyl)ester ist hochviskos.
Beispiel 5
1-Naphthylessigsäure-phenylester

(Phenyl-2-(naphthalin-1-yl)acetat)
Molekulargewicht 262 g/mol
Brechzahlen bei 20°C: – n_g (435,8 nm) = 1,6562 – n_F' (480,0 nm) = 1,6413 – n_e (546,1 nm) = 1,6269 – n_D (589,3 nm) = 1,6201 – n_C' (643,8 nm) = 1,6141
Abbezahl (Dispersion): V_e = 23,0

Beispiel 6
1-Naphthylessigsäure-thiophenylester

(S-Phenyl-2-(naphthalin-1-yl)ethanthioat)
Molekulargewicht 278 g/mol
Brechzahlen bei 20°C: – n_g (435,8 nm) = 1,7059 – n_F' (480,0 nm) = 1,6877 – n_e (546,1 nm) = 1,6706 – n_D (589,3 nm) = 1,6630 – n_C' (643,8 nm) = 1,6555
Abbezahl (Dispersion): V_e = 20,8
Viskosität (bei 20°C): 1022 mm²/s

Beispiel 7
1-Naphthylessigsäure-thiobenzylester

(S-Benzyl-2-(naphthalin-1-yl)ethanthioat)
Molekulargewicht 292 g/mol
Brechzahlen bei 20°C: – n_g (435,8 nm) = 1,6902 – n_F' (480,0 nm) = 1,6739 – n_e (546,1 nm) = 1,6579 – n_D (589,3 nm) = 1,6509 – n_C' (643,8 nm) = 1,6442
Abbezahl (Dispersion): V_e = 22,2
Viskosität (bei 20°C): 308 mm²/s

Beispiel 8
1-Naphthoesäure-benzylester

(Benzyl-1-naphthoat)
Molekulargewicht 262 g/mol
Brechzahlen bei 20°C: – n_g (435,8 nm) = 1,6710 – n_F, (480,0 nm) = 1,6536 – n_e (546,1 nm) = 1,6368 – n_D (589,3 nm) = 1,6292 – n_C' (643,8 nm) = 1,6225
Abbezahl (Dispersion): V_e = 20,5

Beispiel 9
2-Naphthoxyessigsäure-benzylester

(Benzyl-2-(naphthalin-2-yloxy)acetat)
Molekulargewicht 292 g/mol
Brechzahlen bei 20°C: – n_g (435,8 nm) = 1,6506 – n_F' (480,0 nm) = 1,6359 – n_e (546,1 nm) = 1,6219 – n_D (589,3 nm) = 1,6158 – n_C' (643,8 nm) = 1,6094
Abbezahl (Dispersion): V_e = 23,5
Schmelzpunkt ca. 55°C

Beispiel 10
2-Thiophenessigsäure-(1-methylolnaphthyl)ester

(Naphthalin-1-ylmethyl-2-(thiophen-2-yl)acetat)
Molekulargewicht 282 g/mol
Brechzahlen bei 20°C: – n_g (435,8 nm) = 1,6601 – n_F' (480,0 nm) = 1,6455 – n_e (546,1 nm) = 1,6312 – n_D (589,3 nm) = 1,6249 – r_C' (643,8 nm) = 1,6186
Abbezahl (Dispersion): V_e = 23,5

Beispiel 11
Phenylthioessigsäure-benzylester

(Benzyl-2-(phenylthio)acetat)
Molekulargewicht 258 g/mol
Viskosität (bei 20°C): 13 mm²/s
Brechzahlen bei 20°C: – n_g (435,8 nm) = 1,6166 – n_F' (480,0 nm) = 1,6056 – n_e (546,1 nm) = 1,5948 – n_D (589,3 nm) = 1,5896 – n_C' (643,8 nm) = 1,5845
Abbezahl (Dispersion): V_e = 28,2

Beispiel 12
Phenylthioessigsäure-(1-methylolnaphthyl)ester

(Naphthalin-1-ylmethyl-2-(phenylthio)acetat)
Molekulargewicht 308 g/mol
Brechzahlen bei 20°C: – n_g (435,8 nm) = 1,6768 – n_F' (480,0 nm) = 1,6610 – n_e (546,1 nm) = 1,6459 – n_D (589,3 nm) = 1,6390 – n_C' (643,8 nm) = 1,6327
Abbezahl (Dispersion): V_e = 22,8

Beispiel 13
Phenylthioessigsäure-(2-phenylthioethyl)ester

(2-(Phenylthio)ethyl-2-(phenylthio)acetat)
Molekulargewicht 304 g/mol
Brechzahlen bei 20°C: – n_g (435,8 nm) = 1,6387 – n_F' (480,0 nm) = 1,6266 – n_e (546,1 nm) = 1,6148 – n_D (589,3 nm) = 1,6093 – n_C' (643,8 nm) = 1,6041
Abbezahl (Dispersion): V_e = 27,3

Beispiel 14
Phenylthioessigsäure-(biphenyl-4-methyl)ester

Molekulargewicht 334 g/mol
Brechzahlen bei 20°C: – n_g (435,8 nm) = 1,6661 – n_F' (480,0 nm) = 1,6515 – n_e (546,1 nm) = 1,6369 – n_D (589,3 nm) = 1,6301 – n_C' (643,8 nm) = 1,6234
Abbezahl (Dispersion): V_e = 22,7
Schmelzpunkt ca. 53°C

Beispiel 15
(2-Phenylthio)phenylessigsäure-(1-methylolnaphthyl)ester

(Naphthalin-1-ylmethyl-2-phenyl-2-(phenylthio)acetat)
Molekulargewicht 384 g/mol
Brechzahlen bei 20°C: – n_g (435,8 nm) = 1,6851 – n_F' (480,0 nm) = 1,6693 – n_e (546,1 nm) = 1,6539 – n_D (589,3 nm) = 1,6468 – n_C' (643,8 nm) = 1,6403
Abbezahl (Dispersion): V_e = 22,5

(Naphthalin-1-ylmethyl-2-phenyl-2-(phenylthio)acetat) ist hochviskos.
Beispiel 16
Zur Herstellung einer als Immersionsöl für ein Nahfeldmikroskop verwendbaren Immersionsflüssigkeit gemäß einem Ausführungsbeispiel werden 92 mol% 1-Naphthylessigsäure-thiophenylester (NETPE) und 8 mol% 1-Naphthylessigsäure-thiobenzylester (NETBE) vermischt. Die resultierende Immersionsflüssigkeit besitzt folgende Eigenschaften:

Brechzahlen bei 20°C: – n_g (435,8 nm) = 1,7041 – n_F' (480,0 nm) = 1,6860 – n_e (546,1 nm) = 1,6690 – n_D (589,3 nm) = 1,6617 – n_C' (643,8 nm) = 1,6543
Abbezahl (Dispersion): V_e = 21,1

Beispiel 17

Zur Herstellung einer als Immersionsöl für ein Nahfeldmikroskop verwendbaren Immersionsflüssigkeit gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel werden 25 mol% 1-Naphthylessigsäure-Thiophenylester (NETPE) und 75 mol% 1-Naphthylessigsaure-Thiobenzylester (NETBE) vermischt. Die resultierende Immersionsflüssigkeit besitzt die in Tabelle 1 aufgeführten Eigenschaften. Tabelle 1

Brechzahlen bei 20°C	Brechzahlen bei 23°C
n_g (435,8 nm) = 1,6937	n_g (435,8 nm) = 1,6924
n_F' (480,0 nm) = 1,6768	n_F' (480,0 nm) = 1,6755
n_e (546,1 nm) = 1,6608	n_e (546,1 nm) = 1,6596
n_D (589,3 nm) = 1,6536	n_D (589,3 nm) = 1,6523
n_C' (643,8 nm) = 1,6466	n_C' (643,8 nm) = 1,6453
Viskosität (bei 20° C): 391 mm²/s	Viskosität (bei 20°C): 277 mm²/s
Abbezahl (Dispersion): V_e = 21,9

Durch Variation der Zusammensetzung und Mischungsverhältnisse der Immersionsflüssigkeit ist es möglich, eine gewünschte Soll-Brechzahl auf n_e ±0,0005 reproduzierbar einzustellen. Damit ist es möglich, Immersionsflüssigkeit und Optikdesign der Immersionsobjektive optimal aufeinander abzustimmen. Außerdem besteht die Möglichkeit, eine Brechzahlanpassung an das jeweils verwendete Deckglasmaterial zu realisieren. Dies stellt eine wichtige Anforderung beispielsweise bei der Nahfeldmikroskopie dar. Setzt man im vorliegenden Ausführungsbeispiel als Variationsbreite
10 mol% NETPE + 90 mol% NETBE bis
90 mol% NETPE + 10 mol% NETBE
an, sind mit dieser Mischung folgende Brechzahlbereiche möglich:
bei 23°C: n_e = 1,658 bis 1,668
bei 37°C: n_e = 1,652 bis 1,662
Geeignete Deckglasmaterialien sind beispielsweise:

– SF 9 (n_e = 1,65907/V_e = 33,41); und
– SF 50 (n_e = 1,65944/V_e = 32,63)

Immersionsflüssigkeit IF Brechzahlen 23°C	SF 50 (Schott)	Δn (IF-SF50)
n_g (435,8 nm) = 1,6924	1,6806	0,0118
n_F' (480,0 nm) = 1,6755	1,6700	0,0055
n_e (546,1 nm) = 1,6596	1,6594	0,0002
n_D (589,3 nm) = 1,6523	1,6546	–0,0023
n_C' (643,8 nm) = 1,6453	1,6498	–0,0045

Beispiel 18
Zur Herstellung von als Immersionsöl für ein Nahfeldmikroskop verwendbaren Immersionsflüssigkeiten (IF) gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel werden folgende Mischungen hergestellt:
IF1:

– 98 Gew% Mischester aus 40 mol% NETPE + 60 mol% NETBE
– 2 Gew% NETBE

IF2:

– 97,5 Gew% Mischester aus 92 mol% NETPE + 8 mol% NETBE
– 2,5 Gew% NEBE mit: NETPE = 1-Naphthylessigsäure-thiophenylester NETBE = 1-Naphthylessigsäure-thiobenzylester NEBE = 1-Naphthylessigsäure-benzylester

Die Immersionsflüssigkeiten IF1 und IF2 besitzen die in Tabelle 3 aufgeführten Eigenschaften, wobei IF1 auf eine Arbeitstemperatur von 23°C und IF2 auf eine Arbeitstemperatur von 37°C optimiert ist. Tabelle 3

	IF1		IF2
Arbeitstemperatur	23°C	37°C	37°C	23°C
Brechzahlen n
n_g (435,8 nm)	1,6942	1,6881	1,6953	1,7015
n_F' (480,0 nm)	1,6774	1,6713	1,6779	1,6840
n (508,5 nm)	1,6695	1,6635	1,6696	1,6757
n_e (546,1 nm)	1,6610	1,6550	1,6610	1,6671
n (578,0 nm)	1,6555	1,6495	1,6553	1,6614
n_D (589,3 nm)	1,6539	1,6479	1,6535	1,6596
n_C' (643,8 nm)	1,6470	1,6410	1,6463	1,6523
(n_F' – n_C')	0,0304	0,0303	0,0316	0,0317
Dispersion V_e	21,7	21,6	20,9	21,0
Restfluoreszenz F (405 nm/485 nm) [Chininsulfatäquivalent]	11,0 mg/l			11,5 mg/l
Transmission [d = 10 mm]
bei 700 nm	99%			99%
bei 600 nm	99%			99%
bei 550 nm	98%			99%
bei 500 nm	93%			93%
bei 450 nm	90%			91%
bei 420 nm	76%			75%
bei 400 nm	42%			38%
bei 390 nm	21%			18%
bei 380 nm	7,4%			6,5%
bei 370 nm	1,3%			1,2%
Viskosität [mm²/s]	310		130	550

Die in den Unterlagen angegebenen Parameterwerte zur Definition von Prozess- und Messbedingungen für die Charakterisierung von spezifischen Eigenschaften des Erfindungsgegenstands sind auch im Rahmen von Abweichungen – beispielsweise aufgrund von Messfehlern, Systemfehlern, Einwaagefehlern, DIN-Toleranzen und dergleichen – als vom Rahmen der Erfindung mitumfasst anzusehen.

Claims

Immersionsflüssigkeit, umfassend zumindest eine Verbindung der allgemeinen Formel I
bei welcher: R₁ und R₂ jeweils wenigstens eine ungesättigte und/oder aromatische Ringstruktur umfassen; und X: NR₃ mit R₃ ausgewählt aus Wasserstoff oder Kohlenwasserstoff,
bedeutet, wobei Y unabhängig voneinander O, S oder NR₄ mit R₄ ausgewählt aus Wasserstoff oder Kohlenwasserstoff bedeutet, wobei die Verbindung der allgemeinen Formel I bei 20°C im Wellenlängenbereich zwischen 435 nm und 645 nm einen Brechungsindex n von wenigstens 1,52 besitzt.
Immersionsflüssigkeit nach Anspruch 1, bei welcher R₁- in der allgemeinen Formel I die allgemeine Formel II R₅-Z- (Formel II) besitzt, wobei: R₅ die wenigstens eine ungesättigte und/oder aromatische Ringstruktur umfasst; und Z (CR₆R₆)_n bedeutet, wobei R₆ jeweils unabhängig aus Wasserstoff oder Kohlenwasserstoff ausgewählt und n eine ganze Zahl zwischen 1 und 10 ist.
Immersionsflüssigkeit nach Anspruch 1 oder 2, bei welcher die Verbindung der allgemeinen Formel I bei 20°C im Wellenlängenbereich zwischen 435 nm und 645 nm einen Brechungsindex n von wenigstens 1,60 besitzt.
Immersionsflüssigkeit nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei welcher die Verbindung der allgemeinen Formel I bei 20°C und einer Schichtdicke von 10 mm im Wellenlängenbereich zwischen 370 nm und 400 nm eine Transmission von wenigstens 1%, insbesondere von wenigstens 2%, und/oder im Wellenlängenbereich zwischen 400 nm und 420 nm eine Transmission von wenigstens 15%, insbesondere von wenigstens 20%, und/oder im Wellenlängenbereich zwischen 420 nm und 450 nm eine Transmission von wenigstens 40%, insbesondere von wenigstens 50%, und/oder im Wellenlängenbereich zwischen 450 nm und 800 nm eine Transmission von wenigstens 70%, insbesondere von wenigstens 80%, besitzt.
Immersionsflüssigkeit nach einem der Ansprüche 1 bis 4, welche im Temperaturbereich zwischen 20°C und 40°C eine Viskosität ν von wenigstens 50 mm²/s, insbesondere von wenigstens 100 mm²/s, besitzt.
Immersionsflüssigkeit nach einem der Ansprüche 1 bis 5, welche im Temperaturbereich zwischen 20°C und 40°C eine Abbe-Zahl V_e von wenigstens 18, insbesondere von wenigstens 20, besitzt.
Immersionsflüssigkeit nach einem der Ansprüche 1 bis 6, bei welcher R₁ und/oder R₂ wenigstens eine monocyclische und/oder bicyclische und/oder tricyclische Ringstruktur umfasst.
Immersionsflüssigkeit nach einem der Ansprüche 1 bis 7, bei welcher R₁ und/oder R₂ wenigstens eine Ringstruktur mit zumindest einem Heteroatom, insbesondere O, N und/oder S, umfasst.
Immersionsflüssigkeit nach einem der Ansprüche 1 bis 8, bei welcher R₁ und/oder R₂ wenigstens eine weitere funktionelle Gruppe umfasst.
Immersionsflüssigkeit nach Anspruch 9, bei welcher die wenigstens eine weitere funktionelle Gruppe eine Carbonsäure, eine Thiocarbonsäure, einen Carbonsäureester, insbesondere einen Alkyl- und/oder Arylcarbonsäureester, einen Thiocarbonsäureester, insbesondere einen Alkyl- und/oder Arylthiocarbonsäureester, einen Ether, insbesondere einen Alkyl- und/oder Arylether, einen Thioether, insbesondere einen Alkyl- und/oder Arylthioether, ein Halogenid, insbesondere ein Chlorid, Bromid und/oder Iodid, ein Keton, ein Thioketon, einen Aldehyd, einen Thioaldehyd, einen Alkohol, ein Thiol und/oder ein Amin umfasst.
Immersionsflüssigkeit nach einem der Ansprüche 1 bis 10, welche zumindest einen Zusatzstoff umfasst, mittels welchem die Viskosität ν und/oder der Brechungsindex n der Immersionsflüssigkeit auf einen vorbestimmten Parameterwert eingestellt ist.
Immersionsflüssigkeit nach Anspruch 11, bei welcher der zumindest eine Zusatzstoff ein Alkylnaphthalin, ein Chlornaphthalin, ein Bromnaphthalin, ein Jodnaphthalin, ein Phenylnaphthalin und/oder ein Benzylnaphthalin umfasst.
Immersionsflüssigkeit, umfassend zumindest eine Verbindung der allgemeinen Formel I
bei welcher: R₁ und R₂ jeweils wenigstens eine ungesättigte und/oder aromatische Ringstruktur umfassen; X: NR₃ mit R₃ ausgewählt aus Wasserstoff oder Kohlenwasserstoff,
bedeutet, wobei Y unabhängig voneinander O, S oder NR₄ mit R₄ ausgewählt aus Wasserstoff oder Kohlenwasserstoff bedeutet; und die Verbindung der allgemeinen Formel I bei 20°C im Wellenlängenbereich zwischen 435 nm und 440 nm einen Brechungsindex n von mindestens 1,60 besitzt.
Immersionsflüssigkeit nach Anspruch 13, bei welcher die Verbindung der allgemeinen Formel I bei 20°C im Wellenlängenbereich zwischen 440 nm und 645 nm einen Brechungsindex n von mindestens 1,52 und vorzugsweise von mindestens 1,57 besitzt.
Verwendung einer Immersionsflüssigkeit gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 und/oder 13 bis 14 als Immersionsöl für ein Mikroskop, insbesondere für ein Nahfeldmikroskop.