DE102008000715A1

DE102008000715A1 - Verfahren zur in vitro Erfasssung und Unterscheidung von pathophysiologischen Zuständen

Info

Publication number: DE102008000715A1
Application number: DE102008000715A
Authority: DE
Inventors: Stefan Priv.-Doz. Dr. Russwurm
Original assignee: SIRS Lab GmbH
Current assignee: SIRS Lab GmbH
Priority date: 2008-03-17
Filing date: 2008-03-17
Publication date: 2009-09-24
Anticipated expiration: 2028-03-18
Also published as: WO2009115478A2; US8765371B2; GB2470707B; DE102008000715B9; CA2718741A1; GB201017326D0; WO2009115478A3; GB2470707C; US20110098195A1; GB2470707A; JP2011517401A; DE102008000715B4

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur In-vitro-Erfassung und/oder Unterscheidung und/oder Verlaufsbeobachtung von pathophysiologischen Zuständen mittels Probennukleinsäuren, Bestimmung von Genaktivitäten mittels einer Mehrzahl von Polynukleotiden, Bestimmung von Genaktivitäten wenigstens eines internen Referenzgens sowie Bilden eines Index-Wertes aus den einzelnen bestimmten normalisierten Genaktivitäten eines Multigenbiomarkers, der den phatophysiologischen Zustand anzeigt (Figur 2).

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur in vitro Erfassung und/oder Unterscheidung und/oder Verlaufsbeobachtung von pathophysiologischen Zuständen gemäß Anspruch 1, die Verwendung einer Mehrzahl von Polynukleotiden und/oder deren Genloci und/oder deren Transkripten zur Bildung wenigstens eines Multigenbiomarkers zur Herstellung eines Multiplex-Assays gemäß Anspruch 4; die Verwendung mindestens eines Polynukleotids und/oder deren Genloci und/oder deren Transkripten zur Herstellung eines Assays gemäß Anspruch 11, sowie einen Kit zur Durchführung des Verfahrens gemäß Anspruch 14.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von Polynukleotiden zur Erfassung von Genaktivitäten von mindestens einem Multigenbiomarker, zur Herstellung eines Hilfsmittels zur Diagnose bei Patienten mit bestimmten pathophysiologischen Zuständen, wie beispielsweise Sepsis und Sepsisähnliche Zuständen, mit ähnlichen Merkmalen wie ein „In Vitro Diagnostic Multivariate Index Assay” (IVDMIA).
Sepsis („Blutvergiftung”) ist eine lebensbedrohliche Infektion, die den gesamten Organismus erfasst. Sie ist mit hoher Sterblichkeit verbunden, kommt immer häufiger vor und erfasst Menschen in jedem Lebensalter. Sepsis gefährdet den medizinischen Fortschritt in vielen Bereichen der Hochleistungsmedizin und verbraucht einen Großteil der Ressourcen im Gesundheitswesen. Die Sterblichkeit der schweren Sepsis hat sich in den letzten Jahrzehnten nicht entscheidend verbessert. Die letzten beiden Innovationssprünge nach Einführung der Blutkultur (ca. 1880) waren die Einführung der Antibiotika vor über 60 und der Beginn der Intensivmedizin vor etwa 50 Jahren. Um heute ähnlich entscheidende Behandlungsfortschritte zu erzielen, müssen neuartige Diagnostika zur Verfügung gestellt werden.
Sepsis wird durch Infektionserreger verursacht. Da es bislang keine spezielle Therapie gegen die Sepsis gibt, hängt der Erfolg der Behandlung weitgehend von der erfolgreichen Bekämpfung der zugrunde liegenden Infektion und der Qualität der intensivmedizinischen Behandlung ab. Entscheidend für das Überleben ist die frühzeitige Gabe eines Antibiotikums, das außerdem den verursachenden Erreger erfolgreich bekämpft [Kumar et. al., 2006]. Defizite der Sepsis-Diagnostik verzögern jedoch den Therapiebeginn und die Wahl eines geeigneten Antibiotikums. Da die Identifizierung des Sepsiserregers mit den derzeitigen Methoden der Blutkultur nur in weniger als 25% der Sepsisfälle gelingt und die Befunde im Fall des Erregernachweises erst nach 2–3 Tagen vorliegen, muss die initiale Wahl des Antibiotikums oder Antimykotikums (gegen Pilze gerichtete Substanzen) „kalkuliert”, d. h. auf Verdacht gewählt werden. In 20–30% der Fälle ist diese Wahl nicht richtig.
Weitere Ursachen für die Verzögerung der Therapie liegen in der Fehlinterpretation der Krankheitssymptome und Laborwerte. Verbesserte Diagnostika, die die Sepsisdiagnose vereinfachen und beschleunigen, können zu einer erheblichen Reduktion der Sepsissterblichkeit und Verkürzung ihrer Behandlungsdauer beitragen. Medizinische Fachgesellschaften bestätigen die Defizite der bisherigen Sepsis-Diagnostik in Umfragen unter nordamerikanischen und europäischen Intensivmedizinern [Marshall et. al., 2003]. Auch die Betroffeneninitiative „Deutsche Sepsis Hilfe e.V.” und der Deutschen Sepsis-Gesellschaft beklagen die Defizite.
Im Zuge der Entwicklung marktreifer in-vitro-Diagnostika aus dem Bereich molekularer Diagnostik wurde am 26.7.2007 ein Richtlinienentwurf der Food and Drug Administration (FDA) der Vereinigten Staaten von Amerika veröffentlicht. Diese Richtlinie liefert Empfehlungen, Definitionen und Anhaltspunkte für den Entwicklungs- und Zulassungsprozess. Weiterhin werden Spezifikationen für die neue Klasse der „in vitro-diagnostischen multivariaten Index-Assays (IVDMIA)” vorgeschlagen. Kennzeichen dieser Assays sind:

1) Die Kombination von mehreren Einzelwerten mittels eines Interpretationsschrittes, um einen einzelnen patientenspezifischen Ausgabewert in Form eines Index, Score oder einer Klassifikation zu erhalten. Dieser Wert ist für diagnostische Aussagen, zur Schadensbegrenzung, Behandlung oder Vorbeugung einer Krankheit einsetzbar.
2) Das erreichte Ergebnis ist von den Messwerten in einer Weise abgeleitet, die keine Rückschlüsse auf die eigentlichen Messdaten erlaubt. Daher kann das Ergebnis vom End-Anwender nicht bestätigt bzw. nachvollzogen werden.
3) Dadurch ist es notwendig, dem Anwender alle Informationen zur Interpretation des Testergebnisses zur Verfügung zu stellen.

Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere Gene und/oder deren Fragmente und ihre Verwendung zur Erstellung von Multigenbiomarkern, welche spezifisch für einen Zustand und/oder Untersuchungsfrage sind.
Die Erfindung betrifft ferner von den Markergenen abgeleitete PCR-Primer und Sonden für Hybridisierungs- bzw. Vervielfertigungsverfahren.
Nach wie vor ist die Sepsis eines der schwierigsten Krankheitsbilder in der modernen Intensivmedizin, wobei für den klinisch tätigen Arzt nicht nur die Therapie, sondern auch die Diagnose eine Herausforderung darstellt. Trotz Fortschritten im pathophysiologischen Verständnis und der supportiven Behandlung von Intensivpatienten sind generalisierte inflammatorische Zustände wie SIRS und Sepsis bei Patienten auf Intensivstationen sehr häufig auftretende und erheblich zur Sterblichkeit beitragende Erkrankungen [Marshal et al., 2003; Alberti et al., 2003]. Die Sterblichkeit beträgt ca. 20% bei SIRS, ca. 40% bei Sepsis und steigt bei Entwicklung von multiplen Organdysfunktionen bis auf 70–80% an [Brun-Buisson et al., 1995; Le-Gall et al., 1995; Brun-Buisson et al., 2003]. Der Morbiditäts- und Letalitätsbeitrag von SIRS und Sepsis ist von fachübergreifender klinisch-medizinischer Bedeutung, denn dadurch werden in zunehmendem Maße die Behandlungserfolge der fortgeschrittensten Therapieverfahren zahlreicher medizinischer Fachgebiete (z. B. Traumatologie, Neurochirurgie, Herz-/Lungenchirurgie, Viszeralchirurgie, Transplantationsmedizin, Hämatologie/Onkologie, etc.) gefährdet, denen ohne Ausnahme eine Erhöhung des Krankheitsrisikos für SIRS und Sepsis immanent ist. Dies drückt sich auch im kontinuierlichen Anstieg der Häufigkeit der Sepsis aus: zwischen 1979 und 1987 wurde ein Anstieg um 139%, nämlich von 73,6 auf 176 Krankheitsfälle je 100.000 Krankenhauspatienten verzeichnet [MMWR Morb Mortal Wkly Rep 1990]. Die Senkung der Morbidität und Letalität einer Vielzahl von schwer erkrankten Patienten ist daher an einen gleichzeitigen Fortschritt in der Vorbeugung, Behandlung und insbesondere der Erkennung und Verlaufsbeobachtung der Sepsis und schweren Sepsis gebunden.
Im Laufe der Zeit hat der Sepsisbegriff einen erheblichen Bedeutungswandel erfahren. Eine Infektion bzw. der dringliche Verdacht auf eine Infektion sind auch heute noch wesentlicher Bestandteil aktueller Sepsisdefinitionen. Besondere Berücksichtigung findet jedoch dabei die Beschreibung Infektionsort-ferner Organfehlfunktionen im Rahmen der inflammatorischen Wirtsreaktion. Im internationalen Schrifttum haben sich zwischenzeitlich die Kriterien der Konsensuskonferenz des „American College of Chest Physicians/Society of Critical Care Medicine Consensus Conference (ACCP/SCCM)” aus dem Jahr 1992 am breitesten zur Definition des Sepsis-Begriffs durchgesetzt [Bone et al., 1992]. Entsprechend dieser Kriterien werden die klinisch definierten Schweregrade „systemic inflammatory response syndrom” (SIRS), „Sepsis”, „severe Sepsis” und „septic shock” unterschieden. Als SIRS wird dabei die systemische Antwort des inflammatorischen Systems auf einen nichtinfektiösen Reiz definiert. Dazu müssen mindestens zwei der folgenden klinischen Kriterien erfüllt sein: Fieber > 38°C oder Hypothermie < 36°C, eine Leukozytose > 12 g/l oder eine Leukopenie < 4 g/l bzw. eine Linksverschiebung im Differentialblutbild, eine Herzfrequenz von über 90/min, eine Tachypnoe > 20 Atemzüge/min oder ein PaCO₂ (Partialdruck des Kohlendioxid im arteriellen Blut) < 4,3 kPa. Diese Definition hat eine hohe Sensitivität, aber eine niedrige Spezifität. Für intensivmedizinische Belange ist sie wenig hilfreich, da in der Regel jeder Intensivpatient, zumindest für kurze Zeit, die SIRS-Kriterien erfüllt.
Als Sepsis werden solche klinischen Zustände definiert, bei denen die SIRS-Kriterien erfüllt sind und ursächlich eine Infektion nachgewiesen wird oder zumindest sehr wahrscheinlich ist. Eine Infektion wird definiert als ein pathologischer Prozess, welcher durch eine Invasion von Pathogenen beziehungsweise potentiell pathogenen Organismen in ein normalerweise steriles Gewebe hervorgerufen wird. Wenn es dem Körper nicht gelingt, diese Infektion auf den Ursprungsort zu begrenzen, induzieren die Krankheitserreger oder deren Toxine in den vom Infektionsort entfernten Organen bzw. Geweben des Körpers eine Entzündung. Eine sofortige intensivmedizinische Behandlung, die zielgerichtete Gabe von Antibiotika und die operative Sanierung des infektiösen Herdes sind nötig, um eine Genesung zu erreichen. Eine schwere Sepsis ist vom zusätzlichen Auftreten von Organfehlfunktionen gekennzeichnet. Häufige Organfehlfunktionen sind Änderungen der Bewusstseinslage, eine Oligurie, eine Laktazidose oder eine Sepsis-induzierte Hypotension mit einem systolischen Blutdruck von weniger als 90 mmHg bzw. ein Druckabfall um mehr als 40 mmHg vom Ausgangswert. Wenn eine solche Hypotension nicht durch die Verabreichung von Kristalloiden und/oder Kolloiden zu beheben ist und es zusätzlich zu einer Katecholaminpflichtigkeit des Patienten kommt, so spricht man von einem septischen Schock. Dieser wird bei etwa 20% aller Sepsispatienten nachgewiesen.
Es besteht unter vielen Medizinern Einigkeit darüber, dass die Konsensuskriterien nach [Bone et al., 1992] keiner spezifischen Definition von Sepsis entsprechen. So zeigte eine von der European Society of Intensive Care Medicine (ESICM) durchgeführte Umfrage, dass 71% der befragten Ärzte trotz langjähriger klinischer Erfahrungen Unsicherheit bei der Diagnosestellung einer Sepsis hatten [Poeze et al., 2003]. Der Versuch, eine einheitliche Terminologie durchzusetzen, fand in der klinischen Umsetzung variable Akzeptanz. Insbesondere die Fortschritte im Verständnis der Pathophysiologie der Sepsis veranlasste verschiedene Experten, nach einer entsprechenden Modifikation der bisherigen Definitionen zu suchen. Die Definitionen von Sepsis, schwerer Sepsis und septischem Schock wurden bestätigt und als nützlich für Kliniker und Forscher beurteilt. Allerdings wurden die diagnostischen Kriterien der Sepsis erheblich erweitert, um dem klinischen Aspekt der Infektabwehr gerecht zu werden. Die internationale Sepsis-Konferenz 2001 schlug außerdem ein neues Konzept (PIRO genannt) zur Beschreibung der Sepsis vor, welches sich aus den Kriterien Prädisposition, Infektion, Immunantwort (Response) und Organdysfunktion zusammensetzt [Levy et al., 2003]. Trotz einer neuen Definition der SIRS/Sepsis mit dem Akronym PIRO [Opal et al., 2005] wird in den meisten Studien immer noch die ACCP/SCCM Konsensuskonferenz aus dem Jahre 1992 benutzt [Bone et al., 1992], um ihre Patienten zu klassifizieren.
Mehrere Ansätze zur Diagnosestellung von SIRS und Sepsis wurden entwickelt. Diese Ansätze können in 3 Gruppen geteilt werden.
Der erste Gruppe enthält Score-Systeme wie beispielsweise APACHE, SAPS und SIRS welche die Patienten auf der Basis einer Vielzahl physiologischer Indices stratifizieren können. Während in einigen Studien für den APACHE II Score ein diagnostisches Potential nachgewiesen werden konnte, haben andere Studien gezeigt, dass APACHE II und SAPS II nicht zwischen Sepsis und SIRS differenzieren können [Carrigan et al., 2004].
Die zweite Gruppe enthält Proteinmarker, die aus Plasma und Serum nachgewiesen werden. Solche sind zum Beispiel CA125, S100B, Copeptin, Glycin N-acyltransferase (GNAT), Protachykinin und/oder seine Fragmente, Aldose 1-Epimerase (Mutarotase), Chp, Carbamoylphosphat Synthetase 1, LASP-1 (Brahms Diagnostika GmbH Deutschland), IL-1 Ra, MCP-1, MPIF-1, TNF-R1, MIG, BLC, HVEM, IL-15, MCP-2, M-CSF, MIP-3b, MMP-9, PARC, ST-2; IL-6, sIL-2R, CD141, MMP-9, EGF, ENA-78, EOT, Gro-beta, IL-1b, Leptin, MIF, MIP-1a, OSM, Protein C, P-Selectin, und HCC4 (Molecular Staging, Inc., USA) oder CD 14 Antigen, Lipopolysaccharid-Bindungsstellen auf den Proteinen Alkalische Phosphatase und Inter-Alpha-Trypsin Inhibitor (Mochida Pharm Co, Ltd. Japan). Trotz der großen Menge von patentierten Biomarkern konnten sich nur wenige im klinischen Alltag durchsetzen. Von diesen scheinen Procalcitonin (PCT, BRAHMS) und das C-reaktive Protein (CRP, Eli Lilly) die Marker zu sein, die am besten zwischen infektiösen und nicht infektiösen Ursachen der SIRS unterscheiden können.
Procalcitonin ist ein 116 Aminosäuren langes Peptid das eine Rolle bei Entzündungsreaktionen spielt. Dieser Marker ist im Laufe der Zeit zunehmend als neuer Infektionsmarker auf Intensivstationen eingesetzt worden [Sponholz et al., 2006]. Dieser Marker gilt als Infektionsmarker und dient dazu, den Schweregrad der Sepsis festzulegen, wobei die Dynamik der Werte wichtiger ist als die Absolutwerte selbst, um z. B. bei Herzchirurgie-Patienten zwischen infektiöser und nicht-infektiöser Komplikation zu unterscheiden [Sponholz et al., 2006]. Trotz der weitgehenden Akzeptanz des Biomarkers PCT konnte in internationalen Studien gezeigt werden, dass die erreichten Sensitivitäten und Spezifitäten des Sepsismarkers PCT vor allem bei der Abgrenzung einer systemischen bakteriellen SIRS, also Sepsis, von einer nicht -bakteriellen SIRS noch immer unzureichend sind [Ruokonen et al., 1999; Suprin et al. 2000; Ruokonen et al., 2002; Tang et al., 2007a]. Die Meta-Analyse von Tang und Kollegen [Tang et al., 2007a], in der 18 Studien berücksichtigt wurden, zeigt, dass PCT nur schlecht geeignet ist, um SIRS von Sepsis zu diskriminieren. Darüberhinaus betonen die Autoren, dass PCT eine sehr schwache diagnostische Genauigkeit mit einem Odd Ratio (OR) von 7.79 hat. Als Regel benennen die Autoren, dass ein OR < 25 nicht aussagekräftig, zwischen 25 und 100 hilfreich und im Falle von mehr als 100 hoch genau ist [Tang et al., 2007a].
C-reaktives Protein (CRP) ist ein 224 Aminosäuren langes Protein, das eine Rolle bei Entzündungsreaktionen spielt. Die Messung von CRP soll dazu dienen, um den Krankheitsverlauf sowie die Wirksamkeit der gewählten Therapie zu verfolgen.
In mehreren Berichten wurde beschrieben, dass im intensivmedizinischen Bereich PCT ein besser geeigneter diagnostischer Marker als CRP ist [Sponholz et al., 2006; Kofoed et al., 2007]. Darüber hinaus wird PCT als besser geeignet als CRP angesehen, um eine nicht infektiöse versus infektiöse SIRS sowie bakterielle versus virale Infektion zu unterscheiden [Simon et al., 2004].
Die dritte Gruppe enthält Biomarker oder Profile, die auf Transkriptom-Ebene identifiziert wurden. Diese molekularen Parameter sollten eine bessere Korrelation der molekularen inflammatorischen/immunologischen Wirtsantwort mit dem Schweregrad der Sepsis ermöglichen, aber auch Aussagen zur individuellen Prognose liefern. Nach derartigen Biomarkern wird derzeit von verschiedenen wissenschaftlichen Gruppen und kommerziellen Organisationen intensiv gesucht, wie zum Beispiel Veränderungen der Cytokinkonzentrationen im Blut verursacht durch Bakterienzellwandbestandteile wie Lipopolysaccharide [Mathiak et al., 2003], oder Verwendung von Genexpressionsprofilen in einer Blutprobe zur Bestimmung von Unterschieden bei überlebenden und nicht-überlebenden Sepsispatienten [Pachot et al., 2006]. Genexpressionsprofile oder Klassifikatoren sind für die Bestimmung des Schwergrads von Sepsis [ WO 2004/087949 ], die Unterscheidung zwischen einer lokalen oder systemischen Infektion [nicht veröffentlichte DE 10 2007 036 678.9 ], die Identifizierung der Infektionsquelle [ WO 2007/124820 ] oder von Genexpressionssignaturen für die Unterscheidung zwischen mehreren Ätiologien und Pathogen-assoziierten Signaturen [Ramilo et al., 2007] geeignet. Allerdings besteht aufgrund der unzureichenden Spezifität und Sensitivität der Konsensuskriterien nach [Bone et al., 1992], der aktuell verfügbaren Proteinmarker sowie aufgrund des Zeitbedarfs des Nachweises der Infektionsursache durch Blutkultur ein dringender Bedarf für neue Verfahren, die die Komplexität der Erkrankung berücksichtigen. Viele Geneexpressionsstudien, die entweder einzelne Gene und/oder Kombinationen von Genen, die als Klassifkatoren benannt sind, verwenden sowie zahlreiche Beschreibungen von statistischen Verfahren zur Ableitung eines Score und/oder Index [ WO03084388 ; US6960439 ] gehören zum Stand der Technik.
Es besteht heute ein Konsens dahingehend, dass komplexe Erkrankungen sinnvoll nur über mehrere Parameter beschrieben werden können.
In zunehmendem Maße finden molekulare Signaturen Eingang in die klinische Diagnostik, insbesondere bei komplexen Erkrankungen, die mit herkömmlichen Biomarkern nicht erfasst werden können, aber auch zur Beurteilung von Risiken für die Patienten und zur Identifizierung von Respondern beim Einsatz von Medikamenten und Therapien. Nachfolgende Aufzählung soll den aktuellen Stand und die Einsatzgebiete der Genexpressionsdiagnostik verdeutlichen.

1) Die Microarray-basierte, 70 Gene umfassende Signatur namens MammaPrint (Agendia, NL) erlaubt es, eine Prognose über das Rezidiv- und Metastasierungsrisiko von Frauen mit Brustkrebs zu treffen. Dabei wird untersucht, ob das Risiko, in den nächsten Jahren entfernte Metastasen zu entwickeln, als hoch oder niedrig eingestuft werden kann und sie von einer Chemotherapie profitieren würden. Die Zulassung dieses Tests durch die FDA brachte die Entwicklung von Richtlinien für eine neue Klasse von diagnostischen Tests, sog. IVDMIA (in vitro diagnostic multivariate index assay) mit sich. Die MammaPrint-Signatur wird auf einem Mikroarray in den Laboren des Herstellers gemessen und berechnet.
2) An Formalin-fixierten Gewebeproben wird mittels des Oncotype DX-Multigen-Assays (Genomic Health, USA) die Wahrscheinlichkeit des Wiederauftretens von Brustkrebs in Patientinnen beurteilt, sowie das Ansprechen der Patientinnen auf Chemotherapie geprüft. 21 Gene werden als „Recurrence-Score” zusammengefasst. Die Messung findet in den Räumen der Firma statt, es kommt ebenfalls die TaqMan-PCR Technologie zum Einsatz.
3) Der AlloMap Genexpressionstest der Firma XDx (USA) wird zur Überwachung eventueller Abstoßungsreaktionen bei Patienten mit Herztransplantation eingesetzt, die ca. 30% der Patienten innerhalb eines Jahres zeigen. Bislang waren zur Diagnose mehrere Biopsien notwendig. Der Test basiert auf 11 quantitativen PCR-Assays (zusätzlich 9 Kontrollen und Referenzen) unter Nutzung der TaqMan Technologie (Hoffman-La Roche) in den Räumen des Herstellers. Das Probenmaterial ist Blut. Bereits zwei Monate nach der Transplantation sind die Messergebnisse zuverlässig und sagen das Ausbleiben von Abstoßungsreaktionen für die nächsten 80 Tage voraus.

Eine Gemeinsamkeit dieser Tests ist, dass die addressierte diagnostische Fragestelllung Untersuchungszeiten bis zum Vorliegen des Ergebnisses von mehreren Tagen erlaubt. Für diagnostische Tests in der Indikation Sepsis dagegen, muß die Information innerhalb eines einzigen Arbeitstages vorliegen.
Mehrere Anwendungen von Genexpressionsprofilen sind in dem Stand der Technik bekannt.
Pachot und Kollegen demonstrieren den Nutzen von Expressionssignaturen für die Verlaufsbeurteilung von Patienten mit septischem Schock. Hier finden sich molekulare Unterschiede, die die Wiederherstellung eines funktionierenden Immunsystems in den Überlebenden Wiederspiegeln. 28 Markergene mit Funktionen im innaten Immunsystem zeigen innerhalb des ersten Tages nach Diagnose des septischen Schocks mit hoher Sensitivität (100%) und Spezifität (88%) an, ob die Immunparalyse reversibel ist und damit das Überleben des Patienten ermöglicht. Allerdings war in der Untersuchung das Patientenkollektiv zu klein (38) um ein robustes Profil zu erstellen und eine Validierung dieses Datensatzes durch einen unabähngigen Datenatz ist bislang nicht erfolgt. Der Stand der Technik enthält zahlreiche Studien zur Identifikation von Genexpressionsmarkern [Tang et al., 2007b] oder Genexpressionsprofilen für die Feststellung einer systemischen Infektion [Johnson et al., 2007].
Tang und Kollegen [Tang et al., 2007b] suchten in einer bestimmten Blutzellpopulation, den Neutrophilen, nach einer Signatur, welche eine Unterscheidung von Patienten mit SIRS und Sepsis ermöglicht. 50 Marker aus dieser Zellpopulation genügen um die Immunantwort auf eine systemische Infektion wiederzugeben und neue Erkenntnisse zur Pathophysiologie und den beteiligten Signalwegen zu ermöglichen.
Die Klassifikation von Patienten mit und ohne Sepsis gelingt mit hoher Sicherheit (PPV 88% bzw. 91% in Trainings- und Testdatensatz). Die Anwendbarkeit für die klinische Diagnose ist allerdings dadurch begrenzt, dass im Blut diese Signatur von Signalen aus anderen Blutzelltypen überlagert werden kann. Bezüglich der Anwendbarkeit ist die Präparation dieser Blutzellpopulation mit erheblich erhöhtem Aufwand verbunden. Die Aussagekraft der in dieser Studie publizierten Ergebnisse ist für praktische Anwendungen jedoch limitiert, weil die Patientenauswahl sehr stark heterogen war. Es wurden Patienten in die Studie eingeschlossen, die stark unterschiedliche Begleiterkrankungen wie z. B zu 11% bis 16% Tumorerkrankungen aufwiesen oder sehr stark unterschiedlichen therapeutischen Maßnahmen unterlagen (z. B. 27% bis 64% Vasopressor-Therapie), wodurch die Genexpressionsprofile stark beeinflusst wurden.
Johnson und Kollegen [Johnson et al., 2007] beschreiben an einem Kollektiv von Traumapatienten, dass sich die Ausprägung einer Sepsis bereits bis zu 48 Stunden vor der klinischen Diagnose anhand molekularer Veränderungen messen lässt. Die Traumapatienten wurden über mehrere Tage untersucht. Ein Teil der Patienten entwickelte eine Sepsis. Nichtinfektiöse SIRS-Patienten wurden mit prä- septischen Patienten verglichen. Die identifizierte Signatur aus 459 Transkripten setzt sich aus Markern der Immunantwort und Entzündungsmarkern zusammen. Probenmaterial war Vollblut, die Analysen wurden auf einem Mikroarray durchgeführt. Unklar ist, ob sich diese Signatur auch auf andere Kollektive septischer bzw. prä-septischer Patienten ausdehnen lässt. Eine Klassifikation und der diagnostische Nutzen dieser Signatur wurde nicht gezeigt.
Weiterhin werden im Stand der Technik andere Signaturen beschrieben, beispielsweise die Antwort des Wirtes auf eine Infektion.
Die Spezifität der Wirtsantwort auf unterschiedliche Erreger ist bisher in mehreren experimentellen Systemen untersucht worden. In keiner Studie jedoch wurden Genexpressionsprofile und/oder Signaturen von Sepsis-Patienten beschrieben.
Das Ziel von Feezor und Kollegen [Feezor et al., 2003] war es, Unterschiede zwischen Infektionen mit gram-negativen und gram-positiven Erregern zu identifizieren. Blutproben von drei verschiedenen Spendern wurden ex vivo mit E.coli-LPS und Hitze-inaktiviertem S.aureus stimuliert. Mittels Microarraytechnologie wurden Genexpressionsuntersuchungen durchgeführt. Die Arbeitsgruppe fand sowohl Gene, die nach S.aureus-Stimulation hochreguliert und nach LPS-Stimulation herunterreguliert waren, als auch Gene die nach LPS-Behandlung stärker exprimiert wurden als nach der Zugabe von Hitze-inaktivierten S.aureus-Keimen. Gleichzeitig wurden viele Gene durch gram-positive und gram-negative Stimulation in gleichem Maße hochreguliert. Dies betrifft zum Beispiel die Zytokine TNF-α, IL-1β und IL-6. Die differentiell exprimierten Gene wurden leider nicht namentlich veröffentlicht, so dass lediglich ein indirekter Vergleich anderen Ergebnissen möglich ist. Neben der Genexpression wurden von Feezor et al. auch die Plasmakonzentrationen einiger Zytokine untersucht. Dabei korrelierten die Genexpressionsdaten nicht zwangsweise mit den Plasmakonzentrationen. Bei der Genexpression wird die Menge an mRNA vermessen. Diese ist jedoch vor der Proteinsynthese posttranskriptionaler Regulation unterworfen, woraus die beobachteten Unterschiede resultieren können.
Die interessanteste Publikation zu diesem Thema wurde von einer texanischen Forschungsgruppe um Ramilo [Ramilo et al., 2007], veröffentlicht. Hier wurden ebenfalls Genexpressionsuntersuchungen an humanen Blutzellen durchgeführt, die Unterschiede in der molekularen Wirtsreaktion auf verschiedene Pathogene aufdeckten. Dazu wurden pediatrische Patienten mit akuten Infektionen, wie z. B. akuten Atemwegserkrankungen, Harnwegsinfektionen, Bakteriämien, lokalen Abszessen, Knochen- und Gelenkinfektionen sowie Meningitis untersucht. Microarrayexperimente wurden mit RNA-Proben durchgeführt, die aus peripheren mononuklearen Blutzellen von jeweils zehn Patienten mit E.coli- bzw. S.aureus-Infektion isoliert wurden. Die Identifizierung der Erreger erfolgte mittels Blutkultur. Anhand des Trainingsdatensatzes wurden 30 Gene identifiziert, durch deren Verwendung die verursachenden pathogenen Keime mit hoher Genauigkeit diagnostiziert werden konnten.
Trotz der zahlreichen publizierten Studien und der darin beschriebenen individuellen Signaturen, die den Stand der Technik begründen, erlaubt keine davon eine diagnostische Ausage über Sepsis und/oder Sepsis-ähnliche Zustände. Keine dieser Publikationen bietet die Zuverlässigkeit, Genauigkeit und Robustheit der hier offenbarten Erfindung. Diese Studien sind darauf konzentriert, den aus wissenschaftlicher Sicht ”besten” Multigenbiomarker (Klassifikator) zu identifizieren, jedoch nicht, wie in der vorliegenden Erfindung, den für eine spezifische klinische Fragestellung optimalen Multigenbiomarker [Simon et al., 2005].
Somit ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Testsystem zur Verfügung zu stellen, mit dem eine schnelle und zuverlässige Aussage über einen pathophysiologischen Zustand, beispielsweise Sepsis, möglich ist.
Die Lösung dieser Aufgabe erfolgt verfahrenstechnisch durch die Merkmale des Anspruchs 1.
Bezüglich einer Verwendung wird die Aufgabe durch die Merkmale der Ansprüche 4 und 11 gelöst.
Ein Kit gemäß Anspruch 14 löst die Aufgabe ebenfalls.
In allgemeiner Form betrifft die vorliegende Erfindung ein System, das folgende Elemente umfaßt:

• Set von Genaktivitätsmarkern
• Referenzgene als interne Kontrolle für die Normalisierung der Genaktivitätsmarkersignale in Vollblut
• Detektion hauptsächlich über Real-Time-PCR oder andere Amplifikationsverfahren oder Hybridisierungsverfahren
• Verwendung eines Algorithmus, um die Einzelergebnisse der Genaktivitätsmarker zu einem gemeinsamen numerischen Wert, Index oder auch Score, umzuwandeln
• Darstellung dieses numerischen Wertes auf einer entsprechend eingeteilten Skala
• Kalibrierung, d. h. Einteilung der Skala entsprechend der intendierten Anwendung durch vorherige Validierungsexperimente.

Das System liefert eine Lösung für das Problem der Feststellung von Krankheitszuständen wie z. B. die Unterscheidung von infektiösem und nicht-infektiösem Multiorganversagen aber auch für andere in diesem Kontext relevante Anwendungen und Fragestellungen.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur in vitro Erfassung und/oder Unterscheidung und/oder Verlaufsbeobachtung von pathophysiologischen Zuständen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: SIRS, Sepsis und deren Schweregraden; sepsisähnlichen Zuständen; septischem Schock; infektiösem/nicht-infektiösem Multiorganversagen; Überlebenswahrscheinlichkeit bei Sepsis; Fokus einer Infektion; Responder/non-Responder für eine bestimmte Therapie; Ursachen eines pathophysiologischen Zustandes, insbesondere Klassifizierung einer Infektion nach gram-positiven und/oder gram-negativen Bakterien; wobei das Verfahren folgende Schritte umfaßt:

a) Isolierung von Probennukleinsäuren aus einer von einem Patienten stammenden Probe;
b) Bestimmung von Genaktivitäten mittels einer Mehrzahl von Polynukleotiden, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ-ID NO: 1 bis SEQ-ID NO: 669 und/oder deren Genloci und/oder deren Transkripten und/oder Fragmenten davon, zur Bildung wenigstens eines für die Erfassung und/oder Unterscheidung und/oder den Verlauf von pathophysiologischen Zuständen eines Patienten charakteristischen Multigenbiomarkers;
c) Bestimmung von Genaktivitäten wenigstens eines internen Referenzgens, auf die die unter b) bestimmten Genaktivitäten bezogen, insbesondere normalisiert, werden;
d) Bilden eines Index-Wertes aus den einzelnen bestimmten normalisierten Genaktivitäten des Multigenbiomarkers, der den pathophysiologischen Zustand anzeigt.

In einem bevorzugten Verfahren ist das wenigstens eine Referenzgen ein Housekeepinggen, wobei das Housekeepinggen insbesondere ausgewählt ist aus Polynukleotiden der Gruppe bestehend aus SEQ-ID NO: 676 bis SEQ-ID NO: 686 und/oder deren Genloci und/oder deren Transkripten und/oder Fragmenten davon.
Bevorzugt werden als Polynukleotidsequenzen Genloci, sense und/oder antisense Stränge von prä-mRNA und/oder mRNA, small RNA, insbesondere scRNA, snoRNA, micro RNA, siRNA, dsRNA, ncRNA oder transposable Elemente verwendet.
Der Index wird vorzugsweise mittels statistischer Verfahren wie überwachte Klassifikationsverfahren aus dem Bereich des maschinellen und statischen Lernens wie z. B. (diagonale, lineare, quadratische) Diskriminanzanalyse, Super vector machines, verallgemeinerte partielle kleinste Quadrate, k-nächste Nachbarn, random forests, k-nächste Nachbar ermittelt. Für eine lineare Diskriminanzanalyse kann beispielsweise folgende Formel verwendet werden:
Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung einer Mehrzahl von Polynukleotiden, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ-ID NO: 1 bis SEQ-ID NO: 669 und/oder deren Genloci und/oder deren Transkripten und/oder Fragmenten davon, zur Bildung wenigstens eines Multigenbiomarkers zur Herstellung eines Multiplex-Assays als Hilfsmittel zur Beurteilung, ob bei einem Patienten ein pathophysiologischer Zustand vorliegt, und/oder zur Feststellung des Schweregrades und/oder des Verlaufs des pathophysiologischen Zustands.
Bevorzugt ist der Multigenbiomarker eine Kombination von mehreren Polynukleotid-, insbesondere Gensequenzen, anhand deren Genaktivitäten mittels einer Interpretationsfunktion eine Klassifikation durchgeführt und/oder ein Index oder Score gebildet wird.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung hat es sich als vorteilhaft herausgestellt, dass die Genaktivitäten mittels enzymatischer Verfahren, insbesondere Amplifikationsverfahren, bevorzugt Polymereasekettenreaktion (PCR), vorzugsweise Real-Time-PCR; und/oder mittels Hybridisierungsverfahren, insbesondere solchen auf Microarrays, erfasst werden.
Bei der Erfassung der Genaktivitäten auftretende differentielle Expressionssignale der in dem Multigenbiomarker enthaltenen Polynukleotidsequenzen können vorteilhaft und eindeutig einem pathophysiologischen Zustand, einem Verlauf und/oder Therapiemonitoring zugeordnet werden.
Typischerweise wird aus den einzelnen bestimmten Genaktivitäten ein Index gebildet wird, der nach entsprechender Kalibrierung ein Maß für den Schweregrad und/oder den Verlauf des pathophysiologischen Zustands, insbesondere der Sepsis oder des sepsisähnlichen Zustandes, ist.
Dieser Index oder Score kann auf einer leicht interpretierbaren Skala angezeigt werden, um dem behandelnden Arzt eine schnelles diagnostisches Hilfsmittel in die Hand zu geben.
Bei einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung werden die erhaltenen Genaktivitätsdaten zur Herstellung von Software für die Beschreibung mindestens eines pathophysiologischen Zustands und/oder einer Untersuchungsfrage und/oder als Hilfsmittel für Diagnosezwecke und/oder für Patientendatenmangement-Systeme eingesetzt.
Zur Erstellung der Genaktivitätsdaten werden vorteilhaft solche spezifischen Genloci, sense und/oder antisense Stränge von prä-mRNA und/oder mRNA, small RNA, insbesondere scRNA, snoRNA, micro RNA, siRNA, dsRNA, ncRNA oder transposable Elemente, Gene und/oder Genfragmente verwendet, welche eine Sequenzhomologie von mindestens ca. 10%, insbesondere ca. 20%, vorzugsweise ca. 50%, besonders bevorzugt ca. 80% zu den Polynukleotidsequenzen gemäß SEQ-ID NO: 1 bis SEQ-ID NO: 669 aufweisen.
Die Erfindungsgemäß betrifft ferner die Verwendung wenigstens eines Polynukleotids, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ-ID NO: 1 bis SEQ-ID NO: 152 und/oder deren Genloci und/oder deren Transkripten und/oder Fragmenten davon, zur Herstellung eines Assays zur Beurteilung, ob bei einem Patienten ein pathophysiologischer Zustand vorliegt, und/oder zur Feststellung des Schweregrades und/oder des Verlaufs des pathophysiologischen Zustands.
Der pathophysiologische Zustand ist vorteilhaft ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: SIRS, Sepsis und deren Schweregraden; sepsisähnlichen Zuständen; septischer Schock; infektiösem/nicht-infektiösem Multiorganversagen; lokaler/systemischer Infektion; Verbesserung/Verschlechterung eines pathophysiologischen Zustandes, insbesondere Sepsis; Responder/non-Responder für eine bestimmte Therapie; Fokus einer Infektion; Ursachen eines pathophysiologischen Zustandes, insbesondere Klassifizierung nach gram-positiv und/oder gram-negativ.
Erfindungsgemäß ist es bevorzugt, dass die Probennukleinsäure RNA, insbesondere Gesamt-RNA oder mRNA, oder DNA, insbesondere cDNA, ist.
Die Erfindung betrifft ferner einen Kit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, enthaltend mindestens einen Multigenbiomarker, welcher eine Mehrzahl von Polynukleotidsequenzen umfasst, die aus dem Pool von SEQ-ID NO: 1 bis SEQ-ID NO: 669 und/oder deren Genloci und/oder deren Transkripten und/oder Fragmenten davon ausgewählt sind, und/oder Primer und/oder Sonden und/oder Antisensenukleotide hierfür, wobei der Multigenbiomarker spezifisch für einen pathophysiologischen Zustand eines Patienten ist und solche Zustände einschließt, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: SIRS, Sepsis und deren Schweregraden; sepsisähnlichen Zuständen; septischem Schock; infektiösem/nicht-infektiösem Multiorganversagen; Überlebenswahrscheinlichkeit bei Sepsis; lokaler/systemischer Infektion; Responder/non-Responder für eine bestimmte Therapie; Fokus einer Infektion; Ursachen eines pathophysiologischen Zustandes, insbesondere Klassifizierung einer Infektion nach gram-positiven oder gramnegativen Erregern.
Die Polynukleotidsequenzen des Kits umfassen bevorzugt auch Genloci, sense und/oder antisense Stränge von prä-mRNA und/oder mRNA, small RNA, insbesondere scRNA, snoRNA, micro RNA, siRNA, dsRNA, ncRNA oder transposable Elemente.
Als Multigenbiomarker für die Unterscheidung von SIRS/Sepsis oder von infektiösem/nicht-infektiösem Multiorganversagen werden vorzugsweise die Polynukleotidsequenzen mit den in Tab. 11 und 16 angegebenen SEQ-IDs eingesetzt. Als Multigenbiomarker für die Unterscheidung von Ursachen eines pathophysiologischen Zustandes, insbesondere Klassifizierung nach gram-positiven und/oder gram-negativen Bakterien, werden vorzugsweise die Polynukleotidsequenzen mit den in Tab. 20 und 21 angegebenen SEQ-IDs eingesetzt.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht es, als Teil eines integrierten Systems (In Vitro Diagnostic Multivariate Index Assay, IVDMIA) eine potenzielle infektiöse Komplikation in Patienten mit SIRS oder möglichen Sepsis einzuschätzen. Dieses System umfasst die Wahl der Patienten und die Bestimmung von deren Genexpressionssignalen in einem interpretierbaren Index, welchen der Arzt als Hilfsmittel zur Diagnose verwenden kann.
Dieses System kombiniert die gemessenen Genexpressionsdaten von definierten Sequenzgruppen ausgewählt aus SEQ-ID NO: 1 bis SEQ-ID NO: 669 und/oder deren Genloci und/oder deren Transkripten und/oder Fragmenten davon, sowie von Housekeepinggenen. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden zur Erstellung der Genaktivitätsdaten solche spezifischen Gene und/oder Genfragmente verwendet, die eine Sequenzhomologie von mindestens ca. 10%, insbesondere ca. 20%, vorzugsweise ca. 50%, besonders bevorzugt ca. 80% zu den Polynukleotidsequenzen gemäß SEQ-ID NO: 1 bis SEQ-ID NO: 669 oder zu den Housekeepinggenen aufweisen.
Tab. 32 zeigt den hochrelevanten Sequenzpool, der für verschiedene klinische Fragenstellungen wichtig ist.
Tab. 8, 11 und 16 zeigen eine bevorzugte Wahl von Sequenzen, die, wenn in das obengennantes System integriert, für die Unterscheidung zwischen SIRS und Sepsis essentiell sind.
Die Wahl der Sequenzen aus dem hochrelevanten Sequenzpool ist von der klinischen Fragestellung abhängig.
Die Anmelderin hat ein Verfahren entwickelt, das große Sequenzpools benutzt, um Zustände festzustellen und/oder zu unterscheiden oder definierte Untersuchungsfragen zu beantworten. Beispiele sind in folgenden Patentschriften zu finden: Unterscheidung zwischen SIRS, Sepsis und sepsisähnlichen Zuständen [ WO 2004/087949 ; WO 2005/083115 ], Erstellung von Kriterien zur Vorhersage des Krankheitsverlaufs bei Sepsis [ WO 05/106020 ], Unterscheidung zwischen nichtinfektiösen und infektiösen Ursachen eines Multiorganversagens [ WO 2006/042581 ], in vitro Klassifizierung von Genexpressionsprofilen von Patienten mit infektiösem/nichtinfektiösem Multiorganversagen [ WO 2006/100203 ], Feststellung der lokalen Ursachen eines Fiebers unklarer Genese [ WO 2007/144105 ], Polynukleotide zur Erfassung von Genaktivitäten für die Unterscheidung zwischen lokaler und systemischer Infektion [ DE 10 2007 036 678.9 ].
Die Erfindung betrifft Polynukleotidsequenzen, ein Verfahren und ferner Kits zur Erstellung von Multigenbiomarkern, die in einem und/oder mehreren Modulen Merkmale eines „In Vitro Diagnostic Multivariate Index Assay” (IVDMIA) aufweisen.
Definitionen:
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung werden folgende Definitionen verwendet:
Zustand: die klinisch definierten Schweregrade „systemic inflammatory response syndrom” (SIRS), „sepsis”, „severe sepsis” und „septic shock” wie definiert in [Bone et al., 1992] und das PIRO Konzept [Levy et al., 2003].
Multiorganversagen: Als Multiorganversagen bezeichnet man das gleichzeitig oder in rascher zeitlicher Abfolge auftretende Versagen von zwei oder mehr vitalen Organsystemen. Das Multiorgandysfunktionssyndrom (MODS) geht als initiale Organinsuffizienz dem MOV voraus [Zeni et al., 1997]. Man spricht heute vom Multiorganversagen wenn zwei oder mehr Organe gleichzeitig oder nacheinander Funktionstörungen aufweisen, wobei ein chronisch persistierendes Organversagen auszuschließen ist. Die Prognose des MOV hängt eng mit der Anzahl der beteiligten Organsysteme zusammen. Die Mortalität beträgt bei Versagen eines Organs innerhalb der ersten 24 Stunden 22%, nach 7 Tagen 41%. Beim Versagen von drei Organsystemen steigt die Mortalität am ersten Tag auf 80% und nach 4 Tagen auf 100% an [Knaus et al., 1985].
Ein wichtiger Pathomechanismus für die Entstehung von MODS und MOV ist die Entwicklung eines systemischen Inflammationssyndromes (SIRS, [Bone et al., 1992]. MODS und MOV können sowohl infektiologischer als auch nichtinfektiologischer Genese sein.
Fieber unklarer Genese: Fieber unklarer Genese (Feuer of unknow origin, FUO) ist klinisch definiert als ein Fieber, bei dem die Temperatur über einen Zeitraum von mehr als 3 Wochen höher als 38,8°C ist, ohne dass nach einer einwöchigen Untersuchungszeit eine eindeutige Diagnose der Ursache vorliegt. In Abhängigkeit des Ursprungs wurden vier Klassen des FUO beschrieben: FUO klassischen, nosokomialen, immunschwachen oder HIV-bezogenen Ursprungs [Roth und Basello, 2003]. FUO wurde auch als ”eine eher bekannte Krankheit mit einem ungewöhnlichen Erscheinungsbild als eine seltene Störung” geschildert [Amin und Kauffman, 2003].
Nur in 10% der Patienten mit postoperativem Fieber wird eine Infektion dokumentiert [Pile et al., 2006]. In den meisten Fälle geht die Temperatur des Patienten innerhalb von vier Tagen nach dem Eingriff zurück auf Normaltemperatur. Trotzdem entwickeln einige Patienten am oder nach dem fünften postoperativem Tag eine Infektion, wobei es sich in 12% der Fälle um eine Lungenentzündung handelt. Ebenso wird von Pile und Kollegen berichtet, dass es sich bei Fieber, welches zwei Tage nach dem Eingriff auftritt, mit hoher Wahrscheinlichkeit um eine Infektion handelt, wie z. B. eine Infektion der Harnwege und/oder des inneren Unterleibs (Peritonitis), Lungenentzündung oder eine durch einen intravenösen Katheder ausgelöste Infektion.
Untersuchungsfrage: Eine klinische relevante Frage, die für die Behandlung eines Patientes wichtig ist, beispielsweise: Vorhersage des Krankheitsverlaufs, Therapieüberwachung, Fokus der Infektion, Überlebenschancen, Prädisposition, etc.
Eine systemische Infektion ist eine Infektion, bei der sich die Erreger über die Blutbahn im gesamten Organismus ausgebreitet haben.
SIRS: Systemic Inflammatory Response Syndrome, nach Bone [Bone et al., 1992] und Levy [Levy et al., 2003] ein generalisierter, inflammatorischer, nichtinfektiöser Zustand eines Patienten.
Sepsis: Nach Bone [Bone et al., 1992] und Levy [Levy et al., 2003] ein generalisierter, inflammatorischer infektiöser Zustand eines Patienten.
Biologische Flüssigkeit: Als biologische Flüssigkeiten im Sinne der Erfindung werden alle Körperflüssigkeiten der Säugetiere, einschließlich des Menschen, verstanden.
Gen: Ein Gen ist ein Abschnitt auf der Desoxyribonukleinsäure (DNA), der die Grundinformationen zur Herstellung einer biologisch aktiven Ribonukleinsäure (RNA) sowie regulatorische Elemente, welche diese Herstellung aktivieren oder inaktivieren, enthält. Als Gene im Sinne der Erfindung werden auch alle abgeleiteten DNA-Sequenzen, Partialsequenzen und synthetische Analoga (beispielsweise Peptido-Nukleinsäuren (PNA)) verstanden. Die auf Bestimmung der Genexpression auf RNA-Ebene bezogene Beschreibung der Erfindung stellt somit ausdrücklich keine Einschränkung sondern nur eine beispielhafte Anwendung dar.
Genlocus: Genlocus (Genort) ist die Position eines Gens im Genom. Besteht das Genom aus mehreren Chromosomen, ist die Position innerhalb des Chromosoms gemeint, auf dem sich das Gen befindet. Verschiedene Ausprägungen oder Varianten dieses Gens werden als Allele bezeichnet, die sich alle an derselben Stelle auf dem Chromosom, nämlich dem Genlocus befinden. Somit beinhaltet der Begriff „Genlocus” einerseits die reine genetische Information für ein spezifisches Genprodukt und andererseits sämtliche regulatorische DNA-Abschnitte sowie sämtliche zusätzliche DNA-Sequenzen, welche mit dem Gen am Genlocus in irgendeinem funktionellen Zusammenhang stehen. Die letzteren schließen an Sequenzregionen an, die in der unmittelbar Nähe (1 Kb) aber außerhalb des 5'- und/oder 3'-Endes eines Genlocus liegen. Die Spezifizierung des Genlocus erfolgt durch die Accession-Nummer und/oder RefSeq ID des RNA-Hauptproduktes, welches von diesem Locus abstammt.
Genaktivität: Unter Genaktivität wird das Maß der Fähigkeit eines Gens verstanden, transkribiert zu werden und/oder Translationsprodukte zu bilden.
Genexpression: Der Vorgang, ein Genprodukt zu bilden und/oder Ausprägung eines Genotyps zu einem Phänotyp.
Multigenbiomarker: Kombination von mehreren Gen-Sequenzen deren Genaktivitäten mittels einer Interpretationsfunktion ein kombiniertes Gesamtergebnis (z. B. eine Klassifikation und/oder ein Index) bilden. Dieses Ergebnis ist spezifisch für einen Zustand und/oder eine Untersuchungsfrage.
Hybridisierungsbedingungen: Dem Fachmann wohl bekannte physikalische und chemische Parameter, welche die Etablierung eines thermodynamischen Gleichgewichtes aus freien und gebundenen Molekülen beeinflussen können. Im Interesse optimaler Hybridisierungsbedingungen müssen Zeitdauer des Kontaktes der Sonden- und Probenmoleküle, Kationenkonzentration im Hybridisierungspuffer, Temperatur, Volumen sowie Konzentrationen und -verhältnisse der hybridisierenden Moleküle aufeinander abgestimmt werden.
Amplifikationsbedingungen: Konstante oder sich zyklisch verändernde Reaktionsbedingungen, welche die Vervielfältigung des Ausgangsmateriales in Form von Nukleinsäuren ermöglichen. Im Reaktionsgemisch liegen die Einzelbausteine (Desoxyribonukleotide) für die entstehenden Nukleinsäuren vor, ebenso wie kurze Oligonukleotide, welche sich an komplementäre Bereiche im Ausgangsmaterial anlagern können, sowie ein Nukleinsäure-Synthese-Enzym, Polymerase genannt. Dem Fachmann wohl bekannte Kationenkonzentrationen, pH-Wert, Volumen und die Dauer und Temperatur der einzelnen Reaktionsschritte sind von Bedeutung für den Ablauf der Amplifikation.
Primer: Als Primer wird in der vorliegenden Erfindung ein Oligonukleotid bezeichnet, das als Startpunkt für Nukleinsäure-replizierende Enzyme wie z. B. die DNA-Polymerase dient. Primer können sowohl aus DNA als auch aus RNA bestehen (Primer3, siehe z. B. http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi des MIT)
Sonde: In der vorliegenden Anmeldung ist eine Sonde ein Nukleinsäurefragment (DNA oder RNA), das mit einer molekularen Markierung (z. B. Fluoreszenzlabel, insbesondere Scorpion^®, molecular beacons, Minor Groove Binding-Sonden, TaqMan^®-Sonden, Isotopenmarkierung, usw.) versehen werden kann und zur sequenzspezifischen Detektion von Ziel-DNA- und/oder Ziel-RNA-Molekülen eingesetzt wird.
PCR: ist die Abkürzung für die englische Bezeichnung „Polymerase Chain Reaction” (Polymerase-Kettenreaktion). Die Polymerase-Kettenreaktion ist eine Methode, um DNA in vitro außerhalb eines lebenden Organismus mit Hilfe einer DNA-abhängigen DNA Polymerase zu vervielfältigen. PCR wird insbesondere gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt, um kurze Teile – bis zu etwa 3.000 Basenpaare – eines interessierenden DNA-Strangs zu vervielfältigen. Dabei kann es sich um ein Gen oder auch nur um einen Teil eines Gens oder auch um nicht kodierende DNA-Sequenzen handeln. Es ist dem Fachmann wohl bekannt, dass eine Reihe von PCR-Verfahren im Stand der Technik bekannt sind, welche alle durch den Begriff „PCR” mit umfasst sind. Dies gilt insbesondere für die „Real-Time-PCR” (vgl. auch die Erläuterungen weiter unten).
PCR-Primer: Typischerweise benötigt eine PCR zwei Primer, um auf den beiden Einzelsträngen der DNA jeweils den Startpunkt der DNA-Synthese festzulegen, wodurch der zu vervielfältigende Bereich von beiden Seiten begrenzt wird. Derartige Primer sind dem Fachmann wohlbekannt, beispielsweise aus der Website „Primer3”, siehe z. B. http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi des MIT.
Transkript: Für die Zwecke der vorliegenden Anmeldung wird unter einem Transkript jegliches RNA-Produkt verstanden, welches anhand einer DNA-Vorlage hergestellt wird.
Small RNA: Kleine RNAs im Allgemeinen. Vertreter dieser Gruppe sind insbesondere, jedoch nicht ausschließlich:

a) scRNA (small cytoplasmatic RNA), welche eines von mehreren kleinen RNA-Molekülen im Cytoplasma eines Eukaryonten ist.
b) snRNA (small nuclear RNA), eine der vielen kleinen RNA-Formen, die nur im Zellkern vorkommen. Einige der snRNAs spielen beim Spleißen oder bei anderen RNA-verarbeitenden Reaktionen eine Rolle.
c) small non-Protein-coding RNAs, welche die sogenannten small nucleolar RNAs (snoRNAs), microRNAs (miRNAs), short interfering RNAs (siRNAs) und small double-stranded RNAs (dsRNAs) einschließen, welche die Genexpression auf vielen Ebenen, einschließlich der Chromatin-Architektur, RNA-Editierung, RNA-Stabilität, Translation und möglicherweise auch Transkription und Spleißen. Im Allgemeinen werden diese RNAs auf mehrfachem Wege prozessiert aus den Introns und Exons längerer Primärtranskripte, einschließlich proteincodierender Transkripte. Obwohl etwa nur 1,2% des Humangenoms Proteine codiert, wird ein großer Teil dennoch transkribiert. Tatsächlich bestehen ca. 98% der in Säugern und Menschen gefundenen Transkripte aus non-Protein-coding RNAs (ncRNA) aus Introns von proteincodierenden Genen und den Exons und Introns von nicht proteincodierenden Genen, einschließlich vieler, welche anti-sense zu proteincodierenden Genen sind oder mit diesen überlappen. Small nucleolar RNAs (snoRNAs) regulieren die sequenzspezifische Modifikation von Nukleotiden in Target-RNAs. Hierbei treten zwei Typen von Modifikationen auf, nämlich 2'-O-Ribosemethylierung und Pseudouridylierung, welche durch zwei große snoRNA-Familien reguliert werden, die einerseits box C/D-snoRNAs und andererseits box H/ACA snoRNAs genannt werden. Derartige snoRNAs weisen eine Länge von etwa 60 bis 300 Nukleotiden auf. miRNAs (microRNAs) und siRNAs (short interfering RNAs) sind noch kleinere RNAs mit im Allgemeinen 21 bis 25 Nukleotiden. miRNAs stammen aus endogenen kurzen Hairpin-Vorläuferstrukturen und benutzen gewöhnlich andere Loci mit ähnlichen – jedoch nicht identischen Sequenzen als Ziel translationaler Repression. siRNAs entstehen aus längeren doppelsträngigen RNAs oder langen Hairpins, oftmals exogenen Ursprungs. Sie haben gewöhnlich homologe Sequenzen an demselben Locus oder woanders im Genom zum Ziel, wo sie am sogenannten gene silencing, ein Phänomen, welches auch RNAi genannt wird, beteiligt sind. Die Grenzen zwischen miRNAs und siRNAs sind jedoch fließend.
d) Zusätzlich kann der Begriff ”small RNA” auch sogenannte transposable Elemente (TEs) und insbesondere Retroelemente umfassen, welche ebenfalls für die Zwecke der vorliegenden Erfindung unter dem Begriff „small RNA” verstanden werden.

RefSeq ID: Diese Bezeichnung bezieht sich auf Einträge in der NCBI Datenbank (www.ncbi.nlm.nih.gov). Diese Datenbank liefert nicht-redundante Referenz-Standards zu genomischer Information. Diese genomischen Informationen schließen unter anderem Chromosomen, mRNAs, RNAs und Proteine ein. Jede RefSeq ID stellt ein einzelnes, natürlich vorkommendes Molekül eines Organismus dar. Die biologischen Sequenzen, die eine RefSeq repräsentieren, sind von GenBank Einträgen (ebenfalls NCBI) abgeleitet, sind aber eine Zusammenstellung von Informationselementen. Diese Informationselemente stammen aus Primär-Forschung auf DNA-, RNA- und Proteinebene.
Accession-Nummer: Eine Accession-Nummer stellt die Eintragsnummer eines Polynukleotides in der dem Fachmann bekannten NCBI-GenBank dar. In dieser Datenbank werden sowohl RefSeq ID's als auch weniger gut charakterisierte und redundante Sequenzen als Einträge verwaltet und der Öffentlichkeit zugänglich gemacht (www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/index.html).
Abkürzungen

AUC (area under curve)

Fläche unter der Kurve

CRP

C-reaktives Protein

CV (cross validation)

Kreuzvalidierung

DLDA (diagonal linear discriminant analysis)

diagonale lineare Diskriminanzanalyse Klasssifikationsverfahren

GPLS (generalized partial least squares)

verallgemeinerte partielle kleinste Quadrate (Klassifikationsverfahren)

IQR (inter quartile range)

Abstand zwischen dem 75% und 25% Perzentil

kNN (k nearest neighbours)

k-nächste Nachbarn (Klassifikationsverfahren)

LDA (linear discriminant analysis)

lineare Diskriminanzanalyse (Klassifikationsverfahren)

MAD (Median of the absolute deviation of the Median)

Normalisierungsverfahren

NPV (negative predictive value)

negativer prädikativer Wert (Anteil der korrekt negativen Tests)

OR

Odd Ratio

PCT

Procalcitonin

PPV (positive predictive value)

positiver prädikativer Wert (Anteil der korrekt positiven Tests)

RF (random forests)

Klassifikationsverfahren

ROC (receiver operator characteristics)

Abbildung zur Darstellung von Klassifikationsergebnissen

Sensitivität

Anteil der korrekten Tests in der Gruppe mit vorgegebenener Erkrankung (infektiöse SIRS bzw. Sepsis)

Spezifizität

Anteil der korrekten Tests in der Gruppe ohne vorgegebenene Erkrankung (nicht-infektiöse SIRS)

SVM (support vector machines)

Klassifikationsverfahren

Für eine schnelle Diagnosik hat sich in der Praxis herausgestellt, dass Echtzeit- oder Real-Time-Amplifikationsverfahren die bevorzugten Verfahren sind. Daher werden im Folgenden die Grundlagen, welche dem Fachmann wohlbekannt sind, kurz im Hinblick auf ihre Bedeutung für die vorliegende Erfindung zusammengefaßt.
Andere, dem Fachmann bekannten Verfahren, wie z. B. Sequenzierung, Mikroarray basierte Methoden, NASBA usw. sind ebenfalls möglich.
Mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist es möglich, spezifische Sequenzbereiche aus geringsten Ausgangsmengen von Nukleinsäuren in-vitro und zudem schnell zu amplifizieren, um sie so einer Analyse oder Weiterverarbeitung zugänglich zu machen. Ein doppelsträngiges DNA-Molekül wird durch Hitzeeinwirkung aufgeschmolzen (denaturiert). Die Einzelstränge dienen in der Folge als Matrize für die enzymatisch katalysierte Polymerisation von Desoxyribonukleotiden, wodurch wieder doppelsträngige DNA-Moleküle entstehen. Die als Primer bezeichneten Oligodesoxyribonukleotide definieren dabei den zu kopierenden Sequenzabschnitt, indem sie an Orten komplementärer Sequenz mit der Ziel-DNA hybridisieren und als Starter für die Polymerisation dienen. Der Prozess exponentieller Produktbildung wird von verschiedenen Faktoren begrenzt. Im Laufe der PCR geht die Netto-Produktbildung daher schließlich auf Null zurück und die Gesamtmenge an PCR-Produkt erreicht einen Plateauwert.
Geeignete PCR-Primer sind beispielsweise Primer mit den Sequenzen der SEQ ID NO: 687 bis SEQ ID NO: 742. Es ist dem Fachmann jedoch bekannt, dass eine Vielzahl weiterer Primer zur Ausführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann.
Seit ihrer Einführung in das molekularbiologische Methodenspektrum wurde eine nahezu unüberschaubare Vielzahl von technischen Varianten entwickelt. Heute ist die PCR eine der wichtigsten Methoden in der molekularen Biologie und der molekularen Medizin. Heute findet sie Verwendung in einem überaus breiten thematischen Spektrum, z. B. beim Nachweis von Viren oder Keimen, bei der Sequenzierung, dem Verwandtschaftsnachweis, der Erstellung von Transkriptionsprofilen und der Quantifizierung von Nukleinsäuren [Valasek und Repa, 2005; Klein, 2002]. Zudem lassen sich mit Hilfe der PCR in einfacher Weise beliebige Sequenzabschnitte des Nukleinsäurebestandes eines Organismus klonieren. Die Vielzahl entwickelter PCR-Varianten ermöglicht u. a. eine zielgerichtete oder zufällige Veränderung der DNA-Sequenz sowie sogar die Synthese größerer, in dieser Form zuvor nicht existenter Sequenzabfolgen.
Mit diesem klassischen Verfahren lassen sich hochsensitiv DNA und über die reverse Transkription (RT) auch RNA qualitativ nachweisen [Wong et al., 2005; Bustin 2002]. Eine Weiterentwicklung dieser Methode ist die Real-Time-PCR, die erstmals 1991 vorgestellt wurde und neben qualitativen Aussagen auch eine Quantifizierung ermöglicht.
Real-Time-PCR, auch quantitative PCR (qPCR) genannt, ist eine Methode zur Detektion und Quantifizierung von Nukleinsäuren in Echtzeit [Nolan et al., 2006]. In der Molekularbiologie gehört sie bereits seit einigen Jahren zu den etablierten Standardtechniken.
Im Gegensatz zur PCR findet hier die Detektion bereits während der Amplifikation statt. Basierend auf Fluoreszenz-markierten Sonden, den Fluorophoren, kann die Amplifikation in Echtzeit verfolgt werden. In jedem Reaktionszyklus nehmen die fluoreszierenden PCR-Produkte und damit die Intensität der lichtinduzierten Fluoreszenz-Emission zu. Da die Zunahme der Fluoreszenz und die Menge an neusynthetisierten PCR-Produkten über einen weiten Bereich proportional zueinander sind, kann aus den gewonnenen Daten die Ausgangsmenge des Templates bestimmt werden. Eine gelelektrophoretische Auftrennung der Amplifikate ist nicht mehr erforderlich. Die Ergebnisse sind direkt verfügbar, was eine deutliche Zeitersparnis mit sich bringt. Da die Reaktionen in geschlossenen Gefäßen ablaufen, und nach dem Start der PCR keine weiteren Pipettierschritte erforderlich sind, reduziert sich das Kontaminationsrisiko auf ein Minimum. Als Fluorophore werden entweder nukleinsäure-bindende Fluoreszenzfarbstoffe wie SYBRGreen oder sequenzspezifische Fluoreszenzsonden wie Taq-Man-Sonden, LightCycler-Sonden und Molecular Beacons eingesetzt [Kubista et al., 2006]. SYBRGreen ist ein Farbstoff, dessen Fluoreszenz stark zunimmt, sobald das Molekül an doppelsträngige DNA bindet. Diese kostengünstige Lösung ist besonders bei der parallelen Durchführung mehrerer Reaktionen mit unterschiedlichen Primerpaaren geeignet. Nachteile liegen in der geringen Spezifität, da SYBRGreen sequenzunspezifisch an jede doppelsträngige DNA bindet, sowie darin, dass keine Multiplex-Messungen durchgeführt werden können. Mit Hilfe einer Schmelzkurvenanalyse kann nach erfolgter PCR allerdings zwischen dem Zielprodukt und unspezifischer DNA differenziert werden: In Abhängigkeit der Nukleotidlänge und -zusammensetzung zerfällt jeder DNA-Doppelstrang bei einer für ihn charakteristischen Temperatur, der Schmelztemperatur, in seine zwei Einzelstränge. Da die doppelsträngige DNA von spezifischen PCR-Produkten einen höheren Schmelzpunkt hat als unspezifisch entstehende Primerdimere, ist eine Unterscheidung anhand der Fluoreszenzabnahme bei Zunahme der Temperatur möglich.
Im Gegensatz dazu ist der Nachweis mit fluoreszenzbasierten Sonden hochspezifisch, aber auch sehr kostenintensiv. Beim TaqMan-Prinzip enthält der PCR-Ansatz neben den PCR-Primern eine sequenzspezifische TaqMan-Hybridisierungssonde, die über einen Quencher und einen Reporterfarbstoff verfügt. Die Sonde ist komplementär zu einer Sequenz, die zwischen den Primern liegt. In freier Lösung wird die Fluoreszenz durch die räumliche Nähe des Quenchers unterdrückt. Nach dem FRET-(Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer)-Prinzip schluckt der Quencher die Fluoreszenzemission des angeregten Fluorophors. Hybridisiert diese Sonde jedoch mit der Zielsequenz, wird sie während der PCR von der Taq-Polymerase hydrolysiert, der Reporterfarbstoff wird räumlich vom Quencher entfernt und emittiert bei Anregung detektierbare Fluoreszenz. Beim LightCycler-Prinzip enthält der PCR-Ansatz neben den PCR-Primern zwei fluoreszenz-markierte Sonden (Donor- und Akzeptor-Fluoreszenzfarbstoff). Ein nach außen hin messbares Fluoreszenzsignal entsteht nur bei unmittelbar benachbarter Hybridisierung der beiden Sonden mit der spezifischen Zielsequenz. Im Rahmen einer anschließenden Schmelzkurvenanalyse können sogar das Vorliegen und die Art einzelner Punktmutationen innerhalb der Hybridisierungsbereiche der Sonden detektiert werden. Ein weiteres Beispiel sind die Molecular Beacons. Diese Oligonukleotide enthalten am 5'- und 3'-Ende zueinander komplementäre Sequenzen, die in ungebundenem Zustand hybridisieren und eine Haarnadelstruktur bilden. Reporterfluorophor und Quencher, lokalisiert an beiden Enden, sind so in direkter Nachbarschaft. Erst wenn die Sonde am Templat bindet, werden die beiden Farbstoffe räumlich getrennt, so dass nach Anregung wieder Fluoreszenz messbar ist. Scorpion- und Sunrise-Primer bilden zwei weitere Modifikationen für sequenzspezifische Sonden [Whitcombe et al,. 1999].
Die quantitative Bestimmung eines Templates kann mittels absoluter oder relativer Quantifizierung erfolgen. Bei der absoluten Quantifizierung findet die Messung anhand externer Standards, z. B. Plasmid-DNA in unterschiedlichen Verdünnungen, statt. Die relative Quantifizierung nutzt dagegen so genannte Housekeeping- oder Referenzgene als Referenz [Huggett et al., 2005]. Diese Referenzgene werden konstant exprimiert und bieten damit die Möglichkeit zur Normierung unterschiedlicher Expressionsanalysen. Die Auswahl der Housekeepinggene muss für jedes Experiment individuell erfolgen. Für die vorliegende Erfindung werden bevorzugt Housekeepinggene mit den Sequenzen der SEQ-ID NO: 676 bis SEQ-ID NO: 686 verwendet.
Die generierten Experiment-Daten werden mit Hilfe der geräteeigenen Software ausgewertet. Für die grafische Darstellung wird die gemessene Fluoreszenzintensität gegen die Anzahl der Zyklen aufgetragen. Die resultierende Kurve unterteilt sich dabei in drei Bereiche. In der ersten Phase, also zu Beginn der Reaktion, überwiegt noch das Grundrauschen, ein Signal des PCR-Produktes ist noch nicht nachweisbar. Die zweite Phase entspricht der exponentiellen Wachstumsphase. In diesem Segment verdoppelt sich das DNA-Template annähernd in jedem Reaktionsschritt. Entscheidend für die Auswertung ist der Zyklus, bei dem detektierbare Fluoreszenz auftritt und die exponentielle Phase der Amplifikation beginnt. Dieser Threshold-Cycle(CT)-Wert oder auch Crossing Point liefert die Basis für die Berechnung der Ausgangsmenge an vorhandener Ziel-DNA. So ermittelt die Software bei einer absoluten Quantifizierung die Crossing Points der unterschiedlichen Referenz-Verdünnungen und quantifiziert anhand der errechneten Standardkurve die Template-Menge. In der letzten Phase erreicht die Reaktion schließlich ein Plateau.
Die quantitative PCR ist ein wichtiges Werkzeug für Genexpressionsstudien in der klinischen Forschung. Mit der Möglichkeit, mRNA exakt zu quantifizieren, lassen sich bei der Suche nach neuen Wirkstoffen die Auswirkungen bestimmter Faktoren auf Zellen analysieren, die Differenzierung von Vorläuferzellen in verschiedene Zelltypen beobachten oder die Genexpression in Wirtszellen als Antwort auf Infektionen nachverfolgen. Durch den Vergleich von Wildtyp- und Krebszellen auf RNA-Ebene können in der Zellkultur Gene identifiziert werden, die einen entscheidenden Einfluss auf Krebsentstehung haben. In der Routine-Labordiagnostik wird Real-Time-PCR vorrangig zum qualitativen und quantitativen Nachweis von Viren und Bakterien eingesetzt. In der klinischen Routine, insbesondere im Bereich der Intensivmedizin, braucht der Arzt einen schnellen und eindeutigen Befund. Auf Basis der Real-Time-PCR können Tests durchgeführt werden, die noch am gleichen Tag das Ergebnis liefern. Hiermit begründet sich ein enormer Fortschritt für die klinische Diagnostik der Sepsis.
Neben den hier beschriebenen technischen Varianten der PCR-Methode können auch sogenannte isothermale Amplifikationsverfahren wie beispielsweise NASBA oder SDA oder andere technische Varianten für die der Detektion vorausgehenden Vervielfältigung der Zielsequenz verwendet werden.
Ein bevorzugtes Verfahren zur Wahl der Multigenbiomarkersequenzen umfaßt die folgenden Schritte:

a. Patientenauswahl basiert auf dem extremen Gruppenverfahren;
b. Generierung von mindestens einem Multigenbiomarker;
c. Bestimmung finaler Multigenbiomarker.

Ein bevorzugtes Verfahren des dem „in vitro Diagnostic multivariate index assay” ähnlichen Tests umfaßt die folgenden Schritte:

a. Isolierung von Proben-Nukleinsäuren aus einer von einem Patienten stammenden Probe;
b. Erfassung von Genaktivitäten mittels Sequenzen von wenigstens einem Zustands- und/oder Untersuchungsfragespezifischen Multigenbiomarkers;
c. Erfassung von Genaktivitäten für wenigstens ein internes Referenzgen um die in b) erfassten Genaktivitäten zu normalisieren;
d. Verwendung einer Interpretationsfunktion für die in c) normalisierten Genaktivitäten um einen Zustands- und/oder Untersuchungsfrage-spezifischen Index abzuleiten.

Als technische Kontrolle werden zweckmäßig auch die Genaktivitäten von Kontrollgenen bestimmt, beispielsweise solchen mit den Sequenzen der SEQ ID NO: 670 bis SEQ ID NO: 675.
Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung liegt auch in einer Verwendung, bei welcher die Genaktivitäten mittels eines Hybridisierungsverfahrens, insbesondere auf wenigstens einem Mikroarray, bestimmt werden. Der Vorteil eines Mikroarrays liegt in der höheren Informationsdichte des Biochips im Vergleich zu den Amplifikationsverfahren. So ist es z. B. mühelos möglich, auf einem Mikroarray mehrere 100 Sonden bereitzustellen, um in einem einzigen Untersuchungsgang mehrere Fragestellungen gleichzeitig zu untersuchen.
Die mittels der Erfindung erhaltenen Genaktivitätsdaten können auch vorteilhaft für die elektronische Weiterverarbeitung, z. B. zur Aufzeichnung in der elektronischen Krankenakte verwendet werden.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung besteht in der Verwendung von rekombinant oder synthetisch hergestellten, spezifischen Nukleinsäuresequenzen, Partialsequenzen, einzeln oder in Teilmengen, als Multigenbiomarker in Sepsis-Assays und/oder zur Bewertung der Wirkung und Toxizität beim Wirkstoffscreening und/oder zur Herstellung von Therapeutika und von Stoffen und Stoffgemischen, die als Therapeutikum vorgesehen sind, zur Vorbeugung und Behandlung von SIRS und Sepsis.
Für die erfindungsgemäßen Verfahren (Arraytechnik und/oder Amplifikationsverfahren) wird die Probe ausgewählt aus: Gewebe, Körperflüssigkeiten, insbesondere Blut, Serum, Plasma, Urin, Speichel oder Zellen oder Zellkomponenten; oder eine Mischung davon.
Es ist bevorzugt, dass Proben, insbesondere Zellproben, einer lytischen Behandlung unterzogen werden, um deren Zellinhalte freizusetzen.
Offenbart werden hierzu Polynukleotidsequenzen von SEQ-ID NO: 1 bis SEQ-ID NO: 669 aus Blut und Blutzellen sowie daraus abgeleitete Sonden, welche zur Erstellung von Multigenbiomarkern verwendet werden können (vgl. Tab. 32).
Tab. 11 und 16 zeigen beispielhaft eine Sequenzauswahl für Multigenbiomarker für die Unterscheidung von infektiösen/nicht infektiösen Zuständen, und Tab. 20 und 21 zeigen beispielhaft eine Sequenzauswahl für Multigenbiomarker zur Unterscheidung von gram-positiven und gram-negativen Infektionen.
Es ist dem Fachmann klar, dass die in den Ansprüchen dargelegten einzelnen Merkmale der Erfindung ohne Einschränkung beliebig miteinander kombinierbar sind.
Klassifikationsmethoden
Die Theorie des Lernens spielt eine Schlüsselrolle auf dem Gebiet der Statistik, Datenanalyse und künstlichen Intelligenz mit zahlreichen Anwendungen in Ingenieurwissenschaften. Klassifikationsverfahren werden hauptsächlich bei 2 unterschiedlichen Aufgaben verwendet, bei der Abgrenzung von vorher unbekannten Klassen (unüberwachtes Lernen, class discovery) und bei der Zuordnung von bestimmten Daten/Proben/Patienten zu einer bereit definierten Klasse (Klassenvorhersage, class prediction) [Golub et al., 1999].
In der Klassenvorhersage werden Daten/Proben/Patienten benutzt, die bereits existierenden bzw. definierten Klassen/Gruppen zugeordnet wurden (so genannter Trainingsdatensatz), um ein analytisches Verfahren (Klassifikationsalgorithmus) zu entwickeln, das die Unterschiede zwischen den Gruppen widerspiegelt. Unabhängige Proben (sogenannter Testdatensatz) werden verwendet, um die Trennungsgüte der Klassifikationsregel zu bewerten. Die Vorgehensweise kann in folgende Schritte eingeteilt werden:

1. Definiere einen idealen Daten/Proben/Patientensatz, um charakteristische Profile der zu detektierenden Gruppen zu bekommen.
2. Jede Gruppe wird dann geteilt, so dass 2 gleichwertige Teilmengen, ein Trainingsdatensatz und ein Testdatensatz, entstehen.
3. Profile für den Trainingsdatensatz enthalten idealerweise Daten, die eine maximale Differenz zwischen den Gruppen widerspiegeln.
4. Die Differenz zwischen den Gruppen wird mittels geeigneter Abstandsmaße quantifiziert und anhand eines Algorithmus bewertet. Dieser Algorithmus sollte zu einer Klassifikationsregel führen, die mit der höchsten Spezifität und Sensitivität die Daten in die richtige Klasse einordnet. Typische Vertreter solcher Algorithmen aus dem Bereich des überwachten Lernens sind die Diskriminanzanalyse (DA), Random Forests (RF), Generalized Partial Least Squares (GPLS), Support Vector Machines (SVM) oder k-Nearest Neighbors (kNN).
5. Abschließend wird die Güte der Klassifikationsregel am Testdatensatz geprüft.

Definitionen:
Diskriminanzanalyse (DA): Bei der linearen Diskriminanzanalyse erhalten wir eine lineare, bei der quadratischen Diskriminanzanalyse (QDA) eine quadratische Diskriminanzfunktion. Die Diskriminanzfunktion bestimmt sich aus der Kovarianzmatrix und den Gruppenmittelwerten. Im Fall der quadratischen Diskriminanzanalyse wird zusätzlich angenommen, dass auch die Kovarianzmatrix zwischen den Gruppen variiert [Hastie et al., 2001].
Random Forests (RF): Die Klassifikation mittels Random Forests basiert auf der Kombination von Entscheidungsbäumen, [Breiman, 2001]. Der Ablauf des Algorithmus ist etwa folgendermaßen:

1. Wähle durch Ziehen mit Zurücklegen einen Trainingsdatensatz aus (Out-of-bag data).
2. An jedem Knoten des Entscheidungsbaums wähle zufällig Variablen aus. Berechne mit diesen Variablen die beste Aufteilung des Trainingsdatensatzes auf die Klassen.
3. Nachdem alle Entscheidungsbäume generiert wurden, fass die Klassenzuordnungen der einzelnen Entscheidungsbäume zu einer Klassenzuordnung zusammen.

Generalized Partial Least Squares (GPLS): Bei dem Generalized Partial Least Squares [Ding und Gentleman, 2004] Verfahren handelt es sich um eine sehr flexible Verallgemeinerung des multiplen Regressionsmodells. Aufgrund der großen Flexibilität kann diese Methode auch in vielen Situationen angewendet werden, in denen das klassische Modell versagt.
Support Vector Machine (SVM): Beim Support Vector Machine Klassifikator handelt es sich um einen verallgemeinerten linearen Klassifikator. Die Eingabedaten werden in einem höher dimensionalen Raum abgebildet und in diesem Raum wird eine optimale trennende (Hyper-)Ebene konstruiert. Diese im höherdimensionalen Raum linearen Schranken transformieren sich zu nichtlinearen Schranken im Raum der Eingabedaten, [Vapnik, 1999].
k-nächsten Nachbarn (k-Nearest Neighbors, kNN): Bei der Methode der k-nächsten Nachbarn, wird die Klassenzugehörigkeit einer Beobachtung (eines Patienten) anhand der sich in seiner Umgebung befindlichen k-nächsten Nachbarn entschieden. Die Nachbarschaft wird dabei in der Regel mit Hilfe des euklidischen Abstands bestimmt und die Klassenzugehörigkeit dann anhand eines Mehrheitsvotums entschieden [Hastie et al., 2001].
Im Folgenden ist ein generelles Konzept beschrieben, wie die erfindungsgemäßen Verfahren durchgeführt werden. Dabei ist dem Fachmann wohbekannt, dass geringfüge Anpassungen der statistischen Verfahren erforderlich sein können, wenn andere Patientenkollektive und/oder andere Fragestellungen untersucht werden sollen. Für die Generierung des Trainings- und des Testsdatensatzes werden verschiedene statistische Verfahren (Diskriminanzanalyse und/oder Random Forests u. a.) sowie Strategien verwendet (einfache und mehrfache Kreuzvalidierung, zufällige Bootstrapstichproben u. a.)
Basierend auf Mikroarray-Expressionsdaten sollte ein Verfahren zur Bestimmung eines Multigenbiomarkers entwickelt werden, der eine infektiöse Komplikation wie beispielsweise Sepsis widerspiegelt. Der Biomarker und der zugehörige Index-Wert, auch „Score” genannt, bilden die Grundlage eines sogenannten „in vitro Diagnostic multivariate Index Assays” [IVDMIA, FDA-Guidelines, 2003] zur Verbesserung der Diagnose systemischer Infektionen. Die aus dem Verfahren resultierende Klassifikationsregel sollte insbesondere eine Differenzierung von SIRS- und Sepsis-Patienten mit – im Vergleich zum etablierten Biomarker Procalcitonin – verbesserter Sensitivität und Spezifität ermöglichen, ist jedoch nicht auf diese Fragestellung beschränkt.
Zur Entwicklung eines solchen Multigenbiomarkers sind die folgenden Schritte notwendig: 1. Schritt: Trainingsdatensatz. Um den Zusammenhang zwischen einer Genexpression bestimmter Gene und der untersuchten Erkrankung aufzudecken, werden Populationen (Kohorten) definiert, die ihr Vorhanden- bzw. Nichtvorhandensein am deutlichsten repräsentieren. Bei der Diagnose einer infektiösen Komplikation werden üblicherweise Sepsis-Patienten (infektiös) und Patienten mit einer sogenannten sterilen SIRS (nichtinfektiös) in die Studie aufgenommen. Entsprechend dieser Festlegung wird ein Plan zur Sammlung bzw. Auswahl der zugehörigen RNA-Proben festgelegt. Von den ausgewählten Proben werden die Genexpressionsprofile auf einer geeigneten Plattform gemessen, vorverarbeitet und einer Qualitätskontrolle unterzogen. Systematische Messfehler werden korrigiert und Ausreißer eliminiert.
2. Schritt: Genvorauswahl. Bei der Generierung eines formalen Klassifikators auf der Basis von Mikroarray-Daten ist die Genvorauswahl ein Schlüsselschritt, da nur ein geringer Anteil der gemessenen Gene einen Beitrag zur Gruppenunterscheidung leistet. Auch die meisten Klassifikationsverfahren setzen eine Genselektion voraus. Durch eine präzise Genauswahl kann das Klassifikationsverfahren so einfach wie möglich gestaltet und eine Überanpassung an die Trainingsdaten (Querfitting) vermieden werden. Zur Vorauswahl der Klassifikationsgene werden geeignete Filteroptionen wie die Schwelle der statistischen Inferenz, der minimale akzeptierte Abstand zwischen den Gruppen, die minimale Signalintensität u. a. festgelegt. Nur Gene, die solche Bedingungen erfüllen, werden für die Klassifikation betrachtet.
3. Schritt: Klassifikationsverfahren. Verschiedene Klassifikationsverfahren werden bzgl. ihrer Trennfähigkeit hinsichtlich der zu differenzierenden pathophysiologischen Zustände getestet. Dazu werden Methoden der Cross-Validierung verwendet. Ein Klassifikationsverfahren mit dem kleinsten Klassifikationsfehler wird ausgewählt, wobei die kleinste notwendige Anzahl von Genen gleich mitbestimmt wird. Als sinnvolle Regel hat sich herausgestellt, dass die Anzahl der Gene immer kleiner sein soll als die Anzahl der Proben im Trainingsdatensatz, um eine Überanpassung zu vermeiden. Abschließend wird die resultierende Klassifikationsregel definiert.
Patientenauswahl. Die Patientenauswahl ist bei der Aufstellung des Trainingsdatensatzes bedeutsam. In einer Vorstudie im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde vorerst eine Sensitivität von ca. 75% im Trainings- und ca. 65% im Testdatensatz erreicht. Diese relativ geringe Klassifikationsgüte ließ sich aber nicht durch die schwache Optimierung des Klassifikators, sondern durch die nicht ausreichend präzise Auswahl von Sepsis-Patienten erklären. Dementsprechend wurden Sepsis-Patienten nach einer Peritonitis viel häufiger richtig klassifiziert als Sepsis-Patienten nach einer „VAP” (Ventilator-Associated Pneumonia). Tatsächlich liegt die infektiöse Komplikation nach einer Peritonitis an sich vor. Dagegen lässt sich bei VAP eine wirkliche Infektion von einer Kolonisation nur schwer unterscheiden [Mayhall, 2001].
Um die Güte der Patientenauswahl zu bewerten, kann das Prinzip der sogenannten Extremgruppen nützlich sein. Danach werden in einer Studie nur solche Patientengruppen berücksichtigt, die den untersuchten Effekt möglichst deutlich abbilden. Dabei repräsentieren die ausgewählten Stichproben einen idealisierten Fall, in dem viele in der Praxis auftretende Effekte (z. B. die Häufigkeit der Erkrankung) nicht berücksichtigt werden. Von Liu [Liu et al., 2005] wurde vorgeschlagen, für den Trainingsdatensatz eines auf Mikroarrays basierten Klassifikators Extremgruppen zu bilden. Am Beispiel der Überlebensanalyse von Krebspatienten wurde gezeigt, dass die Anwendung von extremen Gruppen (Patienten, die nach kurzer Zeit gestorben sind vs. Patienten, die lange überlebt haben) zu einer besseren Vorauswahl von Klassifikationsgenen und einer höheren Klassifikationgüte geführt hat, auch wenn der Trainingdatensatz aus weniger Profilen (Patienten) bestand, als im üblichen Fall, wenn alle Patienten (auch mit mittleren Überlebenszeiten) berücksicht wurden.
Im Folgenden wird ausgeführt, wie weit die Patientenauswahl die Generierung eines Multigenbiomarkers zur Diagnose der infektiösen Komplikation beeinflussen kann. In einer Studie der Anmelderin wurden Patienten, die nach einem schweren operativen Eingriff eine Sepsis entwickelt haben, untersucht. Es wurden Proben vom ersten Tag der Sepsis-Diagnose mit der Probe vom ersten post-operativen Tag verglichen. Die hier signifikant differentiell exprimierten Gene spiegeln aber einen Mischeffekt wider; die infektiöse Komplikation wird verdeckt durch Effekte wie Erholung nach dem operativen Stress oder die post-operative Behandlung. In der bereits erwähnten Pilotstudie wurden die Patienten mit einer klinischen (nicht immer mikrobiologisch gesicherten) Sepsisdiagnose in die Trainingspopulation eingeschlossen, was zu einer Durchmischung der beiden untersuchten Gruppen (Septiker und Kontrollen) führte und die Sensitivität verschlechterte. In dem Ausführungsbeispiel der US-Patentanmeldung Nr. 20060246495 wurde für die Auswahl der Sepsisgruppe ebenfalls die klinische Sepsisdiagnose verwendet. Darüber hinaus wurde die Schwere der Erkrankung zwischen der Gruppe der Sepsispatienten und der Kontrollgruppe der SIRS-Patienten nicht berücksichtigt. Dies kann der Grund der geringen Klassifikationsgüte und ihrer Abhängigkeit vom Klassifikationsalgorithmus sein. In die Studie von Johnson [Johnson et al., 2007] wurden Patienten nach einem Trauma in zwei Gruppen aufgeteilt, mit einer infektiösen Komplikation und ohne eine Infektion. Der Vorteil dieser Studie war, dass Patienten der beiden Gruppen sich in Komorbidität und Vorbehandlung wenig unterschieden. Die Vorauswahl ist aber nicht für alle Sepsispatienten repräsentativ und die Verallgemeinerung des hier aufgedeckten sepsisrelevanten Genexpressionsmusters auf Patienten mit anderem Hintergrund (auf andere Risikogruppen) ist nicht selbstverständlich. Im Allgemeinen muss davon ausgegangen werden, dass in Studien mit verschiedenen Risikogruppen auch verschiedene Klassifikatoren generiert werden müssen. In der Studie von Tang [Tang et al., 2007a] wurde das Prinzip der Extremgruppen indirekt angewandt, in dem nur Patienten mit einer mikrobiologisch gesicherten Sepsis-Diagnose im Trainingsdatensatz berücksichtigt wurden. Der Proben-Sammelplan führte aber zu einer kleinen Kontrollgruppe (ein Drittel der Proben: 14 aus 44). Dementsprechend wurde im Training eine Spezifität von 77% und in einem unabhängigen Testdatensatz (unter mehr realen Bedingungen) von lediglich 60% erreicht. Die Beschreibung der Patientengruppen in der SIRS-Lab Studie und der Studie von Tang [Tang et al., 2007a] lässt einen weiteren Einflussfaktor erkennen. Sie zeigt, dass die bzgl. des Infektionsfokus heterogenen Sepsisgruppen nicht ausbalanciert sind, sondern dass Gruppen mit verschiedenen Infektionsfoci unterschiedlich vertreten sind. Tatsächlich ist im Großteil der Fälle auf der Intensivstation (ITS) die Lunge (ca. 45–50%) oder der Abdomen (ca. 25%) der Fokus der Infektion bei einer Sepsisdiagnose. Dementsprechend sind diese Patientengruppen in den Untersuchungen überrepräsentiert, viele andere Foci kommen dann nur vereinzelt vor. Ähnlich sind in den Kontrollgruppen insbesondere postoperative und Traumapatienten vertreten und andere Risikogruppen sind nur durch einzelne Patienten vertreten. Die dargestellte Analyse zeigt, dass in allen Studien die ausgewählten Patientengruppen die infektiöse Komplikation nicht eindeutig abbilden, wodurch die Klassifikationsschwächen erklärt werden können. Andererseits wird aus der Zusammenfassung deutlich, dass es bei der infektiösen Komplikation kaum möglich ist, alle Einflussfaktoren bei der Auswahl der Patientengruppen zu berücksichtigen. Aus diesem Grund wird der folgende Weg zur Patientenauswahl für den Trainingsdatensatz vorgeschlagen.
Allgemeines zu Material und Methoden der vorliegenden Erfindung:
Patientenauswahl
Die Auswahl der repräsentativen Stichproben stand im Mittelpunkt des beschriebenen Verfahrens. Es wurden in den Trainingsdatensatz Patienten mit einer mikrobiologischen gesicherten bzw. ausgeschlossenen Infektionsdiagnose aus jeweils zwei der am besten repräsentierten Sepsis- bzw. Kontrollsubgruppen eingeschlossen. Damit wird das Prinzip der Extremgruppen nicht nur für den Haupteffekt (infektiös vs. nicht infektiös) sondern auch für die Kontrolle der wichtigsten Einflussgrössen (Schichtung von Populationen) angewandt. Der Vorteil dieser Auswahl ist vorerst, dass man hier einen Klassifikator für die häufigsten Risiko bzw. Erkrankungsgruppen generiert. Darüber hinaus wird erwartet, dass sich ein Klassifikator, der die systemische Infektion für wenige aber sehr unterschiedliche Subgruppen widerspiegelt, sich auf weitere Patientengruppen anwenden lässt. Bei der Auswahl der Trainingsdaten wurde wie folgt vorgegangen. In die Patientendatenbank der Anmelderin wurden im Zeitrahmen von zweieinhalb Jahren 400 ITS-Patienten aufgenommen, bei denen ein Sepsis-Risiko vermutet wurde, und die zugehörigen klinischen Daten über den gesamten Aufenthalt detailliert dokumentiert. Die RNA-Proben wurden über ca. 7–14 Sepsis-relevante Tage gesammelt. In Annäherung an das PIRO-Konzept [Levy et al., 2003] wurden die Patienten retrospektiv nach folgenden Kriterien stratifiziert: (i) welche Indikation führte zur der Übernahme auf die Intensivstation (postoperative Komplikation, Trauma bzw. Polytrauma, akuter Sepsisverdacht), (ii) wurde eine infektiöse Komplikation diagnostiziert, was war der Infektionsfokus, (iii) wie war die Reaktion des Organismus (Anzahl der vorhanden SIRS-Kriterien, Schock-Behandlung, PCT-, CRP-Werte), (iv) wie schwer war die Erkrankung (SOFA, MODS-Score). Die Datenbankrecherche ergab, dass mit einer infektiösen Komplikation (Sepsis) insbesondere Patienten nach einer Pneumonie (40%) und nach einer Peritonitis (23%) in die Studie aufgenommen wurden. Ohne eine Infektion wurden insbesondere Patienten nach einem (Poly-)Trauma (9%) und nach einer Bypass-Operation (20%) eingeschlossen. Diese Daten entsprechen den epidemiologischen Studien der Deutschen Sepsisgesellschaft, womit die Sammlung als repräsentativ eingestuft wurde. Die Patientendaten dieser Gruppen wurden unabhängig von 2 Ärzten [nach ACCP/SCCM, 1992; Levy et al., 2003; Calandra und Cohen, 2005] geprüft und die finale Patientenauswahl festgelegt. Es wurden aus den beiden Sepsis-Gruppen 46 Patienten mit einer mikrobiologisch gesicherten Diagnose ausgewählt und der erste septische Tag bestimmt. Die Zusammenfassung der Schwere-Kriterien ergab, dass bei den Patienten an diesem Tag eine schwere Sepsis bzw. ein septischer Schock diagnostiziert wurde. Sie erreichten einen durchschnittlichen SOFA-Wert von 10, die Summe akuter Organdysfunktionen betrug etwa 3. Aus den beiden Risikogruppen (nach einer CPB-Operation und oder einem Trauma) wurden 59 Patienten ohne Zeichen einer Infektion ausgewählt und der erste Tag mit einer ähnlichen Schwere wie bei den Sepsis-Gruppen bestimmt. Auf diese Weise wurden 105 Patienten primär in die Studie eingeschlossen; nach der Qualitätskontrolle der zugehörigen Mikroarray-Experimente wurde die Gruppe auf 96 Patienten mit guter Qualität der Genexpressionsmessung eingeschränkt. Eine Aufstellung zu wichtigen klinischen und Labor-Parametern für die ausgewählten Patienten findet sich beispielhaft, jedoch ohne Einschränkung hierauf, in Tab. 1.

Tabelle 1: Klinische und Labor-Parameter von beipielhaft ausgewählten Patienten, zusammengefasst nach den klinischen Gruppen.

	Peritonitis	Pneumonia	CPB	Trauma
Anz. Patienten	25	18	35	18
Mortalität	64.0%	44.4%	20.0%	0.0%
Geschlecht [m/w]	15/10	16/2	21/14	13/5
Alter* [J]	68 (14)	70 (11)	70 (12)	28 (19)
SIRS-Kiterien*	3 (2)	3 (0.75)	3 (1)	3 (1.75)
SOFA Score*	10 (4)	11 (2.75)	7 (3)	10 (5)
Anz. ODF*	3 (1)	3.5 (1)	3 (1)	2 (2)
PCT* [ng/ml]	21.1 (35.5)	4.2 (6.4)	3.3 (10.0)	1.2 (6.1)
CRP* [mg/l]	167.9 (92)	250 (119)	67.4 (49)	19.1 (27.5)
WBC* [no/l]	12900 (8400)	12600 (5650)	14600 (7300)	9350 (4350)

Generierung des Klassifikators
Auf dem Weg zur Klassifikatorentwicklung wurden folgende Schritte durchgeführt:

1. Schritt: Qualitätskontrolle: Aus der vom Expertenwissen bestätigten Vorauswahl aus einem Patientenkollektiv wurden die zugehörigen Genexpressionsdaten verschiedenen Ähnlichkeitsanalysen unterworfen, um untypische Hybridisierungsergebnisse auszuschließen [Buneß et al., 2005], wodurch die finale Trainingsdatenmatrix generiert wurde.
2. Schritt: Normalisierung bzw. Vorverarbeitung der Daten: Verglichen wurden verschiedene Verfahren der Background-Korrektur und der Normalisierung. Am besten zeigten sich Verfahren mit einer Varianz stabilisierenden Transformation [Rocke und Durbin, 2001]. Als bestes Normalisierungsverfahren stellte sich die Normalisierung mittels Box-Cox [Box und Cox, 1964], mit anschießender Median und MAD Standardisierung, heraus. Sein Vorteil, nämlich die Normalisierung einzelner Profile (gegenüber der Normalisierung der gesamte Datenmatrix nach z. B. Huber [Huber et al., 2003], wurde insbesondere beim Bootstrap gezielt verwendet.
3. Schritt: Filter: Es wurde ein Filter verwendet, um die besten Klassifikatorgene zu identifizieren. Der Filter bestand aus folgenden Schritten: (i) Auswahl von einer bestimmten Anzahl an Transkripten mit dem geringsten Variationskoeffizienten, wobei nur Transkripte mit einer positiven mittleren Signalintensität berücksichtigt wurden. (ii) Anschließend wurde für diese Transkripte der Wilcoxon-Test für den Vergleich infektiös vs. nicht infektiös durchgeführt. Die Transkripte wurden mittels der p-Werte angeordnet, wobei alle Transkripte mit einem p-Wert <= 0.001 als gleichwertig betrachtet werden und diese mittels dem Abstand zwischen infektiöser und nicht infektiöser Gruppe angeordnet werden. Der Abstand zwischen den beiden Gruppen wurde mittels des Hodges-Lehmann Schätzer [Hollander und Wolfe, 1973] bestimmt.
4. Schritt: Klassifikation: Die besten der ausgewählten Transkripte wurden dann zur Klassifikation eingesetzt. Im Klassifikationsschritt wurden verschiedene lineare und nicht lineare Verfahren [Hastie et al., 2001] miteinander verglichen: DLDA, LDA, RF, GPLS, SVM und kNN.
5. Schritt: Interne Validierung: Um die Güte der Klassifikation zu beurteilen wurde die 10-fach Kreuzvalidierung verwendet, wobei die Kreuzvalidierung mehrfach (20- bzw. sogar 1000-mal) wiederholt wurde.
6. Schritt: Auswahl der Transkripte: Die finale Auswahl der Transkripte für den Klassifikator erfolgte unter zu Hilfenahme von Bootstrap. Bootstrapping ist in der Statistik eine Methode des Resampling; dabei werden wiederholt Statistiken auf der Grundlage lediglich einer Stichprobe x = (x(1), ..., x(n)) berechnet. Dafür werden im einfachsten Fall B Bootstrap-Stichproben x(b) = (x*(1), ..., x*(n)), b = 1, ..., B, dadurch generiert, dass jeweils n mal aus der gegebenen Stichprobe ein Wert mit Zurücklegen gezogen wird [Efron, 1979].

So wurden aus dem ursprünglichen Trainingsdatensatz bestimmte für die jeweilige Fragestellung geeignete Bootstrap-Stichproben gezogen und für jede dieser Stichproben – wie oben beschrieben – die optimalen Transkripte bestimmt. Im finalen Klassifikator finden sich solche Transkripte, die bei häufigen, z. B. 5000 Wiederholungen am häufigsten ausgewählt wurden.
Bestimmung des finalen Klassifikators
Die Betrachtung der Abhängigkeit der Klassifikationsergebnisse von der Anzahl der Gene bestätigte das Resultat von Baker und Kramer [Baker und Kramer, 2006], nämlich, dass sich die Ergebnisse mit 5, 10, 25, 40 und 50 Genen wenig unterschieden. In 1 wird der Klassifikationsfehler für die lineare Diskriminanzanalyse (LDA) dargestellt. Da die Kurve ihr Minimum bei etwa 12 Merkmalen erreicht, wurden im weiteren die mit dieser Anzahl von Genen erreichten Ergebnisse dargestellt. In Tab. 2 wurden die Ergebnisse der verschiedenen Klassifikationsverfahren, die mittels 20 Wiederholungen einer 10-fach Kreuzvalidierung gewonnen wurden, zusammengefasst. Tabelle 2: Mittels 20-fach CV (Kreuzvalidierung) geschätzte Sensitivität und Spezifität bei simultaner Betrachtung von 12 Transkripten

DLDA LDA RF GPLS SVM 5-NN

Sensitivität 95.3 95.3 95.3 93.0 97.7 90.7

Spezifität 84.9 94.3 90.6 94.3 92.5 96.2
Aus Tab. 2 geht hervor, dass die geschätzte Sensitivität im Bereich von 95%, die geschätzte Spezifität – mit Ausnahme bei DLDA – im Bereich von über 90% liegen. Am vielversprechendsten sind die Ergebnisse mittels LDA und SVM. Im Fall dieser beiden Klassifikationsverfahren wurden jeweils nur wenige Patienten überwiegend falsch klassifiziert, so dass eine Missklassifikationsrate von höchstens 5% erreicht wird. Aufgrund der großen Komplexität der SVM-Methode und dem dadurch entstehenden Rechenaufwand, den die Optimierung eines SVM-Klassifikators verursachen würde, sowie der besseren biologischen Interpretierbarkeit eines Klassifikators auf der Basis der LDA hat sich die Anmelderin dazu entschieden, den Klassifikator auf der Basis der LDA zu entwickeln. Die aus der LDA resultierende Klassifikationsregel wurde in einen Score umgerechnet. Der Score ist für ein beispielhaftes Kollektiv von 96 Patienten in 2 dargestellt. Ein Wert > 10 zeigt an, dass eine Infektion (also Sepsis) sehr wahrscheinlich ist. Ein Wert zwischen +10 und –10, dass ein gewisses Risiko für eine Sepsis besteht. Ein Wert < –10 schließlich deutet darauf hin, dass eine Infektion sehr unwahrscheinlich ist.
Zusammenfassend ergibt sich folgendes Bild: Aus dem Generierungsprozess des Klassifikators werden die Vorteile der Gruppenauswahl deutlich: Die geschätzte Anzahl der Klassifikationsgene ist klein, wodurch eine Überanpassung (overfitting) an die Trainingsdaten unwahrscheinlich ist. Die einzelnen Klassifikationsverfahren unterscheiden sich dabei nur geringfügig (Dass die diagonale lineare Diskriminanzanalyse [DLDA] als Klassifikationsverfahren die geringste Klassifikationsgüte liefert, ist dadurch zu erklären, dass in der DLDA die Korrelation zwischen den Genen nicht berücksichtigt wird, was zum Infomationsverlust führt). Eine Erhöhung der Genanzahl verbessert das Ergebnis nicht. Diese Tatsachen deuten darauf hin, dass die Gruppen im Trainingsdatensatz sich gut trennen lassen, also deutliche Distanzen aufweisen.
Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden anhand von Beispielen und unter Bezug auf das Sequenzprotokoll, das ebenfalls ein Teil dieser Beschreibung ist, näher erläutert, ohne dass dies eine Einschränkung der Erfindung bedeutet.
Ergebnisse
Die Güte der erfindungsgemäßen Multigenbiomarker wurde mit den etablierten Biomarkern PCT und CRP verglichen, wofür die zugehörigen ROCs für den Trainingsdatensatz berechnet wurden (3). Man erhält als AUC (Area Under the Curve): AUC (PCT) = 0.326, AUC (CRP) = 0.656, AUC (PCT & CRP) = 0.940, AUC (Multigenbiomarker) = 0.997. Anhand dieser ROC-Kurven wird die sehr hohe Sensitivität bei ähnlich hoher Spezifität für den deutlich. Durch die gezielte Auswahl der Klassikationsgene wurde also von dem Multigenbiomarker eine bessere Klassifikationsgüte erreicht als von den etablierten Markern PCT und CRP, auch für die Trainingsdaten, die nach dem Prinzip der Extremgruppen scharfe Unterschiede repräsentieren.
Im nächsten Schritt wurden die Genexpressionsdaten der Patientendatenbank der Anmelderin, die nicht im Trainingsdatensatz verwendet wurden, einer Klassifikation unterzogen. Die 4a zeigt die Verteilung der Score-Werte in Abhängigkeit von der klinischen Diagnose. Zum Vergleich wird in der 4b die Verteilung der PCT- und CRP-Werte für den gleichen Datensatz dargestellt. Während die Index-Werte bzw. die Scores mit der klinischen Diagnose übereinstimmen, zeigt insbesondere die PCT-Verteilung, dass eine schwere SIRS eher als Sepsis und eine unkomplizierte Sepsis eher als nicht infektiös eingestuft wird. Eine unspezifische Verteilung zeigen die Marker CRP und WBC (Leukozytenanzahl).
Die Güte der erfindungsgemäßen Multigenbiomarker bzw. des erfindungsgemäßen Verfahrens wurde an Expressionsdaten von weiteren Patienten eines fremden Sammelzentrums untersucht. Auch hier stimmten die klinische und molekularbiologische Einstufung in 90% der Fälle überein.
In 5 wird abschließend die Score-Kurve im Verlauf der Erkrankung für einzelne Patienten dargestellt. Auch hier spiegelt der Multigenbiomarker der vorliegenden Erfindung die klinische Diagnose wider.
In die Validierungsanalyse wurden Patientenprofile der Patientendatabank der Anmelderin eingeschlossen, deren Expressionsprofile nicht im Trainingsdatensatz vertreten waren. Aufgrund des fehlenden Golden Standards für die Diagnose der Sepsis wurde dieser unabhängige Testdatensatz in geschichteten Subgruppen untersucht. Dabei wurden Patientenprofile nach der Schwere der Erkrankung aufgeteilt und klassifiziert (vgl. 4). Tatsächlich wurden Patienten mit einer unkomplizierten SIRS fast ausschließlich als nicht infektiös eingestuft. Patienten mit einer schweren SIRS (SIRS mit zusätzlicher Multiorgandysfunktion (MOD)) wurden überwiegend als nicht infektiös erkannt. Patienten mit einer unkomplizierten Sepsis wurden überwiegend als systemisch infektiös klassifiziert. Die infektiöse Komplikation wurde am häufigsten unter den Patienten mit einer schweren Sepsis bzw. einem septischen Schock bestimmt. Dieser Befund konnte an einer Patientengruppe, die in einem unabhängigen Zentrum rekrutiert und diagnostiziert wurden, bestätigt werden (6).
Weitere Vorteile und Merkmale der vorliegenden Erfindung ergeben sich aufgrund der Beschreibung von Ausführungsbeipielen sowie anhand der Zeichnung.
Es zeigt:
1 einen Verlauf des Klassifikationsfehlers der LDA in Abhängikeit von der Anzahl von Klassifikationsgenen; (a) Klassifikationsfehler bei der Verwendung von 5–200 Genen, (b) Auschnitt für 8–20 Gene;
2 einen Score (a) und seine Verteilung für den Trainingsdatensatz (b);
3 die Güte eines Multigenbiomarkers im Vergleich zu etablierten monomolekularen Biomarkern PCT und CRP bzw. ihrer Kombination (via LDA);
4 eine Verteilung der Biomarker-Werte in Abhängigkeit von der klinischen Diagnose, (a) Multigenbiomarker-Score, (b) PCT, CRP und WBC;
5 einen Verlauf des Score für drei Patienten (die graue Fläche markiert die Tage der Sepsisdiagnose;
6 eine Verteilung der Scores für Expressionsdaten eines fremden Sammelzentrums;
7 eine schematische Darstellung des Mikroarray-Designs und der drei Replikate;
8 eine Darstellung der auf dem Mikroarray repräsentierten Signalwege;
9 ein Beispiel eines qPCR-Laufs (Marker EPC1);
10 eine schematische Darstellung des abgeleiteten Score-wertes für 12 Marker und die Einteilung in vier Bereiche; auf diese Skala wird das Klassifikationsergebnis projiziert;
11 eine schematische Darstellung des abgeleiteten Score-Wertes und die Einteilung in vier Bereiche; auf diese Skala wird das Klassifikationsergebnis projiziert;
12 eine Darstellung der Expressionsunterschiede zwischen den Patientengruppen: Boxplots der Marker erstellt aus 31 Patientenproben (19 mit Sepsisdiagnose, 12 mit SIRS); die Legende erklärt die verwendeten Gensysmbole;
13 eine Boxplot der normalisierten Real-Time-PCR-Daten für den Biomarkerkandidaten CDKN1C (SEQ-ID NO: 104) zur Unterscheidung von gram-positiver und gram-negativer Infektion;
14 einen Boxplot der normalisierten Real-Time-PCR-Daten für den Biomarker CTSL zur Unterscheidung von gram-positiver und gram-negativer Infektion;
15 einen Boxplot der normalisierten Real-Time-PCR-Daten für den Biomarker kandidaten METTL7B (SEQ-ID NO: 145) zur Unterscheidung von gram-positiver und gram-negativer Infektion; und
16 einen Boxplot für den nicht-kodierenden Marker mit der SEQ-ID NO: 207; auf der y-Achse ist der mittlere Ct-Wert während der Real-Time-Amplifikation dargestellt.
Ausführungsbeispiele
Beispiel 1: Sepsis/SIRS-Abgrenzung
Es soll ein Verfahren zur Bestimmung von Multigenbiomarkern offenbart werden. Die aus dem Verfahren resultierende Klassifikationsregel soll eine Differenzierung von SIRS- und Sepsis-Patienten erlauben. Eine weitere Klassifikationsregel soll die Unterscheidung zwischen dem Fokus der Infektion Pneumonie und Peritonitis ermöglichen.
Experimenteller Ansatz
In genomweiten Genexpressionsuntersuchungen des Blutes nichtseptischer und septischer Patienten wurden Transkripte identifiziert, welche unbeeinflusst von der Heterogenität der Patienten bedingt durch Alter, Komorbiditäten und Medikationen die molekularen Unterschiede zwischen Gruppen von Sepsispatienten widerspiegeln. Abhängig vom untersuchten Patientenkollektiv ist die Anzahl der zur erfolgreichen Klassifikation benötigten Biomarker unterschiedlich.
Man geht davon aus, dass in heterogenen Kollektiven mehr Biomarker analysiert werden müssen als in sehr gut definierten Gruppen. Im Sinne möglichst robuster klinischer Diagnostik wird von einem Pool an signifikanten Biomarkern ausgegangen. Je nach diagnostischer Fragestellung werden dann Biomarker ausgewählt und das Klassifikationsverfahren auf diversen technischen Genexpressionsplattformen optimiert. An zwei Beispielen soll das Potenzial der Biomarkerkandidaten verdeutlicht werden:

a) Messung differenzieller Genexpression zwischen SIRS- und Sepsis-Patienten auf einem Mikroarray
b) Klassifikation von SIRS- und Sepsis-Patienten mit Genexpressionssignalen ausgewählter Oligonukleotidsonden, generiert auf dem Mikroarray

zu a:
Charakteristik des verwendeten-Arrays:

• mittels Spottingtechnologie hergestellter Oligonukleotid-Mikroarray
• 484 genspezifische Oligonukleotide sind in 3 Replikaten aufgebracht
• davon adressieren 344 Oligonukleotide Genexpressionsbiomarker
• 84 Oligonukleotide adressieren Kontrollen (neg. and pos.)
• 56 Oligonukleotide adressieren Referenzgene

7 zeigt eine schematische Darstellung des fokussierten Sepsis-Mikroarrays. Gespottet auf epoxy-silanisierte Glasträgern (Nexterion E-Slides, Hersteller Schott, BRD), ist jedes genspezifische Oligonukleotid dreifach repräsentiert. Die drei identischen Sub-Arrays werden mit einer Patientenprobe hybridisiert. Neben den markerspezifischen Oligonukleotiden sind auch Sonden für Kontrollen (Überwachung des gesamten Probenvorbereitungs- und Hybridisierungsprozesses) auf dem Array vertreten.
Biologische Plausibilität der eingesetzten Biomarker:
Die auf dem Array adressierten Markergene sind mit hoher Signifikanz den in 8 dargestellten Signalwegen in der menschlichen Zelle und den damit verbundenen Funktionalitäten zugeordnet. Eine hohe Relevanz für immunologische und inflammatorische Prozesse und damit auch die Sepsis ist gegeben. Für die wissensbasierte Analyse der Biomarkerpopulation auf dem fokussierten Sepsis-Array wurde die Software Ingenuity Pathway Analysis (Ingenuity Systems, USA, www.ingenuitv.com), verwendet, um den funktionellen Kontext der identifizierten Marker zu verdeutlichen. Basierend auf dem gesamten öffentlich verfügbaren Datenbankwissen über die Gene und Genprodukte werden die Marker in funktionelle Netzwerke eingeordnet, welche dann Relevanz für physiologische und pathologische Vorgänge haben können. Die Marker sind mit hoher Signifikanz an immunologischen und entzündlichen Prozessen beteiligt, was von funktioneller Seite einen engen Zusammenhang zur Sepsis vermuten lässt. Damit ist biologische Plausibilität, eine Grundvoraussetzung für Biomarker, gegeben.
Patientenkollektiv für die Auswertung:

Im Großteil der Fälle auf der Intensivstation (ITS) ist die Lunge (ca. 45–50%) oder der Abdomen (ca. 25%) der Fokus der Infektion bei einer Sepsisdiagnose. Daher wurden im Rahmen der Multigenbiomarker-Entwicklung Patienten mit Pneumonie bzw. Peritonitis ausgewählt. Im Fall der SIRS wurden Herz-Patienten ausgewählt, welche den Großteil der SIRS-Patienten auf einer ITS stellen darstellen. Auf diese Weise wurden 12 Patienten mit schwerer Pneumonie, 18 Patienten mit schwerer Peritonitis und 19 Herz-Patienten (OP: cardiopulmonaler Bypass) mit schwerer SIRS identifiziert. Für die Analysen wurde von diesen Patienten jeweils der erste Tag der Diagnose ausgewählt. In nachfolgender Tab. 3 ist das Patientenkollektiv für die Klassifikator-Validierung auf dem Sepsis-Array dargestellt. Tabelle 3: Patientenkollektiv für die Validierung des Klassifikators auf dem fokussierten Sepsis-Array (klinische Daten siehe Beschreibung Gesamtkollektiv von 96 Patienten)

Nr.	Spezifikation	Patient
1	Peritonitis	1021
2	Peritonitis	6008
3	Peritonitis	6008
4	Peritonitis	6023
5	Peritonitis	6023
6	Peritonitis	6023
7	Peritonitis	6025
8	Peritonitis	6035
9	Peritonitis	6073
10	Peritonitis	6075
11	Peritonitis	6084
12	Peritonitis	6118
13	Peritonitis	6127
14	Peritonitis	6132
15	Peritonitis	6138
16	Peritonitis	6040
17	Peritonitis	6065
18	Peritonitis	6096
19	CPB	814
20	CPB	2038
21	CPB	2042
22	CPB	2043
23	CPB	8001
24	CPB	8002
25	CPB	8009
26	CPB	8010
27	CPB	8032
28	CPB	8039
29	CPB	8068
30	CPB	8096
31	CPB	8102
32	CPB	8111
33	CPB	8112
34	CPB	8116
35	CPB	7072
36	CPB	7073
37	CPB	7134
38	Pneumonie	877
39	Pneumonie	1015
40	Pneumonie	6032
41	Pneumonie	6085
42	Pneumonie	6141
43	Pneumonie	8089
44	Pneumonie	6070
45	Pneumonie	6104
46	Pneumonie	6109
47	Pneumonie	6007
48	Pneumonie	6048
49	Pneumonie	6063

Hybridisierung:
4 μg totalRNA aus Patientenblut wurde mittels reverser Transkription (SuperscriptII, Invitrogen, USA) in einem Reaktionsvolumen von 30 μl??? in cDNA umgeschrieben. Als Primer wurde ein PolydT-Primer (18mer eingesetzt). Aminoallyl-dUTP wurde der Reaktion zugesetzt und somit 80% der dTTP Menge im mRNA-Strang anhand des AA-dUTP substituiert (Tab. 4). Tabelle 4: Pipettieransatz für die Proben für die cDNA-Synthese. 4 μg totalRNA sowie 2,5 μg OligodT Primer wurden vorgelegt. Mit RNAse-freiem Wasser wurde auf 30 μl Gesamtvolumen aufgefüllt.

Reaktionsansatz

Bestandteile Proben

5 × RT Puffer 6 μl

50 × dNTP 0,6 μl

0,1 M DTT 3 μl

RNase Out 0,4 μl

Superscript II 2 μl

Total RNA 4 μg

RNAase-freies Wasser auf 30 μl
Alle Proben werden für 2 h bei 42°C inkubiert. Nach diesen 2 h werden die entstandenen mRNA/cDNA Duplexe in einzel-strängige cDNA alkalisch hydrolisiert (Zugabe von je 20 μl 0,5 M EDTA (pH 8,0) und je 20 μl 1 N NaOH mit einer Inkubationszeit von 30 min bei 65°C). Zur Neutralisation der einzelsträngigen cDNA werden je 50 μl 1 M Tris-HCl (pH 7,4) zugegeben. Anschließend werden alle Proben mit 400 μl RNase freiem H₂O versetzt und mittels Microcon YM-30 Säulen (AMICON, USA) aufgereinigt. Dazu gibt man die gesamten Proben auf jeweils eine Säule, die bei 11000 × g für 10 min zentrifugiert wird. Nach zweimaligen waschen mit 450 μl RNase freien H₂O und dazwischenliegende Zentrifugationsschritten bei 11000 × g für 10 min, werden die Säulen umgedreht auf ein neues 1,5 ml Reaktionsgefäß gestülpt und für 3 min bei 15000 × g zentrifugiert. Als Eluat erhält man nun aufgereinigte einzelsträngige cDNA mit einem Volumen von ca. 20–40 μl, welche in der Speedvac zur Trockene reduziert wird.
Markierung der cDNA mit Fluoreszenzfarbstoffen
Zur Detektion der Hybridisierungssignale werden fluoreszierende Farbstoffe eingesetzt. Für die Analysen wurde ein Fluoreszenzfarbstoff von Dyomics verwendet (Hersteller: Dyomics GmbH, Jena, BRD). DY-647 (Cy5-Analoga) werden als N-Hydroxylsuccinimid-Ester (NHS-Ester) erworben und für die Fluoreszenzmarkierung eingesetzt. Die chemische Kopplung der Farbstoffe erfolgt an den eingebauten AA-dUTPs.
Die cDNA wird in 10 μl H₂O gelöst und mit je 5 μl auf zwei Röhrchen aufgeteilt. Die gelösten Proben werden bei 42°C für 5 min inkubiert. Anschließend werden jeder Probe jeweils 3 μl Bicarbonatpuffer zugesetzt. Der Fluoreszenzfarbstoff wird in DMSO (Hersteller SIGMA-Aldrich, BRD) gelöst. Pro Probe werden 75 μg Farbstoff eingesetzt.
Diese lichtempfindliche Reaktion erfolgt im Dunkeln für 1 h. Nach dieser Zeit werden die Proben mit H₂O auf ein Endvolumen von 30 μl aufgefüllt. Die Proben werden mit jeweils 80 μl H₂O und 100 μl Membran-Binding-Solution zusammenpipettiert und mittels Promega Kit (Promega Wizard-SV Gel and PCR CleanUP System, PROMEGA, USA) aufgereinigt, nach den Angaben des Herstellers.
Im letzten Schritt werden die Säulen für 1 min bei 16000 × g trocken zentrifugiert und zweimal mit 50 μl H₂O (je 1 min, 10000 × g) eluiert. Danach wird jede Probe mit 10 μl Cot-1-DNA (Invitrogen, USA) und 400 μl H₂O versetzt. Die Konzentration der markierten Proben erfolgt mittels Microcon YM-30 (10000 × g; 10 min Zentrifugation). Die Säulen werden umgedreht auf ein neues Röhrchen gestülpt und bei 15000 × g für 3 min zentrifugiert. Das Volumen des cDNA/Cot-1-DNA-Gemisches wird auf 32 μl eingestellt. Das fluoreszenzmarkierte cDNA/Cot-1-DNA-Gemisch (32 μl) wird mit 58 μl Hybridisierungsgemisch (Tab. 5) versetzt.
Nach dreiminütiger Denaturierung bei 98°C wird das Gemisch in die Hybridisierungskammern des TECAN-Hybridisierungsautomaten (HS-400, Hersteller Tecan, Österreich) einpipettiert. Das enthaltene Formamid setzt die Schmelztemperatur des Hybrids herab und ermöglicht somit eine gute Hybridisierung. Durch die Zugabe von 10%igem SDS wird die Benetzung der Biomoleküle am Glasobjektträger verbessert. Die Hefe-t-RNA/Poly-A-Mix sorgt dafür, dass es keine unspezifischen Bindungen und Hintergrundrauschen gibt. Demzufolge bindet Poly(A) an das Poly(T)-Ende der markierten cDNA, wobei die Hefe-t-RNA alle unspezifischen Sequenzen blockiert. Tabelle 5: Das Hybridisierungsgemisch für eine Probe.

Bestandteile der Hybridisierungsgemisch Volumina

Formamid 21,60 μl

20 × SSC 15,66 μl

10%SDS 2,70 μl

Hefe-t-RNA/polyA-Mix (je 10,0 μg/μl) 14,40 μl

RNase freies H₂O 3,64 μl

Das Programm an der Hybridisierungsstation ist in der nachfolgenden Tab. 6 dargestellt. Tabelle 6: Das Programm der standardisierten und kontrollierten Hybridisierung am Tecan Gerät.

Programm	Lösungen	Temperatur	Anzahl & Dauer der Durchgänge
1. Waschschritt	Hybridisierungs-Lösung (0,3% SDS, 3,5 × SSC, 24% Formamid)	42,0°C	2 Durchgänge; Zeit 1 min; Aufsaugzeit: 30 sek
2. Probeninjektion		42,0°C
3. Hybridisierung		42,0°C	Agitationsfrequenz: Medium; Zeit: 10 h
4. Waschschritt 1	Waschlösung 1 (2 × SSC/0,03% SDS)	25,0°C	2 Durchgänge; Zeit 1 min; Aufsaugzeit: 30 sek
5. Waschschritt 2	Waschlösung 2 (1 × SSC)	25,0°C	2 Durchgänge; Zeit: 1 min; Aufsaugzeit: 30 sek
6. Waschschritt 3	Waschlösung 3 (0,2 × SSC)	25,0°C	1 Durchgang; Zeit: 1 min; Aufsaugzeit: 30 sek
7. Slide Trocknung		30,0°C	Zeit: 2 min 30 sek; Abschließende Trocknung mit 2,5 bar Stickstoffzufuhr

Die Arrays werden zu Beginn mit Hybridisierungslösung gewaschen und anschließend mit den Proben inkubiert. Der Prozess wird für zehn Stunden bei einer Temperatur von 42°C in Hybridisierungskammern des Tecan Gerätes HS-400 mit konstanter Agitation des Hybridisierungsgemisches auf der Array Oberfläche durchgeführt. Zum Schluss werden die Arrays in drei automatisierten Schritten gewaschen und getrocknet.
Nach zehn Stunden werden alle nicht gebundenen Moleküle durch anschließende Waschschritte vom Mikroarray entfernt. Die fertigen Arrays müssen zur Auswertung eingescannt (AxonB Scanner, GenePix-Software, Axon Technologies, USA) werden. Die resultierenden gpr-files werden biostatistisch ausgewertet.
Auswertung
Die Datenanalyse wurde unter der freien Software R Project Version 2.6.1 durchgeführt, die unter www.r-project.org zur Verfügung steht.
1. Qualitätskontrolle der Rohdaten:
Aus der vom Expertenwissen bestätigten Vorauswahl aus 46 Patienten wurden die zugehörigen Genexpressionsdaten verschiedenen Ähnlichkeitsanalysen unterworfen, um untypische Hybridisierungsergebnisse auszuschließen [Buneß et al., 2005].
2. Normalisierung der Daten:
Verglichen wurden verschiedene Verfahren der Background-Korrektur und der Normalisierung. Am besten zeigten sich Verfahren mit einer Varianz stabilisierenden Transformation [Rocke und Durbin, 2001]. Als bestes Normalisierungsverfahren stellte sich die Normalisierung mittels Box-Cox [Box und Cox, 1964], mit anschießender Median und MAD Standardisierung, heraus. Sein Vorteil, nämlich die Normalisierung einzelner Profile (gegenüber der Normalisierung der gesamten Datenmatrix nach z. B. Huber [Huber et al., 2003], können insbesondere beim Bootstrap gezielt verwendet werden.
3. Statistischer Vergleich der Gruppen:
Die Expressionswerte der untersuchten Transkripte wurden mit dem Wilcoxon-Ranksummen-Test nach dem Infektionsstatus (infektiös vs. nicht infektiös) verglichen. Die Transkripte wurden aufsteigend nach dem erreichten p-Wert angeordnet, wobei alle Transkripte mit einem p-Wert <= 0.001 als gleichwertig betrachtet und diese mittels dem Abstand zwischen infektiöser und nicht infektiöser Gruppe angeordnet wurden. Der Abstand zwischen den beiden Gruppen wurde mittels des Hodges-Lehmann Schätzer bestimmt.
4. Klassifikation:
Aus Tab. 7 wurden 14 Transkripte ausgewählt, die die Patientengruppen in einem Klassifikationstest nach ihrem Infektionszustand am besten trennen konnten. Als bestes Klassifikationsverfahren (d. h. das Verfahren, das in einer einfachen Kreuzvalidierung den kleinsten Klassifikationsfehler lieferte) wurde die lineare Diskriminanzanalyse [Hastie et al., 2001] gewählt. Dafür wurde die Funktion Ida aus dem Packet MASS der Software R verwendet. Für die p = 14 Gen-Markerwurden die Gewichte (w₀, ..., w_p) der Diskriminanzfunktion f_LD, die durch die Formel
definiert ist, aus den normalisierten Expressionsdaten berechnet, wobei nacheinander eine Probe weggelassen wurde. Diese Probe wurde nachhinein klassifiziert, wofür in der vorangegangenen Formel für (x₁, ..., x_p) die ct-Werte der Probe eingesetzt wurden. Die Gewichte der Diskriminanzfunktion wurden so berechnet, dass ein positiver Wert der Funktion die Zuordnung zur Gruppe mit einer infektiösen Komplikation und ein negativer Wert der Funktion die Zuordnung zur Gruppe ohne eine infektiöse Komplikation bedeuten. Die Gewichte der linearen Diskriminanzfunktion, die aus allen Proben berechnet wurden, sind in Tab. 7 zusammengefasst.
zu b):
Klassifikationsergebnisse:

Die verwendeten Expressionssignale entstammen dem obigen Datensatz. In der Klassifikation wurden bei einer einfachen Kreuzvalidierung eine Sensitivität von 96% und eine Spezifität von 95% erreicht. Das entspricht einer Fehlerrate von 96%, also einer Falschklassifikation von 2 Proben. Die Gewichte der zugehörigen Diskriminanzfunktion sind in Tab. 7 zusammengefasst. Tabelle 7: Gewichte der linearen Diskriminanzfunktion als Ergebnis der Klassifikation

Wichtungfaktor	Gensymbol	SEQ-ID	Ermittelte Werte
w0		-	9,5
w1	K/AA0146	261	3,6
w2	FGL2	615	–3,9
w3	CCR2	529,530	–2,7
w4	HLA_DPA	613	–26,1
w5	CD59	571,572,573,574	16
w6	EPC1	280	23,5
w7	TLR5	431	–5,2
w8	CLU	575, 576	15,4
w9	MME	443,444,445,446	–11,3
w10	IGKCem	633	0,5
w11	NSMAF	527	13,7
w12	CCR2	529,530	23,9
w13	BZRP	601,602	–20,6
w14	CD82	470,471	–14,4

Tab. 8 zeigt die differenzielle Genexpression in den Patientengruppen, gemessen auf dem Mikroarray. Tabelle. 8: Differentielle Genexpression zwischen den Patientengruppen; p-Werte für die Analysen 1 und 2: grau unterlegt sind die Marker, die für die jeweilige Analyse einen signifikanten Unterschied zwischen den Gruppen aufzeigen; Analyse1 (nichtinfektiöse vs. infektiöse Ursache des Multiorganversagens): CPB Patienten vs. septische Patienten mit Fokus Peritonitis bzw. Pneumonie; Analyse2 (Fokus der Infektion, Unterscheidung von Fokus Peritonitis von Fokus Pneumonie): 18 septische Patienten mit Fokus Peritonitis vs. 12 Patienten mit dem Fokus Pneumonie

Analyse 1: infektiös/nichtinfektiös			Analyse 2: Pneumonie/Peritonitis als Fokus bei septischen Patienten
Seq-ID	p-Wert	Hodge-Lehmann Schätzer	Seq-ID	p-Wert	Hodge-Lehmann Schätzer
530	0	–0,516	236	0,000014	0,962
546	0	0,241	356	0,000056	–0,62
588	0	0,219	540	0,000244	0,339
613	0	–0,645	540	0,000319	0,399
340	0,000002	0,411	215	0,001067	0,335
530	0,000002	–0,505	235	0,001067	–0,405
626	0,000009	–0,404	161	0,001333	–0,492
599	0,000027	–0,412	364	0,001653	–0,361
600	0,000027	–0,412	365	0,001653	–0,361
527	0,000044	–0,231	18	0,00204	0,172
546	0,00005	0,244	413	0,00204	0,349
621	0,000056	0,233	414	0,00204	0,349
436	0,000062	0,157	415	0,00204	0,349
615	0,000062	–0,331	416	0,00204	0,349
324	0,00007	0,158	12	0,003054	0,318
619	0,000097	–0,365	13	0,003054	0,318
620	0,000097	–0,365	162	0,003054	0,372
518	0,000108	–0,336	272	0,003054	–0,358
628	0,000134	–0,182	571	0,003054	0,203
438	0,000166	–0,298	572	0,003054	0,203
439	0,000166	–0,298	573	0,003054	0,203
501	0,000184	0,17	574	0,003054	0,203
519	0,000184	0,394	636	0,003054	0,396
296	0,000226	0,17	233	0,00448	–0,247
408	0,00025	0,201	538	0,00448	–0,272
409	0,00025	0,201	539	0,00448	–0,272
410	0,00025	0,201	175	0,005386	0,199
411	0,00025	0,201	204	0,005386	0,452
412	0,00025	0,201	465	0,005386	0,296
504	0,00025	0,382	61	0,006447	–0,239
57	0,000277	0,147	62	0,006447	–0,239
183	0,000277	0,293	325	0,006447	–0,291
42	0,000306	–0,145	326	0,006447	–0,291
207	0,000306	0,135	538	0,006447	–0,286
515	0,000306	–0,147	539	0,006447	–0,286
516	0,000306	–0,147	635	0,006447	0,267
259	0,000338	–0,259	167	0,007681	0,415
179	0,00041	0,197	178	0,007681	0,227
180	0,00041	0,197	327	0,009114	–0,233
552	0,000452	–0,296	328	0,009114	–0,233
631	0,000452	0,201	384	0,009114	–0,193
454	0,000497	–0,251	443	0,009114	–0,449
520	0,000497	0,135	444	0,009114	–0,449
521	0,000497	0,135	445	0,009114	–0,449
45	0,0006	0,206	446	0,009114	–0,449
46	0,0006	0,206	18	0,010767	0,192
47	0,0006	0,206	208	0,010767	–0,351
48	0,0006	0,206	355	0,010767	–0,423
424	0,0006	0,156	552	0,010767	–0,214
425	0,0006	0,156	567	0,010767	0,257
426	0,0006	–0,246	581	0,010767	0,236
7	0,000658	0,177	35	0,01267	–0,135
596	0,000658	0,204	36	0,01267	–0,135
522	0,000721	–0,245	37	0,01267	–0,135
523	0,000721	–0,245	38	0,01267	–0,135
524	0,000721	–0,245	39	0,01267	–0,135
525	0,000721	–0,245	40	0,01267	–0,135
526	0,000721	–0,245	41	0,01267	–0,135
529	0,000721	–0,286	368	0,01267	0,224
530	0,000721	–0,286	369	0,01267	0,224
249	0,000865	0,315	370	0,01267	0,224
250	0,000865	0,315	371	0,01267	0,224
470	0,000865	0,17	372	0,01267	0,224
471	0,000865	0,17	373	0,01267	0,224
601	0,000946	0,221	379	0,01267	–0,302
602	0,000946	0,221	20	0,014847	–0,253
420	0,001034	0,303	21	0,014847	–0,253
421	0,001034	0,303	22	0,014847	–0,253
168	0,001129	0,2	23	0,014847	–0,253
197	0,001129	0,246	24	0,014847	–0,253
611	0,001232	–0,247	25	0,014847	–0,253
612	0,001232	–0,247	26	0,014847	–0,253
376	0,001344	0,158	27	0,014847	–0,253
430	0,001344	0,253	28	0,014847	–0,253
542	0,001344	0,139	29	0,014847	–0,253
543	0,001344	0,139	30	0,014847	–0,253
544	0,001344	0,139	31	0,014847	–0,253
545	0,001344	0,139	32	0,014847	–0,253
387	0,001464	0,247	33	0,014847	–0,253
388	0,001464	0,247	50	0,014847	–0,265
423	0,001464	–0,324	51	0,014847	–0,265
528	0,001594	0,324	52	0,014847	–0,265
337	0,001886	0,202	53	0,014847	–0,265
338	0,001886	0,202	54	0,014847	–0,265
469	0,001886	–0,244	55	0,014847	–0,265
302	0,002049	0,18	56	0,014847	–0,265
441	0,002049	0,248	243	0,014847	–0,182
568	0,002225	0,153	456	0,014847	0,241
569	0,002225	0,153	457	0,014847	0,241
295	0,002413	0,22	458	0,014847	0,241
460	0,002413	–0,3	459	0,014847	0,241
247	0,002835	0,173	177	0,017335	–0,121
364	0,002835	0,287	270	0,017335	0,134
365	0,002835	0,287	312	0,017335	0,184
248	0,00332	0,333	313	0,017335	0,184
350	0,00332	0,168	385	0,017335	0,265
273	0,00359	0,216	405	0,017335	0,225
581	0,00359	–0,269	406	0,017335	0,225
594	0,003878	0,176	407	0,017335	0,225
571	0,004187	0,256	438	0,017335	–0,282
572	0,004187	0,256	439	0,017335	–0,282
573	0,004187	0,256	583	0,017335	0,121
574	0,004187	0,256	584	0,017335	0,121
304	0,004518	0,152	58	0,02016	0,163
401	0,004518	0,282	59	0,02016	0,163
451	0,004518	0,184	199	0,02016	0,249
452	0,004518	0,184	460	0,02016	–0,326
561	0,004518	–0,179	533	0,02016	–0,186
601	0,004518	0,24	593	0,02016	0,151
602	0,004518	0,24	258	0,023364	0,28
330	0,004871	0,17	297	0,023364	0,275
331	0,004871	0,17	468	0,023364	0,219
332	0,004871	0,17	518	0,023364	–0,261
333	0,004871	0,17	615	0,023364	–0,19
334	0,004871	0,17	621	0,026976	0,128
335	0,004871	0,17	211	0,031043	0,158
475	0,004871	–0,217	249	0,031043	–0,258
476	0,004871	–0,217	250	0,031043	–0,258
623	0,004871	0,23	434	0,031043	0,283
221	0,005652	0,122	435	0,031043	0,283
222	0,005652	0,122	437	0,031043	0,281
223	0,005652	0,122	442	0,031043	–0,114
462	0,005652	–0,132	473	0,031043	–0,118
463	0,005652	–0,132	474	0,031043	–0,118
464	0,005652	–0,132	619	0,031043	–0,187
581	0,005652	–0,245	620	0,031043	–0,187
64	0,006541	0,218	624	0,031043	–0,202
65	0,006541	0,218	341	0,035598	0,15
196	0,006541	0,192	342	0,035598	0,15
509	0,006541	–0,207	563	0,035598	0,156
510	0,006541	–0,207	564	0,035598	0,156
511	0,006541	–0,207	595	0,035598	0,18
512	0,006541	–0,207	163	0,040689	–0,18
43	0,00703	0,195	164	0,040689	–0,18
44	0,00703	0,195	165	0,040689	–0,18
213	0,00703	0,091	166	0,040689	–0,18
276	0,00703	0,232	359	0,040689	–0,223
467	0,007551	–0,196	530	0,040689	–0,19
645	0,007551	–0,179	637	0,040689	–0,161
175	0,008695	0,147	638	0,040689	–0,161
592	0,008695	0,143	639	0,040689	–0,161
456	0,009321	–0,152	640	0,040689	–0,161
457	0,009321	–0,152	641	0,040689	–0,161
458	0,009321	–0,152	642	0,040689	–0,161
459	0,009321	–0,152	15	0,046354	–0,22
522	0,009321	–0,193	366	0,046354	–0,217
523	0,009321	–0,193	502	0,046354	0,136
524	0,009321	–0,193	503	0,046354	0,136
525	0,009321	–0,193	586	0,046354	–0,194
526	0,009321	–0,193	628	0,046354	–0,084
422	0,009986	–0,175	159	0,052643	0,114
535	0,009986	–0,309	387	0,052643	0,146
609	0,009986	–0,154	388	0,052643	0,146
258	0,010693	–0,198	422	0,052643	–0,199
283	0,010693	0,177	514	0,052643	0,152
215	0,012237	0,232	532	0,052643	–0,166
218	0,012237	0,131	534	0,052643	–0,251
616	0,012237	0,215	594	0,052643	0,174
617	0,012237	0,215	6	0,059596	0,19
618	0,012237	0,215	7	0,059596	–0,129
19	0,013079	0,155	209	0,059596	0,169
635	0,013079	0,173	220	0,059596	0,17
263	0,01397	–0,252	261	0,059596	–0,148
264	0,01397	–0,252	447	0,059596	–0,25
443	0,01397	–0,297	448	0,059596	–0,25
444	0,01397	–0,297	449	0,059596	–0,25
445	0,01397	–0,297	450	0,059596	–0,25
446	0,01397	–0,297	507	0,059596	0,189
479	0,01397	0,169	508	0,059596	0,189
405	0,014913	0,207	562	0,059596	0,138
406	0,014913	0,207	581	0,059596	0,199
407	0,014913	0,207	625	0,059596	–0,197
235	0,015911	0,268	197	0,067266	0,134
245	0,015911	0,131	281	0,067266	0,135
305	0,015911	0,168	291	0,067266	0,48
204	0,016966	0,227	453	0,067266	0,52
440	0,016966	0,134	213	0,075691	0,082
278	0,018079	0,181	236	0,075691	0,201
290	0,021804	0,309	286	0,075691	–0,175
314	0,021804	0,14	577	0,075691	0,131
327	0,021804	0,169	578	0,075691	0,131
328	0,021804	0,169	616	0,075691	–0,269
399	0,021804	0,131	617	0,075691	–0,269
400	0,021804	0,131	618	0,075691	–0,269
598	0,021804	0,139	182	0,084927	0,142
531	0,023182	–0,17	337	0,084927	0,119
597	0,023182	0,14	338	0,084927	0,119
161	0,026162	–0,243	522	0,084927	–0,169
351	0,026162	0,181	523	0,084927	–0,169
352	0,026162	0,181	524	0,084927	–0,169
353	0,026162	0,181	525	0,084927	–0,169
354	0,026162	0,181	526	0,084927	–0,169
383	0,026162	–0,128	645	0,084927	0,197
208	0,027769	0,285	255	0,095012	0,172
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228	0,029459	0,127	336	0,095012	–0,114
229	0,029459	0,127	555	0,095012	0,115
230	0,029459	0,127	556	0,095012	0,115
231	0,029459	0,127	226	0,106	0,091
402	0,033098	0,135	268	0,106	–0,135
307	0,035055	0,135	296	0,106	0,097
308	0,035055	0,135	404	0,106	0,13
309	0,035055	0,135	528	0,106	0,2
310	0,035055	0,135	550	0,106	0,132
311	0,035055	0,135	551	0,106	0,132
385	0,035055	0,156	566	0,106	0,186
540	0,035055	0,241	232	0,117926	0,165
322	0,037107	0,21	253	0,117926	0,356
323	0,037107	0,21	429	0,117926	0,102
593	0,037107	0,139	504	0,117926	–0,197
20	0,039258	–0,177	202	0,130844	0,21
21	0,039258	–0,177	218	0,130844	0,086
22	0,039258	–0,177	242	0,130844	–0,125
23	0,039258	–0,177	244	0,130844	–0,177
24	0,039258	–0,177	280	0,130844	–0,219
25	0,039258	–0,177	345	0,130844	0,181
26	0,039258	–0,177	346	0,130844	0,181
27	0,039258	–0,177	517	0,130844	0,102
28	0,039258	–0,177	14	0,144784	0,148
29	0,039258	–0,177	251	0,144784	0,095
30	0,039258	–0,177	265	0,144784	0,124
31	0,039258	–0,177	282	0,144784	0,166
32	0,039258	–0,177	324	0,144784	0,07
33	0,039258	–0,177	461	0,144784	0,091
226	0,039258	0,091	478	0,144784	0,144
329	0,039258	–0,141	541	0,144784	–0,174
301	0,041511	0,141	601	0,144784	0,153
325	0,041511	0,181	602	0,144784	0,153
326	0,041511	0,181	613	0,144784	–0,162
646	0,041511	0,09	200	0,159796	0,106
647	0,041511	0,09	225	0,159796	0,12
170	0,043871	0,388	237	0,159796	0,095
472	0,043871	0,146	252	0,159796	0,158
286	0,04634	0,188	262	0,159796	0,146
555	0,04634	0,111	288	0,159796	0,047
556	0,04634	0,111	304	0,159796	0,094
61	0,054443	0,159	17	0,175903	–0,151
62	0,054443	0,159	66	0,175903	0,112
292	0,054443	0,114	187	0,175903	–0,127
547	0,057388	–0,104	191	0,175903	0,186
624	0,057388	–0,112	192	0,175903	0,186
177	0,060461	0,13	193	0,175903	0,186
200	0,060461	0,11	194	0,175903	0,186
404	0,060461	0,109	224	0,175903	0,145
540	0,060461	0,263	317	0,175903	–0,115
541	0,060461	–0,14	318	0,175903	–0,115
549	0,060461	–0,177	424	0,175903	–0,103
627	0,060461	0,08	425	0,175903	–0,103
219	0,067007	0,104	519	0,175903	0,166
237	0,067007	0,077	534	0,175903	–0,143
389	0,067007	–0,279	535	0,175903	–0,258
542	0,067007	0,131	565	0,175903	0,144
543	0,067007	0,131	579	0,175903	0,123
544	0,067007	0,131	580	0,175903	0,123
545	0,067007	0,131	43	0,193151	0,101
312	0,070488	0,1	44	0,193151	0,101
313	0,070488	0,1	64	0,193151	–0,089
595	0,070488	0,095	65	0,193151	–0,089
634	0,070488	0,204	314	0,193151	0,111
35	0,074112	–0,087	374	0,193151	0,183
36	0,074112	–0,087	646	0,193151	–0,061
37	0,074112	–0,087	647	0,193151	–0,061
38	0,074112	–0,087	205	0,211556	0,179
39	0,074112	–0,087	210	0,211556	–0,131
40	0,074112	–0,087	278	0,211556	0,108
41	0,074112	–0,087	292	0,211556	0,086
214	0,074112	0,128	367	0,211556	0,081
632	0,074112	0,22	382	0,211556	0,08
14	0,077884	0,138	505	0,211556	0,145
156	0,077884	0,146	530	0,211556	–0,124
157	0,077884	0,146	201	0,231155	0,121
158	0,077884	0,146	227	0,231155	0,092
243	0,077884	–0,107	228	0,231155	0,092
505	0,077884	–0,189	229	0,231155	0,092
622	0,077884	0,172	230	0,231155	0,092
265	0,081808	0,12	231	0,231155	0,092
291	0,081808	–0,302	298	0,231155	–0,069
630	0,081808	0,178	383	0,231155	0,114
505	0,085886	–0,167	467	0,231155	–0,08
270	0,090124	0,105	501	0,231155	0,072
427	0,090124	–0,147	609	0,231155	–0,097
428	0,090124	–0,147	19	0,251953	–0,169
547	0,090124	–0,101	303	0,251953	0,094
553	0,090124	–0,123	454	0,251953	–0,169
225	0,094525	0,112	462	0,251953	–0,085
403	0,094525	0,119	463	0,251953	–0,085
607	0,094525	0,171	464	0,251953	–0,085
608	0,094525	0,171	475	0,251953	–0,128
629	0,094525	0,083	476	0,251953	–0,128
275	0,099092	0,093	254	0,273981	0,125
380	0,099092	0,097	375	0,273981	0,056
381	0,099092	0,097	389	0,273981	0,269
587	0,10383	0,118	430	0,273981	–0,113
186	0,108743	0,114	551	0,273981	0,118
453	0,108743	0,21	587	0,273981	0,072
211	0,113833	0,105	601	0,273981	0,121
577	0,113833	0,116	602	0,273981	0,121
578	0,113833	0,116	629	0,273981	0,039
6	0,119105	0,121	1	0,297233	0,079
182	0,119105	0,091	2	0,297233	0,079
633	0,119105	0,233	3	0,297233	0,079
483	0,124562	0,12	10	0,297233	0,086
484	0,124562	0,12	189	0,297233	0,082
485	0,124562	0,12	256	0,297233	0,106
486	0,124562	0,12	257	0,297233	0,106
487	0,124562	0,12	274	0,297233	–0,091
488	0,124562	0,12	358	0,297233	0,128
489	0,124562	0,12	431	0,297233	–0,178
490	0,124562	0,12	455	0,297233	–0,074
491	0,124562	0,12	479	0,297233	0,089
492	0,124562	0,12	588	0,297233	–0,036
493	0,124562	0,12	184	0,321727	–0,122
494	0,124562	0,12	196	0,321727	–0,128
495	0,124562	0,12	271	0,321727	–0,082
496	0,124562	0,12	322	0,321727	–0,109
497	0,124562	0,12	323	0,321727	–0,109
498	0,124562	0,12	339	0,321727	0,092
499	0,124562	0,12	390	0,321727	0,142
500	0,124562	0,12	433	0,321727	0,072
537	0,124562	0,17	440	0,321727	–0,085
589	0,124562	–0,12	466	0,321727	0,069
590	0,124562	–0,12	506	0,321727	0,085
591	0,124562	–0,12	522	0,321727	–0,101
199	0,130209	0,112	523	0,321727	–0,101
341	0,130209	0,107	524	0,321727	–0,101
342	0,130209	0,107	525	0,321727	–0,101
382	0,130209	0,116	526	0,321727	–0,101
506	0,130209	0,113	529	0,321727	–0,098
517	0,130209	–0,149	530	0,321727	–0,098
49	0,136047	0,141	546	0,321727	–0,089
195	0,136047	0,173	582	0,321727	0,092
387	0,136047	–0,093	599	0,321727	–0,06
388	0,136047	–0,093	600	0,321727	–0,06
461	0,136047	0,076	607	0,321727	0,139
188	0,148314	–0,091	608	0,321727	0,139
202	0,148314	–0,126	622	0,321727	0,153
603	0,148314	–0,15	183	0,347446	–0,116
604	0,148314	–0,15	216	0,347446	0,241
605	0,148314	–0,15	351	0,347446	0,105
606	0,148314	–0,15	352	0,347446	0,105
167	0,15475	0,154	353	0,347446	0,105
289	0,16139	0,069	354	0,347446	0,105
1	0,168239	0,06	419	0,347446	–0,075
2	0,168239	0,06	470	0,347446	0,056
3	0,168239	0,06	471	0,347446	0,056
299	0,168239	–0,136	9	0,374396	–0,117
300	0,168239	–0,136	171	0,374396	–0,062
319	0,168239	0,055	198	0,374396	–0,105
320	0,168239	0,055	238	0,374396	0,089
321	0,168239	0,055	239	0,374396	0,0891
191	0,175299	–0,088	285	0,374396	0,122
192	0,175299	–0,088	585	0,374396	0,066
193	0,175299	–0,088	156	0,402547	0,075
194	0,175299	–0,088	157	0,402547	0,075
253	0,175299	–0,245	158	0,402547	0,075
262	0,175299	0,131	176	0,402547	–0,092
566	0,175299	0,122	181	0,402547	–0,071
357	0,182573	0,071	219	0,402547	0,075
650	0,182573	0,086	240	0,402547	0,061
159	0,190064	0,088	284	0,402547	–0,112
240	0,190064	0,06	305	0,402547	–0,069
280	0,197774	0,101	319	0,402547	0,064
534	0,197774	–0,096	320	0,402547	0,064
614	0,197774	0,086	321	0,402547	0,064
260	0,205705	0,153	391	0,402547	0,094
391	0,205705	–0,084	392	0,402547	0,094
392	0,205705	–0,084	393	0,402547	0,094
393	0,205705	–0,084	394	0,402547	0,094
394	0,205705	–0,084	401	0,402547	–0,112
306	0,21386	0,066	436	0,402547	0,052
315	0,21386	0,072	589	0,402547	–0,081
203	0,22224	0,086	590	0,402547	–0,081
274	0,22224	0,096	591	0,402547	–0,081
298	0,22224	0,07	633	0,402547	–0,221
367	0,22224	0,061	45	0,431892	0,081
390	0,22224	–0,097	46	0,431892	0,081
466	0,22224	–0,084	47	0,431892	0,081
533	0,22224	0,07	48	0,431892	0,081
162	0,230849	0,134	266	0,431892	0,137
176	0,239686	0,046	267	0,431892	0,159
356	0,239686	–0,178	277	0,431892	0,078
551	0,239686	–0,106	290	0,431892	0,177
212	0,248754	–0,087	395	0,431892	0,041
358	0,248754	–0,069	396	0,431892	0,041
254	0,258055	0,108	397	0,431892	0,041
267	0,258055	0,142	398	0,431892	0,041
297	0,258055	–0,085	420	0,431892	0,108
433	0,258055	0,058	421	0,431892	0,108
234	0,267589	0,079	432	0,431892	0,103
345	0,267589	0,117	515	0,431892	–0,043
346	0,267589	0,117	516	0,431892	–0,043
532	0,267589	–0,092	631	0,431892	–0,077
473	0,277356	–0,067	4	0,462387	0,052
474	0,277356	–0,067	5	0,462387	0,052
538	0,277356	0,087	234	0,462387	–0,071
539	0,277356	0,087	245	0,462387	0,076
563	0,277356	–0,067	247	0,462387	0,042
564	0,277356	–0,067	289	0,462387	0,053
210	0,287359	0,072	295	0,462387	0,035
251	0,287359	–0,041	360	0,462387	0,074
294	0,287359	0,074	361	0,462387	0,074
429	0,287359	0,062	362	0,462387	0,074
232	0,297598	–0,114	363	0,462387	0,074
261	0,297598	0,05	376	0,462387	0,066
288	0,297598	0,042	441	0,462387	0,08
154	0,308072	0,093	505	0,462387	–0,1
236	0,308072	0,08	513	0,462387	–0,086
252	0,308072	–0,064	546	0,462387	–0,062
442	0,308072	–0,046	276	0,494013	0,07
63	0,318782	–0,083	329	0,494013	0,046
272	0,318782	–0,086	423	0,494013	0,11
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397	0,318782	–0,046	485	0,494013	0,078
398	0,318782	–0,046	486	0,494013	0,078
513	0,318782	–0,069	487	0,494013	0,078
187	0,329728	0,065	488	0,494013	0,078
244	0,329728	0,051	489	0,494013	0,078
277	0,329728	–0,089	490	0,494013	0,078
610	0,329728	0,122	491	0,494013	0,078
12	0,340909	0,078	492	0,494013	0,078
13	0,340909	0,078	493	0,494013	0,078
15	0,340909	–0,073	494	0,494013	0,078
339	0,340909	–0,109	495	0,494013	0,078
377	0,340909	0,088	496	0,494013	0,078
386	0,340909	–0,063	497	0,494013	0,078
431	0,340909	0,094	498	0,494013	0,078
242	0,352326	0,037	499	0,494013	0,078
375	0,352326	0,066	500	0,494013	0,078
480	0,363976	0,069	630	0,494013	0,154
481	0,363976	0,069	49	0,526711	–0,051
482	0,363976	0,069	57	0,526711	0,06
281	0,375859	–0,072	263	0,526711	0,07
579	0,375859	–0,089	264	0,526711	0,07
580	0,375859	–0,089	402	0,526711	–0,04
4	0,387973	0,067	451	0,526711	0,061
5	0,387973	0,067	452	0,526711	0,061
432	0,387973	0,087	527	0,526711	0,06
190	0,400318	–0,062	570	0,526711	0,06
343	0,400318	0,058	596	0,526711	0,048
344	0,400318	–0,054	610	0,526711	–0,14
418	0,400318	0,057	626	0,526711	–0,073
538	0,400318	0,062	214	0,56045	–0,04
539	0,400318	0,062	276	0,56045	0,077
50	0,412891	–0,057	343	0,56045	–0,065
51	0,412891	–0,057	509	0,56045	0,079
52	0,412891	–0,057	510	0,56045	0,079
53	0,412891	–0,057	511	0,56045	0,079
54	0,412891	–0,057	512	0,56045	0,079
55	0,412891	–0,057	542	0,56045	0,032
56	0,412891	–0,057	543	0,56045	0,032
163	0,412891	0,057	544	0,56045	0,032
164	0,412891	0,057	545	0,56045	0,032
165	0,412891	0,057	571	0,56045	0,046
166	0,412891	0,057	572	0,56045	0,046
636	0,412891	0,11	573	0,56045	0,046
206	0,42569	0,043	574	0,56045	0,046
282	0,42569	–0,05	8	0,595155	–0,066
360	0,42569	0,064	347	0,595155	0,037
361	0,42569	0,064	348	0,595155	0,037
362	0,42569	0,064	349	0,595155	0,037
363	0,42569	0,064	380	0,595155	0,067
582	0,42569	0,05	381	0,595155	0,067
201	0,438713	–0,052	399	0,595155	0,045
233	0,451957	0,054	400	0,595155	0,045
269	0,451957	–0,046	632	0,595155	–0,089
379	0,451957	–0,066	644	0,595155	0,053
465	0,451957	0,047	34	0,630785	–0,062
570	0,451957	–0,043	168	0,630785	0,017,
571	0,451957	0,061	217	0,630785	0,078
572	0,451957	0,061	283	0,630785	0,032
573	0,451957	0,061	302	0,630785	–0,029
574	0,451957	0,061	315	0,630785	–0,034
585	0,451957	0,06	426	0,630785	0,033
238	0,465419	–0,047	568	0,630785	0,026
239	0,465419	–0,047	569	0,630785	0,026
256	0,465419	0,06	575	0,630785	–0,114
257	0,465419	0,06	576	0,630785	–0,114
276	0,465419	–0,054	592	0,630785	0,026
366	0,465419	0,055	207	0,667254	0,022
384	0,465419	0,07	221	0,667254	–0,041
10	0,479097	–0,05	222	0,667254	–0,041
184	0,479097	0,046	223	0,667254	–0,041
217	0,479097	–0,04	248	0,667254	0,084
575	0,479097	–0,1	259	0,667254	0,056
576	0,479097	–0,1	294	0,667254	0,029
160	0,492987	0,047	330	0,667254	0,043
189	0,492987	0,041	331	0,667254	0,043
220	0,492987	0,059	332	0,667254	0,043
255	0,492987	0,056	333	0,667254	0,043
413	0,492987	–0,058	334	0,667254	0,043
414	0,492987	–0,058	335	0,667254	0,043
415	0,492987	–0,058	403	0,667254	0,044
416	0,492987	–0,058	469	0,667254	–0,037
625	0,492987	0,055	531	0,667254	–0,046
550	0,507086	–0,071	60	0,704507	0,033
551	0,507086	–0,071	185	0,704507	–0,019
557	0,507086	0,035	203	0,704507	–0,074
558	0,507086	0,035	287	0,704507	0,051
559	0,507086	0,035	377	0,704507	–0,073
560	0,507086	0,035	387	0,704507	0,086
643	0,507086	0,043	388	0,704507	0,086
17	0,521389	0,048	472	0,704507	–0,031
198	0,535892	0,044	520	0,704507	–0,014
533	0,535892	–0,037	521	0,704507	–0,014
637	0,535892	0,029	533	0,704507	–0,033
638	0,535892	0,029	547	0,704507	0,039
639	0,535892	0,029	186	0,742446	–0,02
640	0,535892	0,029	279	0,742446	0,018
641	0,535892	0,029	293	0,742446	0,084
642	0,535892	0,029	301	0,742446	–0,027
34	0,550592	0,054	357	0,742446	–0,029
317	0,550592	–0,023	427	0,742446	0,032
318	0,550592	–0,023	428	0,742446	0,032
648	0,550592	–0,05	575	0,742446	–0,037
649	0,550592	–0,05	576	0,742446	–0,037
284	0,565483	–0,033	648	0,742446	–0,072
293	0,565483	–0,053	649	0,742446	–0,072
554	0,565483	–0,023	42	0,78101	–0,022
60	0,580562	–0,059	155	0,78101	0,022
478	0,595822	0,042	275	0,78101	0,025
507	0,595822	0,03	306	0,78101	–0,023
508	0,595822	0,03	350	0,78101	0,031
205	0,611259	–0,052	378	0,78101	0,039
355	0,611259	–0,093	386	0,78101	0,036
378	0,611259	–0,029	408	0,78101	0,019
8	0,626866	0,027	409	0,78101	0,019
303	0,626866	0,036	410	0,78101	0,019
316	0,626866	–0,019	411	0,78101	0,019
562	0,626866	0,031	412	0,78101	0,019
9	0,658572	–0,048	542	0,78101	–0,047
18	0,674658	–0,025	543	0,78101	–0,047
216	0,674658	–0,055	544	0,78101	–0,047
347	0,674658	0,019	545	0,78101	–0,047
348	0,674658	0,019	650	0,78101	0,029
349	0,674658	0,019	188	0,82009	0,04
468	0,674658	0,022	260	0,82009	–0,012
536	0,674658	–0,036	299	0,82009	–0,043
11	0,690891	0,039	300	0,82009	–0,043
434	0,690891	–0,053	307	0,82009	–0,027
435	0,690891	–0,053	308	0,82009	–0,027
565	0,690891	–0,033	309	0,82009	–0,027
172	0,707264	0,025	310	0,82009	–0,027
173	0,707264	0,025	311	0,82009	–0,027
174	0,707264	0,025	344	0,82009	0,028
224	0,707264	0,024	418	0,82009	0,026
246	0,707264	0,037	548	0,82009	–0,027
271	0,723771	–0,021	549	0,82009	0,018
171	0,740405	–0,018	554	0,82009	0,011
567	0,740405	–0,022	598	0,82009	0,031
586	0,757158	–0,019	11	0,859616	–0,011
419	0,774024	–0,017	16	0,859616	–0,025
66	0,790995	–0,012	246	0,859616	0,044
447	0,790995	0,021	340	0,859616	0,027
448	0,790995	0,021	480	0,859616	–0,018
449	0,790995	0,021	481	0,859616	–0,018
450	0,790995	0,021	482	0,859616	–0,018
514	0,790995	–0,014	547	0,859616	–0,009
548	0,790995	0,021	603	0,859616	0,025
268	0,808064	–0,017	604	0,859616	0,025
16	0,825223	0,018	605	0,859616	0,025
209	0,825223	–0,018	606	0,859616	0,025
241	0,825223	–0,016	627	0,859616	0,012
437	0,825223	0,017	643	0,859616	0,013
502	0,825223	–0,016	154	0,899475	–0,033
503	0,825223	–0,016	169	0,899475	–0,022
266	0,842464	0,032	179	0,899475	0,002
374	0,859779	–0,008	180	0,899475	0,002
644	0,859779	0,02	195	0,899475	0,033
185	0,877161	–0,013	561	0,899475	0,014
417	0,877161	0,01	614	0,899475	–0,012
583	0,877161	–0,007	634	0,899475	0,032
584	0,877161	–0,007	63	0,93959	–0,007
279	0,8946	–0,013	190	0,93959	–0,022
287	0,91209	–0,011	206	0,93959	0,011
336	0,91209	–0,01	212	0,93959	0,028
155	0,929622	–0,024	417	0,93959	–0,006
169	0,929622	–0,013	536	0,93959	0,037
178	0,929622	0,006	597	0,93959	0,009
181	0,929622	0,009	160	0,979843	0,006
368	0,929622	–0,024	172	0,979843	0,002
369	0,929622	–0,024	173	0,979843	0,002
370	0,929622	–0,024	174	0,979843	0,002
371	0,929622	–0,024	241	0,979843	0,017
372	0,929622	–0,024	273	0,979843	0,005
373	0,929622	–0,024	477	0,979843	0,003
58	0,964777	0,007	537	0,979843	0,01
59	0,964777	0,007	557	0,979843	–0,001
359	0,964777	0,005	558	0,979843	–0,001
534	0,964777	–0,003	559	0,979843	–0,001
18	0,982384	–0,002	560	0,979843	–0,001
477	0,982384	0,003	611	0,979843	–0,011
285	1	–0,002	612	0,979843	–0,011
455	1	0,002	623	0,979843	0,003
575	1	0,001	269	1	0
576	1	0,001	553	1	–0,005

Beispiel 2: Aufstellung eines Klassifikators zur Identifizierung von SIRS- und Sepsis-Patienten mittels Real-Time-PCR
Messung der Genexpression
Es wurden Patienten mit Pneumonie bzw. Peritonitis als typische Sepsis-Vertreter und im Fall der SIRS Patienten mit einer schweren Herz-OP ausgewählt (Cardiopulmonaler Bypass, CPB), da diese den Großteil der SIRS-Patienten auf einer ITS stellen (siehe Tab. 9). Die Patienten wurden retrospektiv von einem Ärzte-Team der Uni-Klinik Jena in ihrer Diagnose validiert.

Aus dem Blut der Patienten wurde Total-RNA isoliert und in cDNA umgeschrieben. Diese wurde im Assay als Templat eingesetzt. Tabelle 9: Liste der untersuchten Patienten

Patienten-ID	Sepsis		SIRS
Patienten-ID	Peritonitis	Pneumonie	SIRS
714	X
6008	X
6009	X
6025	X
6035	X
6040	X
6046	X
6062	X
6065	X
6073	X
6075	X
6084	X
6032		X
6048		X
6063		X
6070		X
6085		X
6104		X
6141		X
814			X
8001			X
8002			X
8009			X
8010			X
8012			X
8068			X
8096			X
8102			X
8111			X
8112			X
8116			X

Die Marker zur Klassifizierung (Tab. 10) wurden aus dem Biomarkerpool (siehe Beispiel 1) ausgewählt und zeigen starke differenzielle Genexpression in Patientengruppen mit und ohne diagnostizierte Sepsis.

Zur Quantifizierung von Genexpression sind verschiedene Methoden verfügbar. Relative Quantifizierung von Genexpression bedeutet eine Aussage zur Abundanz des Targettranskriptes beispielsweise bezogen auf einen Kalibrator. Das kann ein aus den Expressionswerten konstant exprimierter Gene (sog. Referenzgene oder Housekeepinggene) ermittelter Bezugswert sein. Für jeden Organismus und jedes Gewebe sind solche Referenzgene spezifisch und müssen für die jeweilige Studie sorgfältig ausgewählt werden. Ausgehend von den Genexpressionsprofilen aus dem Vollblut der Sepsis- und Kontrollpatienten wurden die stabilsten Gene mit der geringsten Variabilität ausgewählt und in der quantitativen PCR zur Normalisierung eingesetzt. Tabelle 10: Markergene, die für die Klassifizierung verwendet wurden

Marker	Beschreibung (NCBI-Datenbank, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)
BZRP	Benzodiazepine receptor
CD82	CD82 molecule
CD59	CD59 molecule
FGL2	Fibrinogen-related protein
HIA-DPA1	Major histocompatibility complex, class II, DP alpha 1
CPVL	Carboxypeptidase vitellogenetic-like gene
MME	Metallomembrane endopeptidase
IL7R	Interleukin 7 receptor
CCR2	Chemokine (C-C motif) receptor 2
EPC1	Enhancer of polycomb homolog 1 (Primerpaar 6)
KIAA0146
C4orf18	Chromosome 4 open reading frame 18
MON2	= KIAA1040, MON2 homolog
NSMAF	Neutral sphingomyelinase (N-SMase) activation associated factor
TLR5	Toll-like receptor 5
CLU	Clusterin
IGKCem	Immunglobulin kappa constant
ZFANDA	Zinc finger AN-type domain 2A
UBC (housekeeper)	Ubiquitin
ITGAL (housekeeper)	Integrin, alpha L
SNAPC (housekeeper)	Small nuclear RNA activating complex
IL18 (housekeeper)	Interleukin 18
CASP8 (housekeeper)	Caspase 8

Tab. 11 ist eine Liste der in der Real-Time PCR verwendeten Primer und deren SeqIDs. Für jede Zielsequenz sind mehrere Primerkombinationen möglich, die Tabelle stellt nur eine von vielen Möglichkeiten dar. Tabelle 11: Liste der verwendeten Primer. Für jede Zielsequenz sind mehrere Primerkombinationen möglich.

Marker und Referenzgene	Primer für quantitative PCR (SeqID)
BZRP (SeqID 601,602)	Forward	687
BZRP (SeqID 601,602)	Reverse	688
CD82 (SeqID 470,471)	Forward	689
CD82 (SeqID 470,471)	Reverse	690
CD59 (SeqID 571, 572, 573, 574)	Forward	691
CD59 (SeqID 571, 572, 573, 574)	Reverse	692
FGL2 (SeqID 615)	Forward	693
FGL2 (SeqID 615)	Reverse	694
HLA-DPA1 (SeqID 613)	Forward	695
HLA-DPA1 (SeqID 613)	Reverse	696
CPVL (SeqID 619,620)	Forward	697
CPVL (SeqID 619,620)	Reverse	698
MME (SeqID 443,444,445,446)	Forward	699
MME (SeqID 443,444,445,446)	Reverse	700
IL7R (SeqID 541)	Forward	701
IL7R (SeqID 541)	Reverse	702
CCR2 (SeqID 529,530)	Forward	703
CCR2 (SeqID 529,530)	Reverse	704
EPC1 (SeqID 280)	Forward	705
EPC1 (SeqID 280)	Reverse	706
KIAA0146 (SeqID 261)	Forward	707
KIAA0146 (SeqID 261)	Reverse	708
C4orf18 (SeqID 611,612)	Forward	709
C4orf18 (SeqID 611,612)	Reverse	710
MON2 (SeqID 248)	Forward	711
MON2 (SeqID 248)	Reverse	712
NSMAF (SeqID 527)	Forward	713
NSMAF (SeqID 527)	Reverse	714
TLR5 (SeqID 431)	Forward	715
TLR5 (SeqID 431)	Reverse	716
CLU (SeqID 575, 576)	Forward	717
CLU (SeqID 575, 576)	Reverse	718
IGKCem (SeqID 401)	Forward	719
IGKCem (SeqID 401)	Reverse	720
ZFANDA (SeqID 290)	Forward	721
ZFANDA (SeqID 290)	Reverse	722
UBC (SeqID 678)	Forward	723
UBC (SeqID 678)	Reverse	724
ITGAL (SeqID 676, 677)	Forward	725
ITGAL (SeqID 676, 677)	Reverse	726
SNAPC (SeqID 679)	Forward	727
SNAPC (SeqID 679)	Reverse	728
IL18 (SeqID 680)	Forward	729
IL18 (SeqID 680)	Reverse	730
CASP8 (SeqID 681, 682, 683, 684, 685, 686)	Forward	731
CASP8 (SeqID 681, 682, 683, 684, 685, 686)	Reverse	732

Experimentelle Ausführung
Blutabnahme und RNA-Isolation:
Das Vollblut der Patienten wurde auf der Intensivstation von den Patienten mittels des PAXGene Kits gemäß den Vorgaben des Herstellers (Qiagen) abgenommen und die RNA isoliert.
Reverse Transkription:
Von jeder Patienten-Probe wurden 4 μg der Total-RNA zu komplementärer DNA (cDNA) mit der reversen Transkriptase Superscript II (Invitrogen) in einem 20 μl-Ansatz (enthält 1 μl 10 mM dNTP-Mix von Fermentas und 1 μl 0,5 μg/μl Oligo(dT)-Primer) umgeschrieben. Die RNA wurde anschließend durch alkalische Hydrolyse aus dem Ansatz entfernt. Die Reaktionsansätze wurden nicht aufgereinigt, sondern mit Wasser auf 50 μl aufgefüllt.
Real-Time-PCR

Verwendet wurde der Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG-Kit der Firma Invitrogen. Die Patienten-cDNA wurde 1:100 mit Wasser verdünnt und davon jeweils 1 μl in die PCR eingesetzt. Es wurde pro Marker eine PCR-Platte (BIORAD) mit allen 31 Patienten und No-Template-Controls (NTC) in 3-facher Ausführung pipettiert.

PCR-Ansatz pro well (10 μl)	2 μl Templat-cDNA 1:100
	1 μl forward primer, 10 mM
	1 μl reverse primer, 10 mM
	1 μl Fluorescein Reference Dye
	5 μl Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG

Es wurde ein Mastermix ohne Templat hergestellt, dieser wurde in 9 μl-Aliquots in die PCR-Platte gesteppt und dazu wurden jeweils die Patienten-cDNAs pipettiert.
Das sich daran anschließende PCR-Programm war folgendermaßen aufgebaut:
Verwendet wurde das iQ^TM5 Multicolor Real-Time-PCR Detection System der Firma BIORAD mit der dazugehörigen Auswertungssoftware. Die Ergebnisse eines solchen qPCR-Laufs sind in 9 gezeigt. Mit Hilfe der Auswertungssoftware wurden für jeden der 18 Marker und 5 Housekeeper solche Abbildungen generiert, aus denen sich dann die entsprechenden Ct-Werte ableiten ließen. Die Ct-Werte werden vom Programm automatisch im Bereich des linearen Anstiegs der Kurven berechnet. Im Beispiel von EPC1 lagen die Ct-Werte für die Sepsis-Patienten im Bereich von 25,08–27,71 und für die SIRS-Patienten im Bereich von 28,08–35,91.
Datenanalyse:
Die Datenanalyse wurde unter der freien Software R Project Version 2.6.1 durchgeführt, die unter www.r-project.org zur Verfügung steht.
Daten-Vorverarbeitung:
Die gemessenen Expressionssignale wurden im Excel-Format abgespeichert und über die 3-fach-Bestimmungen gemittelt. Der Marker MON2 mit 15 fehlenden Werten und die Patienten 6065 und 8111 mit 13 bzw. einem fehlenden Wert wurden aus der Analyse ausgeschlossen. Damit enthielt der Trainingsdatensatz 18 infektiöse (62%) und 11 nicht infektiöse (38%) Proben. Zum Normalisieren wurden aus den 5 gemessenen die 3 stabilsten Housekeepergene bestimmt. Anschließend wurde für jeden Patienten wurde der Mittelwert der 3 ausgewählten Housekeeper-Gene von den Marker-Genen subtrahiert.
Klassifikation:
Um die Gen-Marker nach ihrer Trennungsgüte anzuordnen, wurde der Wilcoxon Ranksummen-Test durchgeführt, in dem die Patientengruppen mit und ohne eine infektiöse Komplikation verglichen wurden. Danach wurden Gene mit p < 0.001 nach dem Hodge-Lehmann-Schätzer angeordnet, die restlichen nach dem p-Wert selbst.
Für die Klassifikation wurde die lineare Diskriminanzanalyse [Hastie et al., 2001] mit einer einfachen Kreuzvalidierung verwendet. Die Berechnung erfolgte unter der Verwendung der Funktion Ida aus der R-Bibliothek MASS. Für p Marker wurden die Gewichte (w₀, ..., w_p) der Diskriminanzfunktion f_LD, die durch die Formel
definiert ist, aus den Trainingsdaten berechnet, wobei nacheinander eine Probe weggelassen wurde. Diese Probe wurde nachhinein klassifiziert, wofür in der vorangegangenen Formel für x_i die Ct-Werte der Probe eingesetzt wurden. Die Gewichte der Diskriminanzfunktion wurden so berechnet, dass ein positiver Wert der Funktion die Zuordnung zur Gruppe mit einer infektiösen Komplikation und ein negativer Wert der Funktion die Zuordnung zur Gruppe ohne eine infektiöse Komplikation bedeuten. Die Klassifikationsprozedur wurde für eine aufsteigende Anzahl von Markern wiederholt.
Anschließend wurde die Vorgehensweise für alle Trainingsdaten durchgeführt und zwei weiteren unabhängigen Proben wurden klassifiziert. Die Gewichte der linearen Diskriminanzfunktion für die aufsteigende Anzahl der Marker und die zugehörigen Score-werte für die unabhängigen Proben 790 und 933 (die grau unterlegten Werte wurden in 12 graphisch dargestellt) sind in Tab. 12 zusammengefasst.
Ergebnisse
Bei der Klassifikation wurden zuerst die 2 besten Marker verwendet, danach wurde schrittweise der nächste Marker zugefügt. Bei der einfachen Kreuzvalidierung wurde in fast allen Fällen keine Probe falsch klassifiziert. Lediglich bei der Verwendung von 13, 14 und 17 Markern wurde bei der einfachen Kreuzvalidierung eine nicht infektiöse Probe falsch klassifiziert. Damit wurden eine Sensitivität von 100% und eine Spezifität von 91% für den Trainingsdatensatz erreicht.
Die zwei unabhängigen Proben 933 und 790 wurden beide überwiegend korrekt klassifiziert. Für die korrekte Klassifikation (d. h. einen negativen Score-Wert) der nicht-infektiösen Probe 933 benötigte man 2 und mehr Marker. Für die infektiöse Probe 790 benötigte man 6 und mehr Marker-Gene, um einen positiven Score-Wert zu erreichen (vgl. Tab. 12). Die Klassifikation wurde mit mehr als 14 Markern instabil. In 10 sind die Score-Werte für die Klassifikation mit 12 Markern für die Proben 933 und 790 abgebildet. Es wird eine schematische Darstellung des abgeleiteten Score-Wertes und die Einteilung in 4 Bereiche gezeigt. Liegt der berechnete Score über 6,5, so hat der Patient mit einer 95%igen Wahrscheinlichkeit eine Sepsis (infektiös). Liegt der Score unter –6,5, so ist die Wahrscheinlichkeit, keine Sepsis zu haben, für den Patienten ebenfalls 95% (nicht infektiös). Auf diese Skala wurde das Klassifikationsergebnis für 12 Marker für zwei vom Klassifikationsdatensatz unabhängige Testproben projiziert. Der Score der Probe 933 nahm den Wert von –36,58 an und der Patient wurde als nicht infektiös klassifiziert; der Score der Probe 790 nahm den Wert von 7,44 an und wurde als infektiös klassifiziert.
Die Experimente lieferten Expressionssignale in guter Qualität, so dass die zugehörige Datenmatrix zur Aufstellung des Klassikators verwendet werden konnte. Mittels der gemessenen Signale konnten die Trainingsdaten nach der infektiösen Komplikation so gut wie vollständig getrennt werden. Ebenfalls 2 unabhängige Testdaten wurden richtig klassifiziert. Für eine robuste Klassifikationsgüte im Trainings- und Testdatensatz benötigte man 6 bis 14 Klassifikationsmarker.
Tab. 13a zeigt die Rohdaten (Ct-Werte) aus den qPCR-Assays, wobei in Tab. 13b die Gewichte der linearen Diskriminanzfunktion für aufsteigende Anzahl von Markern und die zugehörigen Score-Werte für die unabhängigen Proben 790 und 933 gezeigt sind.
Beispiel 3: Aufstellung eines Klassifikators zur Identifizierung von SIRS- und Sepsis-Patienten mittels konventioneller PCR
Messung der Genexpression
Es wurden Patienten mit Pneumonie bzw. Peritonitis als typische Sepsis-Vertreter und im Fall der SIRS Patienten mit einer schweren Herz-OP ausgewählt (Cardiopulmonaler Bypass, CPB), da diese den Großteil der SIRS-Patienten auf einer ITS stellen (siehe Tab. 14).

Aus dem Blut der Patienten wurde Total-RNA isoliert und in cDNA umgeschrieben. Diese wurde im Assay als Template eingesetzt. Tabelle 14: Liste der untersuchten Patienten

Die Marker zur Klassifizierung wurden aus dem Biomarkerpool (siehe Beispiel 1) ausgewählt und zeigen starke differenzielle Genexpression in Patientengruppen mit und ohne diagnostizierte Sepsis.

Tab. 15 enthält eine Auflistung der Genprodukte der Genexpressionsmarker, die für die Klassifizierung verwendet wurden, sowie ihre Beschreibung. Tab. 16 ist eine Liste der in der PCR verwendeten Primer und die dazugehörigen Seq-IDs. Für jede Zielsequenz sind mehrere Primerkombinationen möglich, die Tabelle stellt nur eine von vielen Möglichkeiten dar. Tabelle 15: Genprodukte der Genexpressionsbiomarker, die für die Klassifizierung verwendet wurden, sowie ihre Beschreibung

Marker	Beschreibung (NCBI-Datenbank, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)
BZRP	Benzodiazepine receptor
CD82	CD82 molecule
FGL2	Fibrinogen-related protein
HLA-DPA1	Major histocompatibility complex, class II, DP alpha 1
CPVL	Carboxypeptidase vitellogenetic-like gene
MME	Metallomembrane endopeptidase
IL7R	Interleukin 7 receptor
CCR2	Chemokine (C-C motif) receptor 2
EPC1	Enhancer of polycomb homolog 1
KIAA0146
C4orf18	Chromosome 4 open reading frame 18
MON2	= KIAA1040, MON2 homolog
NSMAF	Neutral sphingomyelinase (N-SMase) activation associated factor
TLR5	Toll-like receptor 5
CLU	Clusterin
UBC (Referenzgen)	Ubiquitin
ITGAL (Referenzgen)	Integrin, alpha L
SNAPC (Referenzgen)	Small nuclear RNA activating complex

Tabelle 16: Liste der verwendeten Primer. Für jede Zielsequenz sind mehrere Primerkombinationen möglich, die Tabelle stellt nur eine von vielen Möglichkeiten dar.

Marker und Referenzgene	Primer für quantitative PCR
BZRP (SeqID 601,602)	forward	687
BZRP (SeqID 601,602)	reverse	688
CD82 (SeqID 470,471)	forward	689
CD82 (SeqID 470,471)	reverse	690
FGL2 (SeqID 615)	forward	693
FGL2 (SeqID 615)	reverse	694
HLA-DPA1 (SeqID 613)	forward	695
HLA-DPA1 (SeqID 613)	reverse	696
CPVL (SeqID 619,620)	forward	697
CPVL (SeqID 619,620)	reverse	698
MME (SEQID443,444,445,446)	forward	699
MME (SEQID443,444,445,446)	reverse	700
IL7R (SeqID 541)	forward	701
IL7R (SeqID 541)	reverse	702
CCR2 (SeqID 529,530)	forward	703
CCR2 (SeqID 529,530)	reverse	704
EPC1 (SeqID 280)	forward	705
EPC1 (SeqID 280)	reverse	706
KIAA0146 (SeqID 261)	forward	707
KIAA0146 (SeqID 261)	reverse	708
C4orf18 (SeqID 611,612)	forward	709
C4orf18 (SeqID 611,612)	reverse	710
MON2 (SeqID 248)	forward	711
MON2 (SeqID 248)	reverse	712
NSMAF (SeqID 527)	forward	713
NSMAF (SeqID 527)	reverse	714
TLR5 (SeqID 431)	forward	715
TLR5 (SeqID 431)	reverse	716
CLU (SeqID 575,576)	forward	717
CLU (SeqID 575,576)	reverse	718
UBC (SeqID 678)	forward	723
UBC (SeqID 678)	reverse	724
ITGAL (SeqID 676,677)	forward	725
ITGAL (SeqID 676,677)	reverse	726
SNAPC (SeqID 679)	forward	727
SNAPC (SeqID 679)	reverse	728

Experimentelle Ausführung
Blutabnahme und RNA-Isolation:
Das Vollblut der Patienten wurde auf der Intensivstation von den Patienten mittels des PAXGene Kits gemäß den Vorgaben des Herstellers (Qiagen) abgenommen und die RNA isoliert.
Reverse Transkription:
Von jeder Patienten-Probe wurden 4 μg der Total-RNA zu komplementärer DNA (cDNA) mit der reversen Transkriptase Superscript II (Invitrogen) in einem 20 μl-Ansatz (enthält 1 μl 10 mM dNTP-Mix von Fermentas und 1 μl 0,5 μg/μl Oligo(dT)-Primer) umgeschrieben. Die RNA wurde anschließend durch alkalische Hydrolyse aus dem Ansatz entfernt. Die Reaktionsansätze wurden nicht aufgereinigt, sondern mit Wasser auf 50 μl aufgefüllt.
PCR:

Die Patienten-cDNA wurde 1:500 (bzw. bei 4 Markern 1:50, SNAPC, EPC1, KIAA0146 und MON2) mit Wasser verdünnt und davon jeweils 1 μl in die PCR eingesetzt. Es wurde pro Marker eine PCR-Platte (96 wells, Nerbe Plus) mit allen 31 Patienten und No-Template-Controls (NTC) in 3-fach-Bestimmung pipettiert.

PCR-Ansatz pro well (13 μl)	1 μl Templat cDNA 1:500 oder 1:50
	0,5 μl forward primer, 10 mM
	0,5 μl reverse primer, 10 mM
	1,3 μl 10 × Puffer I
	0,05 μl Accuprime Taq-Polymerase
	9,7 μl Wasser

Es wurde ein Mastermix ohne Templat hergestellt, dieser wurde in 12 μl-Aliquots in die PCR-Platte gesteppt und dazu wurden jeweils die Patienten-cDNA pipettiert (siehe Zusammensetzung des PCR-Reaktionsansatzes).
Das sich daran anschließende PCR-Programm war folgendermaßen aufgebaut:
Verwendet wurde ein Mastercycler Gradient der Firma Eppendorf.
Detektion der PCR-Produkte:
Es wurde eine 1,1-fache SYBR Green-Lösung hergestellt. Dazu wurden zu 8,9 ml Wasser 100 μl einer 100 × SYBR Green-Stammlösung (hergestellt aus einer 10.000 × SYBR Green-Stammlösung der Firma BMA, BioWhittaker Molecular Applications) pipettiert und gemischt. Im Anschluß an die PCR wurden von dieser Lösung je 90 μl in jeden PCR-Ansatz gegeben und dieses Gemisch dann in eine schwarze Platte (96 wells, Greiner) überführt. Im Anschluß daran wurde diese Platte in einem Fluoreszenz-Meßgerät (TECAN GENios) bei 485 nm Anregungswellenlänge/535 nm Emmissionswellenlänge gemessen.
Datenanalyse:
Die Datenanalyse wurde unter der freien Software R Project Version 2.6.1 durchgeführt, die unter www.r-project.org zur Verfügung steht.
Daten-Vorverarbeitung:
Die gemessenen Expressionssignale (siehe Tab. 16) wurden im Excel-Format abgespeichert, über die 3-fach-Bestimmungen gemittelt und für jeden Marker wurden die NTC-Werte abgezogen. Patient 6065 mit 15 fehlenden Werten wurde aus der Analyse ausgeschlossen. Einzelne fehlende Werte wurden mit dem knn-Algorithmus ersetzt (dafür wurde die Funktion pamr.knnimpute aus der R-Bibliothek pamr verwendet). Die gemittelten Signale wurden log-2 transformiert. Zum Normalisieren wurde für jeden Patienten von den zugehörigen Marker-Genen der Mittelwert der 3 Housekeepergene subtrahiert.
Klassifikation:
Um die Genmarker nach ihrer Trennungsgüte anzuordnen, wurde der Wilcoxon Ranksummen-Test durchgeführt, in dem die Patientengruppen mit und ohne eine infektiöse Komplikation verglichen wurden. Danach wurden Gene mit p < 0.001 nach dem Hodge-Lehmann-Schätzer angeordnet, die restlichen nach dem p-Wert selbst.
Für die Klassifikation wurde die lineare Diskriminanzanalyse [Hastie et al., 2001] verwendet (für die Berechnung wurde die Funktion Ida im R-Packet MASS genutzt). Die geschätzten Gewichte (w₀, w₁, ..., w_p) der linearen Diskriminanzfunktion f_LD mit p Markern wurden in Tab. 17 zusammengefasst. Für eine Messung mit den Werten (x₁, ..., x_p) wurde der zugehörige Score nach der Formel
berechnet. Ein positiver Wert der Funktion führte zu einer Zuordnung zur Gruppe mit einer infektiösen Komplikation und ein negativer Wert der Funktion zu einer Zuordnung zur Gruppe ohne eine infektiöse Komplikation.
Im ersten Schritt wurde die Trennbarkeit des Trainingsdatensatzes mittels einfacher Kreuzvalidierung geprüft. Anschließend wurden zwei unabhängige Proben klassifiziert, von jeweils einer der beiden untersuchten Patienten-Gruppen (Patient 933 und 790). Dafür wurden die Roh-Messsignale in gleicher Weise vorverarbeitet wie die Trainingsdaten.
Ergebnisse
Die Anordnung der Gene und die zugehörigen Werte sind in 11 zusammengefasst. Es werden die Expressionsunterschiede zwischen den Gruppen: Boxplots der 15 Marker erstellt aus 31 Patienten-Proben (19 mit Sepsis-Diagnose, 12 mit SIRS) dargestellt. Mittels der Boxplots wurde Gen für Gen die Verteilung der Ct-Werte pro Gruppe dargestellt. Diese Ct-Werte wurden von jeder Patientenprobe mittels Real-Time PCR an der cDNA der Patienten (Biorad IQ5) generiert und über die Ct-Werte von drei Referenzgenen normalisiert. An der x-Achse sind der p-Wert und der Hodge-Lehmann-Schätzer des Wilcoxon Rank-Summen-Tests angegeben. Bei der Klassifikation wurden bei der einfachen Kreuzvalidierung 1 eine Sensitivität von 100% und eine Spezifität von 83% erreicht, was einer Falschklassifikation von 2 nicht infektiösen Proben entspricht.
Die zwei unabhängigen Proben wurden beide korrekt klassifiziert. 12 zeigt eine schematische Darstellung des abgeleiteten Score-Wertes und die Einteilung in 4 Bereiche. Liegt der berechnete Score über 6,5, so hat der Patient mit einer 95%igen Wahrscheinlichkeit eine Sepsis. Liegt der Score unter –6,5, so ist die Wahrscheinlichkeit, keine Sepsis zu haben, für den Patienten ebenfalls 95%. Auf diese Skala wurde das Klassifikationsergebnis projiziert. Der Score der Probe 933 nahm den Wert von –38,7 an und wurde als nicht infektiös klassifiziert; der Score der Probe 790 nahm den Wert von 9,1 an und wurde als infektiös klassifiziert.

Tab. 18a enthält die Rohdaten aus den Fluoreszenzmessungen mit SYBR Green am TECAN GENios. Tab. 18b zeigt die Rohdaten der unabhängigen Patienen-Proben sowie die Legende für die Gennamen und deren Zuordnung zu den SeqIDs. Tabelle 17: Koeffizienten der linearen Diskriminanzfunktion

Bezeichnung	SeqID	Wert
w0	-	5,16
w1	601,602	–34,31
w2	443,445,446,446	0,72
w3	615	–1,93
w4	613	–1,30
w5	619,620	–11,25
w6	541	1,03
w7	529,530	28,05
w8	261	3,31
w9	280	3,42
w10	611,612	–1,91
w11	248	1,61
w12	470,471	–9,74
w13	527	4,03
w14	431	–13,20
w15	575,576	27,28

Beispiel 4: Erregertyp – Gram⁺ vs. Gram^– – Differenzielle Genexpression in septischen Patienten mit gram-negativen und gram-positiven Sepsiserregern sowie Identifizierung und partielle Validierung der Biomarkerkandidaten für eine diagnostische Anwendung.
In genomweiten Genexpressionsanalysen auf Mikroarrayplattformen wurden Biomarker identifiziert, welche in septischen Patienten mit Infektionen gram-negativer und gram-positiver Bakterien unterschiedlich stark exprimiert werden. Ausgehend von dieser Biomarkerliste mit 114 Markern wurde für drei Marker gezeigt, dass sich diese Genexpressionsunterschiede mittels quantitativer PCR darstellen lassen. Für diese 3 Marker wurden genspezifische Primer identifiziert und ihre Genaktivität mittels quantitativer PCR bestimmt.
Messung der Genexpression
Auswahl des Patientenkollektivs:

Aus der umfangreichen Patientendatenbank wurden Patientengruppen mit nachgewiesener (Identifizierung durch Blutkultur) gram-negativer und gram-positiver Infektion ausgewählt. Die für die Untersuchungen ausgewählten Patienten litten alle unter einer schweren Sepsis bzw. Septischem Schock. Die Sepsis ging in den meisten Fällen von einer Pneumonie (Lungenentzündung) oder einer Tracheobronchitis (Entzündung der Bronchien) aus (siehe Tab. 19). Tabelle 19: Liste der untersuchten Patienten. Nicht unterlegt: Patienten mit gram-negativer Infektion; hellgrau unterlegt: Patienten mit gram-positiver Infektion.

	Einordnung	Infektionsherd (Fokus bei Sepsis)
6104.001	Schwere Sepsis	Pneumonie (wahrscheinlich)
7120.005	Septischer Schock	Pneumonie (definitiv); Intraabdominelle Infektion (wahrscheinlich)
6058.001	Schwere Sepsis	Pneumonie (definitiv)
6047.003	Schwere Sepsis	Pneumonie (wahrscheinlich); Tracheobronchitis (wahrscheinlich)
6103.001	Septischer Schock	Pneumonie (wahrscheinlich)
7023.001	Schock Septischer	Pneumonie (wahrscheinlich)
7040.001	Septischer Schock	tiefe chir. Wundinfektion (definitiv); Pneumonie (wahrscheinlich)
1015.002	Septischer Schock	Pneumonie (definitiv)
6070.002	Schwere Sepsis	Pneumonie (wahrscheinlich); Tracheobronchitis (wahrscheinlich)

Diese Patienten wurden in einer pangenomischen Genexpressionsstudie auf der Illumina-Plattform (www.Illumina.com) analysiert.
Durchführung Genexpressionsanalyse auf Illumina-Plattform:
Für die Illumina-Probenvorbereitung wird der „Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit” von Ambion (Ambion, USA) nach den darin enthaltenen Vorschriften verwendet. Die Vorbereitung der Hybridisierung erfolgt mit dem „Illumina Gene Expression System”.
Die einzelnen Schritte sind nachfolgend prinzipiell beschrieben:

• Reverse Transkription (Erststrang cDNA-Synthese)

Es werden 50–500 ng RNA in ein Microzentrifugenröhrchen geben und auf 11 μl mit Nuklease-freiem Wasser aufgefüllt.
Folgender Reaktionsmix wird zusammenpipettiert:

1 μl T7 Oligo (dT) Primer

2 μl 10 × First Strand Buffer

4 μl dNTP Mix

1 μl RNase Inhibitor

1 μl Array Script
Von dem Mix werden 9 μl zur RNA-Probe gegeben und anschließend 2 Stunden bei 42°C inkubiert. An den Poly-A-Überhang am 3' Ende der mRNA lagert sich das T7 Oligo(dT)-Nukleotid komplementär an, sodass die mRNA unabhängig von ihrer Sequenz mit Hilfe von ArrayScript in cDNA umgeschrieben wird. Nach den 2 Stunden Inkubation wird das Reaktionsgefäß wieder auf Eis gelegt.

• Illumina: Zweitstrang cDNA-Synthese

Folgender Reaktionsmix wird auf Eis vorbereitet:

63 μl Nuclease free H₂O

10 μl 10 × Second Strand Buffer

4 μl dNTP Mix

2 μl DNA Polymerase

1 μl RNase H
Zu der Probe werden 80 μl vom Zweitstrang cDNA-Reaktionsmix gegeben und anschließend wird 2 Stunden bei 16°C im Thermocycler inkubiert. Während der Zweitstrangsynthese durch DNA-Polymerase wird gleichzeitig die RNA durch RNase H abgebaut.

• In Vitro Transkription (IVT, zur cRNA-Synthese)

Bei Raumtemperatur wird folgender Mix vorbereitet:

2,5 μl T7 10 × Reaction Buffer

2,5 μl T7 Enzyme Mix

2,5 μl Biotin NTP Mix
Der angesetzte Mix wird zur Probe gegeben und 14 h Stunden inkubiert. Der T7 Enzyme Mix enthält T7 RNA Polymerase, eine hoch Promotor-spezifische RNA-Polymerase, die ein DNA-Template benötigt. Das T7 Oligo(dT)-Nukleotid, welches für die Reverse Transkription verwendet wird, verfügt über eine T7-Promotor Sequenz, welche nun von der T7 RNA Polymerase erkannt wird. Es werden cRNA- Stränge (=Antisense RNA) synthetisiert, welche biotinyliertes UTP enthalten. Die In Vitro Transkription ist somit ein Amplifikations- und Markierungsschritt in einem. Anschließend an die Inkubation wird 75 μl Nuklease-freies Wasser hinzugegeben.
Aufreinigung:
Nach der Zweitstrang-cDNA-Synthese folgt ein Aufreinigungsschritt, durch welchen RNA, Primer, Enzyme und Salz entfernt werden. Ein weiterer Aufreinigungsschritt nach der In Vitro Transkription entfernt Enzyme, Salz, sowie nicht eingelagerte Nukleotide.
Die Aufreinigung erfolgt über cDNA bzw. cRNA Filter Kartuschen, an welchen die Nukleinsäuren mittels cDNA- bzw. cRNA-Bindepuffer gebunden werden. Nach der Zugabe des Waschpuffers werden die Filterkartuschen trocken zentrifugiert und die Nukleinsäure wird mit RNase freiem Wasser in ein neues Reaktionsgefäß eluiert.
Hybridisierung:
Die Hybridisierung der cRNA an genspezifische Oligonukleotidsonden erfolgt auf sog. Beadarrays, welche auf Trägern, den Beadchips, angeordnet sind. Die benötigten Puffer, Lösungen und Hybridisierungskammern werden vom Hersteller in Form des Bead-Chip-Kits zur Verfügung gestellt (HumanWG-6 BeadChip-Kit, Illumina, www.illumina.com).
1,5 μg der jeweiligen cRNA-Probe wird auf 10 μl mit RNase freiem Wasser aufgefüllt. Zu der Probe werden 20 μl GEX-HYB-Lösung hinzugefügt. In die Befeuchtungspufferreservoirs der Hybridisierungskammer werden 200 μl GEX-HCB eingefüllt und die Bead Chips (Human WG-6 BeadChip, Illumina, www.illumina.com) werden in die Hybridisierungskammer eingesetzt. 30 μl Probe wird auf die Probenöffnung des Arrays aufgetragen. Die Hybridisierungskammer wird sorgfältig verschlossen und die Proben werden 16–20 Stunden bei 58°C inkubiert.
Die Bead Chips werden in E1BC Waschlösung eingetaucht und im High-Temp Puffer bei 55°C gewaschen. Anschließend erfolgen ein Waschschritt bei Raumtemperatur mit E1BC-Lösung, ein Ethanolwaschschritt und ein weiterer Waschschritt mit E1BC. Es folgt ein Blockierschritt mit Block E1 Puffer und ein Markierungsschritt mit Block E1 + Streptavidin-Cy3, bei dem an die biotinylierten Nukleotide der cRNA das fluoreszenzmarkierte Streptavidin bindet. Es wird nochmals mit E1BC Puffer gewaschen und anschließend wird der Bead Chip durch Zentrifugation getrocknet (2 min bei 500 rpm). Anschließend kann der Bead Chip mit dem Bead Array Reader (Illumina Beadstation 500, www.illumina.com) eingescannt werden.
Auswertung der Microarray-Daten:
Mit dem Beadarray Reader wird der Bead Chip fluorometrisch ausgelesen. Der Scanner hat eine Auflösung von 0,8 μm und somit wird von jedem der 48687 auf einem Array platzierten Beadtypen die Fluoreszenz an mindestens 9 Pixeln gemessen. Jeder Beadtyp liegt in mindestens 5facher Redundanz vor. Mit dem von Illumina zur Verfügung gestellte Programm Bead Studio 2.0 werden die Fluoreszenzwerte eines Beadtypen gemittelt und als „Average Signal” ausgegeben. Neben den Beads, die als Sonde für humane Gentranskripte dienen, gibt es auch Beadtypen, die als Negativ-Kontrollen wirken. Deren Sequenzen hybridisieren nicht mit Transkripten aus dem Human-Genom.
Mit Hilfe dieser Kontrollbeads wird das Hintergrundsignal ermittelt, welches von jedem gemittelten Signal abgezogen wird. Außerdem wird mit den Negativ-Kontrollen der Detektions-p-Wert jedes einzelnen Beadtypen ermittelt, der eine Auskunft darüber gibt, ob es sich um ein echtes Signal handelt oder ob die gemessene Intesität dem Hintergrund entspricht. Für die weiterführende Analyse werden nur die Beadtypen verwendet, bei denen mindestens einer der zehn Arrays einen Detektions-p-Wert unter 0,01 erreicht hat.
Für die Korrektur der systematischen Messfehler wurde die vom Datenverarbeitungsprogramm Bead Studio 2.0 (Bestandteil der Illumina Beadstation 500) vorgeschlagene Normalisierung mittels Cubic Splines gewählt. Entsprechend der Empfehlungen [MAQC-Consortium, 2006] wurden zusätzlich folgende Korrekturschritte zugefügt. Die Daten wurden mit der Statistiksoftware weiter bearbeitet (http://www.r.project.org). Aus allen für die weitere Analyse ausgewählten Beadtypen wird der kleinste gemittelte Signal-Wert ermittelt. Dieses Minimum wird von jedem gemittelten Signal subtrahiert, so dass nun das kleinste gemittelte Signal den Wert 0 annimmt. Zu jedem gemittelten Signal wird außerdem die Konstante 16 addiert, bevor zur Basis 2 logarithmiert wird. Nach dem Logarithmieren erhält das kleinste gemittelte Signal den Wert 4. Gleichzeitig wird verhindert, dass das gemittelte Signal einen negativen Wert annehmen kann.
Vergleicht man die Expressionsdaten von gram-positiven mit gram-negativen Proben, so wird das Verhältnis zwischen den Expressionswerten als „Fold Change” angegeben. Dieser Wert gibt an, um welchen Faktor das Transkript in der einen Probe anders exprimiert wurde als in der anderen Probe. Um den Logarithmischen Fold Change zu erhalten, wird die Differenz aus den Mittelwerten der normalisierten Daten beider Gruppen gebildet. Hier wird der Fold Change von gram-positiv bezüglich gram-negativ angegeben: log2 FoldChange = Mittelwert(normdata(gram+)) – Mittelwert(normdata(gram–)) log2 FoldChange = log2(gram+/gram–)
Die Zahl 2 wird mit dem Logarithmischen Fold Change potenziert, um einen Theoretischen Fold Change zu erhalten. Nimmt der Theoretische Fold Change einen Wert kleiner als eins an, so ergibt sich der Fold Change aus dem negativen Reziproken des Theoretischen Fold Changes. Im entgegengesetzten Fall entspricht der Fold Change dem Theoretischen Fold Change: Theoretischer Fold Change = 2log2 Fold Change = 2log2(gram+/gram–) = gram+/gram–

Fold Change: wenn Theoretischer Fold Change < 1

Ein positiver Fold Change bedeutet, dass das entsprechende Gen im Fall einer gram-positiven Infektion stärker exprimiert wird als bei einer gram-negativen Infektion.

Für jeden Beadtyp wird außerdem der p-Wert für den t-Test und den Wilcoxon-Test berechnet. Unter der Annahme, dass die Nullhypothese des Tests richtig ist, gibt der p-Wert die Wahrscheinlichkeit an, dass der gemessene Wert durch Zufall zustande kommt. Ist diese Wahrscheinlichkeit geringer als eine vorgegebene Schranke, so wird angenommen, dass die Differenz nicht zufällig ist. In Tab. 20 sind die identifizierten Biomarker dargestellt: Tabelle 20: Differentielle Genexpression von Transkripten in gram-positiver und gram-negativer Sepsis, gemessen auf der Illumina-Genexpressionsplattform

Symbol	Illumina TargetID	Fold Change Gram+ vs. Gram–	p-Wert t-Test	p-Wert Wilcoxon-Test	SeqID	Biologische Plausibilität
FLJ42957	ILMN_10187	–2,066	0,06351	0,09524	67
C22orf5	ILMN_10219	–1,572	0,00853	0,00794	68
GZMH	ILMN_10239	2,385	0,18916	0,22222	69	ist an der Zelllyse in Zell-vermittelter Immunantwort beteiligt; besitzt Peptidase- und Proteolyse-Aktivität; ist an Apoptose beteiligt
	ILMN_105873	–1,441	0,00716	0,01587	70
GPR137B	ILMN_10711	1,842	0,00413	0,00794	71
	ILMN_107750	–2,114	0,00797	0,03175	72	Intron einer vermeintlichen Transkript-Variante von RNASET2
	ILMN_109087	–2,060	0,09233	0,42063	73
LOC728653	ILMN_109663	–1,549	0,00851	0,00794	74,75
	ILMN_110605	1,441	0,12945	0,00794	76
BC002942	ILMN_11132	–1,547	0,00218	0,00794	77
ITIH4	ILMN_11142	–2,215	0,20823	0,15079	78	ist möglicherweise in Akute-Phase-Reaktionen involviert
MAOA	ILMN_11566	–3,140	0,11311	0,30952	79	wichtige Funktion im Amin-Metabolismus des Zentralen Nervensystems; baut Neurotransmitter wie Dopamin ab
SDHB	ILMN_12116	1,188	0,03632	0,00794	80	besitzt Elektronen-Transport-Aktivität;
	ILMN_122129	–1,365	0,00993	0,01587	81
	ILMN_123073	–1,324	0,01229	0,00794	82
LOC113386	ILMN_12569	1,562	0,00377	0,00794	83
LOC285908	ILMN_12575	–1,402	0,00485	0,01587	84
F12	ILMN_12933	–2,010	0,52542	0,30952	85	aktiviert die Koagulationsfaktoren VII und XI; initiiert die Blutkoagulation und die Fibrinolyse
RPS6KA5	ILMN_13156	–2,211	0,10517	0,09524	86	spielt eine essentielle Rolle bei der Transkriptionsaktivierung als Antwort auf TNF; reagiert auf oxidativen Stress
GDI1	ILMN_13492	–1,530	0,04136	0,00794	87	verlangsamt das wegdissoziieren des GDP von RAB-Proteinen
CMIP	ILMN_13851	–1,282	0,01492	0,00794	88
VPS13D	ILMN_14155	–1,250	0,01823	0,00794	89
LGALS3	ILMN_14333	2,182	0,33372	0,42063	90	bindet IgE; ist an Makrophagen-Aktivierung beteiligt
C1orf74	ILMN_1469	1,307	0,00323	0,00794	91
EIF1AY	ILMN_14704	4,963	0,14239	0,42063	92	initiiert die Translation
PCOLCE2	ILMN_14782	2,020	0,07343	0,09524	93
PRAM-1	ILMN_14804	–1,596	0,00938	0,03175	94	dieses Protein ähnelt FYB/SLAP-130, welches an T-Zell-Rezeptor-vermittelten Signalwegen beteiligt ist
PLAC8	ILMN_17809	2,203	0,04188	0,09524	95
PAQR6	ILMN_18415	–1,532	0,01116	0,00794	96	Rezeptor-Aktivität
NDE1	ILMN_18439	–1,416	0,02123	0,00794	97
TOP3A	ILMN_1902	–1,337	0,01157	0,00794	98	katalysiert das vorrübergehende Brechen und das Wiederzusammenlagern einzelsträngiger DNA während der Transkription
ARG1	ILMN_19494	–2,076	0,06063	0,09524	99	hydrolysiert Arginin und ist damit in den Harnstoffwechsel involviert
LGALS2	ILMN_19736	2,221	0,14025	0,09524	100	bindet Galaktoside
HBZ	ILMN_19775	–2,418	0,35974	0,42063	101	Sauerstoff-Transport-Aktivität
CYP27A1	ILMN_2033	–2,616	0,04173	0,09524	102	oxidiert Cholesterol-Zwischenprodukte
EIF2AK2	ILMN_20636	–1,643	0,02192	0,00794	103	bindet doppelsträngige RNA; ist an Protein-Synthese-Inhibition beteiligt
CDKN1C	ILMN_20689	2,047	0,00736	0,00794	104	Negative Regulation der Zellproliferation; Zyklin-abhängige Protein-Kinase-Aktivität
MNT	ILMN_21283	–1,278	0,03776	0,00794	105	wirkt als Transkriptionsrepressor; bindet an DNA-Bindeproteine
MDFIC	ILMN_21649	1,158	0,04237	0,00794	106	ist an der Transkriptionsregulation viraler Genome beteiligt
ZNFN1A1	ILMN_22185	2,287	0,12649	0,15079	107	interagiert mit Promotoren der B- und T-Zellentwicklung; besitzt DNA-bindende Fähigkeiten und ist an der Regulation der Transkription beteiligt
KIAA0690	ILMN_22207	–1,631	0,00181	0,01587	108
RPLP0	ILMN_22954	2,264	0,29058	0,30952	109	Komponente der 60S-Untereinheit von Ribosomen
KIAA0367	ILMN_23214	–2,755	0,04168	0,03175	110
FOXC1	ILMN_23624	–2,003	0,19170	0,30952	111	Transkriptionsfaktor; reguliert embrionale Entwicklung
SYT11	ILMN_23967	–1,218	0,00016	0,00794	112	bindet Calcium-Ionen; besitzt Transporter-Aktivität
DPEP2	ILMN_24146	–1,838	0,01433	0,00794	113	besitzt Proteolyse- und Peptidolyseaktivität; hydrolysiert u. a. den β-Laktamring einiger Antibiotika
TPST1	ILMN_2477	–2,715	0,17087	0,22222	114	besitzt Transferase-Aktivität
JUP	ILMN_2607	–2,825	0,08747	0,03175	115	Element des Zytoskelettes; ist an Zelladhäsion beteiligt
ENTPD7	ILMN_26198	2,091	0,03844	0,00794	116	Hydrolase-Aktivität; Regulation der Erregungsübertragung
VIPR1	ILMN_27565	–2,262	0,02954	0,03175	117	Rezeptor für kleine Neuropeptide
UBE4B	ILMN_28085	–1,423	0,00118	0,00794	118	katalysiert den Zusammenbau von Ubiqutinketten und ermöglicht somit den Abbau von Proteinen
TTLL4	ILMN_28183	–1,443	0,00312	0,01587	119	besitzt Ligase-Aktivität
C5orf30	ILMN_28409	–2,177	0,10035	0,09524	120
GBP1	ILMN_28413	2,512	0,03832	0,09524	121	bindet Guanin-Nukleotide; Expression von GBP1 wird durch Interferon induziert
FLJ12700	ILMN_28810	–1,373	0,01685	0,00794	122
KIAA1539	ILMN_29031	–1,233	0,01807	0,00794	123
DVL2	ILMN_29320	–1,272	0,01430	0,00794	124	spielt möglicherweise eine Rolle in Signalwegen verschiedener Wnt-Gene
SMCY	ILMN_29791	2,608	0,09136	0,30952	125	besitzt Zink-Finger-Domäne; bindet an DNA
XAB2	ILMN_30213	–1,392	0,01287	0,00794	126	ist an Transkriptionsvorgängen beteiligt
TMEM119	ILMN_30233	–2,336	0,07191	0,09524	127
LOC644863	ILMN_33000	1,517	0,03096	0,00794	128
DAAM2	ILMN_3540	–2,565	0,13476	0,22222	129	ist rho-abhängig; rekrutiert Profilin zur Membran und fördert Aktin-Polymerisierung; es wird für Transkriptionsaktivierung von Serum-Response-Faktoren benötigt
LOC644037	ILMN_37144	2,015	0,16628	0,22222	130
LOC400713	ILMN_37636	–1,410	0,00277	0,01587	131
LOC644033	ILMN_39734	–2,027	0,05730	0,15079	132
HEBP1	ILMN_4128	2,047	0,03781	0,05556	133	vermittelt Calcium-Mobilisierung und Chemotaxis von Monozyten und Dentritischen Zellen
ZNF187	ILMN_4390	–2,114	0,47706	0,30952	134	besitzt Transkriptionafaktor-Aktivität
SAMD4B	ILMN_5298	–1,420	0,01003	0,00794	135
ADORA3	ILMN_5334	–2,056	0,29105	0,22222	136	interagiert mit G-Protein; schützt vor Herzschäden; ist möglicherweise in Zellproliferation und Zelltod verwickelt
U2AF1L4	ILMN_5343	2,092	0,03842	0,00794	137	RNA-Bindung, spielt eine kritische Rolle in Splice-Vorgängen
TNNT1	ILMN_537	2,161	0,17568	0,22222	138	ist an der Muskelentwicklung beteiligt
TLR9	ILMN_5498	–1,478	0,00666	0,03175	404	aktiviert das angeborene Immunsystem nach Erkennung von unmethylierten CpG-Motiven
GPC2	ILMN_6771	–1,470	0,00923	0,00794	139	Zelloberflächen Proteoglycan
NLF2	ILMN_6857	–1,346	0,15084	0,00794	140
THEDC1	ILMN_7113	–2,264	0,32089	0,30952	141	ist an der Fettsäuresynthese beteiligt
INHBB	ILMN_7166	–2,198	0,07401	0,09524	142	besitzt Tumor-Suppressor-Aktivität; besitzt Cytokin-Aktivität
SNFT	ILMN_7180	1,564	0,00625	0,01587	143	reagiert auf Erreger; Regulation der Transkription
	ILMN_73408	–2,617	0,08397	0,05556	144
METTL7B	ILMN_7370	3,082	0,00148	0,00794	145	Methaltransferase-Aktivität
PPP1R10	ILMN_8464	–1,310	0,03765	0,00794	146	dieses Gen liegt in der Region des Haupthistokompatibilitätskomplex I; besitzt Transkriptionsregulator-Aktivität
RPS4Y1	ILMN_8579	11,651	0,06490	0,09524	147	bindet RNA; Komponente der 40S-Untereinheit von Ribosomen und ist damit an der Protein-Synthese beteiligt
PAIP1	ILMN_879	1,147	0,02433	0,00794	148	ist an Translationsinitiation und Proteinsynthese beteiligt
CTSL	ILMN_8814	2,052	0,00248	0,01587	159	Cystein-Typ Endopeptidase-Aktivität; spielt eine wichtige Rolle im Protein-Katabolismus
	ILMN_89024	–1,472	0,03363	0,00794	150
KIAA1324	ILMN_9289	–2,497	0,09589	0,15079	151
TAOK2	ILMN_9392	–1,359	0,00962	0,01587	152	reguliert die JNK-Kaskade positiv; regiert auf Stress

Die Genaktivität von drei Markern aus dieser Liste wurden mittels quantitativer PCR an der cDNA derselben Patienten gemessen, um die Daten mit einer anderen Methode zu reproduzieren.

Die drei Marker sowie ein repräsentatives Primerpaar für die Quantifizierung mittel Real-Time-PCR sind in Tab. 21 dargestellt. Weiterhin werden zur relativen Quantifizierung sog. Referenzgene verwendet, welche im jeweiligen Gewebe konstant exprimiert sind. Die in diesem Experiment genutzten Referenzgene sind ebenfalls dargestellt. Tabelle 21: Markergene und Referenzgene für die PCR-Validierung

Marker	Primer für qualitative PCR (SeqID)
CDKN1C	reverse: 734
CTSL SeqID 149	forward: 735
CTSL SeqID 149	reverse: 736
SeqID 145 METTL7B	forward: 737
SeqID 145 METTL7B

Referenzgene	Primer für quantitative PCR (SeqID)
SNAPC SeqID 679	forward: 727
SNAPC SeqID 679	reverse: 728
CASP8 SeqID 681–686	forward: 731
CASP8 SeqID 681–686	reverse: 732
ITGAL SeqID 676,677	forward: 725
ITGAL SeqID 676,677	reverse: 726

Experimentelle Ausführung
Blutabnahme und RNA-Isolation:
Das Vollblut der Patienten wurde auf der Intensivstation von den Patienten mittels des PAXGene Kits gemäß den Vorgaben des Herstellers (Qiagen) abgenommen. Nach Abnahme des Vollblutes wurde die Gesamt-RNA der Proben unter Anwendung des PAXGene Blood RNA Kits gemäß den Vorgaben des Herstellers (Qiagen) isoliert.
Reverse Transkription:
Von jeder Patienten-Probe wurden 300 ng der Total-RNA zu komplementärer DNA (cDNA) mit der reversen Transkriptase Superscript II (Invitrogen) in einem 20 μl-Ansatz umgeschrieben und die RNA anschließend durch alkalische Hydrolyse aus dem Ansatz entfernt. Die Reaktionsansätze wurden anschließend mit Hilfe von Microcon-Säulchen aufgereinigt.
Real-Time-PCR

Verwendet wurde der Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG-Kit der Firma Invitrogen. Für einen 10 μl-Ansatz wurden folgende Bestandteile pipettiert:

5 μl	Platinum SYBR Green qPCR Supermix-UDG, 2 ×
1 μl	Primer forward (10 pmol/μl)
1 μl	Primer reverse (10 pmol/μl)
1 μl	Fluorescein (0,5 μM)
1 μl	H₂O, RNase frei
1 μl	Template cDNA (6,67 ng/μl)

Das sich daran anschließende PCR-Programm war folgendermaßen aufgebaut:
Verwendet wurde das iQ^TM5 Multicolor Real-Time-PCR Detection System der Firma BIORAD mit der dazugehörigen Auswertungssoftware.
Ergebnisse
Die Ct-Werte der Real-Time-PCR wurden nach der Methode von Vandesompele normalisiert [Vandesompele et al., 2002]. Für die Vandesompele-Normalisierung wird zuerst die Relative Größe R für jedes Target (Interessierendes Gen (Gene of Interest) und Referenzgen) berechnet: R = Emin(Ct)–Ct
Für die Effizienz E wird der idealisierte Wert 2 eingesetzt. Die Effizienz wird mit der Differenz aus dem kleinsten Ct-Wert aus allen Proben eines Gens und der jeweiligen Patientenprobe potenziert. Der Normalisierungsfaktor NF wird über das geometrische Mittel der Relativen Größen R der Referenzgene (Ref) berechnet:
Für den Normalisierungsfaktor wird die dritte Wurzel aus dem Produkt der drei Referenzgene gezogen. Um die normalisierten Daten zu erhalten, wird der Quotient aus Relativer Größe R und dem Normalisierungsfaktor gebildet:
In diesem Zusammenhang zeigt 13 die differenzielle Expression des Gens CDKN1C in septischen Patienten mit gram-positiver und gram-negativer Infektion. Im Boxplot sind die mittleren normalisierten Ct-Werte für jeweils 5 Patienten dargestellt. Ermittelt wurden diese Werte mit realtime-PCR an der cDNA der Patienten. 14 zeigt die differenzielle Expression des Gens CTSL in septischen Patienten mit gram-positiver und gram-negativer Infektion. Im Boxplot sind ebenfalls die mittleren normalisierten Ct-Werte für jeweils 5 Patienten dargestellt. Ermittelt wurden diese Werte mit realtime-PCR an der cDNA der Patienten.
In 15 wird die differenzielle Expression des Gens METTL7B in septischen Patienten mit gram-positiver und gram-negativer Infektion gezeigt. Im Boxplot sind die mittleren normalisierten Ct-Werte für jeweils 5 Patienten dargestellt. Ermittelt wurden diese Werte mit realtime-PCR an der cDNA der Patienten.
Tab. 22 zeigt Rohdaten (Ct-Werte, Mittelwerte aus Triplikaten) aus den qPCR-Assays für den Marker CDKN1C (SeqID 104).
Tab. 23 enthält nach Vandesompele [Vandesompele et al., 2002] normalisierte Rohdaten aus den qPCR-Assays für den Marker CDKNIC (SeqID 104).
In Tab. 24 sind Rohdaten (Ct-Werte, Mittelwerte aus Triplikaten) aus den qPCR-Assays für den Marker CTSL (SeqID 149) enthalten.
Tab 25 zeigt nach Vandesompele [Vandesompele et al., 2002] normalisierte Rohdaten aus den gPCR-Assays für den Marker CTSL (SeqID 149).
In Tab. 26 sind Rohdaten (Ct-Werte, Mittelwerte aus Triplikaten) aus den qPCR-Assays für den Marker METTL7B (SeqID 145) enthalten.

Tab. 27 zeigt nach Vandesompele [Vandesompele et al., 2002] normalisierte Rohdaten aus den gPCR-Assays für den Marker METTL7B (SeqID 145). Tabelle 22: Rohdaten (Ct-Werte, Mittelwerte) aus den qPCR-Assays für den Marker CDKN1C (SeqID 104). Hellgrau: Patienten mit gram-negativer Infektion, dunkelgrau: Patienten mit gram-positiver Infektion.

Patient	SeqID 104	ITGAL (Ref.-Gen, SeqID 676, 677)	CASP8 (Ref.-Gen, SeqIDs 681, 682, 683, 684, 685, 686)	SNAPC (Ref.-Gen, SeqID 679)
6047.003	31,24	25,97	27,62	31,79
7120.005	30,92	23,81	25,69	30,1
6058.001	30,31	23,54	24,2	28,64
6104.001	30,87	24,55	26,15	29,24
7023.001	28,81	25,34	26,83	30,7
1015.002	29,73	25,35	26,88	30,22
7040.001	29,47	25,33	26,88	30,38
6103.001	28,73	23,58	25,74	29,06
6070.002	30,44	25,93	28,3	31,55

Tabelle 23: Nach Vandesompele normalisierte Rohdaten aus den qPCR-Assays für den Marker CDKN1C (SeqID 104). Hellgrau: Patienten mit gram-negativer Infektion, dunkelgrau: Patienten mit gram-positiver Infektion.

Patient	Seq ID 104	ITGAL (Ref.-Gen, Seq ID 95)	CASP8 (Ref.-Gen, SeqIDs 680, 681, 682, 683, 684, 685)	SNAPC (Ref.-Gen, SeqID 678)
6047.003	1,404444876	1,484523571	0,747424624	0,901250463
7120.005	0,461158097	1,745128575	0,749153538	0,764894847
6058.001	0,334481889	1	1	1
6104.001	0,516437858	1,130269389	0,589133569	1,501772904
7023.001	4,237852377	1,286394669	0,723634619	1,074252648
1015.002	2,032609864	1,159363791	0,634342247	1,359742373
7040.001	2,514026749	1,214194884	0,655196702	1,257013375
6103.001	1,587401052	1,543993487	0,545884132	1,186462635
6070.002	2,682044796	1,674039226	0,511686946	1,167427804

Tabelle 24: Rohdaten (Ct-Werte, Mittelwerte) aus den qPCR-Assays für den Marker CTSL (SeqID 149). Hellgrau: Patienten mit gram-negativer Infektion, dunkelgrau: Patienten mit gram-positiver Infektion.

Patient	SeqID 149	ITGAL (Ref.-Gen, SeqID 676, 677)	CASP8 (Ref.-Gen, SeqIDs 681, 682, 683, 684, 685, 686)	SNAPC (Ref.-Gen, SeqID 679)
6047.003		25,97	27,62	31,79
7120.005	29,33	23,81	25,69	30,1
6058.001	27,53	23,54	24,2	28,64
6104.001	29,8	24,55	26,15	29,24
7023.001	28,62	25,34	26,83	30,7
1015.002	28,65	25,35	26,88	30,22
7040.001	28,71	25,33	26,88	30,38
6103.001	27,62	23,58	25,74	29,06
6070.002	30,04	25,93	28,3	31,55

Tabelle 25: Nach Vandesompele normalisierte Rohdaten aus den qPCR-Assays für den Marker CTSL (SeqID 149). Hellgrau: Patienten mit gram-negativer Infektion, dunkelgrau: Patienten mit gram-positiver Infektion.

Patient	SeqID 149	ITGAL (Ref.-Gen, SeqID 676, 677)	CASP8 (Ref.-Gen, SeqIDs 681, 682, 683, 684, 685, 686)	SNAPC (Ref.-Gen, SeqID 679)
6047.003	1,301341855	1,484523571	0,747424624	0,901250463
7120.005	0,604298528	1,745128575	0,749153538	0,764894847
6058.001	1	1	1	1
6104.001	0,471937156	1,130269389	0,589133569	1,501772904
7023.001	2,104289696	1,286394669	0,723634619	1,074252648
1015.002	1,870382496	1,159363791	0,634342247	1,359742373
7040.001	1,853176124	1,214194884	0,655196702	1,257013375
6103,001	1,4913994	1,543993487	0,545884132	1,186462635
6070.002	1,540430222	1,674039226	0,511686946	1,167427804

Tabelle 26: Rohdaten (Ct-Werte, Mittelwerte) aus den qPCR-Assays für den Marker METTL7B (SeqID 145). Hellgrau: Patienten mit gram-negativer Infektion, dunkelgrau: Patienten mit gram-positiver Infektion.

Patient	SeqID 145	ITGAL (Ref.-Gen, SeqID 676, 677)	CASP8 (Ref.-Gen, SeqIDs 681, 682, 683, 684, 685, 686)	SNAPC (Ref.-Gen, SeqID 679)
6047.003	29,8	25,97	27,62	31,79
7120.005	31,25	23,81	25,69	30,1
6058.001	29,96	23,54	24,2	28,64
6104.001	29,6	24,55	26,15	29,24
7023.001	28,88	25,34	26,83	30,7
1015.002	27,71	25,35	26,88	30,22
7040.001	29,35	25,33	26,88	30,38
6103.001	26,65	23,58	25,74	29,06
6070.002	27,6	25,93	28,3	31,55

Tabelle 27: Nach Vandesompele normalisierte Rohdaten aus den qPCR-Assays für den Marker METTL7B (SeqID 145). Hellgrau: Patienten mit gram-negativer Infektion, dunkelgrau: Patienten mit gram-positiver Infektion.

Patient	SeqID 145	ITGAL (Ref.-Gen, SeqID 676, 677)	CASP8 (Ref.-Gen, SeqIDs 681, 682, 683, 684, 685, 686)	SNAPC (Ref.-Gen, SeqID 679)
6047.003	0,901250463	1,484523571	0,747424624	0,901250463
7120.005	0,086769591	1,745128575	0,749153538	0,764894847
6058.001	0,10083022	1	1	1
6104.001	0,294566785	1,130269389	0,589133569	1,501772904
7023.001	0,954841604	1,286394669	0,723634619	1,074252648
1015.002	1,949809711	1,159363791	0,634342247	1,359742373
7040.001	0,646176415	1,214194884	0,655196702	1,257013375
6103.001	1,587401052	1,543993487	0,545884132	1,186462635
6070.002	4,542017716	1,674039226	0,511686946	1,167427804

Signifikanz der Ergebnisse
Mit dem Wilcoxon Test wurde anschließend überprüft, ob die Ergebnisse signifikant sind. Die aufgestellte Nullhypothese besagte, dass es keine signifikanten Unterschiede in den beiden Gruppen bezüglich der Genexpression gibt. Die Nullhypothese konnte bei allen 3 Targets widerlegt werden. Damit ist der Unterschied zwischen gram-positiven und gram-negativen Septikern bezüglich der Expression von CDKN1C (SeqID 104), CTSL (SeqID 149) und METTL7B (SeqID 145) mit einer 95%igen Wahrscheinlichkeit nicht zufällig.
Fold Change
Um die x-fache Veränderung einer größeren Anzahl von Werten miteinander zu vergleichen, wurde aus den nach Vandesompele normalisierten Werten zuerst das geometrische Mittel jeder Gruppe gebildet. Der Fold Change bzw. die x-fache Veränderung der Genexpression berechnet sich dann aus dem Quotienten der nach Vandesompele normalisierten Ct-Werte der zu vergleichenden Gruppen. Die Effizienz der PCR wurde schon bei der Normalisierung einberechnet, sodass sie an dieser Stelle entfällt.
Der Fold Change der Patienten berechnet sich somit wie folgt:
Alle drei untersuchten Targets wiesen in der PCR-Analyse einen Fold Change_{Gram+ Vs. Gram–} mit der gleichen Tendenz wie in der Microarrayauswertung auf. Dabei fällt auf, dass das Target METTL7B, welches bei Illumina den größten Fold Change erzielte nun auch in der PCR-Analyse den höchsten Wert annimmt.

Tab. 28 zeigt medizinische Parameter der in die Analyse eingegangenen Patienten wie sie von Seiten der Klinik validiert wurden. Tabelle 28: Medizinische Parameter der in die Analyse eingegangenen Patienten. Hellgrau: Patienten mit gram-negativer Infektion, dunkelgrau: Patienten mit gram-positiver Infektion.

	6103.001	7023.001	7040.001	1015.002	6070.002
Alter [Jahre]	36	75	70	71	-
Geschlecht	männlich	männlich	männlich	männlich	männlich
Gewicht [kg]	75	124	60	75	90
Größe [cm]	-	178	-	171	183
BMI	-	39,1	-	25,6	26,9
Aufnahmedatum	21.05.2004	09.11.2004	06.11.2004	02.11.2002	03.11.2003
Tag der Probennahme	23.05.2004	18.11.2004	27.11.2004	11.11.2002	13.12.2003
ITS-Tag	3	9	2	2	3
Quick (max) [%]	91	97	56	67	89
PTT (max) [s]	43	55	50	58,8	35
Fibrinogen (min)	-	5,5	6,6	6,2	-
ATIII (min) [%]	-	60	-	52	-
Thrombos [*10³] (min)	149	232	411	112	267
Leukos	8900	14200	28400	20100	10600
CRP (max) [mg/l]	343	124	304	-	404
PCT (max) [ng/ml]	0,65	0,3	13,5	5,12	2,31
Laktat (max) [mmol/l]	1,3	1,6	1,4	1,6	2,2
Bilirubin ges (max) [μmol/l]	11	9	19	11,7	21
Kreatinin (max) [μmol/l]	86	144	444	266	167
Krea-Cl. (min) [μmol/l]	-	-	-	38	47
BE (min) [mmol/l]	4	0	–4,8	–5,1	–2,3
Albumin (min) [mmol/l]	-	-	-	13,1	-
Temperatur [°C]	39,7	38,7	38,6	39,8	37,5
Herzfrequenz [min^–1]	107	110	110	119	134
Atemfrequenz spont. [min^–1]	18	22	-	17	12
Arterielles CO₂ [kP]	5,23	-	-	4,59	4,58
PaO₂	-	-	-	-	94
PaO₂/FiO₂	133	106	173	194	147
Diurese [ml/24 h]	3310	2346	0	2910	4125
MAP [mmHg]	69	56	62	56	66
Entlassungsdatum	03.06.2004	09.01.2005	30.12.2004	12.12.2002	21.01.2004
Entlassungsart	verlegt	verstorben	entlassen	entlassen	entlassen
	6104.001	7120.005	6058.001	6047.003
Alter [Jahre]	40	84	55	51
Geschlecht	weiblich	weiblich	weiblich	männlich
Gewicht [kg]	65	-	82	125
Größe [cm]	168	170	170	191
BMI	23,0	-	28,4	34,3
Aufnahmedatum	28.04.2004	20.04.2005	27.10.2003	21.09.2003
Tag der Probennahme	25.05.2004	26.04.2005	07.11.2003	27.09.2003
ITS-Tag	7	5	10	6
Quick (max) [%]	87	71	113	122
PTT (max) [s]	43	33	78,7	30,9
Fibrinogen (min)	-	3,9	-	-
ATIII (min) [%]	-	-	-	-
Thrombos [*10³] (min)	342	190	214	143
Leukos	16700	21400	18000	6800
CRP (max) [mg/l]	250	50,8	64,3	161
PCT (max) [ng/ml]	38,7	3,99	1,57	5,61
Laktat (max) [mmol/l]	1,2	3,1	2,9	0,9
Bilirubin ges (max) [μmol/l]	6	8	22	13,6

Kreatinin (max) [μmol/l]	37	132	108	94
Krea-Cl. (min) [μmol/l]	111	14	52	127
BE (min) [mmol/l]	5,5	0,7	1,2	2,8
Albumin (min) [mmol/l]	-	-	-	-
Temperatur [°C]	37,9	37,5	37,8	38,1
Herzfrequenz [min^–1]	122	141	116	115
Atemfrequenz spont. [min^–1]	32	23	23	27
Arterielles CO₂ [kP]	5,04	5,5	3,99	5,18
PaO₂	93	-	-	-
PaO₂/FiO₂	198	129	148	211
Diurese [ml/24 h]	3550	1138	2290	3420
MAP [mmHg]	66	71	65	80
Entlassungsdatum	16.06.2004	03.05.2005	09.12.2003	07.10.2003
Entlassungsart	entlassen	verstorben	entlassen	entlassen

Beispiel 5: Nicht-kodierende RNA – Differenzielle Genexpression eines Transkriptes ohne Protein-kodierende Funktion (sog. nicht-kodierende RNA) in SIRS- und Sepsis-Patienten mittels Real-Time-PCR.
Messung der Genexpression
Es wurden 5 Patienten mit Pneumonie als Sepsis-Vertreter und im Fall der SIRS 5 Patienten mit einer schweren Herz-OP ausgewählt (Cardiopulmonaler Bypass, CPB), da diese den Großteil der SIRS-Patienten auf einer ITS stellen (siehe Tab. 29). Die Patienten wurden retrospektiv von einem Ärzte-Team der Uni-Klinik Jena in ihrer Diagnose validiert.
Aus dem Blut der Patienten wurde Total-RNA isoliert und in cDNA umgeschrieben. Diese wurde im Assay als Templat eingesetzt. Tabelle 29: Liste der untersuchten Patienten

Patienten-ID Sepsis (Pneumonie) SIRS

6032 X

6048 X

6063 X

6070 X

6104 X

8002 X

8026 X

8086 X

8102 X

2038 X
Der Marker mit der SeqID 207 (Accession-No. AA868082) für nichtkodierende RNA ist Bestandteil der oben angeführten Biomarkerliste.
Tab. 30 zeigt ein Beispiel eines Primerpaares für die Amplifikation des nichtkodierenden Markers mit der SeqID 207 in der Real-Time PCR. Es wurden 10 Patienten untersucht (5 Sepsis-Patienten, 5 SIRS-Patienten). Tabelle 30: Beispielhaftes Primerpaar für die quantitative PCR

SeqID Primer

207 forward Seq-ID 739

reverse SeqID 740
Experimentelle Ausführung
Blutabnahme und RNA-Isolation
Das Vollblut der Patienten wurde auf der Intensivstation von den Patienten mittels des PAXGene Kits gemäß den Vorgaben des Herstellers (Qiagen) abgenommen und die RNA isoliert.
Reverse Transkription
Von jeder Patienten-Probe wurden 4 μg der Total-RNA zu komplementärer DNA (cDNA) mit der Reversen Transkriptase Superscript II (Invitrogen) und den genspezifischen Primern in einem 20 μl-Ansatz umgeschrieben (10 mM dNTP-Mix und 2 μM genspezifische Primer (SeqID 207) und die RNA anschließend durch alkalische Hydrolyse aus dem Ansatz entfernt. Die Reaktionsansätze wurden mit Microcon-Säulchen aufgereinigt, die eluierte cDNA in der SpeedVac eingedampft und anschließend in 50 μl Wasser aufgenommen.
Real-Time-PCR
Verwendet wurde der Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG-Kit der Firma Invitrogen. Die Patienten-cDNA wurde 1:100 mit Wasser verdünnt und davon jeweils 2 μl in die PCR eingesetzt. Alle Ansätze wurden in 3facher Ausführung pipettiert.
PCR-Ansatz pro well (10 μl):

2 μl Template cDNA 1:100
1 μl forward primer, 10 mM
1 μl reverse primer, 10 mM
1 μl Fluorescein Reference Dye
5 μl Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG, 2x

Es wurde ein Mastermix ohne Template hergestellt, dieser wurde in 8 μl-Aliquots in die PCR-Platte gesteppt und dazu wurden jeweils die Patienten-cDNAs pipettiert. Das sich daran anschließende PCR-Programm war folgendermaßen aufgebaut:
Verwendet wurde das iQ^TM5 Multicolor Real-Time-PCR Detection System der Firma BIORAD mit der dazugehörigen Auswertungssoftware.
Ergebnisse
Die mittels Real-Time-Assays gemessenen Expressionssignale wurden im Excel-Format abgespeichert und über die 3-fach-Bestimmungen gemittelt. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tab. 31 gezeigt. Tabelle. 31 Ct-Werte aus den Real Time-Assays

Patienten-ID Ct-Werte (Mittelwerte)

6032 22,33

6048 22,62

6063 20,99

6070 26,82

6104 22,59

8002 23,92

8026 23,28

8086 23,18

8102 23,95

2038 22,93
16 zeigt einen Boxplot für den nicht-kodierenden Marker mit der SeqID 207, erstellt aus 10 Patienten-Proben (5 mit Sepsis-Diagnose, 5 mit SIRS). Auf der y-Achse ist der mittlere Ct-Wert während der Real-Time-Amplifikation dargestellt. Es ist eine klare Trennung von Sepsis- und SIRS-Patienten erkennbar.
Die folgende Tab. 32 stellt den Bezug zwischen der Sequenzprotokollnummer der einzelnen Polynukleotide und deren öffentlich zugänglichen Accession-Nummer her. Tabelle 32: Korrelation von Sequenznummer (Sequenzprotkoll) und Accession-Nummer
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Claims

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Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das wenigstens eine Referenzgen ein Housekeepinggen ist, insbesondere ausgewählt aus Polynukleotiden der Gruppe bestehend aus SEQ-ID NO: 676 bis SEQ-ID NO: 686, und/oder deren Genloci und/oder deren Transkripten und/oder Fragmenten davon.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Polynukleotidsequenzen Genloci, sense und/oder antisense Stränge von prä- mRNA und/oder mRNA, small RNA, insbesondere scRNA, snoRNA, micro RNA, siRNA, dsRNA, ncRNA oder transposable Elemente zur Erfassung der Genexpressionsprofile verwendet werden.
Verwendung einer Mehrzahl von Polynukleotiden, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ-ID NO: 1 bis SEQ-ID NO: 669 und/oder deren Genloci und/oder deren Transkripten und/oder Fragmenten davon, zur Bildung wenigstens eines Multigenbiomarkers zur Herstellung eines Multiplex-Assays als Hilfsmittel zur Beurteilung, ob bei einem Patienten ein pathophysiologischer Zustand vorliegt, und/oder zur Feststellung des Schweregrades und/oder des Verlaufs des pathophysiologischen Zustands.
Verwendung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Multigenbiomarker eine Kombination von mehreren Polynukleotid-, insbesondere Gensequenzen ist, anhand deren Genaktivitäten mittels einer Interpretationsfunktion eine Klassifikation durchgeführt und/oder ein Index gebildet wird.
Verwendung nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Genaktivitäten mittels enzymatischer Verfahren, insbesondere Amplifikationsverfahren, bevorzugt Polymereasekettenreaktion (PCR), vorzugsweise Real-Time-PCR; und/oder mittels Hybridisierungsverfahren, insbesondere solchen auf Microarrays, erfasst werden.
Verwendung nach einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass aus den einzelnen bestimmten Genaktivitäten ein Index gebildet wird, der nach entsprechender Kalibrierung ein Maß für den Schweregrad und/oder den Verlauf des pathophysiologischen Zustands, insbesondere der Sepsis oder des sepsisähnlichen Zustandes, ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 4 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Index auf einer leicht interpretierbaren Skala angezeigt wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 4 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass man die erhaltenen Genaktivitätsdaten zur Herstellung von Software für die Beschreibung mindestens eines pathophysiologischen Zustands und/oder einer Untersuchungsfrage und/oder als Hilfsmittel für Diagnosezwecke und/oder für Patientendatenmangement-Systeme einsetzt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 4 bis 9, wobei zur Erstellung der Genaktivitätsdaten solche spezifischen Genloci, sense und/oder antisense Stränge von prä-mRNA und/oder mRNA, small RNA, insbesondere scRNA, snoRNA, micro RNA, siRNA, dsRNA, ncRNA oder transposable Elemente, Gene und/oder Genfragmente verwendet werden, welche eine Sequenzhomologie von mindestens ca. 10%, insbesondere ca. 20%, vorzugsweise ca. 50%, besonders bevorzugt ca. 80% zu den Polynukleotidsequenzen gemäß SEQ-ID NO: 1 bis SEQ-ID NO: 669 aufweisen.
Verwendung mindestens eines Polynukleotids, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ-ID NO: 1 bis SEQ-ID NO: 152 und/oder deren Genloci und/oder deren Transkripten und/oder Fragmenten davon, zur Herstellung eines Assays zur Beurteilung, ob bei einem Patienten ein pathophysiologischer Zustand vorliegt, und/oder zur Feststellung des Schweregrades und/oder des Verlaufs des pathophysiologischen Zustands.
Verwendung nach einem der Ansprüche 4 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass der pathophysiologische Zustand ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: SIRS, Sepsis und deren Schweregraden; sepsisähnlichen Zuständen; septischem Schock; infektiösem/nicht-infektiösem Multiorganversagen; lokaler/systemischer Infektion; Verbesserung/Verschlechterung eines pathophysiologischen Zustandes, insbesondere Sepsis; Responder/non-Responder für eine bestimmte Therapie; Fokus einer Infektion; Ursachen eines pathophysiologischen Zustandes, insbesondere Klassifizierung nach gram-positiv und/oder gram-negativ.
Verwendung nach einem der Ansprüche 4 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Probennukleinsäure RNA, insbesondere Gesamt-RNA oder mRNA, oder DNA, insbesondere cDNA, ist.
Kit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 3, enthaltend mindestens einen Multigenbiomarker, welcher eine Mehrzahl von Polynukleotidsequenzen umfasst, die aus dem Pool von SEQ-ID NO: 1 bis SEQ-ID NO: 669 und/oder deren Genloci und/oder deren Transkripten und/oder Fragmenten davon ausgewählt sind, und/oder Primer und/oder Sonden und/oder Antisensenukleotide hierfür, wobei der Multigenbiomarker spezifisch für einen pathophysiologischen Zustand eines Patienten ist und solche Zustände einschließt, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: SIRS, Sepsis und deren Schweregraden; sepsisähnlichen Zuständen; septischem Schock; infektiösem/nicht-infektiösem Multiorganversagen; Überlebenswahrscheinlichkeit bei Sepsis; lokaler/systemischer Infektion; Responder/non-Responder für eine bestimmte Therapie; Fokus einer Infektion; Ursachen eines pathophysiologischen Zustandes, insbesondere Klassifizierung einer Infektion nach gram-positiven oder gram-negativen Erregern.
Kit nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Polynukleotidsequenzen auch Genloci, sense und/oder antisense Stränge von prä-mRNA und/oder mRNA, small RNA, insbesondere scRNA, snoRNA, micro RNA, siRNA, dsRNA, ncRNA oder transposable Elemente umfassen.