WO2009115478A2

WO2009115478A2 - Verfahren zur in vitro erfassung und unterscheidung von pathophysiologischen zuständen

Info

Publication number: WO2009115478A2
Application number: PCT/EP2009/053042
Authority: WO
Inventors: Stefan Russwurm
Original assignee: Sirs-Lab Gmbh
Priority date: 2008-03-17
Filing date: 2009-03-16
Publication date: 2009-09-24
Also published as: WO2009115478A3; US8765371B2; DE102008000715B9; DE102008000715A1; GB201017326D0; GB2470707B; JP2011517401A; GB2470707A; CA2718741A1; DE102008000715B4; US20110098195A1; GB2470707C

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur in vitro Erfassung und/oder Unterscheidung und/oder Verlaufsbeobachtung von pathophysiologischen Zuständen (z.B. SIRS oder SEPSIS) mittels Probennukleinsäuren, Bestimmung von Genaktivitäten mittels einer Mehrzahl von Polynukleotiden, Bestimmung von Genaktivitäten wenigstens eines internen Referenzgens sowie Bilden eines Index-Wertes aus den einzelnen bestimmten normalisierten Genaktivitäten eines Multigenbiomarkers, der den pathophysiologischen Zustand anzeigt, umfasst.

Description

Beschreibung

Verfahren zur in vitro Erfassung und Unterscheidung von pathophysiologischen

Zuständen

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur in vitro Erfassung und/oder Unterscheidung und/oder Verlaufsbeobachtung von pathophysiologischen Zuständen gemäß Anspruch 1 , die Verwendung einer Mehrzahl von Polynukleotiden und/oder deren Genloci und/oder deren Transkripten zur Bildung wenigstens eines Multigenbiomarkers zur Herstellung eines Multiplex-Assays gemäß Anspruch 4; die Verwendung mindestens eines Polynukleotids und/oder deren Genloci und/oder deren Transkripten zur Herstellung eines Assays gemäß Anspruch 11 , sowie einen Kit zur Durchführung des Verfahrens gemäß Anspruch 14.

Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von Polynukleotiden zur Erfassung von Genaktivitäten von mindestens einem Multigenbiomarker, zur Herstellung eines Hilfsmittels zur Diagnose bei Patienten mit bestimmten pathophysiologischen Zuständen, wie beispielsweise Sepsis und Sepsisähnliche Zuständen, mit ähnlichen Merkmalen wie ein „In Vitro Diagnostic Multivariate Index Assay" (IVDMIA).

Sepsis („Blutvergiftung") ist eine lebensbedrohliche Infektion, die den gesamten Organismus erfasst. Sie ist mit hoher Sterblichkeit verbunden, kommt immer häufiger vor und erfasst Menschen in jedem Lebensalter. Sepsis gefährdet den medizinischen Fortschritt in vielen Bereichen der Hochleistungsmedizin und verbraucht einen Großteil der Ressourcen im Gesundheitswesen. Die Sterblichkeit der schweren Sepsis hat sich in den letzten Jahrzehnten nicht entscheidend verbessert. Die letzten beiden Innovationssprünge nach Einführung der Blutkultur (ca. 1880) waren die Einführung der Antibiotika vor über 60 und der Beginn der Intensivmedizin vor etwa 50 Jahren. Um heute ähnlich entscheidende Behandlungsfortschritte zu erzielen, müssen neuartige Diagnostika zur Verfügung gestellt werden.

Sepsis wird durch Infektionserreger verursacht. Da es bislang keine spezielle Therapie gegen die Sepsis gibt, hängt der Erfolg der Behandlung weitgehend von der erfolgreichen Bekämpfung der zugrunde liegenden Infektion und der Qualität der intensivmedizinischen Behandlung ab. Entscheidend für das Überleben ist die frühzeitige Gabe eines Antibiotikums, das außerdem den verursachenden Erreger erfolgreich bekämpft [Kumar et. al., 2006]. Defizite der Sepsis-Diagnostik verzögern jedoch den Therapiebeginn und die Wahl eines geeigneten Antibiotikums. Da die Identifizierung des Sepsiserregers mit den derzeitigen Methoden der Blutkultur nur in weniger als 25 % der Sepsisfälle gelingt und die Befunde im Fall des Erregernachweises erst nach 2-3 Tagen vorliegen, muss die initiale Wahl des Antibiotikums oder Antimykotikums (gegen Pilze gerichtete Substanzen) „kalkuliert", d.h. auf Verdacht gewählt werden. In 20 - 30 % der Fälle ist diese Wahl nicht richtig.

Weitere Ursachen für die Verzögerung der Therapie liegen in der Fehlinterpretation der Krankheitssymptome und Laborwerte. Verbesserte Diagnostika, die die Sepsisdiagnose vereinfachen und beschleunigen, können zu einer erheblichen Reduktion der Sepsissterblichkeit und Verkürzung ihrer Behandlungsdauer beitragen. Medizinische Fachgesellschaften bestätigen die Defizite der bisherigen Sepsis-Diagnostik in Umfragen unter nordamerikanischen und europäischen Intensivmedizinern [Marshall et. al., 2003]. Auch die Betroffeneninitiative „Deutsche Sepsis Hilfe e.V." und der Deutschen Sepsis-Gesellschaft beklagen die Defizite.

Im Zuge der Entwicklung marktreifer in-vitro-Diagnostika aus dem Bereich molekularer Diagnostik wurde am 26.7.2007 ein Richtlinienentwurf der Food and Drug Administration (FDA) der Vereinigten Staaten von Amerika veröffentlicht. Diese Richtlinie liefert Empfehlungen, Definitionen und Anhaltspunkte für den Entwicklungsund Zulassungsprozess. Weiterhin werden Spezifikationen für die neue Klasse der „in vitro-diagnostischen multivariaten Index-Assays (IVDMIA)" vorgeschlagen. Kennzeichen dieser Assays sind:

1 ) Die Kombination von mehreren Einzelwerten mittels eines Interpretationsschrittes, um einen einzelnen patientenspezifischen Ausgabewert in Form eines Index, Score oder einer Klassifikation zu erhalten. Dieser Wert ist für diagnostische Aussagen, zur Schadensbegrenzung, Behandlung oder Vorbeugung einer Krankheit einsetzbar.

2) Das erreichte Ergebnis ist von den Messwerten in einer Weise abgeleitet, die keine Rückschlüsse auf die eigentlichen Messdaten erlaubt. Daher kann das Ergebnis vom End-Anwender nicht bestätigt bzw. nachvollzogen werden. 3) Dadurch ist es notwendig, dem Anwender alle Informationen zur Interpretation des Testergebnisses zur Verfügung zu stellen.

Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere Gene und/oder deren Fragmente und ihre Verwendung zur Erstellung von Multigenbiomarkern, welche spezifisch für einen Zustand und/oder Untersuchungsfrage sind.

Die Erfindung betrifft ferner von den Markergenen abgeleitete PCR-Primer und Sonden für Hybridisierungs- bzw. Vervielfertigungsverfahren.

Nach wie vor ist die Sepsis eines der schwierigsten Krankheitsbilder in der modernen Intensivmedizin, wobei für den klinisch tätigen Arzt nicht nur die Therapie, sondern auch die Diagnose eine Herausforderung darstellt. Trotz Fortschritten im pathophysiologischen Verständnis und der supportiven Behandlung von Intensivpatienten sind generalisierte inflammatorische Zustände wie SIRS und Sepsis bei Patienten auf Intensivstationen sehr häufig auftretende und erheblich zur Sterblichkeit beitragende Erkrankungen [Marshai et al., 2003; Alberti et al., 2003]. Die Sterblichkeit beträgt ca. 20 % bei SIRS, ca. 40 % bei Sepsis und steigt bei Entwicklung von multiplen Organdysfunktionen bis auf 70-80 % an [Brun-Buisson et al., 1995; Le-GaII et al., 1995; Brun-Buisson et al., 2003]. Der Morbiditäts- und Letalitätsbeitrag von SIRS und Sepsis ist von fachübergreifender klinischmedizinischer Bedeutung, denn dadurch werden in zunehmendem Maße die Behandlungserfolge der fortgeschrittensten Therapieverfahren zahlreicher medizinischer Fachgebiete (z.B. Traumatologie, Neurochirurgie, Herz- /Lungenchirurgie, Viszeralchirurgie, Transplantationsmedizin, Hämatologie/ Onkologie, etc.) gefährdet, denen ohne Ausnahme eine Erhöhung des Krankheitsrisikos für SIRS und Sepsis immanent ist. Dies drückt sich auch im kontinuierlichen Anstieg der Häufigkeit der Sepsis aus: zwischen 1979 und 1987 wurde ein Anstieg um 139%, nämlich von 73,6 auf 176 Krankheitsfälle je 100.000 Krankenhauspatienten verzeichnet [MMWR Morb Mortal WkIy Rep 1990]. Die Senkung der Morbidität und Letalität einer Vielzahl von schwer erkrankten Patienten ist daher an einen gleichzeitigen Fortschritt in der Vorbeugung, Behandlung und insbesondere der Erkennung und Verlaufsbeobachtung der Sepsis und schweren Sepsis gebunden. Im Laufe der Zeit hat der Sepsisbegriff einen erheblichen Bedeutungswandel erfahren. Eine Infektion bzw. der dringliche Verdacht auf eine Infektion sind auch heute noch wesentlicher Bestandteil aktueller Sepsisdefinitionen. Besondere Berücksichtigung findet jedoch dabei die Beschreibung Infektionsort-ferner Organfehlfunktionen im Rahmen der inflammatorischen Wirtsreaktion. Im internationalen Schrifttum haben sich zwischenzeitlich die Kriterien der Konsensuskonferenz des „American College of Chest Physicians/Society of Critical Care Medicine Consensus Conference (ACCP/SCCM)" aus dem Jahr 1992 am breitesten zur Definition des Sepsis-Begriffs durchgesetzt [Bone et al., 1992]. Entsprechend dieser Kriterien werden die klinisch definierten Schweregrade „systemic inflammatory response Syndrom" (SIRS), „Sepsis", „severe Sepsis" und „septic shock" unterschieden. Als SIRS wird dabei die systemische Antwort des inflammatorischen Systems auf einen nichtinfektiösen Reiz definiert. Dazu müssen mindestens zwei der folgenden klinischen Kriterien erfüllt sein: Fieber >38°C oder Hypothermie <36°C, eine Leukozytose >12g/l oder eine Leukopenie <4g/l bzw. eine Linksverschiebung im Differentialblutbild, eine Herzfrequenz von über 90/min, eine Tachypnoe >20 Atemzüge/min oder ein PaCO₂ (Partialdruck des Kohlendioxid im arteriellen Blut) <4,3 kPa. Diese Definition hat eine hohe Sensitivität, aber eine niedrige Spezifität. Für intensivmedizinische Belange ist sie wenig hilfreich, da in der Regel jeder Intensivpatient, zumindest für kurze Zeit, die SIRS-Kriterien erfüllt.

Als Sepsis werden solche klinischen Zustände definiert, bei denen die SIRS- Kriterien erfüllt sind und ursächlich eine Infektion nachgewiesen wird oder zumindest sehr wahrscheinlich ist. Eine Infektion wird definiert als ein pathologischer Prozess, welcher durch eine Invasion von Pathogenen beziehungsweise potentiell pathogenen Organismen in ein normalerweise steriles Gewebe hervorgerufen wird. Wenn es dem Körper nicht gelingt, diese Infektion auf den Ursprungsort zu begrenzen, induzieren die Krankheitserreger oder deren Toxine in den vom Infektionsort entfernten Organen bzw. Geweben des Körpers eine Entzündung. Eine sofortige intensivmedizinische Behandlung, die zielgerichtete Gabe von Antibiotika und die operative Sanierung des infektiösen Herdes sind nötig, um eine Genesung zu erreichen. Eine schwere Sepsis ist vom zusätzlichen Auftreten von Organfehlfunktionen gekennzeichnet. Häufige Organfehlfunktionen sind Änderungen der Bewusstseinslage, eine Oligurie, eine Laktazidose oder eine Sepsis-induzierte Hypotension mit einem systolischen Blutdruck von weniger als 90 mmHg bzw. ein Druckabfall um mehr als 40 mmHg vom Ausgangswert. Wenn eine solche Hypotension nicht durch die Verabreichung von Kristalloiden und/oder Kolloiden zu beheben ist und es zusätzlich zu einer Katecholaminpflichtigkeit des Patienten kommt, so spricht man von einem septischen Schock. Dieser wird bei etwa 20 % aller Sepsispatienten nachgewiesen.

Es besteht unter vielen Medizinern Einigkeit darüber, dass die Konsensuskriterien nach [Bone et al., 1992] keiner spezifischen Definition von Sepsis entsprechen. So zeigte eine von der European Society of Intensive Care Medicine (ESICM) durchgeführte Umfrage, dass 71 % der befragten Ärzte trotz langjähriger klinischer Erfahrungen Unsicherheit bei der Diagnosestellung einer Sepsis hatten [Poeze et al., 2003]. Der Versuch, eine einheitliche Terminologie durchzusetzen, fand in der klinischen Umsetzung variable Akzeptanz. Insbesondere die Fortschritte im Verständnis der Pathophysiologie der Sepsis veranlasste verschiedene Experten, nach einer entsprechenden Modifikation der bisherigen Definitionen zu suchen. Die Definitionen von Sepsis, schwerer Sepsis und septischem Schock wurden bestätigt und als nützlich für Kliniker und Forscher beurteilt. Allerdings wurden die diagnostischen Kriterien der Sepsis erheblich erweitert, um dem klinischen Aspekt der Infektabwehr gerecht zu werden. Die internationale Sepsis-Konferenz 2001 schlug außerdem ein neues Konzept (PIRO genannt) zur Beschreibung der Sepsis vor, welches sich aus den Kriterien Prädisposition, Infektion, Immunantwort (Response) und Organdysfunktion zusammensetzt [Levy et al., 2003]. Trotz einer neuen Definition der SIRS/Sepsis mit dem Akronym PIRO [Opal et al., 2005] wird in den meisten Studien immer noch die ACCP/SCCM Konsensuskonferenz aus dem Jahre 1992 benutzt [Bone et al., 1992], um ihre Patienten zu klassifizieren.

Mehrere Ansätze zur Diagnosestellung von SIRS und Sepsis wurden entwickelt. Diese Ansätze können in 3 Gruppen geteilt werden.

Der erste Gruppe enthält Score-Systeme wie beispielsweise APACHE, SAPS und SIRS welche die Patienten auf der Basis einer Vielzahl physiologischer Indices stratifizieren können. Während in einigen Studien für den APACHE Il Score ein diagnostisches Potential nachgewiesen werden konnte, haben andere Studien gezeigt, dass APACHE Il und SAPS Il nicht zwischen Sepsis und SIRS differenzieren können [Carrigan et al., 2004].

Die zweite Gruppe enthält Proteinmarker, die aus Plasma und Serum nachgewiesen werden. Solche sind zum Beispiel CA125, S100B, Copeptin, Glycin N- acyltransferase (GNAT), Protachykinin und/oder seine Fragmente, Aldose 1 - Epimerase (Mutarotase), Chp, Carbamoylphosphat Synthetase 1 , LASP-1 (Brahms Diagnostika GmbH Deutschland), IL-1 Ra, MCP-1 , MPIF-1 , TNF-R1 , MIG, BLC, HVEM, IL-15, MCP-2, M-CSF, MIP-3b, MMP-9, PARC, ST-2; IL-6, slL-2R, CD141 , MMP-9, EGF, ENA-78, EOT, Gro-beta, IL-I b, Leptin, MIF, MIP-I a, OSM, Protein C, P-Selectin, und HCC4 (Molecular Staging, Inc., USA) oder CD 14 Antigen, Lipopolysaccharid-Bindungsstellen auf den Proteinen Alkalische Phosphatase und Inter-Alpha-Trypsin Inhibitor (Mochida Pharm Co, Ltd. Japan). Trotz der großen Menge von patentierten Biomarkern konnten sich nur wenige im klinischen Alltag durchsetzen. Von diesen scheinen Procalcitonin (PCT, BRAHMS) und das C-reaktive Protein (CRP, EIi Lilly) die Marker zu sein, die am besten zwischen infektiösen und nicht infektiösen Ursachen der SIRS unterscheiden können.

Procalcitonin ist ein 1 16 Aminosäuren langes Peptid das eine Rolle bei Entzündungsreaktionen spielt. Dieser Marker ist im Laufe der Zeit zunehmend als neuer Infektionsmarker auf Intensivstationen eingesetzt worden [Sponholz et al., 2006]. Dieser Marker gilt als Infektionsmarker und dient dazu, den Schweregrad der Sepsis festzulegen, wobei die Dynamik der Werte wichtiger ist als die Absolutwerte selbst, um z. B. bei Herzchirurgie-Patienten zwischen infektiöser und nicht-infektiöser Komplikation zu unterscheiden [Sponholz et al., 2006]. Trotz der weitgehenden Akzeptanz des Biomarkers PCT konnte in internationalen Studien gezeigt werden, dass die erreichten Sensitivitäten und Spezifitäten des Sepsismarkers PCT vor allem bei der Abgrenzung einer systemischen bakteriellen SIRS, also Sepsis, von einer nicht -bakteriellen SIRS noch immer unzureichend sind [Ruokonen et al., 1999; Suprin et al. 2000; Ruokonen et al.,2002; Tang et al., 2007a]. Die Meta-Analyse von Tang und Kollegen [Tang et al., 2007a], in der 18 Studien berücksichtigt wurden, zeigt, dass PCT nur schlecht geeignet ist, um SIRS von Sepsis zu diskriminieren. Darüberhinaus betonen die Autoren, dass PCT eine sehr schwache diagnostische Genauigkeit mit einem Odd Ratio (OR) von 7.79 hat. Als Regel benennen die Autoren, dass ein OR <25 nicht aussagekräftig, zwischen 25 und 100 hilfreich und im Falle von mehr als 100 hoch genau ist [Tang et al., 2007a].

C-reaktives Protein (CRP) ist ein 224 Aminosäuren langes Protein, das eine Rolle bei Entzündungsreaktionen spielt. Die Messung von CRP soll dazu dienen, um den Krankheitsverlauf sowie die Wirksamkeit der gewählten Therapie zu verfolgen.

In mehreren Berichten wurde beschrieben, dass im intensivmedizinischen Bereich PCT ein besser geeigneter diagnostischer Marker als CRP ist [Sponholz et al., 2006; Kofoed et al., 2007]. Darüber hinaus wird PCT als besser geeignet als CRP angesehen, um eine nicht infektiöse versus infektiöse SIRS sowie bakterielle versus virale Infektion zu unterscheiden [Simon et al., 2004].

Die dritte Gruppe enthält Biomarker oder Profile, die auf Transkriptom - Ebene identifiziert wurden. Diese molekularen Parameter sollten eine bessere Korrelation der molekularen inflammatorischen/immunologischen Wirtsantwort mit dem Schweregrad der Sepsis ermöglichen, aber auch Aussagen zur individuellen Prognose liefern. Nach derartigen Biomarkern wird derzeit von verschiedenen wissenschaftlichen Gruppen und kommerziellen Organisationen intensiv gesucht, wie zum Beispiel Veränderungen der Cytokinkonzentrationen im Blut verursacht durch Bakterienzellwandbestandteile wie Lipopolysaccharide [Mathiak et al., 2003], oder Verwendung von Genexpressionsprofilen in einer Blutprobe zur Bestimmung von Unterschieden bei überlebenden und nicht-Überlebenden Sepsispatienten [Pachot et al., 2006]. Genexpressionsprofile oder Klassifikatoren sind für die Bestimmung des Schwergrads von Sepsis [WO 2004/087949], die Unterscheidung zwischen einer lokalen oder systemischen Infektion [nicht veröffentlichte DE 10 2007 036 678.9], die Identifizierung der Infektionsquelle [WO 2007/124820] oder von Genexpressionssignaturen für die Unterscheidung zwischen mehreren Ätiologien und Pathogen-assoziierten Signaturen [Ramilo et al., 2007] geeignet. Allerdings besteht aufgrund der unzureichenden Spezifität und Sensitivität der Konsensuskriterien nach [Bone et al., 1992], der aktuell verfügbaren Proteinmarker sowie aufgrund des Zeitbedarfs des Nachweises der Infektionsursache durch Blutkultur ein dringender Bedarf für neue Verfahren, die die Komplexität der Erkrankung berücksichtigen. Viele Geneexpressionsstudien, die entweder einzelne Gene und/oder Kombinationen von Genen, die als Klassifkatoren benannt sind, verwenden sowie zahlreiche Beschreibungen von statistischen Verfahren zur Ableitung eines Score und/oder Index [WO03084388; US6960439] gehören zum Stand der Technik.

Es besteht heute ein Konsens dahingehend, dass komplexe Erkrankungen sinnvoll nur über mehrere Parameter beschrieben werden können.

In zunehmendem Maße finden molekulare Signaturen Eingang in die klinische Diagnostik, insbesondere bei komplexen Erkrankungen, die mit herkömmlichen Biomarkern nicht erfasst werden können, aber auch zur Beurteilung von Risiken für die Patienten und zur Identifizierung von Respondern beim Einsatz von Medikamenten und Therapien. Nachfolgende Aufzählung soll den aktuellen Stand und die Einsatzgebiete der Genexpressionsdiagnostik verdeutlichen.

1 ) Die Microarray-basierte, 70 Gene umfassende Signatur namens MammaPrint (Aqendia, NL) erlaubt es, eine Prognose über das Rezidiv- und Metastasierungsrisiko von Frauen mit Brustkrebs zu treffen. Dabei wird untersucht, ob das Risiko, in den nächsten Jahren entfernte Metastasen zu entwickeln, als hoch oder niedrig eingestuft werden kann und sie von einer Chemotherapie profitieren würden. Die Zulassung dieses Tests durch die FDA brachte die Entwicklung von Richtlinien für eine neue Klasse von diagnostischen Tests, sog. IVDMIA (in vitro diagnostic multivariate index assay) mit sich. Die MammaPrint-Signatur wird auf einem Mikroarray in den Laboren des Herstellers gemessen und berechnet.

2) An Formalin-fixierten Gewebeproben wird mittels des Oncotype DX -Multiqen- Assavs (Genomic Health, USA) die Wahrscheinlichkeit des Wiederauftretens von Brustkrebs in Patientinnen beurteilt, sowie das Ansprechen der Patientinnen auf Chemotherapie geprüft. 21 Gene werden als „Recurrence-Score" zusammengefasst. Die Messung findet in den Räumen der Firma statt, es kommt ebenfalls die TaqMan- PCR Technologie zum Einsatz.

3) Der AlloMap Genexpressionstest der Firma XDx (USA) wird zur Überwachung eventueller Abstoßungsreaktionen bei Patienten mit Herztransplantation eingesetzt, die ca. 30 % der Patienten innerhalb eines Jahres zeigen. Bislang waren zur Diagnose mehrere Biopsien notwendig. Der Test basiert auf 1 1 quantitativen PCR- Assays (zusätzlich 9 Kontrollen und Referenzen) unter Nutzung der TaqMan Technologie (Hoffman-La Roche) in den Räumen des Herstellers. Das Probenmaterial ist Blut. Bereits zwei Monate nach der Transplantation sind die Messergebnisse zuverlässig und sagen das Ausbleiben von Abstoßungsreaktionen für die nächsten 80 Tage voraus.

Eine Gemeinsamkeit dieser Tests ist, dass die addressierte diagnostische Fragestelllung Untersuchungszeiten bis zum Vorliegen des Ergebnisses von mehreren Tagen erlaubt. Für diagnostische Tests in der Indikation Sepsis dagegen, muß die Information innerhalb eines einzigen Arbeitstages vorliegen.

Mehrere Anwendungen von Genexpressionsprofilen sind in dem Stand der Technik bekannt.

Pachot und Kollegen demonstrieren den Nutzen von Expressionssignaturen für die Verlaufsbeurteilung von Patienten mit septischem Schock. Hier finden sich molekulare Unterschiede, die die Wiederherstellung eines funktionierenden Immunsystems in den Überlebenden wiederspiegeln. 28 Markergene mit Funktionen im innaten Immunsystem zeigen innerhalb des ersten Tages nach Diagnose des septischen Schocks mit hoher Sensitivität (100%) und Spezifität (88%) an, ob die Immunparalyse reversibel ist und damit das Überleben des Patienten ermöglicht. Allerdings war in der Untersuchung das Patientenkollektiv zu klein (38) um ein robustes Profil zu erstellen und eine Validierung dieses Datensatzes durch einen unabähngigen Datenatz ist bislang nicht erfolgt. Der Stand der Technik enthält zahlreiche Studien zur Identifikation von Genexpressionsmarkern [Tang et al., 2007b] oder Genexpressionsprofilen für die Feststellung einer systemischen Infektion [Johnson et al., 2007].

Tang und Kollegen [Tang et al., 2007b] suchten in einer bestimmten Blutzellpopulation, den Neutrophilen, nach einer Signatur, welche eine Unterscheidung von Patienten mit SIRS und Sepsis ermöglicht. 50 Marker aus dieser Zellpopulation genügen um die Immunantwort auf eine systemische Infektion wiederzugeben und neue Erkenntnisse zur Pathophysiologie und den beteiligten Signalwegen zu ermöglichen.

Die Klassifikation von Patienten mit und ohne Sepsis gelingt mit hoher Sicherheit (PPV 88% bzw. 91 % in Trainings- und Testdatensatz). Die Anwendbarkeit für die klinische Diagnose ist allerdings dadurch begrenzt, dass im Blut diese Signatur von Signalen aus anderen Blutzelltypen überlagert werden kann. Bezüglich der Anwendbarkeit ist die Präparation dieser Blutzellpopulation mit erheblich erhöhtem Aufwand verbunden. Die Aussagekraft der in dieser Studie publizierten Ergebnisse ist für praktische Anwendungen jedoch limitiert, weil die Patientenauswahl sehr stark heterogen war. Es wurden Patienten in die Studie eingeschlossen, die stark unterschiedliche Begleiterkrankungen wie z. B zu 1 1 % bis 16% Tumorerkrankungen aufwiesen oder sehr stark unterschiedlichen therapeutischen Maßnahmen unterlagen (z.B. 27% bis 64% Vasopressor-Therapie), wodurch die Genexpressionsprofile stark beeinflusst wurden.

Johnson und Kollegen [Johnson et al., 2007] beschreiben an einem Kollektiv von Traumapatienten, dass sich die Ausprägung einer Sepsis bereits bis zu 48 Stunden vor der klinischen Diagnose anhand molekularer Veränderungen messen lässt. Die Traumapatienten wurden über mehrere Tage untersucht. Ein Teil der Patienten entwickelte eine Sepsis. Nichtinfektiöse SIRS-Patienten wurden mit präseptischen Patienten verglichen. Die identifizierte Signatur aus 459 Transkripten setzt sich aus Markern der Immunantwort und Entzündungsmarkern zusammen. Probenmaterial war Vollblut, die Analysen wurden auf einem Mikroarray durchgeführt. Unklar ist, ob sich diese Signatur auch auf andere Kollektive septischer bzw. präseptischer Patienten ausdehnen lässt. Eine Klassifikation und der diagnostische Nutzen dieser Signatur wurde nicht gezeigt.

Weiterhin werden im Stand der Technik andere Signaturen beschrieben, beispielsweise die Antwort des Wirtes auf eine Infektion.

Die Spezifität der Wirtsantwort auf unterschiedliche Erreger ist bisher in mehreren experimentellen Systemen untersucht worden. In keiner Studie jedoch wurden Genexpressionsprofile und/oder Signaturen von Sepsis-Patienten beschrieben. Das Ziel von Feezor und Kollegen [Feezor et al., 2003] war es, Unterschiede zwischen Infektionen mit gram-negativen und gram-positiven Erregern zu identifizieren. Blutproben von drei verschiedenen Spendern wurden ex vivo mit E.coli- LPS und Hitze-inaktiviertem S.aureus stimuliert. Mittels Microarraytechnologie wurden Genexpressionsuntersuchungen durchgeführt. Die Arbeitsgruppe fand sowohl Gene, die nach S.aureus-s-Stimulation hochreguliert und nach LPS-Stimulation herunterreguliert waren, als auch Gene die nach LPS-Behandlung stärker exprimiert wurden als nach der Zugabe von Hitze-inaktivierten S.aureus-Keimen. Gleichzeitig wurden viele Gene durch gram-positive und gram-negative Stimulation in gleichem Maße hochreguliert. Dies betrifft zum Beispiel die Zytokine TNF-α, IL-1 ß und IL-6. Die differentiell exprimierten Gene wurden leider nicht namentlich veröffentlicht, so dass lediglich ein indirekter Vergleich anderen Ergebnissen möglich ist. Neben der Genexpression wurden von Feezor et al. auch die Plasmakonzentrationen einiger Zytokine untersucht. Dabei korrelierten die Genexpressionsdaten nicht zwangsweise mit den Plasmakonzentrationen. Bei der Genexpression wird die Menge an mRNA vermessen. Diese ist jedoch vor der Proteinsynthese posttranskriptionaler Regulation unterworfen, woraus die beobachteten Unterschiede resultieren können.

Die interessanteste Publikation zu diesem Thema wurde von einer texanischen Forschungsgruppe um Ramilo [Ramilo et al., 2007], veröffentlicht. Hier wurden ebenfalls Genexpressionsuntersuchungen an humanen Blutzellen durchgeführt, die Unterschiede in der molekularen Wirtsreaktion auf verschiedene Pathogene aufdeckten. Dazu wurden pediatrische Patienten mit akuten Infektionen, wie z.B. akuten Atemwegserkrankungen, Harnwegsinfektionen, Bakteriämien, lokalen Abszessen, Knochen- und Gelenkinfektionen sowie Meningitis untersucht. Microarrayexperimente wurden mit RNA-Proben durchgeführt, die aus peripheren mononuklearen Blutzellen von jeweils zehn Patienten mit E.coli- bzw. S.aureus- Infektion isoliert wurden. Die Identifizierung der Erreger erfolgte mittels Blutkultur. Anhand des Trainingsdatensatzes wurden 30 Gene identifiziert, durch deren Verwendung die verursachenden pathogenen Keime mit hoher Genauigkeit diagnostiziert werden konnten. Trotz der zahlreichen publizierten Studien und der darin beschriebenen individuellen Signaturen, die den Stand der Technik begründen, erlaubt keine davon eine diagnostische Ausage über Sepsis und/oder Sepsis-ähnliche Zustände. Keine dieser Publikationen bietet die Zuverlässigkeit, Genauigkeit und Robustheit der hier offenbarten Erfindung. Diese Studien sind darauf konzentriert, den aus wissenschaftlicher Sicht "besten" Multigenbiomarker (Klassifikator) zu identifizieren, jedoch nicht, wie in der vorliegenden Erfindung, den für eine spezifische klinische Fragestellung optimalen Multigenbiomarker [Simon et al., 2005].

Somit ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Testsystem zur Verfügung zu stellen, mit dem eine schnelle und zuverlässige Aussage über einen pathophysiologischen Zustand, beispielsweise Sepsis, möglich ist.

Die Lösung dieser Aufgabe erfolgt verfahrenstechnisch durch die Merkmale des Anspruchs 1.

Bezüglich einer Verwendung wird die Aufgabe durch die Merkmale der Ansprüche 4 und 1 1 gelöst.

Ein Kit gemäß Anspruch 14 löst die Aufgabe ebenfalls.

In allgemeiner Form betrifft die vorliegende Erfindung ein System, das folgende Elemente umfaßt:

• Set von Genaktivitätsmarkern

• Referenzgene als interne Kontrolle für die Normalisierung der Genaktivitätsmarkersignale in Vollblut

• Detektion hauptsächlich über Real-Time-PCR oder andere Amplifikationsverfahren oder Hybridisierungsverfahren • Verwendung eines Algorithmus, um die Einzelergebnisse der Genaktivitätsmarker zu einem gemeinsamen numerischen Wert, Index oder auch Score, umzuwandeln

• Darstellung dieses numerischen Wertes auf einer entsprechend eingeteilten Skala

• Kalibrierung, d.h. Einteilung der Skala entsprechend der intendierten Anwendung durch vorherige Validierungsexperimente.

Das System liefert eine Lösung für das Problem der Feststellung von Krankheitszuständen wie z. B. die Unterscheidung von infektiösem und nichtinfektiösem Multiorganversagen aber auch für andere in diesem Kontext relevante Anwendungen und Fragestellungen.

Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur in vitro Erfassung und/oder Unterscheidung und/oder Verlaufsbeobachtung von pathophysiologischen Zuständen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: SIRS, Sepsis und deren Schweregraden; sepsisähnlichen Zuständen; septischem Schock; infektiösem/nicht-infektiösem Multiorganversagen; Überlebenswahrscheinlichkeit bei Sepsis; Fokus einer Infektion; Responder/non-Responder für eine bestimmte Therapie; Ursachen eines pathophysiologischen Zustandes, insbesondere Klassifizierung einer Infektion nach gram-positiven und/oder gram-negativen Bakterien; wobei das Verfahren folgende Schritte umfaßt:

a) Isolierung von Probennukleinsäuren aus einer von einem Patienten stammenden Probe;

b) Bestimmung von Genaktivitäten mittels einer Mehrzahl von Polynukleotiden, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ-ID NO: 1 bis SEQ-ID NO: 669 und/oder deren Genloci und/oder deren Transkripten und/oder Fragmenten davon, zur Bildung wenigstens eines für die Erfassung und/oder Unterscheidung und/oder den Verlauf von pathophysiologischen Zuständen eines Patienten charakteristischen Multigenbiomarkers;

c) Bestimmung von Genaktivitäten wenigstens eines internen Referenzgens, auf die die unter b) bestimmten Genaktivitäten bezogen, insbesondere normalisiert, werden;

d) Bilden eines Index-Wertes aus den einzelnen bestimmten normalisierten Genaktivitäten des Multigenbiomarkers, der den pathophysiologischen Zustand anzeigt.

In einem bevorzugten Verfahren ist das wenigstens eine Referenzgen ein Housekeepinggen, wobei das Housekeepinggen insbesondere ausgewählt ist aus Polynukleotiden der Gruppe bestehend aus SEQ-ID NO: 676 bis SEQ-ID NO: 686 und/oder deren Genloci und/oder deren Transkripten und/oder Fragmenten davon.

Bevorzugt werden als Polynukleotidsequenzen Genloci, sense und/oder antisense Stränge von prä-mRNA und/oder mRNA, small RNA, insbesondere scRNA, snoRNA, micro RNA, siRNA, dsRNA, ncRNA oder transposable Elemente verwendet.

Der Index wird vorzugsweise mittels statistischer Verfahren wie überwachte Klassifikationsverfahren aus dem Bereich des maschinellen und statischen Lernens wie z.B. (diagonale, lineare, quadratische) Diskriminanzanalyse, Super vector machines, verallgemeinerte partielle kleinste Quadrate, k-nächste Nachbarn, random forests, k-nächste Nachbar ermittelt. Für eine lineare Diskriminanzanalyse kann beispielsweise folgende Formel verwendet werden:

Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung einer Mehrzahl von Polynukleotiden, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ-ID NO: 1 bis SEQ-ID NO: 669 und/oder deren Genloci und/oder deren Transkripten und/oder Fragmenten davon, zur Bildung wenigstens eines Multigenbiomarkers zur Herstellung eines Multiplex- Assays als Hilfsmittel zur Beurteilung, ob bei einem Patienten ein pathophysiologischer Zustand vorliegt, und/oder zur Feststellung des Schweregrades und/oder des Verlaufs des pathophysiologischen Zustands.

Bevorzugt ist der Multigenbiomarker eine Kombination von mehreren Polynukleotid-, insbesondere Gensequenzen, anhand deren Genaktivitäten mittels einer Interpretationsfunktion eine Klassifikation durchgeführt und/oder ein Index oder Score gebildet wird.

Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung hat es sich als vorteilhaft herausgestellt, dass die Genaktivitäten mittels enzymatischer Verfahren, insbesondere Amplifikationsverfahren, bevorzugt Polymereasekettenreaktion (PCR), vorzugsweise Real-Time-PCR; und/oder mittels Hybridisierungsverfahren, insbesondere solchen auf Microarrays, erfasst werden.

Bei der Erfassung der Genaktivitäten auftretende differentielle Expressionssignale der in dem Multigenbiomarker enthaltenen Polynukleotidsequenzen können vorteilhaft und eindeutig einem pathophysiologischen Zustand, einem Verlauf und/oder Therapiemonitoring zugeordnet werden.

Typischerweise wird aus den einzelnen bestimmten Genaktivitäten ein Index gebildet wird, der nach entsprechender Kalibrierung ein Maß für den Schweregrad und/oder den Verlauf des pathophysiologischen Zustands, insbesondere der Sepsis oder des sepsisähnlichen Zustandes, ist.

Dieser Index oder Score kann auf einer leicht interpretierbaren Skala angezeigt werden, um dem behandelnden Arzt eine schnelles diagnostisches Hilfsmittel in die Hand zu geben.

Bei einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung werden die erhaltenen Genaktivitätsdaten zur Herstellung von Software für die Beschreibung mindestens eines pathophysiologischen Zustands und/oder einer Untersuchungsfrage und/oder als Hilfsmittel für Diagnosezwecke und/oder für Patientendatenmangement-Systeme eingesetzt.

Zur Erstellung der Genaktivitätsdaten werden vorteilhaft solche spezifischen Genloci, sense und/oder antisense Stränge von prä-mRNA und/oder mRNA, small RNA, insbesondere scRNA, snoRNA, micro RNA, siRNA, dsRNA, ncRNA oder transposable Elemente, Gene und/oder Genfragmente verwendet, welche eine Sequenzhomologie von mindestens ca. 10%, insbesondere ca. 20%, vorzugsweise ca. 50%, besonders bevorzugt ca. 80% zu den Polynukleotidsequenzen gemäß SEQ- ID NO: 1 bis SEQ-ID NO: 669 aufweisen.

Die Erfindungsgemäß betrifft ferner die Verwendung wenigstens eines Polynukleotids, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ-ID NO: 1 bis SEQ-ID NO: 152 und/oder deren Genloci und/oder deren Transkripten und/oder Fragmenten davon, zur Herstellung eines Assays zur Beurteilung, ob bei einem Patienten ein pathophysiologischer Zustand vorliegt, und/oder zur Feststellung des Schweregrades und/oder des Verlaufs des pathophysiologischen Zustands.

Der pathophysiologische Zustand ist vorteilhaft ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: SIRS, Sepsis und deren Schweregraden; sepsisähnlichen Zuständen; septischer Schock; infektiösem/nicht-infektiösem Multiorganversagen; lokaler/systemischer Infektion; Verbesserung/Verschlechterung eines pathophysiologischen Zustandes, insbesondere Sepsis; Responder/non-Responder für eine bestimmte Therapie; Fokus einer Infektion; Ursachen eines pathophysiologischen Zustandes, insbesondere Klassifizierung nach gram-positiv und/oder gram-negativ.

Erfindungsgemäß ist es bevorzugt, dass die Probennukleinsäure RNA, insbesondere Gesamt-RNA oder mRNA, oder DNA, insbesondere cDNA, ist.

Die Erfindung betrifft ferner einen Kit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, enthaltend mindestens einen Multigenbiomarker, welcher eine Mehrzahl von Polynukleotidsequenzen umfasst, die aus dem Pool von SEQ-ID NO: 1 bis SEQ- ID NO: 669 und/oder deren Genloci und/oder deren Transkripten und/oder Fragmenten davon ausgewählt sind, und/oder Primer und/oder Sonden und/oder Antisensenukleotide hierfür, wobei der Multigenbiomarker spezifisch für einen pathophysiologischen Zustand eines Patienten ist und solche Zustände einschließt, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: SIRS, Sepsis und deren Schweregraden; sepsisähnlichen Zuständen; septischem Schock; infektiösem/nichtinfektiösem Multiorganversagen; Überlebenswahrscheinlichkeit bei Sepsis; lokaler/systemischer Infektion; Responder/non-Responder für eine bestimmte Therapie; Fokus einer Infektion; Ursachen eines pathophysiologischen Zustandes, insbesondere Klassifizierung einer Infektion nach gram-positiven oder gramnegativen Erregern.

Die Polynukleotidsequenzen des Kits umfassen bevorzugt auch Genloci, sense und/oder antisense Stränge von prä-mRNA und/oder mRNA, small RNA, insbesondere scRNA, snoRNA, micro RNA, siRNA, dsRNA , ncRNA oder transposable Elemente.

Als Multigenbiomarker für die Unterscheidung von SIRS/Sepsis oder von infektiösem/nicht-infektiösem Multiorganversagen werden vorzugsweise die Polynukleotidsequenzen mit den in Tab. 1 1 und 16 angegebenen SEQ-IDs eingesetzt. Als Multigenbiomarker für die Unterscheidung von Ursachen eines pathophysiologischen Zustandes, insbesondere Klassifizierung nach gram-positiven und/oder gram-negativen Bakterien, werden vorzugsweise die Polynukleotidsequenzen mit den in Tab. 20 und 21 angegebenen SEQ-IDs eingesetzt.

Die vorliegende Erfindung ermöglicht es, als Teil eines integrierten Systems (In Vitro Diagnostic Multivariate Index Assay, IVDMIA) eine potenzielle infektiöse Komplikation in Patienten mit SIRS oder möglichen Sepsis einzuschätzen. Dieses System umfasst die Wahl der Patienten und die Bestimmung von deren Genexpressionssignalen in einem interpretierbaren Index, welchen der Arzt als Hilfsmittel zur Diagnose verwenden kann. Dieses System kombiniert die gemessenen Genexpressionsdaten von definierten Sequenzgruppen ausgewählt aus SEQ-ID NO: 1 bis SEQ-ID NO: 669 und/oder deren Genloci und/oder deren Transkripten und/oder Fragmenten davon, sowie von Housekeepinggenen. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden zur Erstellung der Genaktivitätsdaten solche spezifischen Gene und/oder Genfragmente verwendet, die eine Sequenzhomologie von mindestens ca. 10%, insbesondere ca. 20%, vorzugsweise ca. 50%, besonders bevorzugt ca. 80% zu den Polynukleotidsequenzen gemäß SEQ-ID NO: 1 bis SEQ- ID NO: 669 oder zu den Housekeepinggenen aufweisen.

Tab. 32 zeigt den hochrelevanten Sequenzpool, der für verschiedene klinische Fragenstellungen wichtig ist.

Tab. 8, 1 1 und 16 zeigen eine bevorzugte Wahl von Sequenzen, die, wenn in das obengennantes System integriert, für die Unterscheidung zwischen SIRS und Sepsis essentiell sind.

Die Wahl der Sequenzen aus dem hochrelevanten Sequenzpool ist von der klinischen Fragestellung abhängig.

Die Anmelderin hat ein Verfahren entwickelt, das große Sequenzpools benutzt, um Zustände festzustellen und/oder zu unterscheiden oder definierte Untersuchungsfragen zu beantworten. Beispiele sind in folgenden Patentschriften zu finden: Unterscheidung zwischen SIRS, Sepsis und sepsisähnlichen Zuständen [WO 2004/087949; WO 2005/0831 15], Erstellung von Kriterien zur Vorhersage des Krankheitsverlaufs bei Sepsis [WO 05/106020], Unterscheidung zwischen nichtinfektiösen und infektiösen Ursachen eines Multiorganversagens [WO 2006/042581 ], in vitro Klassifizierung von Genexpressionsprofilen von Patienten mit infektiösem/nichtinfektiösem Multiorganversagen [WO 2006/100203], Feststellung der lokalen Ursachen eines Fiebers unklarer Genese [WO 2007/144105], Polynukleotide zur Erfassung von Genaktivitäten für die Unterscheidung zwischen lokaler und systemischer Infektion [DE 10 2007 036 678.9]. Die Erfindung betrifft Polynukleotidsequenzen, ein Verfahren und ferner Kits zur Erstellung von Multigenbiomarkern, die in einem und/oder mehreren Modulen Merkmale eines „In Vitro Diagnostic Multivariate Index Assay" (IVDMIA) aufweisen.

Definitionen:

Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung werden folgende Definitionen verwendet:

Zustand: die klinisch definierten Schweregrade „systemic inflammatory response Syndrom" (SIRS), „sepsis", „severe sepsis" und „septic shock" wie definiert in [Bone et al., 1992] und das PIRO Konzept [Levy et al., 2003].

Multiorganversagen: Als Multiorganversagen bezeichnet man das gleichzeitig oder in rascher zeitlicher Abfolge auftretende Versagen von zwei oder mehr vitalen Organsystemen. Das Multiorgandysfunktionssyndrom (MODS) geht als initiale Organinsuffizienz dem MOV voraus [Zeni et al., 1997]. Man spricht heute vom Multiorganversagen wenn zwei oder mehr Organe gleichzeitig oder nacheinander Funktionstörungen aufweisen, wobei ein chronisch persistierendes Organversagen auszuschließen ist. Die Prognose des MOV hängt eng mit der Anzahl der beteiligten Organsysteme zusammen. Die Mortalität beträgt bei Versagen eines Organs innerhalb der ersten 24 Stunden 22%, nach 7 Tagen 41 %. Beim Versagen von drei Organsystemen steigt die Mortalität am ersten Tag auf 80 % und nach 4 Tagen auf 100 % an [Knaus et al., 1985].

Ein wichtiger Pathomechanismus für die Entstehung von MODS und MOV ist die Entwicklung eines systemischen Inflammationssyndromes (SIRS, [Bone et al., 1992]. MODS und MOV können sowohl infektiologischer als auch nicht- infektiologischer Genese sein.

Fieber unklarer Genese: Fieber unklarer Genese (Fever of unknow origin, FUO) ist klinisch definiert als ein Fieber, bei dem die Temperatur über einen Zeitraum von mehr als 3 Wochen höher als 38,8°C ist, ohne dass nach einer einwöchigen Untersuchungszeit eine eindeutige Diagnose der Ursache vorliegt. In Abhängigkeit des Ursprungs wurden vier Klassen des FUO beschrieben: FUO klassischen, nosokomialen, immunschwachen oder HlV-bezogenen Ursprungs [Roth und Basello, 2003]. FUO wurde auch als "eine eher bekannte Krankheit mit einem ungewöhnlichen Erscheinungsbild als eine seltene Störung" geschildert [Amin und Kauffman, 2003].

Nur in 10% der Patienten mit postoperativem Fieber wird eine Infektion dokumentiert [PiIe et al., 2006]. In den meisten Fälle geht die Temperatur des Patienten innerhalb von vier Tagen nach dem Eingriff zurück auf Normaltemperatur. Trotzdem entwickeln einige Patienten am oder nach dem fünften postoperativem Tag eine Infektion, wobei es sich in 12% der Fälle um eine Lungenentzündung handelt. Ebenso wird von PiIe und Kollegen berichtet, dass es sich bei Fieber, welches zwei Tage nach dem Eingriff auftritt, mit hoher Wahrscheinlichkeit um eine Infektion handelt, wie z.B. eine Infektion der Harnwege und/ oder des inneren Unterleibs (Peritonitis), Lungenentzündung oder eine durch einen intravenösen Katheder ausgelöste Infektion.

Untersuchungsfrage: Eine klinische relevante Frage, die für die Behandlung eines Patientes wichtig ist, beispielsweise: Vorhersage des Krankheitsverlaufs, Therapieüberwachung, Fokus der Infektion, Überlebenschancen, Prädisposition, etc.

Eine systemische Infektion ist eine Infektion, bei der sich die Erreger über die Blutbahn im gesamten Organismus ausgebreitet haben.

SIRS: Systemic Inflammatory Response Syndrome, nach Bone [Bone et al., 1992] und Levy [Levy et al., 2003] ein generalisierter, inflammatorischer, nichtinfektiöser Zustand eines Patienten.

Sepsis: Nach Bone [Bone et al., 1992] und Levy [Levy et al., 2003] ein generalisierter, inflammatorischer infektiöser Zustand eines Patienten. Biologische Flüssigkeit: Als biologische Flüssigkeiten im Sinne der Erfindung werden alle Körperflüssigkeiten der Säugetiere, einschließlich des Menschen, verstanden.

Gen: Ein Gen ist ein Abschnitt auf der Desoxyribonukleinsäure (DNA), der die Grundinformationen zur Herstellung einer biologisch aktiven Ribonukleinsäure (RNA) sowie regulatorische Elemente, welche diese Herstellung aktivieren oder inaktivieren, enthält. Als Gene im Sinne der Erfindung werden auch alle abgeleiteten DNA- Sequenzen, Partialsequenzen und synthetische Analoga (beispielsweise Peptido- Nukleinsäuren (PNA)) verstanden. Die auf Bestimmung der Genexpression auf RNA- Ebene bezogene Beschreibung der Erfindung stellt somit ausdrücklich keine Einschränkung sondern nur eine beispielhafte Anwendung dar.

Genlocus: Genlocus (Genort) ist die Position eines Gens im Genom. Besteht das Genom aus mehreren Chromosomen, ist die Position innerhalb des Chromosoms gemeint, auf dem sich das Gen befindet. Verschiedene Ausprägungen oder Varianten dieses Gens werden als Allele bezeichnet, die sich alle an derselben Stelle auf dem Chromosom, nämlich dem Genlocus befinden. Somit beinhaltet der Begriff „Genlocus" einerseits die reine genetische Information für ein spezifisches Genprodukt und andererseits sämtliche regulatorische DNA-Abschnitte sowie sämtliche zusätzliche DNA-Sequenzen, welche mit dem Gen am Genlocus in irgendeinem funktionellen Zusammenhang stehen. Die letzteren schließen an Sequenzregionen an, die in der unmittelbar Nähe (1 Kb) aber außerhalb des 5-' und/oder 3'- Endes eines Genlocus liegen. Die Spezifizierung des Genlocus erfolgt durch die Accession-Nummer und/oder RefSeq ID des RNA-Hauptproduktes, welches von diesem Locus abstammt.

Genaktivität: Unter Genaktivität wird das Maß der Fähigkeit eines Gens verstanden, transkribiert zu werden und/oder Translationsprodukte zu bilden.

Genexpression: Der Vorgang, ein Genprodukt zu bilden und/oder Ausprägung eines Genotyps zu einem Phänotyp. Multigenbiomarker: Kombination von mehreren Gen-Sequenzen deren Genaktivitäten mittels einer Interpretationsfunktion ein kombiniertes Gesamtergebnis (z.B. eine Klassifikation und/oder ein Index) bilden. Dieses Ergebnis ist spezifisch für einen Zustand und/oder eine Untersuchungsfrage.

Hybridisierungsbedingungen: Dem Fachmann wohl bekannte physikalische und chemische Parameter, welche die Etablierung eines thermodynamischen Gleichgewichtes aus freien und gebundenen Molekülen beeinflussen können. Im Interesse optimaler Hybridisierungsbedingungen müssen Zeitdauer des Kontaktes der Sonden- und Probenmoleküle, Kationenkonzentration im Hybridisierungspuffer, Temperatur, Volumen sowie Konzentrationen und -Verhältnisse der hybridisierenden Moleküle aufeinander abgestimmt werden.

Amplifikationsbedingungen: Konstante oder sich zyklisch verändernde Reaktionsbedingungen, welche die Vervielfältigung des Ausgangsmateriales in Form von Nukleinsäuren ermöglichen. Im Reaktionsgemisch liegen die Einzelbausteine (Desoxyribonukleotide) für die entstehenden Nukleinsäuren vor, ebenso wie kurze Oligonukleotide, welche sich an komplementäre Bereiche im Ausgangsmaterial anlagern können, sowie ein Nukleinsäure-Synthese-Enzym, Polymerase genannt. Dem Fachmann wohl bekannte Kationenkonzentrationen, pH-Wert, Volumen und die Dauer und Temperatur der einzelnen Reaktionsschritte sind von Bedeutung für den Ablauf der Amplifikation.

Primer: Als Primer wird in der vorliegenden Erfindung ein Oligonukleotid bezeichnet, das als Startpunkt für Nukleinsäure-replizierende Enzyme wie z. B. die DNA-Polymerase dient. Primer können sowohl aus DNA als auch aus RNA bestehen (Primer3, siehe z.B. http://frodo.wi. mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi des MIT)

Sonde: In der vorliegenden Anmeldung ist eine Sonde ein

Nukleinsäurefragment (DNA oder RNA), das mit einer molekularen Markierung (z.B. Fluoreszenzlabel, insbesondere Scorpion^®, molecular beacons, Minor Groove Binding- Sonden, TaqMan^®-Sonden, Isotopenmarkierung, usw.) versehen werden kann und zur sequenzspezifischen Detektion von Ziel-DNA- und/oder Ziel-RNA- Molekülen eingesetzt wird.

PCR: ist die Abkürzung für die englische Bezeichnung „Polymerase Chain Reaction" (Polymerase-Kettenreaktion). Die Polymerase-Kettenreaktion ist eine Methode, um DNA in vitro außerhalb eines lebenden Organismus mit Hilfe einer DNA-abhängigen DNA Polymerase zu vervielfältigen. PCR wird insbesondere gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt, um kurze Teile - bis zu etwa 3.000 Basenpaare - eines interessierenden DNA-Strangs zu vervielfältigen. Dabei kann es sich um ein Gen oder auch nur um einen Teil eines Gens oder auch um nicht kodierende DNA-Sequenzen handeln. Es ist dem Fachmann wohl bekannt, dass eine Reihe von PCR-Verfahren im Stand der Technik bekannt sind, welche alle durch den Begriff „PCR" mit umfasst sind. Dies gilt insbesondere für die „Real-Time-PCR" (vgl. auch die Erläuterungen weiter unten).

PCR-Primer: Typischerweise benötigt eine PCR zwei Primer, um auf den beiden Einzelsträngen der DNA jeweils den Startpunkt der DNA-Synthese festzulegen, wodurch der zu vervielfältigende Bereich von beiden Seiten begrenzt wird. Derartige Primer sind dem Fachmann wohlbekannt, beispielsweise aus der Website „Primer3", siehe z.B. http://frodo.wi. mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi des MIT.

Transkript: Für die Zwecke der vorliegenden Anmeldung wird unter einem Transkript jegliches RNA-Produkt verstanden, welches anhand einer DNA-Vorlage hergestellt wird.

Small RNA: Kleine RNAs im Allgemeinen. Vertreter dieser Gruppe sind insbesondere, jedoch nicht ausschließlich: a) scRNA (small cytoplasmatic RNA), welche eines von mehreren kleinen RNA-Molekülen im Cytoplasma eines Eukaryonten ist. b) snRNA (small nuclear RNA), eine der vielen kleinen RNA-Formen, die nur im Zellkern vorkommen. Einige der snRNAs spielen beim Spleißen oder bei anderen RNA-verarbeitenden Reaktionen eine Rolle. c) small non-protein-codinq RNAs₁ welche die sogenannten small nucleolar RNAs (snoRNAs), microRNAs (miRNAs), Short interfering RNAs (siRNAs) und small double-stranded RNAs (dsRNAs) einschließen, welche die Genexpression auf vielen Ebenen, einschließlich der Chromatin-Architektur, RNA-Editierung, RNA- Stabilität, Translation und möglicherweise auch Transkription und Spleißen. Im Allgemeinen werden diese RNAs auf mehrfachem Wege prozessiert aus den Introns und Exons längerer Primärtranskripte, einschließlich proteincodierender Transkripte. Obwohl etwa nur 1 ,2% des Humangenoms Proteine codiert, wird ein großer Teil dennoch transkribiert. Tatsächlich bestehen ca. 98% der in Säugern und Menschen gefundenen Transkripte aus non-protein-coding RNAs (ncRNA) aus Introns von proteincodierenden Genen und den Exons und Introns von nicht proteincodierenden Genen, einschließlich vieler, welche anti-sense zu proteincodierenden Genen sind oder mit diesen überlappen. Small nucleolar RNAs (snoRNAs) regulieren die sequenzspezifische Modifikation von Nukleotiden in Target-RNAs. Hierbei treten zwei Typen von Modifikationen auf, nämlich 2'-O-Ribosemethylierung und Pseudouridylierung, welche durch zwei große snoRNA-Familien reguliert werden, die einerseits box C/D-snoRNAs und andererseits box H/ACA snoRNAs genannt werden. Derartige snoRNAs weisen eine Länge von etwa 60 bis 300 Nukleotiden auf. miRNAs (microRNAs) und siRNAs (short interfering RNAs ) sind noch kleinere RNAs mit im Allgemeinen 21 bis 25 Nukleotiden. miRNAs stammen aus endogenen kurzen Hairpin-Vorläuferstrukturen und benutzen gewöhnlich andere Loci mit ähnlichen - jedoch nicht identischen Sequenzen als Ziel translationaler Repression. siRNAs entstehen aus längeren doppelsträngigen RNAs oder langen Hairpins, oftmals exogenen Ursprungs. Sie haben gewöhnlich homologe Sequenzen an demselben Locus oder woanders im Genom zum Ziel, wo sie am sogenannten gene silencing, ein Phänomen, welches auch RNAi genannt wird, beteiligt sind. Die Grenzen zwischen miRNAs und siRNAs sind jedoch fließend. d) Zusätzlich kann der Begriff "small RNA" auch sogenannte transposable Elemente (TEs) und insbesondere Retroelemente umfassen, welche ebenfalls für die Zwecke der vorliegenden Erfindung unter dem Begriff „small RNA" verstanden werden.

RefSeq ID: Diese Bezeichnung bezieht sich auf Einträge in der NCBI Datenbank (www.ncbi.nlm.nih.gov). Diese Datenbank liefert nicht-redundante Referenz-Standards zu genomischer Information. Diese genomischen Informationen schließen unter anderem Chromosomen, mRNAs, RNAs und Proteine ein. Jede RefSeq ID stellt ein einzelnes, natürlich vorkommendes Molekül eines Organismus dar. Die biologischen Sequenzen, die eine RefSeq repräsentieren, sind von GenBank Einträgen (ebenfalls NCBI) abgeleitet, sind aber eine Zusammenstellung von Informationselementen. Diese Informationselemente stammen aus Primär-Forschung auf DNA-, RNA- und Proteinebene.

Accession-Nummer: Eine Accession-Nummer stellt die Eintragsnummer eines Polynukleotides in der dem Fachmann bekannten NCBI-GenBank dar. In dieser Datenbank werden sowohl RefSeq ID's als auch weniger gut charakterisierte und redundante Sequenzen als Einträge verwaltet und der Öffentlichkeit zugänglich gemacht (www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/index.html).

Abkürzungen

AUC (area under curve) Fläche unter der Kurve

CRP C-reaktives Protein

CV (cross validation) Kreuzvalidierung

DLDA diagonale lineare Diskriminanzanalyse

(diagonal linear discriminant analysis) Klasssifikationsverfahren GPLS (generalized partial least Squares) verallgemeinerte partielle kleinste

Quadrate (Klassifikationsverfahren)

IQR (inter quartile ränge) Abstand zwischen dem 75% und 25%

Perzentil kNN (k nearest neighbours) k-nächste Nachbarn

(Klassifikationsverfahren) LDA (linear discriminant analysis) lineare Diskriminanzanalyse

(Klassifikationsverfahren)

MAD Normalisierungsverfahren

(Median of the absolute deviation of the Median) NPV (negative predictive value) negativer prädikativer Wert (Anteil der korrekt negativen Tests)

OR Odd Ratio

PCT Procalcitonin

PPV (positive predictive value) positiver prädikativer Wert (Anteil der korrekt positiven Tests)

RF (random forests) Klassifikationsverfahren

ROC (receiver Operator characteristics) Abbildung zur Darstellung von

Klassifikationsergebnissen Sensitivität Anteil der korrekten Tests in der

Gruppe mit vorgegebenener

Erkrankung (infektiöse SIRS bzw.

Sepsis) Spezifizität Anteil der korrekten Tests in der

Gruppe ohne vorgegebenene

Erkrankung (nicht-infektiöse SIRS) SVM (support vector machines) Klassifikationsverfahren

Für eine schnelle Diagnosik hat sich in der Praxis herausgestellt, dass Echtzeitoder Real-Time-Amplifikationsverfahren die bevorzugten Verfahren sind. Daher werden im Folgenden die Grundlagen, welche dem Fachmann wohlbekannt sind, kurz im Hinblick auf ihre Bedeutung für die vorliegende Erfindung zusammengefaßt.

Andere, dem Fachmann bekannten Verfahren, wie z.B. Sequenzierung, Mikroarray basierte Methoden, NASBA usw. sind ebenfalls möglich.

Mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist es möglich, spezifische Sequenzbereiche aus geringsten Ausgangsmengen von Nukleinsäuren in-vitro und zudem schnell zu amplifizieren, um sie so einer Analyse oder Weiterverarbeitung zugänglich zu machen. Ein doppelsträngiges DNA-Molekül wird durch Hitzeeinwirkung aufgeschmolzen (denaturiert). Die Einzelstränge dienen in der Folge als Matrize für die enzymatisch katalysierte Polymerisation von Desoxyribonukleotiden, wodurch wieder doppelsträngige DNA-Moleküle entstehen. Die als Primer bezeichneten Oligodesoxyribonukleotide definieren dabei den zu kopierenden Sequenzabschnitt, indem sie an Orten komplementärer Sequenz mit der Ziel-DNA hybridisieren und als Starter für die Polymerisation dienen. Der Prozess exponentieller Produktbildung wird von verschiedenen Faktoren begrenzt. Im Laufe der PCR geht die Netto-Produktbildung daher schließlich auf Null zurück und die Gesamtmenge an PCR-Produkt erreicht einen Plateauwert.

Geeignete PCR-Primer sind beispielsweise Primer mit den Sequenzen der SEQ ID NO: 687 bis SEQ ID NO: 742. Es ist dem Fachmann jedoch bekannt, dass eine Vielzahl weiterer Primer zur Ausführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann.

Seit ihrer Einführung in das molekularbiologische Methodenspektrum wurde eine nahezu unüberschaubare Vielzahl von technischen Varianten entwickelt. Heute ist die PCR eine der wichtigsten Methoden in der molekularen Biologie und der molekularen Medizin. Heute findet sie Verwendung in einem überaus breiten thematischen Spektrum, z. B. beim Nachweis von Viren oder Keimen, bei der Sequenzierung, dem Verwandtschaftsnachweis, der Erstellung von Transkriptionsprofilen und der Quantifizierung von Nukleinsäuren [Valasek und Repa, 2005; Klein, 2002]. Zudem lassen sich mit Hilfe der PCR in einfacher Weise beliebige Sequenzabschnitte des Nukleinsäurebestandes eines Organismus klonieren. Die Vielzahl entwickelter PCR-Varianten ermöglicht u. a. eine zielgerichtete oder zufällige Veränderung der DNA-Sequenz sowie sogar die Synthese größerer, in dieser Form zuvor nicht existenter Sequenzabfolgen.

Mit diesem klassischen Verfahren lassen sich hochsensitiv DNA und über die reverse Transkription (RT) auch RNA qualitativ nachweisen [Wong et al., 2005; Bustin 2002]. Eine Weiterentwicklung dieser Methode ist die Real-Time-PCR, die erstmals 1991 vorgestellt wurde und neben qualitativen Aussagen auch eine Quantifizierung ermöglicht.

Real-Time-PCR, auch quantitative PCR (qPCR) genannt, ist eine Methode zur Detektion und Quantifizierung von Nukleinsäuren in Echtzeit [Nolan et al., 2006]. In der Molekularbiologie gehört sie bereits seit einigen Jahren zu den etablierten Standardtechniken.

Im Gegensatz zur PCR findet hier die Detektion bereits während der Amplifikation statt. Basierend auf Fluoreszenz-markierten Sonden, den Fluorophoren, kann die Amplifikation in Echtzeit verfolgt werden. In jedem Reaktionszyklus nehmen die fluoreszierenden PCR-Produkte und damit die Intensität der lichtinduzierten Fluoreszenz-Emission zu. Da die Zunahme der Fluoreszenz und die Menge an neusynthetisierten PCR-Produkten über einen weiten Bereich proportional zueinander sind, kann aus den gewonnenen Daten die Ausgangsmenge des Templates bestimmt werden. Eine gelelektrophoretische Auftrennung der Amplifikate ist nicht mehr erforderlich. Die Ergebnisse sind direkt verfügbar, was eine deutliche Zeitersparnis mit sich bringt. Da die Reaktionen in geschlossenen Gefäßen ablaufen, und nach dem Start der PCR keine weiteren Pipettierschritte erforderlich sind, reduziert sich das Kontaminationsrisiko auf ein Minimum. Als Fluorophore werden entweder nukleinsäure-bindende Fluoreszenzfarbstoffe wie SYBRGreen oder sequenzspezifische Fluoreszenzsonden wie Taq-Man-Sonden, LightCycler-Sonden und Molecular Beacons eingesetzt [Kubista et al., 2006]. SYBRGreen ist ein Farbstoff, dessen Fluoreszenz stark zunimmt, sobald das Molekül an doppelsträngige DNA bindet. Diese kostengünstige Lösung ist besonders bei der parallelen Durchführung mehrerer Reaktionen mit unterschiedlichen Primerpaaren geeignet. Nachteile liegen in der geringen Spezifität, da SYBRGreen sequenzunspezifisch an jede doppelsträngige DNA bindet, sowie darin, dass keine Multiplex-Messungen durchgeführt werden können. Mit Hilfe einer Schmelzkurvenanalyse kann nach erfolgter PCR allerdings zwischen dem Zielprodukt und unspezifischer DNA differenziert werden: In Abhängigkeit der Nukleotidlänge und -Zusammensetzung zerfällt jeder DNA-Doppelstrang bei einer für ihn charakteristischen Temperatur, der Schmelztemperatur, in seine zwei Einzelstränge. Da die doppelsträngige DNA von spezifischen PCR-Produkten einen höheren Schmelzpunkt hat als unspezifisch entstehende Primerdimere, ist eine Unterscheidung anhand der Fluoreszenzabnahme bei Zunahme der Temperatur möglich.

Im Gegensatz dazu ist der Nachweis mit fluoreszenzbasierten Sonden hochspezifisch, aber auch sehr kostenintensiv. Beim TaqMan-Prinzip enthält der PCR-Ansatz neben den PCR-Primern eine sequenzspezifische TaqMan- Hybridisierungssonde, die über einen Quencher und einen Reporterfarbstoff verfügt. Die Sonde ist komplementär zu einer Sequenz, die zwischen den Primern liegt. In freier Lösung wird die Fluoreszenz durch die räumliche Nähe des Quenchers unterdrückt. Nach dem FRET-(Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer)-Prinzip schluckt der Quencher die Fluoreszenzemission des angeregten Fluorophors. Hybridisiert diese Sonde jedoch mit der Zielsequenz, wird sie während der PCR von der Taq-Polymerase hydrolysiert, der Reporterfarbstoff wird räumlich vom Quencher entfernt und emittiert bei Anregung detektierbare Fluoreszenz. Beim LightCycler- Prinzip enthält der PCR-Ansatz neben den PCR-Primern zwei fluoreszenz-markierte Sonden (Donor- und Akzeptor- Fluoreszenzfarbstoff). Ein nach außen hin messbares Fluoreszenzsignal entsteht nur bei unmittelbar benachbarter Hybridisierung der beiden Sonden mit der spezifischen Zielsequenz. Im Rahmen einer anschließenden Schmelzkurvenanalyse können sogar das Vorliegen und die Art einzelner Punktmutationen innerhalb der Hybridisierungsbereiche der Sonden detektiert werden. Ein weiteres Beispiel sind die Molecular Beacons. Diese Oligonukleotide enthalten am 5^'- und 3^'-Ende zueinander komplementäre Sequenzen, die in ungebundenem Zustand hybridisieren und eine Haarnadelstruktur bilden. Reporterfluorophor und Quencher, lokalisiert an beiden Enden, sind so in direkter Nachbarschaft. Erst wenn die Sonde am Templat bindet, werden die beiden Farbstoffe räumlich getrennt, so dass nach Anregung wieder Fluoreszenz messbar ist. Scorpion- und Sunrise-Primer bilden zwei weitere Modifikationen für sequenzspezifische Sonden [Whitcombe et al,. 1999].

Die quantitative Bestimmung eines Templates kann mittels absoluter oder relativer Quantifizierung erfolgen. Bei der absoluten Quantifizierung findet die Messung anhand externer Standards, z.B. Plasmid-DNA in unterschiedlichen Verdünnungen, statt. Die relative Quantifizierung nutzt dagegen so genannte Housekeeping- oder Referenzgene als Referenz [Huggett et al., 2005]. Diese Referenzgene werden konstant exprimiert und bieten damit die Möglichkeit zur Normierung unterschiedlicher Expressionsanalysen. Die Auswahl der Housekeepinggene muss für jedes Experiment individuell erfolgen. Für die vorliegende Erfindung werden bevorzugt Housekeepinggene mit den Sequenzen der SEQ-ID NO: 676 bis SEQ-ID NO: 686 verwendet.

Die generierten Experiment-Daten werden mit Hilfe der geräteeigenen Software ausgewertet. Für die grafische Darstellung wird die gemessene Fluoreszenzintensität gegen die Anzahl der Zyklen aufgetragen. Die resultierende Kurve unterteilt sich dabei in drei Bereiche. In der ersten Phase, also zu Beginn der Reaktion, überwiegt noch das Grundrauschen, ein Signal des PCR-Produktes ist noch nicht nachweisbar. Die zweite Phase entspricht der exponentiellen Wachstumsphase. In diesem Segment verdoppelt sich das DNA-Template annähernd in jedem Reaktionsschritt. Entscheidend für die Auswertung ist der Zyklus, bei dem detektierbare Fluoreszenz auftritt und die exponentielle Phase der Amplifikation beginnt. Dieser Threshold- Cycle(CT)-Wert oder auch Crossing Point liefert die Basis für die Berechnung der Ausgangsmenge an vorhandener Ziel-DNA. So ermittelt die Software bei einer absoluten Quantifizierung die Crossing Points der unterschiedlichen Referenz- Verdünnungen und quantifiziert anhand der errechneten Standardkurve die Template-Menge. In der letzten Phase erreicht die Reaktion schließlich ein Plateau.

Die quantitative PCR ist ein wichtiges Werkzeug für Genexpressionsstudien in der klinischen Forschung. Mit der Möglichkeit, mRNA exakt zu quantifizieren, lassen sich bei der Suche nach neuen Wirkstoffen die Auswirkungen bestimmter Faktoren auf Zellen analysieren, die Differenzierung von Vorläuferzellen in verschiedene Zelltypen beobachten oder die Genexpression in Wirtszellen als Antwort auf Infektionen nachverfolgen. Durch den Vergleich von Wildtyp- und Krebszellen auf RNA-Ebene können in der Zellkultur Gene identifiziert werden, die einen entscheidenden Einfluss auf Krebsentstehung haben. In der Routine-Labordiagnostik wird Real-Time-PCR vorrangig zum qualitativen und quantitativen Nachweis von Viren und Bakterien eingesetzt. In der klinischen Routine, insbesondere im Bereich der Intensivmedizin, braucht der Arzt einen schnellen und eindeutigen Befund. Auf Basis der Real-Time-PCR können Tests durchgeführt werden, die noch am gleichen Tag das Ergebnis liefern. Hiermit begründet sich ein enormer Fortschritt für die klinische Diagnostik der Sepsis.

Neben den hier beschriebenen technischen Varianten der PCR-Methode können auch sogenannte isothermale Amplifikationsverfahren wie beispielsweise NASBA oder SDA oder andere technische Varianten für die der Detektion vorausgehenden Vervielfältigung der Zielsequenz verwendet werden.

Ein bevorzugtes Verfahren zur Wahl der Multigenbiomarkersequenzen umfaßt die folgenden Schritte:

a. Patientenauswahl basiert auf dem extremen Gruppenverfahren;

b. Generierung von mindestens einem Multigenbiomarker;

c. Bestimmung finaler Multigenbiomarker. Ein bevorzugtes Verfahren des dem „in vitro Diagnostic multivariate index assay" ähnlichen Tests umfaßt die folgenden Schritte:

a. Isolierung von Proben-Nukleinsäuren aus einer von einem Patienten stammenden Probe;

b. Erfassung von Genaktivitäten mittels Sequenzen von wenigstens einem Zustands- und/oder Untersuchungsfragespezifischen Multigenbiomarkers;

c. Erfassung von Genaktivitäten für wenigstens ein internes Referenzgen um die in b) erfassten Genaktivitäten zu normalisieren;

d. Verwendung einer Interpretationsfunktion für die in c) normalisierten Genaktivitäten um einen Zustands- und/oder Untersuchungsfrage-spezifischen Index abzuleiten.

Als technische Kontrolle werden zweckmäßig auch die Genaktivitäten von Kontrollgenen bestimmt, beispielsweise solchen mit den Sequenzen der SEQ ID NO: 670 bis SEQ ID NO: 675.

Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung liegt auch in einer Verwendung, bei welcher die Genaktivitäten mittels eines Hybridisierungsverfahrens, insbesondere auf wenigstens einem Mikroarray, bestimmt werden. Der Vorteil eines Mikroarrays liegt in der höheren Informationsdichte des Biochips im Vergleich zu den Amplifikationsverfahren. So ist es z.B. mühelos möglich, auf einem Mikroarray mehrere 100 Sonden bereitzustellen, um in einem einzigen Untersuchungsgang mehrere Fragestellungen gleichzeitig zu untersuchen.

Die mittels der Erfindung erhaltenen Genaktivitätsdaten können auch vorteilhaft für die elektronische Weiterverarbeitung, z. B. zur Aufzeichnung in der elektronischen Krankenakte verwendet werden. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung besteht in der Verwendung von rekombinant oder synthetisch hergestellten, spezifischen Nukleinsäuresequenzen, Partialsequenzen, einzeln oder in Teilmengen, als Multigenbiomarker in Sepsis- Assays und/oder zur Bewertung der Wirkung und Toxizität beim Wirkstoffscreening und/oder zur Herstellung von Therapeutika und von Stoffen und Stoffgemischen, die als Therapeutikum vorgesehen sind, zur Vorbeugung und Behandlung von SIRS und Sepsis.

Für die erfindungsgemäßen Verfahren (Arraytechnik und/oder Amplifikationsverfahren) wird die Probe ausgewählt aus: Gewebe, Körperflüssigkeiten, insbesondere Blut, Serum, Plasma, Urin, Speichel oder Zellen oder Zellkomponenten; oder eine Mischung davon.

Es ist bevorzugt, dass Proben, insbesondere Zellproben, einer lytischen Behandlung unterzogen werden, um deren Zellinhalte freizusetzen.

Offenbart werden hierzu Polynukleotidsequenzen von SEQ-ID NO: 1 bis SEQ-ID NO: 669 aus Blut und Blutzellen sowie daraus abgeleitete Sonden, welche zur Erstellung von Multigenbiomarkern verwendet werden können (vgl. Tab. 32).

Tab. 1 1 und 16 zeigen beispielhaft eine Sequenzauswahl für Multigenbiomarker für die Unterscheidung von infektiösen/nicht infektiösen Zuständen, und Tab. 20 und 21 zeigen beispielhaft eine Sequenzauswahl für Multigenbiomarker zur Unterscheidung von gram-positiven und gram-negativen Infektionen.

Es ist dem Fachmann klar, dass die in den Ansprüchen dargelegten einzelnen Merkmale der Erfindung ohne Einschränkung beliebig miteinander kombinierbar sind.

Klassifikationsmethoden

Die Theorie des Lernens spielt eine Schlüsselrolle auf dem Gebiet der Statistik, Datenanalyse und künstlichen Intelligenz mit zahlreichen Anwendungen in Ingenieurwissenschaften. Klassifikationsverfahren werden hauptsächlich bei 2 unterschiedlichen Aufgaben verwendet, bei der Abgrenzung von vorher unbekannten Klassen (unüberwachtes Lernen, class discovery) und bei der Zuordnung von bestimmten Daten/Proben/Patienten zu einer bereit definierten Klasse (Klassenvorhersage, class prediction) [Golub et al., 1999].

In der Klassenvorhersage werden Daten/Proben/Patienten benutzt, die bereits existierenden bzw. definierten Klassen/Gruppen zugeordnet wurden (so genannter Trainingsdatensatz), um ein analytisches Verfahren (Klassifikationsalgorithmus) zu entwickeln, das die Unterschiede zwischen den Gruppen widerspiegelt. Unabhängige Proben (sogenannter Testdatensatz) werden verwendet, um die Trennungsgüte der Klassifikationsregel zu bewerten. Die Vorgehensweise kann in folgende Schritte eingeteilt werden:

1. Definiere einen idealen Daten/Proben/Patientensatz, um charakteristische Profile der zu detektierenden Gruppen zu bekommen.

2. Jede Gruppe wird dann geteilt, so dass 2 gleichwertige Teilmengen, ein Trainingsdatensatz und ein Testdatensatz, entstehen.

3. Profile für den Trainingsdatensatz enthalten idealerweise Daten, die eine maximale Differenz zwischen den Gruppen widerspiegeln.

4. Die Differenz zwischen den Gruppen wird mittels geeigneter Abstandsmaße quantifiziert und anhand eines Algorithmus bewertet. Dieser Algorithmus sollte zu einer Klassifikationsregel führen, die mit der höchsten Spezifität und Sensitivität die Daten in die richtige Klasse einordnet. Typische Vertreter solcher Algorithmen aus dem Bereich des überwachten Lernens sind die Diskriminanzanalyse (DA), Random Forests (RF), Generalized Partial Least Squares (GPLS), Support Vector Machines (SVM) oder k-Nearest Neighbors (kNN).

5. Abschließend wird die Güte der Klassifikationsregel am Testdatensatz geprüft.

Definitionen:

Diskriminanzanalyse (DA): Bei der linearen Diskriminanzanalyse erhalten wir eine lineare, bei der quadratischen Diskriminanzanalyse (QDA) eine quadratische Diskriminanzfunktion. Die Diskriminanzfunktion bestimmt sich aus der Kovarianzmatrix und den Gruppenmittelwerten. Im Fall der quadratischen Diskriminanzanalyse wird zusätzlich angenommen, dass auch die Kovarianzmatrix zwischen den Gruppen variiert [Hastie et al.,2001 ].

Random Forests (RF): Die Klassifikation mittels Random Forests basiert auf der Kombination von Entscheidungsbäumen, [Breiman, 2001 ]. Der Ablauf des Algorithmus ist etwa folgendermaßen:

1. Wähle durch Ziehen mit Zurücklegen einen Trainingsdatensatz aus (Out-of-bag data).

2. An jedem Knoten des Entscheidungsbaums wähle zufällig Variablen aus. Berechne mit diesen Variablen die beste Aufteilung des Trainingsdatensatzes auf die Klassen.

3. Nachdem alle Entscheidungsbäume generiert wurden, fass die Klassenzuordnungen der einzelnen Entscheidungsbäume zu einer Klassenzuordnung zusammen.

Generalized Partial Least Squares (GPLS): Bei dem Generalized Partial Least Squares [Ding und Gentleman, 2004] Verfahren handelt es sich um eine sehr flexible Verallgemeinerung des multiplen Regressionsmodells. Aufgrund der großen Flexibilität kann diese Methode auch in vielen Situationen angewendet werden, in denen das klassische Modell versagt.

Support Vector Machine (SVM): Beim Support Vector Machine Klassifikator handelt es sich um einen verallgemeinerten linearen Klassifikator. Die Eingabedaten werden in einem höher dimensionalen Raum abgebildet und in diesem Raum wird eine optimale trennende (Hyper-)Ebene konstruiert. Diese im höherdimensionalen Raum linearen Schranken transformieren sich zu nichtlinearen Schranken im Raum der Eingabedaten, [Vapnik, 1999].

k-nächsten Nachbarn (k-Nearest Neighbors, kNN): Bei der Methode der k- nächsten Nachbarn, wird die Klassenzugehörigkeit einer Beobachtung (eines Patienten) anhand der sich in seiner Umgebung befindlichen k-nächsten Nachbarn entschieden. Die Nachbarschaft wird dabei in der Regel mit Hilfe des euklidischen Abstands bestimmt und die Klassenzugehörigkeit dann anhand eines Mehrheitsvotums entschieden [Hastie et al., 2001 ].

Im Folgenden ist ein generelles Konzept beschrieben, wie die erfindungsgemäßen Verfahren durchgeführt werden. Dabei ist dem Fachmann wohbekannt, dass geringfüge Anpassungen der statistischen Verfahren erforderlich sein können, wenn andere Patientenkollektive und/oder andere Fragestellungen untersucht werden sollen. Für die Generierung des Trainings- und des Testsdatensatzes werden verschiedene statistische Verfahren (Oiskriminanzanalyse und/oder Random Forests u.a.) sowie Strategien verwendet (einfache und mehrfache Kreuzvalidierung, zufällige Bootstrapstichproben u.a.)

Basierend auf Mikroarray-Expressionsdaten sollte ein Verfahren zur Bestimmung eines Multigenbiomarkers entwickelt werden, der eine infektiöse Komplikation wie beispielsweise Sepsis widerspiegelt. Der Biomarker und der zugehörige Index-Wert, auch „Score" genannt, bilden die Grundlage eines sogenannten „in vitro Diagnostic multivariate Index Assays" [IVDMIA, FDA- Guidelines, 2003] zur Verbesserung der Diagnose systemischer Infektionen. Die aus dem Verfahren resultierende Klassifikationsregel sollte insbesondere eine Differenzierung von SIRS-und Sepsis-Patienten mit - im Vergleich zum etablierten Biomarker Procalcitonin - verbesserter Sensitivität und Spezifität ermöglichen, ist jedoch nicht auf diese Fragestellung beschränkt.

Zur Entwicklung eines solchen Multigenbiomarkers sind die folgenden Schritte notwendig: 1. Schritt: Traininqsdatensatz. Um den Zusammenhang zwischen einer Genexpression bestimmter Gene und der untersuchten Erkrankung aufzudecken, werden Populationen (Kohorten) definiert, die ihr Vorhanden- bzw. NichtVorhandensein am deutlichsten repräsentieren. Bei der Diagnose einer infektiösen Komplikation werden üblicherweise Sepsis-Patienten (infektiös) und Patienten mit einer sogenannten sterilen SIRS (nichtinfektiös) in die Studie aufgenommen. Entsprechend dieser Festlegung wird ein Plan zur Sammlung bzw. Auswahl der zugehörigen RNA-Proben festgelegt. Von den ausgewählten Proben werden die Genexpressionsprofile auf einer geeigneten Plattform gemessen, vorverarbeitet und einer Qualitätskontrolle unterzogen. Systematische Messfehler werden korrigiert und Ausreißer eliminiert.

2. Schritt: Genvorauswahl. Bei der Generierung eines formalen Klassifikators auf der Basis von Mikroarray-Daten ist die Genvorauswahl ein Schlüsselschritt, da nur ein geringer Anteil der gemessenen Gene einen Beitrag zur Gruppenunterscheidung leistet. Auch die meisten Klassifikationsverfahren setzen eine Genselektion voraus. Durch eine präzise Genauswahl kann das Klassifikationsverfahren so einfach wie möglich gestaltet und eine Überanpassung an die Trainingsdaten (Overfitting) vermieden werden. Zur Vorauswahl der Klassifikationsgene werden geeignete Filteroptionen wie die Schwelle der statistischen Inferenz, der minimale akzeptierte Abstand zwischen den Gruppen, die minimale Signalintensität u. a. festgelegt. Nur Gene, die solche Bedingungen erfüllen, werden für die Klassifikation betrachtet.

3.Schritt: Klassifikationsverfahren. Verschiedene Klassifikationsverfahren werden bzgl. ihrer Trennfähigkeit hinsichtlich der zu differenzierenden pathophysiologischen Zustände getestet. Dazu werden Methoden der Cross- Validierung verwendet. Ein Klassifikationsverfahren mit dem kleinsten Klassifikationsfehler wird ausgewählt, wobei die kleinste notwendige Anzahl von Genen gleich mitbestimmt wird. Als sinnvolle Regel hat sich herausgestellt, dass die Anzahl der Gene immer kleiner sein soll als die Anzahl der Proben im Trainingsdatensatz, um eine Überanpassung zu vermeiden. Abschließend wird die resultierende Klassifikationsregel definiert.

Patientenauswahl Die Patientenauswahl ist bei der Aufstellung des Trainingsdatensatzes bedeutsam. In einer Vorstudie im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde vorerst eine Sensitivität von ca. 75 % im Trainings-und ca. 65 % im Testdatensatz erreicht. Diese relativ geringe Klassifikationsgüte ließ sich aber nicht durch die schwache Optimierung des Klassifikators, sondern durch die nicht ausreichend präzise Auswahl von Sepsis-Patienten erklären. Dementsprechend wurden Sepsis-Patienten nach einer Peritonitis viel häufiger richtig klassifiziert als Sepsis-Patienten nach einer „VAP" (Ventilator-Associated Pneumonia). Tatsächlich liegt die infektiöse Komplikation nach einer Peritonitis an sich vor. Dagegen lässt sich bei VAP eine wirkliche Infektion von einer Kolonisation nur schwer unterscheiden [Mayhall, 2001 ].

Um die Güte der Patientenauswahl zu bewerten, kann das Prinzip der sogenannten Extremgruppen nützlich sein. Danach werden in einer Studie nur solche Patientengruppen berücksichtigt, die den untersuchten Effekt möglichst deutlich abbilden. Dabei repräsentieren die ausgewählten Stichproben einen idealisierten Fall, in dem viele in der Praxis auftretende Effekte (z.B. die Häufigkeit der Erkrankung) nicht berücksichtigt werden. Von Liu [Liu et al., 2005] wurde vorgeschlagen, für den Trainingsdatensatz eines auf Mikroarrays basierten Klassifikators Extremgruppen zu bilden. Am Beispiel der Überlebensanalyse von Krebspatienten wurde gezeigt, dass die Anwendung von extremen Gruppen (Patienten, die nach kurzer Zeit gestorben sind vs. Patienten, die lange überlebt haben) zu einer besseren Vorauswahl von Klassifikationsgenen und einer höheren Klassifikationgüte geführt hat, auch wenn der Trainingdatensatz aus weniger Profilen (Patienten) bestand, als im üblichen Fall, wenn alle Patienten (auch mit mittleren Überlebenszeiten) berücksicht wurden.

Im Folgenden wird ausgeführt, wie weit die Patientenauswahl die Generierung eines Multigenbiomarkers zur Diagnose der infektiösen Komplikation beeinflussen kann. In einer Studie der Anmelderin wurden Patienten, die nach einem schweren operativen Eingriff eine Sepsis entwickelt haben, untersucht. Es wurden Proben vom ersten Tag der Sepsis-Diagnose mit der Probe vom ersten post-operativen Tag verglichen. Die hier signifikant differentiell exprimierten Gene spiegeln aber einen Mischeffekt wider; die infektiöse Komplikation wird verdeckt durch Effekte wie Erholung nach dem operativen Stress oder die post-operative Behandlung. In der bereits erwähnten Pilotstudie wurden die Patienten mit einer klinischen (nicht immer mikrobiologisch gesicherten) Sepsisdiagnose in die Trainingspopulation eingeschlossen, was zu einer Durchmischung der beiden untersuchten Gruppen (Septiker und Kontrollen) führte und die Sensitivität verschlechterte. In dem Ausführungsbeispiel der US-Patentanmeldung Nr. 20060246495 wurde für die Auswahl der Sepsisgruppe ebenfalls die klinische Sepsisdiagnose verwendet. Darüber hinaus wurde die Schwere der Erkrankung zwischen der Gruppe der Sepsispatienten und der Kontrollgruppe der SIRS-Patienten nicht berücksichtigt. Dies kann der Grund der geringen Klassifikationsgüte und ihrer Abhängigkeit vom Klassifikationsalgorithmus sein. In die Studie von Johnson [Johnson et al., 2007] wurden Patienten nach einem Trauma in zwei Gruppen aufgeteilt, mit einer infektiösen Komplikation und ohne eine Infektion. Der Vorteil dieser Studie war, dass Patienten der beiden Gruppen sich in Komorbidität und Vorbehandlung wenig unterschieden. Die Vorauswahl ist aber nicht für alle Sepsispatienten repräsentativ und die Verallgemeinerung des hier aufgedeckten sepsisrelevanten Genexpressionsmusters auf Patienten mit anderem Hintergrund (auf andere Risikogruppen) ist nicht selbstverständlich. Im Allgemeinen muss davon ausgegangen werden, dass in Studien mit verschiedenen Risikogruppen auch verschiedene Klassifikatoren generiert werden müssen. In der Studie von Tang [Tang et al., 2007a] wurde das Prinzip der Extremgruppen indirekt angewandt, in dem nur Patienten mit einer mikrobiologisch gesicherten Sepsis-Diagnose im Trainingsdatensatz berücksichtigt wurden. Der Proben-Sammelplan führte aber zu einer kleinen Kontrollgruppe (ein Drittel der Proben: 14 aus 44). Dementsprechend wurde im Training eine Spezifität von 77% und in einem unabhängigen Testdatensatz (unter mehr realen Bedingungen) von lediglich 60% erreicht. Die Beschreibung der Patientengruppen in der SIRS-Lab Studie und der Studie von Tang [Tang et al., 2007a] lässt einen weiteren Einflussfaktor erkennen. Sie zeigt, dass die bzgl. des Infektionsfokus heterogenen Sepsisgruppen nicht ausbalanciert sind, sondern dass Gruppen mit verschiedenen Infektionsfoci unterschiedlich vertreten sind. Tatsächlich ist im Großteil der Fälle auf der Intensivstation (ITS) die Lunge (ca. 45-50 %) oder der Abdomen (ca. 25%) der Fokus der Infektion bei einer Sepsisdiagnose. Dementsprechend sind diese Patientengruppen in den Untersuchungen überrepräsentiert, viele andere Foci kommen dann nur vereinzelt vor. Ähnlich sind in den Kontrollgruppen insbesondere postoperative und Traumapatienten vertreten und andere Risikogruppen sind nur durch einzelne Patienten vertreten. Die dargestellte Analyse zeigt, dass in allen Studien die ausgewählten Patientengruppen die infektiöse Komplikation nicht eindeutig abbilden, wodurch die Klassifikationsschwächen erklärt werden können. Andererseits wird aus der Zusammenfassung deutlich, dass es bei der infektiösen Komplikation kaum möglich ist, alle Einflussfaktoren bei der Auswahl der Patientengruppen zu berücksichtigen. Aus diesem Grund wird der folgende Weg zur Patientenauswahl für den Trainingsdatensatz vorgeschlagen. Allqemeines zu Material und Methoden der vorliegenden Erfindung:

Patientenauswahl

Die Auswahl der repräsentativen Stichproben stand im Mittelpunkt des beschriebenen Verfahrens. Es wurden in den Trainingsdatensatz Patienten mit einer mikrobiologischen gesicherten bzw. ausgeschlossenen Infektionsdiagnose aus jeweils zwei der am besten repräsentierten Sepsis- bzw. Kontrollsubgruppen eingeschlossen. Damit wird das Prinzip der Extremgruppen nicht nur für den Haupteffekt (infektiös vs. nicht infektiös) sondern auch für die Kontrolle der wichtigsten Einflussgrössen (Schichtung von Populationen) angewandt. Der Vorteil dieser Auswahl ist vorerst, dass man hier einen Klassifikator für die häufigsten Risiko bzw. Erkrankungsgruppen generiert. Darüber hinaus wird erwartet, dass sich ein Klassifikator, der die systemische Infektion für wenige aber sehr unterschiedliche Subgruppen widerspiegelt, sich auf weitere Patientengruppen anwenden lässt. Bei der Auswahl der Trainingsdaten wurde wie folgt vorgegangen. In die Patientendatenbank der Anmelderin wurden im Zeitrahmen von zweieinhalb Jahren 400 ITS-Patienten aufgenommen, bei denen ein Sepsis-Risiko vermutet wurde, und die zugehörigen klinischen Daten über den gesamten Aufenthalt detailliert dokumentiert. Die RNA-Proben wurden über ca. 7-14 Sepsis-relevante Tage gesammelt. In Annäherung an das PIRO-Konzept [Levy et al., 2003] wurden die Patienten retrospektiv nach folgenden Kriterien stratifiziert: (i) welche Indikation führte zur der Übernahme auf die Intensivstation (postoperative Komplikation, Trauma bzw. Polytrauma, akuter Sepsisverdacht), (ii) wurde eine infektiöse Komplikation diagnostiziert, was war der Infektionsfokus, (iii) wie war die Reaktion des Organismus (Anzahl der vorhanden SIRS-Kriterien , Schock-Behandlung, PCT-, CRP-Werte), (iv) wie schwer war die Erkrankung (SOFA, M O D S- Score). Die Datenbankrecherche ergab, dass mit einer infektiösen Komplikation (Sepsis) insbesondere Patienten nach einer Pneumonie (40%) und nach einer Peritonitis (23%) in die Studie aufgenommen wurden. Ohne eine Infektion wurden insbesondere Patienten nach einem (PoIy-) Trauma (9 %) und nach einer Bypass-Operation (20%) eingeschlossen. Diese Daten entsprechen den epidemiologischen Studien der Deutschen Sepsisgesellschaft, womit die Sammlung als repräsentativ eingestuft wurde. Die Patientendaten dieser Gruppen wurden unabhängig von 2 Ärzten [nach ACCP/SCCM, 1992; Levy et al., 2003; Calandra und Cohen, 2005] geprüft und die finale Patientenauswahl festgelegt. Es wurden aus den beiden Sepsis-Gruppen 46 Patienten mit einer mikrobiologisch gesicherten Diagnose ausgewählt und der erste septische Tag bestimmt. Die Zusammenfassung der Schwere-Kriterien ergab, dass bei den Patienten an diesem Tag eine schwere Sepsis bzw. ein septischer Schock diagnostiziert wurde. Sie erreichten einen durchschnittlichen SOFA- Wert von 10, die Summe akuter Organdysfunktionen betrug etwa 3. Aus den beiden Risikogruppen (nach einer CPB- Operation und oder einem Trauma) wurden 59 Patienten ohne Zeichen einer Infektion ausgewählt und der erste Tag mit einer ähnlichen Schwere wie bei den Sepsis-Gruppen bestimmt. Auf diese Weise wurden 105 Patienten primär in die Studie eingeschlossen; nach der Qualitätskontrolle der zugehörigen Mikroarray- Experimente wurde die Gruppe auf 96 Patienten mit guter Qualität der Genexpressionsmessung eingeschränkt. Eine Aufstellung zu wichtigen klinischen und Labor- Parametern für die ausgewählten Patienten findet sich beispielhaft, jedoch ohne Einschränkung hierauf, in Tab. 1.

Generierung des Klassifikators

Auf dem Weg zur Klassifikatorentwicklung wurden folgende Schritte durchgeführt: 1. Schritt: Qualitätskontrolle: Aus der vom Expertenwissen bestätigten Vorauswahl aus einem Patientenkollektiv wurden die zugehörigen Genexpressionsdaten verschiedenen Ähnlichkeitsanalysen unterworfen, um untypische Hybridisierungsergebnisse auszuschließen [Buneß et al., 2005], wodurch die finale Trainingsdatenmatrix generiert wurde.

2. Schritt: Normalisierung bzw. Vorverarbeitunq der Daten: Verglichen wurden verschiedene Verfahren der Background-Korrektur und der Normalisierung. Am besten zeigten sich Verfahren mit einer Varianz stabilisierenden Transformation [Rocke und Durbin, 2001 ]. Als bestes Normalisierungsverfahren stellte sich die Normalisierung mittels Box-Cox [Box und Cox, 1964], mit anschießender Median und MAD Standardisierung, heraus. Sein Vorteil, nämlich die Normalisierung einzelner Profile (gegenüber der Normalisierung der gesamte Datenmatrix nach z.B. Huber [Huber et al., 2003], wurde insbesondere beim Bootstrap gezielt verwendet.

3. Schritt: Filter: Es wurde ein Filter verwendet, um die besten Klassifikatorgene zu identifizieren. Der Filter bestand aus folgenden Schritten:

(i) Auswahl von einer bestimmten Anzahl an Transkripten mit dem geringsten Variationskoeffizienten, wobei nur Transkripte mit einer positiven mittleren Signalintensität berücksichtigt wurden, (ii) Anschließend wurde für diese Transkripte der Wilcoxon-Test für den Vergleich infektiös vs. nicht infektiös durchgeführt. Die Transkripte wurden mittels der p-Werte angeordnet, wobei alle Transkripte mit einem p-Wert <= 0.001 als gleichwertig betrachtet werden und diese mittels dem Abstand zwischen infektiöser und nicht infektiöser Gruppe angeordnet werden. Der Abstand zwischen den beiden Gruppen wurde mittels des Hodges-Lehmann Schätzer [Hollander und Wolfe, 1973] bestimmt.

4. Schritt: Klassifikation: Die besten der ausgewählten Transkripte wurden dann zur Klassifikation eingesetzt. Im Klassifikationsschritt wurden verschiedene lineare und nicht lineare Verfahren [Hastie et al., 2001 ] miteinander verglichen: DLDA, LDA, RF, GPLS, SVM und kNN. 5. Schritt: Interne Validierung: Um die Güte der Klassifikation zu beurteilen wurde die 10-fach Kreuzvalidierung verwendet, wobei die Kreuzvalidierung mehrfach (20- bzw. sogar 1000-mal) wiederholt wurde.

6. Schritt: Auswahl der Transkripte: Die finale Auswahl der Transkripte für den Klassifikator erfolgte unter zu Hilfenahme von Bootstrap. Bootstrapping ist in der Statistik eine Methode des Resampling; dabei werden wiederholt Statistiken auf der Grundlage lediglich einer Stichprobe x = (x(1 ),...,x(n)) berechnet. Dafür werden im einfachsten Fall B Bootstrap-Stichproben x(b) = (x^*(1 ),...,x^*(n)), b = 1 ,...,B, dadurch generiert, dass jeweils n mal aus der gegebenen Stichprobe ein Wert mit Zurücklegen gezogen wird [Efron, 1979].

So wurden aus dem ursprünglichen Trainingsdatensatz bestimmte für die jeweilige Fragestellung geeignete Bootstrap-Stichproben gezogen und für jede dieser Stichproben - wie oben beschrieben - die optimalen Transkripte bestimmt. Im finalen Klassifikator finden sich solche Transkripte, die bei häufigen, z.B. 5000 Wiederholungen am häufigsten ausgewählt wurden.

Bestimmung des finalen Klassifikators

Die Betrachtung der Abhängigkeit der Klassifikationsergebnisse von der Anzahl der Gene bestätigte das Resultat von Baker und Kramer [Baker und Kramer, 2006], nämlich, dass sich die Ergebnisse mit 5, 10, 25, 40 und 50 Genen wenig unterschieden. In Fig. 1 wird der Klassifikationsfehler für die lineare Diskriminanzanalyse (LDA) dargestellt. Da die Kurve ihr Minimum bei etwa 12 Merkmalen erreicht, wurden im weiteren die mit dieser Anzahl von Genen erreichten Ergebnisse dargestellt. In Tab. 2 wurden die Ergebnisse der verschiedenen Klassifikationsverfahren, die mittels 20 Wiederholungen einer 10-fach Kreuzvalidierung gewonnen wurden, zusammengefasst.

Tabelle 2: Mittels 20-fach CV (Kreuzvalidierung) geschätzte Sensitivität und Spezifität bei simultaner Betrachtung von 12 Transkripten

Aus Tab. 2 geht hervor, dass die geschätzte Sensitivität im Bereich von 95 %, die geschätzte Spezifität - mit Ausnahme bei DLDA - im Bereich von über 90 % liegen. Am vielversprechendsten sind die Ergebnisse mittels LDA und SVM. Im Fall dieser beiden Klassifikationsverfahren wurden jeweils nur wenige Patienten überwiegend falsch klassifiziert, so dass eine Missklassifikationsrate von höchstens 5% erreicht wird. Aufgrund der großen Komplexität der SVM-Methode und dem dadurch entstehenden Rechenaufwand, den die Optimierung eines SVM- Klassifikators verursachen würde, sowie der besseren biologischen Interpretierbarkeit eines Klassifikators auf der Basis der LDA hat sich die Anmelderin dazu entschieden, den Klassifikator auf der Basis der LDA zu entwickeln. Die aus der LDA resultierende Klassifikationsregel wurde in einen Score umgerechnet. Der Score ist für ein beispielhaftes Kollektiv von 96 Patienten in Fig. 2 dargestellt. Ein Wert > 10 zeigt an, dass eine Infektion (also Sepsis) sehr wahrscheinlich ist. Ein Wert zwischen +10 und -10, dass ein gewisses Risiko für eine Sepsis besteht. Ein Wert < -10 schließlich deutet darauf hin, dass eine Infektion sehr unwahrscheinlich ist.

Zusammenfassend ergibt sich folgendes Bild: Aus dem Generierungsprozess des Klassifikators werden die Vorteile der Gruppenauswahl deutlich: Die geschätzte Anzahl der Klassifikationsgene ist klein, wodurch eine Überanpassung (overfitting) an die Trainingsdaten unwahrscheinlich ist. Die einzelnen Klassifikationsverfahren unterscheiden sich dabei nur geringfügig (Dass die diagonale lineare Diskriminanzanalyse [DLDA] als Klassifikationsverfahren die geringste Klassifikationsgüte liefert, ist dadurch zu erklären, dass in der DLDA die Korrelation zwischen den Genen nicht berücksichtigt wird, was zum Informationsverlust führt). Eine Erhöhung der Genanzahl verbessert das Ergebnis nicht. Diese Tatsachen deuten darauf hin, dass die Gruppen im Trainingsdatensatz sich gut trennen lassen, also deutliche Distanzen aufweisen.

Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden anhand von Beispielen und unter Bezug auf das Sequenzprotokoll, das ebenfalls ein Teil dieser Beschreibung ist, näher erläutert, ohne dass dies eine Einschränkung der Erfindung bedeutet. Erqebnisse

Die Güte der erfindungsgemäßen Multigenbiomarker wurde mit den etablierten Biomarkern PCT und CRP verglichen, wofür die zugehörigen ROCs für den Trainingsdatensatz berechnet wurden (Fig. 3). Man erhält als AUC (Area Under the Curve): AUC(PCT) = 0.326, AUC(CRP) = 0.656, AUC(PCT & CRP) = 0.940, AUC(Multigenbiomarker) = 0.997. Anhand dieser ROC-Kurven wird die sehr hohe Sensitivität bei ähnlich hoher Spezifität für den deutlich. Durch die gezielte Auswahl der Klassikationsgene wurde also von dem Multigenbiomarker eine bessere Klassifikationsgüte erreicht als von den etablierten Markern PCT und CRP, auch für die Trainingsdaten, die nach dem Prinzip der Extremgruppen scharfe Unterschiede repräsentieren.

Im nächsten Schritt wurden die Genexpressionsdaten der Patientendatenbank der Anmelderin, die nicht im Trainingsdatensatz verwendet wurden, einer Klassifikation unterzogen. Die Fig. 4a zeigt die Verteilung der Score-Werte in Abhängigkeit von der klinischen Diagnose. Zum Vergleich wird in der Fig. 4b die Verteilung der PCT-und CRP-Werte für den gleichen Datensatz dargestellt. Während die Index-Werte bzw. die Scores mit der klinischen Diagnose übereinstimmen, zeigt insbesondere die PCT-Verteilung, dass eine schwere SIRS eher als Sepsis und eine unkomplizierte Sepsis eher als nicht infektiös eingestuft wird. Eine unspezifische Verteilung zeigen die Marker CRP und WBC (Leukozytenanzahl).

Die Güte der erfindungsgemäßen Multigenbiomarker bzw. des erfindungsgemäßen Verfahrens wurde an Expressionsdaten von weiteren Patienten eines fremden Sammelzentrums untersucht. Auch hier stimmten die klinische und molekularbiologische Einstufung in 90% der Fälle überein.

In Fig. 5 wird abschließend die Score-Kurve im Verlauf der Erkrankung für einzelne Patienten dargestellt. Auch hier spiegelt der Multigenbiomarker der vorliegenden Erfindung die klinische Diagnose wider.

In die Validierungsanalyse wurden Patientenprofile der Patientendatabank der Anmelderin eingeschlossen, deren Expressionsprofile nicht im Trainingsdatensatz vertreten waren. Aufgrund des fehlenden Golden Standards für die Diagnose der Sepsis wurde dieser unabhängige Testdatensatz in geschichteten Subgruppen untersucht. Dabei wurden Patientenprofile nach der Schwere der Erkrankung aufgeteilt und klassifiziert (vgl. Fig. 4). Tatsächlich wurden Patienten mit einer unkomplizierten SIRS fast ausschließlich als nicht infektiös eingestuft. Patienten mit einer schweren SIRS (SIRS mit zusätzlicher Multiorgandysfunktion (MOD)) wurden überwiegend als nicht infektiös erkannt. Patienten mit einer unkomplizierten Sepsis wurden überwiegend als systemisch infektiös klassifiziert. Die infektiöse Komplikation wurde am häufigsten unter den Patienten mit einer schweren Sepsis bzw. einem septischen Schock bestimmt. Dieser Befund konnte an einer Patientengruppe, die in einem unabhängigen Zentrum rekrutiert und diagnostiziert wurden, bestätigt werden (Fig. 6).

Weitere Vorteile und Merkmale der vorliegenden Erfindung ergeben sich aufgrund der Beschreibung von Ausführungsbeipielen sowie anhand der Zeichnung.

Es zeigt:

Fig. 1 einen Verlauf des Klassifikationsfehlers der LDA in Abhängikeit von der

Anzahl von Klassifikationsgenen; (a) Klassifikationsfehler bei der

Verwendung von 5-200 Genen, (b) Auschnitt für 8-20 Gene; Fig. 2 einen Score (a) und seine Verteilung für den Trainingsdatensatz (b); Fig. 3 die Güte eines Multigenbiomarkers im Vergleich zu etablierten monomolekularen Biomarkern PCT und CRP bzw. ihrer Kombination (via

LDA); Fig. 4 eine Verteilung der Biomarker-Werte in Abhängigkeit von der klinischen

Diagnose, (a) Multigenbiomarker-Score, (b) PCT, CRP und WBC; Fig. 5 einen Verlauf des Score für drei Patienten (die graue Fläche markiert die

Tage der Sepsisdiagnose; Fig. 6 eine Verteilung der Scores für Expressionsdaten eines fremden

Sammelzentrums; Fig. 7 eine schematische Darstellung des Mikroarray-Designs und der drei

Replikate; Fig. 8 eine Darstellung der auf dem Mikroarray repräsentierten Signalwege; Fig. 9 ein Beispiel eines qPCR-Laufs (Marker EPC1 );

Fig. 10 eine schematische Darstellung des abgeleiteten Score-wertes für 12 Marker und die Einteilung in vier Bereiche; auf diese Skala wird das

Klassifikationsergebnis projiziert; Fig. 1 1 eine schematische Darstellung des abgeleiteten Score-Wertes und die

Einteilung in vier Bereiche; auf diese Skala wird das Klassifikationsergebnis projiziert; Fig. 12 eine Darstellung der Expressionsunterschiede zwischen den

Patientengruppen: Boxplots der Marker erstellt aus 31 Patientenproben (19 mit Sepsisdiagnose, 12 mit SIRS); die Legende erklärt die verwendeten

Gensysmbole; Fig. 13 eine Boxplot der normalisierten Real-Time-PCR-Daten für den

Biomarkerkandidaten CDKN1 C (SEQ-ID NO: 104) zur Unterscheidung von gram-positiver und gram-negativer Infektion; Fig. 14 einen Boxplot der normalisierten Real-Time-PCR-Daten für den Biomarker

CTSL zur Unterscheidung von gram-positiver und gram-negativer Infektion; Fig. 15 einen Boxplot der normalisierten Real-Time-PCR-Daten für den Biomarker kandidaten METTL7B (SEQ-ID NO: 145) zur Unterscheidung von grampositiver und gram-negativer Infektion; und Fig. 16 einen Boxplot für den nicht-kodierenden Marker mit der SEQ-ID NO: 207; auf der y-Achse ist der mittlere Ct-Wert während der Real-Time-Amplifikation dargestellt.

Ausführunqsbeispiele

Beispiel 1 : Sepsis/SIRS-Abqrenzunq

Es soll ein Verfahren zur Bestimmung von Multigenbiomarkern offenbart werden. Die aus dem Verfahren resultierende Klassifikationsregel soll eine Differenzierung von SIRS- und Sepsis-Patienten erlauben. Eine weitere Klassifikationsregel soll die Unterscheidung zwischen dem Fokus der Infektion Pneumonie und Peritonitis ermöglichen. Experimenteller Ansatz

In genomweiten Genexpressionsuntersuchungen des Blutes nichtseptischer und septischer Patienten wurden Transkripte identifiziert, welche unbeeinflusst von der Heterogenität der Patienten bedingt durch Alter, Komorbiditäten und Medikationen die molekularen Unterschiede zwischen Gruppen von Sepsispatienten widerspiegeln. Abhängig vom untersuchten Patientenkollektiv ist die Anzahl der zur erfolgreichen Klassifikation benötigten Biomarker unterschiedlich.

Man geht davon aus, dass in heterogenen Kollektiven mehr Biomarker analysiert werden müssen als in sehr gut definierten Gruppen. Im Sinne möglichst robuster klinischer Diagnostik wird von einem Pool an signifikanten Biomarkern ausgegangen. Je nach diagnostischer Fragestellung werden dann Biomarker ausgewählt und das Klassifikationsverfahren auf diversen technischen Genexpressionsplattformen optimiert. An zwei Beispielen soll das Potenzial der Biomarkerkandidaten verdeutlicht werden:

a) Messung differenzieller Genexpression zwischen SIRS- und Sepsis- Patienten auf einem Mikroarray b) Klassifikation von SIRS- und Sepsis-Patienten mit Genexpressionssignalen ausgewählter Oligonukleotidsonden, generiert auf dem Mikroarray

zu a:

Charakteristik des verwendeten-Arravs:

• mittels Spottingtechnologie hergestellter Oligonukleotid-Mikroarray

• 484 genspezifische Oligonukleotide sind in 3 Replikaten aufgebracht

• davon adressieren 344 Oligonukleotide Genexpressionsbiomarker

• 84 Oligonukleotide adressieren Kontrollen (neg. and pos.)

• 56 Oligonukleotide adressieren Referenzgene

Fig. 7 zeigt eine schematische Darstellung des fokussierten Sepsis-Mikroarrays. Gespottet auf epoxy-silanisierte Glasträgern (Nexterion E-Slides, Hersteller Schott, BRD), ist jedes genspezifische Oligonukleotid dreifach repräsentiert. Die drei identischen Sub-Arrays werden mit einer Patientenprobe hybridisiert. Neben den markerspezifischen Oligonukleotiden sind auch Sonden für Kontrollen (Überwachung des gesamten Probenvorbereitungs- und Hybridisierungsprozesses) auf dem Array vertreten.

Biologische Plausibilität der eingesetzten Biomarker:

Die auf dem Array adressierten Markergene sind mit hoher Signifikanz den in Fig. 8 dargestellten Signalwegen in der menschlichen Zelle und den damit verbundenen Funktionalitäten zugeordnet. Eine hohe Relevanz für immunologische und inflammatorische Prozesse und damit auch die Sepsis ist gegeben. Für die wissensbasierte Analyse der Biomarkerpopulation auf dem fokussierten Sepsis-Array wurde die Software Ingenuity Pathway Analysis (Ingenuity Systems, USA, www.ingenuity.com), verwendet, um den funktionellen Kontext der identifizierten Marker zu verdeutlichen. Basierend auf dem gesamten öffentlich verfügbaren Datenbankwissen über die Gene und Genprodukte werden die Marker in funktionelle Netzwerke eingeordnet, welche dann Relevanz für physiologische und pathologische Vorgänge haben können. Die Marker sind mit hoher Signifikanz an immunologischen und entzündlichen Prozessen beteiligt, was von funktioneller Seite einen engen Zusammenhang zur Sepsis vermuten lässt. Damit ist biologische Plausibilität, eine Grundvoraussetzung für Biomarker, gegeben.

Patientenkollektiv für die Auswertung:

Im Großteil der Fälle auf der Intensivstation (ITS) ist die Lunge (ca. 45-50 %) oder der Abdomen (ca. 25%) der Fokus der Infektion bei einer Sepsisdiagnose. Daher wurden im Rahmen der Multigenbiomarker-Entwicklung Patienten mit Pneumonie bzw. Peritonitis ausgewählt. Im Fall der SIRS wurden Herz-Patienten ausgewählt, welche den Großteil der SIRS-Patienten auf einer ITS stellen darstellen. Auf diese Weise wurden 12 Patienten mit schwerer Pneumonie, 18 Patienten mit schwerer Peritonitis und 19 Herz-Patienten (OP: cardiopulmonaler Bypass) mit schwerer SIRS identifiziert. Für die Analysen wurde von diesen Patienten jeweils der erste Tag der Diagnose ausgewählt. In nachfolgender Tab. 3 ist das Patientenkollektiv für die Klassifikator- Validierung auf dem Sepsis- Array dargestellt. Tabelle 3: Patientenkollektiv für die Validierung des Klassifikators auf dem fokussierten Sepsis-Array (klinische Daten siehe Beschreibung Gesamtkollektiv von 96 Patienten)

Hybridisierunq:

4 μg total RNA aus Patientenblut wurde mittels reverser Transkription (Superscriptll, Invitrogen, USA) in einem Reaktionsvolumen von 30μl??? in cDNA umgeschrieben. Als Primer wurde ein PolydT-Primer (18mer eingesetzt). Aminoallyl- dUTP wurde der Reaktion zugesetzt und somit 80 % der dTTP Menge im mRNA- Strang anhand des AA-dUTP substituiert (Tab. 4).

Tabelle 4: Pipettieransatz für die Proben für die cDNA-Synthese. 4μg totaIRNA sowie 2,5μg OligodT Primer wurden vorgelegt. Mit RNAse-freiem Wasser wurde auf 30μl Gesamtvolumen aufgefüllt.

Alle Proben werden für 2 h bei 42 °C inkubiert. Nach diesen 2 h werden die entstandenen mRNA / cDNA Duplexe in einzel-strängige cDNA alkalisch hydrolisiert (Zugabe von je 20 μl 0,5 M EDTA (pH 8,0) und je 20 μl 1 N NaOH mit einer Inkubationszeit von 30 min bei 65 °C). Zur Neutralisation der einzelsträngigen cDNA werden je 50 μl 1 M Tris-HCI (pH 7,4) zugegeben. Anschließend werden alle Proben mit 400 μl RNase freiem H₂O versetzt und mittels Microcon YM-30 Säulen (AMICON, USA) aufgereinigt. Dazu gibt man die gesamten Proben auf jeweils eine Säule, die bei 1 10OOxg für 10 min zentrifugiert wird. Nach zweimaligen waschen mit 450 μl RNase freien H₂O und dazwischenliegende Zentrifugationsschritten bei 1 1000xg für 10 min, werden die Säulen umgedreht auf ein neues 1 ,5 ml Reaktionsgefäß gestülpt und für 3 min bei 15000xg zentrifugiert. Als Eluat erhält man nun aufgereinigte einzelsträngige cDNA mit einem Volumen von ca. 20 - 40 μl, welche in der Speedvac zur Trockene reduziert wird.

Markierung der cDNA mit Fluoreszenzfarbstoffen

Zur Detektion der Hybridisierungssignale werden fluoreszierende Farbstoffe eingesetzt. Für die Analysen wurde ein Fluoreszenzfarbstoff von Dyomics verwendet (Hersteller: Dyomics GmbH, Jena, BRD). DY-647 (Cy5-Analoga) werden als N- Hydroxylsuccinimid-Ester (NHS-Ester) erworben und für die Fluoreszenzmarkierung eingesetzt. Die chemische Kopplung der Farbstoffe erfolgt an den eingebauten AA- dUTPs.

Die cDNA wird in 10 μl H₂O gelöst und mit je 5 μl auf zwei Röhrchen aufgeteilt. Die gelösten Proben werden bei 42 °C für 5 min inkubiert. Anschließend werden jeder Probe jeweils 3 μl Bicarbonatpuffer zugesetzt. Der Fluoreszenzfarbstoff wird in DMSO (Hersteller SIGMA-Aldrich, BRD) gelöst. Pro Probe werden 75 μg Farbstoff eingesetzt. Diese lichtempfindliche Reaktion erfolgt im Dunkeln für 1 h. Nach dieser Zeit werden die Proben mit H₂O auf ein Endvolumen von 30 μl aufgefüllt. Die Proben werden mit jeweils 80 μl H₂O und 100 μl Membran-Binding-Solution zusammenpipettiert und mittels Promega Kit ( Promega Wizard-SV Gel and PCR CleanUP System, PROMEGA, USA) aufgereinigt, nach den Angaben des Herstellers.

Im letzten Schritt werden die Säulen für 1 min bei 16000xg trocken zentrifugiert und zweimal mit 50 μl H₂O (je 1 min, 10000xg) eluiert. Danach wird jede Probe mit 10 μl Cot-1 -DNA (Invitrogen, USA) und 400 μl H₂O versetzt. Die Konzentration der markierten Proben erfolgt mittels Microcon YM-30 (10000xg; 10 min Zentrifugation). Die Säulen werden umgedreht auf ein neues Röhrchen gestülpt und bei 15000xg für 3 min zentrifugiert. Das Volumen des cDNA/Cot-1 -DNA-Gemisches wird auf 32μl eingestellt. Das fluoreszenzmarkierte cDNA/Cot-1 -DNA-Gemisch (32μl) wird mit 58 μl Hybridisierungsgemisch (Tab. 5) versetzt.

Nach dreiminütiger Denaturierung bei 98 °C wird das Gemisch in die Hybridisierungskammern des TECAN- Hybridisierungsautomaten (HS-400, Hersteller Tecan, Österreich) einpipettiert. Das enthaltene Formamid setzt die Schmelztemperatur des Hybrids herab und ermöglicht somit eine gute Hybridisierung. Durch die Zugabe von 10 %igem SDS wird die Benetzung der Biomoleküle am Glasobjektträger verbessert. Die Hefe-t-RNA / Poly-A-Mix sorgt dafür, dass es keine unspezifischen Bindungen und Hintergrundrauschen gibt. Demzufolge bindet PoIy(A) an das Poly(T)-Ende der markierten cDNA, wobei die Hefe-t-RNA alle unspezifischen Sequenzen blockiert.

Tabelle 5: Das Hybridisierungsgemisch für eine Probe.

Das Programm an der Hybridisierungsstation ist in der nachfolgenden Tab. 6 dargestellt.

Die Arrays werden zu Beginn mit Hybridisierungslösung gewaschen und anschließend mit den Proben inkubiert. Der Prozess wird für zehn Stunden bei einer Temperatur von 42 °C in Hybridisierungskammern des Tecan Gerätes HS-400 mit konstanter Agitation des Hybridisierungsgemisches auf der Array Oberfläche durchgeführt. Zum Schluss werden die Arrays in drei automatisierten Schritten gewaschen und getrocknet.

Nach zehn Stunden werden alle nicht gebundenen Moleküle durch anschließende Waschschritte vom Mikroarray entfernt. Die fertigen Arrays müssen zur Auswertung eingescannt (AxonB Scanner, GenePix-Software, Axon Technologies, USA) werden. Die resultierenden gpr-files werden biostatistisch ausgewertet.

Auswertung

Die Datenanalyse wurde unter der freien Software R Project Version 2.6.1 durchgeführt, die unter www.r-project.org zur Verfügung steht.

1. Qualitätskontrolle der Rohdaten:

Aus der vom Expertenwissen bestätigten Vorauswahl aus 46 Patienten wurden die zugehörigen Genexpressionsdaten verschiedenen Ähnlichkeitsanalysen unterworfen, um untypische Hybridisierungsergebnisse auszuschließen [Buneß et al., 2005].

2. Normalisierung der Daten:

Verglichen wurden verschiedene Verfahren der Background-Korrektur und der Normalisierung. Am besten zeigten sich Verfahren mit einer Varianz stabilisierenden Transformation [Rocke und Durbin, 2001 ]. Als bestes Normalisierungsverfahren stellte sich die Normalisierung mittels Box-Cox [Box und Cox, 1964], mit anschießender Median und MAD Standardisierung, heraus. Sein Vorteil, nämlich die Normalisierung einzelner Profile (gegenüber der Normalisierung der gesamten Datenmatrix nach z.B. Huber [Huber et al., 2003], können insbesondere beim Bootstrap gezielt verwendet werden.

3. Statistischer Vergleich der Gruppen:

Die Expressionswerte der untersuchten Transkripte wurden mit dem Wilcoxon- Ranksummen-Test nach dem Infektionsstatus (infektiös vs. nicht infektiös) verglichen. Die Transkripte wurden aufsteigend nach dem erreichten p-Wert angeordnet, wobei alle Transkripte mit einem p-Wert <= 0.001 als gleichwertig betrachtet und diese mittels dem Abstand zwischen infektiöser und nicht infektiöser Gruppe angeordnet wurden. Der Abstand zwischen den beiden Gruppen wurde mittels des Hodges-Lehmann Schätzer bestimmt.

4. Klassifikation:

Aus Tab. 7 wurden 14 Transkripte ausgewählt, die die Patientengruppen in einem Klassifikationstest nach ihrem Infektionszustand am besten trennen konnten. Als bestes Klassifikationsverfahren (d.h. das Verfahren, das in einer einfachen Kreuzvalidierung den kleinsten Klassifikationsfehler lieferte) wurde die lineare Diskriminanzanalyse [Hastie et al., 2001 ] gewählt. Dafür wurde die Funktion Ida aus dem Packet MASS der Software R verwendet. Für die p = 14 Gen-Marker wurden die Gewichte (w_o,...,w_p ) der Diskriminanzfunktion f_LD, die durch die Formel

definiert ist, aus den normalisierten Expressionsdaten berechnet, wobei nacheinander eine Probe weggelassen wurde. Diese Probe wurde nachhinein klassifiziert, wofür in der vorangegangenen Formel für {xi,...,x_p) die ct-Werte der Probe eingesetzt wurden. Die Gewichte der Diskriminanzfunktion wurden so berechnet, dass ein positiver Wert der Funktion die Zuordnung zur Gruppe mit einer infektiösen Komplikation und ein negativer Wert der Funktion die Zuordnung zur Gruppe ohne eine infektiöse Komplikation bedeuten. Die Gewichte der linearen Diskriminanzfunktion, die aus allen Proben berechnet wurden, sind in Tab. 7 zusammengefasst.

zu b):

Klassifikationserqebnisse:

Die verwendeten Expressionssignale entstammen dem obigen Datensatz. In der Klassifikation wurden bei einer einfachen Kreuzvalidierung eine Sensitivität von 96 % und eine Spezifität von 95 % erreicht. Das entspricht einer Fehlerrate von 96 %, also einer Falschklassifikation von 2 Proben. Die Gewichte der zugehörigen Diskriminanzfunktion sind in Tab. 7 zusammengefasst.

Tab. 8 zeigt die differenzielle Genexpression in den Patientengruppen, gemessen auf dem Mikroarray.

Tabelle. 8: Differentielle Genexpression zwischen den Patientengruppen; p-Werte für die Analysen 1 und 2: grau unterlegt sind die Marker, die für die jeweilige Analyse einen signifikanten Unterschied zwischen den Gruppen aufzeigen; Analysel (nichtinfektiöse vs. infektiöse Ursache des Multiorganversagens): CPB Patienten vs. septische Patienten mit Fokus Peritonitis bzw. Pneumonie; Analyse2 (Fokus der Infektion, Unterscheidung von Fokus Peritonitis von Fokus Pneumonie): 18 septische Patienten mit Fokus Peritonitis vs. 12 Patienten mit dem Fokus Pneumonie

Beispiel 2: Aufstellung eines Klassifikators zur Identifizierung von SIRS- und Sepsis-Patienten mittels Real-Time-PCR

Messung der Genexpression

Es wurden Patienten mit Pneumonie bzw. Peritonitis als typische Sepsis- Vertreter und im Fall der SIRS Patienten mit einer schweren Herz-OP ausgewählt (Cardiopulmonaler Bypass, CPB), da diese den Großteil der SIRS-Patienten auf einer ITS stellen (siehe Tab. 9). Die Patienten wurden retrospektiv von einem Ärzte- Team der Uni-Klinik Jena in ihrer Diagnose validiert.

Aus dem Blut der Patienten wurde Total-RNA isoliert und in cDNA umgeschrieben. Diese wurde im Assay als Templat eingesetzt.

Tabelle 9: Liste der untersuchten Patienten

Die Marker zur Klassifizierung (Tab. 10) wurden aus dem Biomarkerpool (siehe Beispiel 1 ) ausgewählt und zeigen starke differenzielle Genexpression in Patientengruppen mit und ohne diagnostizierte Sepsis.

Zur Quantifizierung von Genexpression sind verschiedene Methoden verfügbar. Relative Quantifizierung von Genexpression bedeutet eine Aussage zur Abundanz des Targettranskriptes beispielsweise bezogen auf einen Kalibrator. Das kann ein aus den Expressionswerten konstant exprimierter Gene (sog. Referenzgene oder Housekeepinggene) ermittelter Bezugswert sein. Für jeden Organismus und jedes Gewebe sind solche Referenzgene spezifisch und müssen für die jeweilige Studie sorgfältig ausgewählt werden. Ausgehend von den Genexpressionsprofilen aus dem Vollblut der Sepsis- und Kontrollpatienten wurden die stabilsten Gene mit der geringsten Variabilität ausgewählt und in der quantitativen PCR zur Normalisierung eingesetzt.

Tab. 1 1 ist eine Liste der in der Real-Time PCR verwendeten Primer und deren SeqlDs. Für jede Zielsequenz sind mehrere Primerkombinationen möglich, die Tabelle stellt nur eine von vielen Möglichkeiten dar.

Experimentelle Ausführung

Blutabnahme und RNA-Isolation:

Das Vollblut der Patienten wurde auf der Intensivstation von den Patienten mittels des PAXGene Kits gemäß den Vorgaben des Herstellers (Qiagen) abgenommen und die RNA isoliert.

Reverse Transkription:

Von jeder Patienten-Probe wurden 4 μg der Total-RNA zu komplementärer DNA (cDNA) mit der reversen Transkriptase Superscript Il (Invitrogen) in einem 20 μl- Ansatz (enthält 1 μl 10 mM dNTP-Mix von Fermentas und 1 μl 0,5 μg/μl Oligo(dT)- Primer) umgeschrieben. Die RNA wurde anschließend durch alkalische Hydrolyse aus dem Ansatz entfernt. Die Reaktionsansätze wurden nicht aufgereinigt, sondern mit Wasser auf 50 μl aufgefüllt.

Real-Time-PCR

Verwendet wurde der Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG - Kit der Firma Invitrogen. Die Patienten-cDNA wurde 1 :100 mit Wasser verdünnt und davon jeweils 1 μl in die PCR eingesetzt. Es wurde pro Marker eine PCR-Platte (BIORAD) mit allen 31 Patienten und No-Template-Controls (NTC) in 3-facher Ausführung pipettiert.

PCR-Ansatz pro well (10 μl) 2μl Templat-cDNA 1 :100

1 μl forward primer, 10 mM

1 μl reverse primer, 10 mM

1 μl Fluorescein Reference Dye

5 μl Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG Es wurde ein Mastermix ohne Templat hergestellt, dieser wurde in 9 μl-Aliquots in die PCR-Platte gesteppt und dazu wurden jeweils die Patienten-cDNAs pipettiert.

Verwendet wurde das iQ^™5 Multicolor Real-Time-PCR Detection System der Firma BIORAD mit der dazugehörigen Auswertungssoftware. Die Ergebnisse eines solchen qPCR-Laufs sind in Fig. 9 gezeigt. Mit Hilfe der Auswertungssoftware wurden für jeden der 18 Marker und 5 Housekeeper solche Abbildungen generiert, aus denen sich dann die entsprechenden Ct-Werte ableiten ließen. Die Ct-Werte werden vom Programm automatisch im Bereich des linearen Anstiegs der Kurven berechnet. Im Beispiel von EPC1 lagen die Ct-Werte für die Sepsis-Patienten im Bereich von 25,08 - 27,71 und für die SIRS-Patienten im Bereich von 28,08 - 35,91.

Datenanalvse:

Daten-Vorverarbeitunq:

Die gemessenen Expressionssignale wurden im Excel-Format abgespeichert und über die 3-fach-Bestimmungen gemittelt. Der Marker MON2 mit 15 fehlenden Werten und die Patienten 6065 und 81 1 1 mit 13 bzw. einem fehlenden Wert wurden aus der Analyse ausgeschlossen. Damit enthielt der Trainingsdatensatz 18 infektiöse (62%) und 1 1 nicht infektiöse (38%) Proben. Zum Normalisieren wurden aus den 5 gemessenen die 3 stabilsten Housekeepergene bestimmt. Anschließend wurde für jeden Patienten wurde der Mittelwert der 3 ausgewählten Housekeeper-Gene von den Marker-Genen subtrahiert. Klassifikation:

Um die Gen-Marker nach ihrer Trennungsgüte anzuordnen, wurde der Wilcoxon Ranksummen-Test durchgeführt, in dem die Patientengruppen mit und ohne eine infektiöse Komplikation verglichen wurden. Danach wurden Gene mit p < 0.001 nach dem Hodge-Lehmann-Schätzer angeordnet, die restlichen nach dem p-Wert selbst.

Für die Klassifikation wurde die lineare Diskriminanzanalyse [Hastie et al., 2001 ] mit einer einfachen Kreuzvalidierung verwendet. Die Berechnung erfolgte unter der Verwendung der Funktion Ida aus der R-Bibliothek MASS. Für p Marker wurden die Gewichte der Diskriminanzfunktion f_LD, die durch die Formel

definiert ist, aus den Trainingsdaten berechnet, wobei nacheinander eine Probe weggelassen wurde. Diese Probe wurde nachhinein klassifiziert, wofür in der vorangegangenen Formel für x, die Ct-Werte der Probe eingesetzt wurden. Die Gewichte der Diskriminanzfunktion wurden so berechnet, dass ein positiver Wert der Funktion die Zuordnung zur Gruppe mit einer infektiösen Komplikation und ein negativer Wert der Funktion die Zuordnung zur Gruppe ohne eine infektiöse Komplikation bedeuten. Die Klassifikationsprozedur wurde für eine aufsteigende Anzahl von Markern wiederholt.

Anschließend wurde die Vorgehensweise für alle Trainingsdaten durchgeführt und zwei weiteren unabhängigen Proben wurden klassifiziert. Die Gewichte der linearen Diskriminanzfunktion für die aufsteigende Anzahl der Marker und die zugehörigen Score-werte für die unabhängigen Proben 790 und 933 (die grau unterlegten Werte wurden in Fig. 12 graphisch dargestellt) sind in Tab. 12 zusammengefasst.

Ergebnisse

Bei der Klassifikation wurden zuerst die 2 besten Marker verwendet, danach wurde schrittweise der nächste Marker zugefügt. Bei der einfachen Kreuzvalidierung wurde in fast allen Fällen keine Probe falsch klassifiziert. Lediglich bei der Verwendung von 13, 14 und 17 Markern wurde bei der einfachen Kreuzvalidierung eine nicht infektiöse Probe falsch klassifiziert. Damit wurden eine Sensitivität von 100 % und eine Spezifität von 91 % für den Trainingsdatensatz erreicht.

Die zwei unabhängigen Proben 933 und 790 wurden beide überwiegend korrekt klassifiziert. Für die korrekte Klassifikation (d.h. einen negativen Score-Wert) der nicht-infektiösen Probe 933 benötigte man 2 und mehr Marker. Für die infektiöse Probe 790 benötigte man 6 und mehr Marker-Gene, um einen positiven Score-Wert zu erreichen (vgl. Tab. 12). Die Klassifikation wurde mit mehr als 14 Markern instabil. In Fig. 10 sind die Score-Werte für die Klassifikation mit 12 Markern für die Proben 933 und 790 abgebildet. Es wird eine schematische Darstellung des abgeleiteten Score-Wertes und die Einteilung in 4 Bereiche gezeigt. Liegt der berechnete Score über 6,5, so hat der Patient mit einer 95%igen Wahrscheinlichkeit eine Sepsis (infektiös). Liegt der Score unter -6,5, so ist die Wahrscheinlichkeit, keine Sepsis zu haben, für den Patienten ebenfalls 95% (nicht infektiös). Auf diese Skala wurde das Klassifikationsergebnis für 12 Marker für zwei vom Klassifikationsdatensatz unabhängige Testproben projiziert. Der Score der Probe 933 nahm den Wert von - 36,58 an und der Patient wurde als nicht infektiös klassifiziert; der Score der Probe 790 nahm den Wert von 7,44 an und wurde als infektiös klassifiziert.

Die Experimente lieferten Expressionssignale in guter Qualität, so dass die zugehörige Datenmatrix zur Aufstellung des Klassikators verwendet werden konnte. Mittels der gemessenen Signale konnten die Trainingsdaten nach der infektiösen Komplikation so gut wie vollständig getrennt werden. Ebenfalls 2 unabhängige Testdaten wurden richtig klassifiziert. Für eine robuste Klassifikationsgüte im Trainings- und Testdatensatz benötigte man 6 bis 14 Klassifikationsmarker.

Tab. 13a zeigt die Rohdaten (Ct-Werte) aus den qPCR-Assays, wobei in Tab. 13b die Gewichte der linearen Diskriminanzfunktion für aufsteigende Anzahl von Markern und die zugehörigen Score-Werte für die unabhängigen Proben 790 und 933 gezeigt sind.

Tabelle 13b: Gewichte der linearen Diskriminanzfunktion für aufsteigende Anzahl von Markern und die zugehörigen Score- Werte für die unabhängigen Proben 790 und 933.

Legenden zu den Gennamen:

[File ANM\SL0604B1 doc] 11 03 09 SIRS-LAB GmbH

Beispiel 3: Aufstellung eines Klassifikators zur Identifizierung von SIRS- und Sepsis-Patienten mittels konventioneller PCR

Messung der Genexpression

Es wurden Patienten mit Pneumonie bzw. Peritonitis als typische Sepsis- Vertreter und im Fall der SIRS Patienten mit einer schweren Herz-OP ausgewählt (Cardiopulmonaler Bypass, CPB), da diese den Großteil der SIRS-Patienten auf einer ITS stellen (siehe Tab. 14).

Aus dem Blut der Patienten wurde Total-RNA isoliert und in cDNA umgeschrieben. Diese wurde im Assay als Template eingesetzt.

Die Marker zur Klassifizierung wurden aus dem Biomarkerpool (siehe Beispiel 1 ) ausgewählt und zeigen starke differenzielle Genexpression in Patientengruppen mit und ohne diagnostizierte Sepsis.

Tab. 15 enthält eine Auflistung der Genprodukte der Genexpressionsmarker, die für die Klassifizierung verwendet wurden, sowie ihre Beschreibung. Tab. 16 ist eine Liste der in der PCR verwendeten Primer und die dazugehörigen Seq-IDs. Für jede Zielsequenz sind mehrere Primerkombinationen möglich, die Tabelle stellt nur eine von vielen Möglichkeiten dar. Tabelle 15: Genprodukte der Genexpressionsbiomarker, die für die Klassifizierung verwendet wurden, sowie ihre Beschreibung

Tabelle 16: Liste der verwendeten Primer. Für jede Zielsequenz sind mehrere Primerkombinationen möglich, die Tabelle stellt nur eine von vielen Möglichkeiten dar.

Experimentelle Ausführung

Blutabnahme und RNA-Isolation:

Reverse Transkription:

PCR:

Die Patienten-cDNA wurde 1 :500 (bzw. bei 4 Markern 1 :50, SNAPC, EPC1 , KIAA0146 und MON2) mit Wasser verdünnt und davon jeweils 1 μl in die PCR eingesetzt. Es wurde pro Marker eine PCR-Platte (96 wells, Nerbe Plus) mit allen 31 Patienten und No-Template-Controls (NTC) in 3-fach-Bestimmung pipettiert.

PCR-Ansatz pro well (13 μl) 1 μl Templat cDNA 1 :500 oder 1 :50

0,5 μl forward primer, 10 mM 0,5 μl reverse primer, 10 mM 1 ,3 μl 10 x Puffer I 0,05 μl Accuprime Taq-Polymerase 9,7 μl Wasser

Es wurde ein Mastermix ohne Templat hergestellt, dieser wurde in 12 μl- Aliquots in die PCR-Platte gesteppt und dazu wurden jeweils die Patienten-cDNA pipettiert (siehe Zusammensetzung des PCR- Reaktionsansatzes).

Das sich daran anschließende PCR-Programm war folgendermaßen aufgebaut:

Verwendet wurde ein Mastercycler Gradient der Firma Eppendorf.

Detektion der PCR-Produkte:

Es wurde eine 1 ,1 -fache SYBR Green-Lösung hergestellt. Dazu wurden zu 8,9 ml Wasser 100 μl einer 100 x SYBR Green-Stammlösung (hergestellt aus einer 10.000 x SYBR Green-Stammlösung der Firma BMA, BioWhittaker Molecular Applications) pipettiert und gemischt. Im Anschluß an die PCR wurden von dieser Lösung je 90 μl in jeden PCR-Ansatz gegeben und dieses Gemisch dann in eine schwarze Platte (96 wells, Greiner) überführt. Im Anschluß daran wurde diese Platte in einem Fluoreszenz-Meßgerät (TECAN GENios) bei 485 nm Anregungswellenlänge/535 nm Emmissionswellenlänge gemessen.

Datenanalvse:

Daten-Vorverarbeitunq:

Die gemessenen Expressionssignale (siehe Tab. 16) wurden im Excel-Format abgespeichert, über die 3-fach-Bestimmungen gemittelt und für jeden Marker wurden die NTC-Werte abgezogen. Patient 6065 mit 15 fehlenden Werten wurde aus der Analyse ausgeschlossen. Einzelne fehlende Werte wurden mit dem knn-Algorithmus ersetzt (dafür wurde die Funktion pamr.knnimpute aus der R-Bibliothek pamr verwendet). Die gemittelten Signale wurden log-2 transformiert. Zum Normalisieren wurde für jeden Patienten von den zugehörigen Marker-Genen der Mittelwert der 3 Housekeepergene subtrahiert. Klassifikation:

Um die Genmarker nach ihrer Trennungsgüte anzuordnen, wurde der Wilcoxon Ranksummen-Test durchgeführt, in dem die Patientengruppen mit und ohne eine infektiöse Komplikation verglichen wurden. Danach wurden Gene mit p < 0.001 nach dem Hodge-Lehmann-Schätzer angeordnet, die restlichen nach dem p-Wert selbst.

Für die Klassifikation wurde die lineare Diskriminanzanalyse [Hastie et al., 2001 ] verwendet (für die Berechnung wurde die Funktion Ida im R-Packet MASS genutzt). Die geschätzten Gewichte

der linearen Diskriminanzfunktion f_LD mit p Markern wurden in Tab. 17 zusammengefasst. Für eine Messung mit den Werten

wurde der zugehörige Score nach der Formel

berechnet. Ein positiver Wert der Funktion führte zu einer Zuordnung zur Gruppe mit einer infektiösen Komplikation und ein negativer Wert der Funktion zu einer Zuordnung zur Gruppe ohne eine infektiöse Komplikation.

Im ersten Schritt wurde die Trennbarkeit des Trainingsdatensatzes mittels einfacher Kreuzvalidierung geprüft. Anschließend wurden zwei unabhängige Proben klassifiziert, von jeweils einer der beiden untersuchten Patienten-Gruppen (Patient 933 und 790). Dafür wurden die Roh-Messsignale in gleicher Weise vorverarbeitet wie die Trainingsdaten.

Ergebnisse

Die Anordnung der Gene und die zugehörigen Werte sind in Fig. 1 1 zusammengefasst. Es werden die Expressionsunterschiede zwischen den Gruppen: Boxplots der 15 Marker erstellt aus 31 Patienten-Proben (19 mit Sepsis-Diagnose, 12 mit SIRS) dargestellt. Mittels der Boxplots wurde Gen für Gen die Verteilung der Ct- Werte pro Gruppe dargestellt. Diese Ct-Werte wurden von jeder Patientenprobe mittels Real-Time PCR an der cDNA der Patienten (Biorad IQ5) generiert und über die Ct-Werte von drei Referenzgenen normalisiert. An der x-Achse sind der p-Wert und der Hodge-Lehmann-Schätzer des Wilcoxon Rank-Summen-Tests angegeben. Bei der Klassifikation wurden bei der einfachen Kreuzvalidierung 1 eine Sensitivität von 100 % und eine Spezifität von 83 % erreicht, was einer Falschklassifikation von 2 nicht infektiösen Proben entspricht.

Die zwei unabhängigen Proben wurden beide korrekt klassifiziert. Fig. 12 zeigt eine schematische Darstellung des abgeleiteten Score-Wertes und die Einteilung in 4 Bereiche. Liegt der berechnete Score über 6,5, so hat der Patient mit einer 95 %igen Wahrscheinlichkeit eine Sepsis. Liegt der Score unter -6,5, so ist die Wahrscheinlichkeit, keine Sepsis zu haben, für den Patienten ebenfalls 95 %. Auf diese Skala wurde das Klassifikationsergebnis projiziert. Der Score der Probe 933 nahm den Wert von -38,7 an und wurde als nicht infektiös klassifiziert; der Score der Probe 790 nahm den Wert von 9,1 an und wurde als infektiös klassifiziert.

Tab. 18a enthält die Rohdaten aus den Fluoreszenzmessungen mit SYBR Green am TECAN GENios. Tab. 18b zeigt die Rohdaten der unabhängigen Patienen- Proben sowie die Legende für die Gennamen und deren Zuordnung zu den SeqlDs.

Beispiel 4: Erreqertyp - Gram vs. Gram - Differenzielle Genexpression in

septischen Patienten mit gram-negativen und gram-positiven Sepsiserreqern sowie Identifizierung und partielle Validierung der Biomarkerkandidaten für eine diagnostische Anwendung.

In genomweiten Genexpressionsanalysen auf Mikroarrayplattformen wurden Biomarker identifiziert, welche in septischen Patienten mit Infektionen gram-negativer und gram-positiver Bakterien unterschiedlich stark exprimiert werden. Ausgehend von dieser Biomarkerliste mit 1 14 Markern wurde für drei Marker gezeigt, dass sich diese Genexpressionsunterschiede mittels quantitativer PCR darstellen lassen. Für diese 3 Marker wurden genspezifische Primer identifiziert und ihre Genaktivität mittels quantitativer PCR bestimmt.

Messung der Genexpression

Auswahl des Patientenkollektivs:

Aus der umfangreichen Patientendatenbank wurden Patientengruppen mit nachgewiesener (Identifizierung durch Blutkultur) gram-negativer und gram-positiver Infektion ausgewählt. Die für die Untersuchungen ausgewählten Patienten litten alle unter einer schweren Sepsis bzw. Septischem Schock. Die Sepsis ging in den meisten Fällen von einer Pneumonie (Lungenentzündung) oder einer Tracheobronchitis (Entzündung der Bronchien) aus (siehe Tab. 19).

Tabelle 19: Liste der untersuchten Patienten. Nicht unterlegt: Patienten mit gram-negativer Infektion; hellgrau unterlegt: Patienten mit gram-positiver Infektion.

Diese Patienten wurden in einer pangenomischen Genexpressionsstudie auf der Illumina-Plattform (wwwJJJ_ιumin_ιa.cgm_ι) analysiert.

Durchführung Genexpressionsanalvse auf Illumina-Plattform: Für die Illumina-Probenvorbereitung wird der „Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit" von Ambion (Ambion, USA) nach den darin enthaltenen Vorschriften verwendet. Die Vorbereitung der Hybridisierung erfolgt mit dem „Illumina Gene Expression System".

Die einzelnen Schritte sind nachfolgend prinzipiell beschrieben:

• Reverse Transkription (Erststrang cDNA-Synthese)

Es werden 50-500ng RNA in ein Microzentrifugenröhrchen geben und auf 1 1 μl mit Nuklease-freiem Wasser aufgefüllt.

Folgender Reaktionsmix wird zusammenpipettiert:

1 μl T7 Oligo (dT) Primer

2μl 10X First Strand Buffer

4μl dNTP Mix

1 μl RNase Inhibitor

1 μl Array Script Von dem Mix werden 9μl zur RNA-Probe gegeben und anschließend 2 Stunden bei 42 °C inkubiert. An den Poly-A-Überhang am 3' Ende der mRNA lagert sich das T7 Oligo(dT)-Nukleotid komplementär an, sodass die mRNA unabhängig von ihrer Sequenz mit Hilfe von ArrayScript in cDNA umgeschrieben wird. Nach den 2 Stunden Inkubation wird das Reaktionsgefäß wieder auf Eis gelegt.

• Illumina: Zweitstrang cDNA-Synthese Folgender Reaktionsmix wird auf Eis vorbereitet:

63μl Nuclease free H₂O

10μl 10X Second Strand Buffer

4μl dNTP Mix

2μl DNA Polymerase

1 μl RNase H

Zu der Probe werden 80μl vom Zweitstrang cDNA-Reaktionsmix gegeben und anschließend wird 2 Stunden bei 16°C im Thermocycler inkubiert. Während der Zweitstrangsynthese durch DNA-Polymerase wird gleichzeitig die RNA durch RNase H abgebaut.

• In Vitro Transkription (IVT, zur cRNA-Synthese) Bei Raumtemperatur wird folgender Mix vorbereitet:

2,5μl T7 10X Reaction Buffer 2,5μl T7 Enzyme Mix 2,5μl Biotin NTP Mix

Der angesetzte Mix wird zur Probe gegeben und 14h Stunden inkubiert. Der T7 Enzyme Mix enthält T7 RNA Polymerase, eine hoch Promotor-spezifische RNA- Polymerase, die ein DNA-Template benötigt. Das T7 Oligo(dT)-Nukleotid, welches für die Reverse Transkription verwendet wird, verfügt über eine T7-Promotor Sequenz, welche nun von der T7 RNA Polymerase erkannt wird. Es werden cRNA-Stränge (=Antisense RNA) synthetisiert, welche biotinyliertes UTP enthalten. Die In Vitro Transkription ist somit ein Amplifikations- und Markierungsschritt in einem. Anschließend an die Inkubation wird 75μl Nuklease-freies Wasser hinzugegeben.

Aufreiniqunq:

Nach der Zweitstrang-cDNA-Synthese folgt ein Aufreinigungsschritt, durch welchen RNA, Primer, Enzyme und Salz entfernt werden. Ein weiterer Aufreinigungsschritt nach der In Vitro Transkription entfernt Enzyme, Salz, sowie nicht eingelagerte Nukleotide.

Die Aufreinigung erfolgt über cDNA bzw. cRNA Filter Kartuschen, an welchen die Nukleinsäuren mittels cDNA- bzw. cRNA-Bindepuffer gebunden werden. Nach der Zugabe des Waschpuffers werden die Filterkartuschen trocken zentrifugiert und die Nukleinsäure wird mit RNase freiem Wasser in ein neues Reaktionsgefäß eluiert.

Hvbridisierunα:

Die Hybridisierung der cRNA an genspezifische Oligonukleotidsonden erfolgt auf sog. Beadarrays, welche auf Trägern, den Beadchips, angeordnet sind. Die benötigten Puffer, Lösungen und Hybridisierungskammern werden vom Hersteller in Form des Bead-Chip-Kits zur Verfügung gestellt (HumanWG-6 BeadChip-Kit, Illumina, www.illumina.com).

1 ,5μg der jeweiligen cRNA-Probe wird auf 10μl mit RNase freiem Wasser aufgefüllt. Zu der Probe werden 20μl GEX-HYB-Lösung hinzugefügt. In die Befeuchtungspufferreservoirs der Hybridisierungskammer werden 200μl GEX-HCB eingefüllt und die Bead Chips (Human WG-6 BeadChip, Illumina, www.illumina.com) werden in die Hybridisierungskammer eingesetzt. 30μl Probe wird auf die Probenöffnung des Arrays aufgetragen. Die Hybridisierungskammer wird sorgfältig verschlossen und die Proben werden 16-20 Stunden bei 58 °C inkubiert.

Die Bead Chips werden in E1 BC Waschlösung eingetaucht und im High-Temp Puffer bei 55 °C gewaschen. Anschließend erfolgen ein Waschschritt bei Raumtemperatur mit E1 BC-Lösung, ein Ethanolwaschschritt und ein weiterer Waschschritt mit E1 BC. Es folgt ein Blockierschritt mit Block E1 Puffer und ein Markierungsschritt mit Block E1 + Streptavidin-Cy3, bei dem an die biotinylierten Nukleotide der cRNA das fluoreszenzmarkierte Streptavidin bindet. Es wird nochmals mit E1 BC Puffer gewaschen und anschließend wird der Bead Chip durch Zentrifugation getrocknet (2min bei 500 rpm). Anschließend kann der Bead Chip mit dem Bead Array Reader (Illumina Beadstation 500, www.illumina.com) eingescannt werden.

Auswertung der Microarrav-Daten:

Mit dem Beadarray Reader wird der Bead Chip fluorometrisch ausgelesen. Der Scanner hat eine Auflösung von 0,8μm und somit wird von jedem der 48687 auf einem Array platzierten Beadtypen die Fluoreszenz an mindestens 9 Pixeln gemessen. Jeder Beadtyp liegt in mindestens 5facher Redundanz vor. Mit dem von Illumina zur Verfügung gestellte Programm Bead Studio 2.0 werden die Fluoreszenzwerte eines Beadtypen gemittelt und als „Average Signal" ausgegeben. Neben den Beads, die als Sonde für humane Gentranskripte dienen, gibt es auch Beadtypen, die als Negativ-Kontrollen wirken. Deren Sequenzen hybridisieren nicht mit Transkripten aus dem Human-Genom.

Mit Hilfe dieser Kontrollbeads wird das Hintergrundsignal ermittelt, welches von jedem gemittelten Signal abgezogen wird. Außerdem wird mit den Negativ-Kontrollen der Detektions-p-Wert jedes einzelnen Beadtypen ermittelt, der eine Auskunft darüber gibt, ob es sich um ein echtes Signal handelt oder ob die gemessene Intesität dem Hintergrund entspricht. Für die weiterführende Analyse werden nur die Beadtypen verwendet, bei denen mindestens einer der zehn Arrays einen Detektions- p-Wert unter 0,01 erreicht hat.

Für die Korrektur der systematischen Messfehler wurde die vom Datenverarbeitungsprogramm Bead Studio 2.0 (Bestandteil der Illumina Beadstation 500) vorgeschlagene Normalisierung mittels Cubic Splines gewählt. Entsprechend der Empfehlungen [MAQC-Consortium, 2006] wurden zusätzlich folgende Korrekturschritte zugefügt. Die Daten wurden mit der Statistiksoftware weiter bearbeitet (http://www.r.project.org). Aus allen für die weitere Analyse ausgewählten Beadtypen wird der kleinste gemittelte Signal-Wert ermittelt. Dieses Minimum wird von jedem gemittelten Signal subtrahiert, so dass nun das kleinste gemittelte Signal den Wert 0 annimmt. Zu jedem gemittelten Signal wird außerdem die Konstante 16 addiert, bevor zur Basis 2 logarithmiert wird. Nach dem Logarithmieren erhält das kleinste gemittelte Signal den Wert 4. Gleichzeitig wird verhindert, dass das gemittelte Signal einen negativen Wert annehmen kann.

Vergleicht man die Expressionsdaten von gram-positiven mit gram-negativen Proben, so wird das Verhältnis zwischen den Expressionswerten als „Fold Change" angegeben. Dieser Wert gibt an, um welchen Faktor das Transkript in der einen Probe anders exprimiert wurde als in der anderen Probe. Um den Logarithmischen FoId Change zu erhalten, wird die Differenz aus den Mittelwerten der normalisierten Daten beider Gruppen gebildet. Hier wird der FoId Change von gram-positiv bezüglich gram-negativ angegeben:

log₂ FoldChange = Mittelwert(normdata(gram+)) - Mittelwert(normdata(gram-)) log₂ FoldChange = Iog₂(gram+/gram-)

Die Zahl 2 wird mit dem Logarithmischen FoId Change potenziert, um einen Theoretischen FoId Change zu erhalten. Nimmt der Theoretische FoId Change einen Wert kleiner als eins an, so ergibt sich der FoId Change aus dem negativen Reziproken des Theoretischen FoId Changes. Im entgegengesetzten Fall entspricht der FoId Change dem Theoretischen FoId Change:

Theoretischer FoId Change = 2 ^{log2 Fold Changθ} = 2^log2(gram+/gram-) =gram+/gram- FoId Change: wenn Theoretischer FoId Change < 1

dann FoId Change =

TheoretischerFoldChange sonst FoId Change = Theoretischer FoId Change

Ein positiver FoId Change bedeutet, dass das entsprechende Gen im Fall einer gram-positiven Infektion stärker exprimiert wird als bei einer gram-negativen Infektion.

Für jeden Beadtyp wird außerdem der p-Wert für den t-Test und den Wilcoxon- Test berechnet. Unter der Annahme, dass die Nullhypothese des Tests richtig ist, gibt der p-Wert die Wahrscheinlichkeit an, dass der gemessene Wert durch Zufall zustande kommt. Ist diese Wahrscheinlichkeit geringer als eine vorgegebene Schranke, so wird angenommen, dass die Differenz nicht zufällig ist.

In Tab. 20 sind die identifizierten Biomarker dargestellt:

Tabelle 20: Differentielle Genexpression von Transkripten in gram-positiver und gram-negativer Sepsis, gemessen auf der Illumina-Genexpressionsplattform

Die Genaktivität von drei Markern aus dieser Liste wurden mittels quantitativer PCR an der cDNA derselben Patienten gemessen, um die Daten mit einer anderen Methode zu reproduzieren.

Die drei Marker sowie ein repräsentatives Primerpaar für die Quantifizierung mittel Real-Time-PCR sind in Tab. 21 dargestellt. Weiterhin werden zur relativen Quantifizierung sog. Referenzgene verwendet, welche im jeweiligen Gewebe konstant exprimiert sind. Die in diesem Experiment genutzten Referenzgene sind ebenfalls dargestellt.

Blutabnahme und RNA-Isolation:

Das Vollblut der Patienten wurde auf der Intensivstation von den Patienten mittels des PAXGene Kits gemäß den Vorgaben des Herstellers (Qiagen) abgenommen. Nach Abnahme des Vollblutes wurde die Gesamt-RNA der Proben unter Anwendung des PAXGene Blood RNA Kits gemäß den Vorgaben des Herstellers (Qiagen) isoliert.

Reverse Transkription:

Von jeder Patienten-Probe wurden 300 ng der Total-RNA zu komplementärer DNA (cDNA) mit der reversen Transkriptase Superscript Il (Invitrogen) in einem 20 μl- Ansatz umgeschrieben und die RNA anschließend durch alkalische Hydrolyse aus dem Ansatz entfernt. Die Reaktionsansätze wurden anschließend mit Hilfe von Microcon-Säulchen aufgereinigt.

Real-Time-PCR

Verwendet wurde der Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG - Kit der Firma Invitrogen. Für einen 10 μl-Ansatz wurden folgende Bestandteile pipettiert:

5 μl Platinum SYBR Green qPCR Supermix-UDG, 2x

1 μl Primer forward (10 pmol/μl)

1 μl Primer reverse (10 pmol/μl)

1 μl Fluorescein (0,5 μM)

1 μl H₂O, RNase frei

1 μl Template cDNA (6,67 ng/μl)

Verwendet wurde das iQ^™5 Multicolor Real-Time-PCR Detection System der Firma BIORAD mit der dazugehörigen Auswertungssoftware.

Ergebnisse

Die Ct-Werte der Real-Time-PCR wurden nach der Methode von Vandesompele normalisiert [Vandesompele et al., 2002]. Für die Vandesompele- Normalisierung wird zuerst die Relative Größe R für jedes Target (Interessierendes Gen (Gene gf hterest) und Referenzgen) berechnet:

Für die Effizienz E wird der idealisierte Wert 2 eingesetzt. Die Effizienz wird mit der Differenz aus dem kleinsten Ct-Wert aus allen Proben eines Gens und der jeweiligen Patientenprobe potenziert. Der Normalisierungsfaktor NF wird über das geometrische Mittel der Relativen Größen R der Referenzgene (Ref) berechnet:

Für den Normalisierungsfaktor wird die dritte Wurzel aus dem Produkt der drei Referenzgene gezogen. Um die normalisierten Daten zu erhalten, wird der Quotient aus Relativer Größe R und dem Normalisierungsfaktor gebildet:

In diesem Zusammenhang zeigt Fig. 13 die differenzielle Expression des Gens CDKN1 C in septischen Patienten mit gram-positiver und gram-negativer Infektion. Im Boxplot sind die mittleren normalisierten Ct-Werte für jeweils 5 Patienten dargestellt. Ermittelt wurden diese Werte mit realtime-PCR an der cDNA der Patienten. Fig. 14 zeigt die differenzielle Expression des Gens CTSL in septischen Patienten mit gram-positiver und gram-negativer Infektion. Im Boxplot sind ebenfalls die mittleren normalisierten Ct-Werte für jeweils 5 Patienten dargestellt. Ermittelt wurden diese Werte mit realtime-PCR an der cDNA der Patienten.

In Fig. 15 wird die differenzielle Expression des Gens METTL7B in septischen Patienten mit gram-positiver und gram-negativer Infektion gezeigt. Im Boxplot sind die mittleren normalisierten Ct-Werte für jeweils 5 Patienten dargestellt. Ermittelt wurden diese Werte mit realtime-PCR an der cDNA der Patienten.

Tab. 22 zeigt Rohdaten (Ct-Werte, Mittelwerte aus Triplikaten) aus den qPCR- Assays für den Marker CDKN1 C (SeqlD 104).

Tab. 23 enthält nach Vandesompele [Vandesompele et al., 2002] normalisierte Rohdaten aus den qPCR-Assays für den Marker CDKN1 C (SeqlD 104).

In Tab. 24 sind Rohdaten (Ct-Werte, Mittelwerte aus Triplikaten) aus den qPCR- Assays für den Marker CTSL (SeqlD 149) enthalten.

Tab 25 zeigt nach Vandesompele [Vandesompele et al., 2002] normalisierte Rohdaten aus den qPCR-Assays für den Marker CTSL (SeqlD 149).

In Tab. 26 sind Rohdaten (Ct-Werte, Mittelwerte aus Triplikaten) aus den qPCR- Assays für den Marker METTL7B (SeqlD 145) enthalten.

Tab. 27 zeigt nach Vandesompele [Vandesompele et al., 2002] normalisierte Rohdaten aus den qPCR-Assays für den Marker METTL7B (SeqlD 145).

Tabelle 22: Rohdaten (Ct-Werte, Mittelwerte) aus den qPCR-Assays für den Marker CDKN1 C (SeqlD 104). Hellgrau: Patienten mit gram-negativer Infektion, dunkelgrau: Patienten mit gram-positiver Infektion.

Tabelle 23: Nach Vandesompele normalisierte Rohdaten aus den qPCR-Assays für den Marker CDKN 1 C (SeqlD 104). Hellgrau: Patienten mit gram-negativer Infektion, dunkelgrau: Patienten mit gram-positiver Infektion.

Tabelle 24: Rohdaten (Ct-Werte, Mittelwerte) aus den qPCR-Assays für den Marker CTSL (SeqlD 149). Hellgrau: Patienten mit gram-negativer Infektion, dunkelgrau: Patienten mit gram-positiver Infektion.

Tabelle 25: Nach Vandesompele normalisierte Rohdaten aus den qPCR-Assays für den Marker CTSL (SeqlD 149). Hellgrau: Patienten mit gram-negativer Infektion, dunkelgrau: Patienten mit gram-positiver Infektion.

Tabelle 26: Rohdaten (Ct-Werte, Mittelwerte) aus den qPCR-Assays für den Marker METTL7B (SeqlD 145). Hellgrau: Patienten mit gram-negativer Infektion, dunkelgrau: Patienten mit gram-positiver Infektion.

Tabelle 27: Nach Vandesompele normalisierte Rohdaten aus den qPCR-Assays für den Marker METTL7B (SeqlD 145). Hellgrau: Patienten mit gram-negativer Infektion, dunkelgrau: Patienten mit gram-positiver Infektion.

Signifikanz der Ergebnisse

Mit dem Wilcoxon Test wurde anschließend überprüft, ob die Ergebnisse signifikant sind. Die aufgestellte Nullhypothese besagte, dass es keine signifikanten Unterschiede in den beiden Gruppen bezüglich der Genexpression gibt. Die Nullhypothese konnte bei allen 3 Targets widerlegt werden. Damit ist der Unterschied zwischen gram-positiven und gram-negativen Septikern bezüglich der Expression von CDKN1 C( SeqlD 104), CTSL (SeqlD 149) und METTL7B (SeqlD 145) mit einer 95%igen Wahrscheinlichkeit nicht zufällig.

FoId Change

Um die x-fache Veränderung einer größeren Anzahl von Werten miteinander zu vergleichen, wurde aus den nach Vandesompele normalisierten Werten zuerst das geometrische Mittel jeder Gruppe gebildet. Der FoId Change bzw. die x-fache Veränderung der Genexpression berechnet sich dann aus dem Quotienten der nach Vandesompele normalisierten Ct-Werte der zu vergleichenden Gruppen. Die Effizienz der PCR wurde schon bei der Normalisierung einberechnet, sodass sie an dieser Stelle entfällt.

Der FoId Change der Patienten berechnet sich somit wie folgt:

Alle drei untersuchten Targets wiesen in der PCR-Analyse einen FoId Change_Gram₊ vs Gram- mit der gleichen Tendenz wie in der Microarrayauswertung auf. Dabei fällt auf, dass das Target METTL7B, welches bei Illumina den größten FoId Change erzielte nun auch in der PCR-Analyse den höchsten Wert annimmt.

Tab. 28 zeigt medizinische Parameter der in die Analyse eingegangenen Patienten wie sie von Seiten der Klinik validiert wurden.

Tabelle 28: Medizinische Parameter der in die Analyse eingegangenen Patienten. Hellgrau: Patienten mit gram-negativer Infektion, dunkelgrau: Patienten mit gram-positiver Infektion.

Beispiel 5: Nicht-kodierende RNA - Differenzielle Genexpression eines Transkriptes ohne Protein-kodierende Funktion (sog, nicht-kodierende RNA) in SIRS- und Sepsis-Patienten mittels Real-Time-PCR.

Messung der Genexpression

Es wurden 5 Patienten mit Pneumonie als Sepsis-Vertreter und im Fall der SIRS 5 Patienten mit einer schweren Herz-OP ausgewählt (Cardiopulmonaler Bypass, CPB), da diese den Großteil der SIRS-Patienten auf einer ITS stellen (siehe Tab. 29). Die Patienten wurden retrospektiv von einem Ärzte-Team der Uni-Klinik Jena in ihrer Diagnose validiert.

Tabelle 29: Liste der untersuchten Patienten

Der Marker mit der SeqlD 207 (Accession-No. AA868082) für nichtkodierende RNA ist Bestandteil der oben angeführten Biomarkerliste.

Tab. 30 zeigt ein Beispiel eines Primerpaares für die Amplifikation des nicht- kodierenden Markers mit der SeqlD 207 in der Real-Time PCR. Es wurden 10 Patienten untersucht (5 Sepsis-Patienten, 5 SIRS-Patienten).

Experimentelle Ausführung

Blutabnahme und RNA-Isolation

Reverse Transkription

Von jeder Patienten-Probe wurden 4 μg der Total-RNA zu komplementärer DNA (cDNA) mit der Reversen Transkriptase Superscript Il (Invitrogen) und den genspezifischen Primern in einem 20 μl-Ansatz umgeschrieben (10 mM dNTP-Mix und 2 μM genspezifische Primer (SeqlD 207) und die RNA anschließend durch alkalische Hydrolyse aus dem Ansatz entfernt. Die Reaktionsansätze wurden mit Microcon-Säulchen aufgereinigt, die eluierte cDNA in der SpeedVac eingedampft und anschließend in 50 μl Wasser aufgenommen.

Real-Time-PCR

Verwendet wurde der Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG - Kit der Firma Invitrogen. Die Patienten-cDNA wurde 1 :100 mit Wasser verdünnt und davon jeweils 2 μl in die PCR eingesetzt. Alle Ansätze wurden in 3facher Ausführung pipettiert.

1 μl reverse primer, 10 mM

1 μl Fluorescein Reference Dye

5 μl Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG, 2x

Es wurde ein Mastermix ohne Template hergestellt, dieser wurde in 8 μl- Aliquots in die PCR-Platte gesteppt und dazu wurden jeweils die Patienten-cDNAs pipettiert. Das sich daran anschließende PCR-Programm war folgendermaßen aufgebaut:

Ergebnisse

Die mittels Real-Time-Assays gemessenen Expressionssignale wurden im Excel-Format abgespeichert und über die 3-fach-Bestimmungen gemittelt. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tab. 31 gezeigt.

Tabelle. 31 Ct-Werte aus den Real Time-Assays

Fig. 16 zeigt einen Boxplot für den nicht-kodierenden Marker mit der SeqlD 207, erstellt aus 10 Patienten-Proben (5 mit Sepsis-Diagnose, 5 mit SIRS). Auf der y- Achse ist der mittlere Ct-Wert während der Real-Time- Amplifikation dargestellt. Es ist eine klare Trennung von Sepsis- und SIRS-Patienten erkennbar.

Die folgende Tab. 32 stellt den Bezug zwischen der Sequenzprotokollnummer der einzelnen Polynukleotide und deren öffentlich zugänglichen Accession-Nummer her.

Tabelle 32: Korrelation von Sequenznummer (Sequenzprotkoll) und Accession- Nummer

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Claims

Ansprüche

1. Verfahren zur in vitro Erfassung und/oder Unterscheidung und/oder Verlaufsbeobachtung von pathophysiologischen Zuständen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: SIRS, Sepsis und deren Schweregraden; sepsisähnlichen Zuständen; septischem Schock; infektiösem/nicht-infektiösem Multiorganversagen; Überlebenswahrscheinlichkeit bei Sepsis; Fokus einer Infektion; Responder/non-Responder für eine bestimmte Therapie; Ursachen eines pathophysiologischen Zustandes, insbesondere Klassifizierung einer Infektion nach gram-positiven und/oder gram-negativen Bakterien; wobei das Verfahren folgende Schritte umfaßt:

2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das wenigstens eine Referenzgen ein Housekeepinggen ist, insbesondere ausgewählt aus Polynukleotiden der Gruppe bestehend aus SEQ-ID NO: 676 bis SEQ-ID NO: 686, und/oder deren Genloci und/oder deren Transkripten und/oder Fragmenten davon.

3. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass als Polynukleotidsequenzen Genloci, sense und/oder antisense Stränge von prä- mRNA und/oder mRNA, small RNA, insbesondere scRNA, snoRNA, micro RNA, siRNA, dsRNA , ncRNA oder transposable Elemente zur Erfassung der Genexpressionsprofile verwendet werden.

4. Verwendung einer Mehrzahl von Polynukleotiden, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ-ID NO: 1 bis SEQ-ID NO: 669 und/oder deren Genloci und/oder deren Transkripten und/oder Fragmenten davon, zur Bildung wenigstens eines Multigenbiomarkers zur Herstellung eines Multiplex-Assays als Hilfsmittel zur Beurteilung, ob bei einem Patienten ein pathophysiologischer Zustand vorliegt, und/oder zur Feststellung des Schweregrades und/oder des Verlaufs des pathophysiologischen Zustands.

5. Verwendung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Multigenbiomarker eine Kombination von mehreren Polynukleotid-, insbesondere Gensequenzen ist, anhand deren Genaktivitäten mittels einer Interpretationsfunktion eine Klassifikation durchgeführt und/oder ein Index gebildet wird.

6. Verwendung nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Genaktivitäten mittels enzymatischer Verfahren, insbesondere Amplifikationsverfahren, bevorzugt Polymereasekettenreaktion (PCR), vorzugsweise Real-Time-PCR; und/oder mittels Hybridisierungsverfahren, insbesondere solchen auf Microarrays, erfasst werden.

7. Verwendung nach einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass aus den einzelnen bestimmten Genaktivitäten ein Index gebildet wird, der nach entsprechender Kalibrierung ein Maß für den Schweregrad und/oder den Verlauf des pathophysiologischen Zustands, insbesondere der Sepsis oder des sepsisähnlichen Zustandes, ist.

8. Verwendung nach einem der Ansprüche 4 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Index auf einer leicht interpretierbaren Skala angezeigt wird.

9. Verwendung nach einem der Ansprüche 4 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass man die erhaltenen Genaktivitätsdaten zur Herstellung von Software für die Beschreibung mindestens eines pathophysiologischen Zustands und/oder einer Untersuchungsfrage und/oder als Hilfsmittel für Diagnosezwecke und/oder für Patientendatenmangement-Systeme einsetzt.

10. Verwendung nach einem der Ansprüche 4 bis 9, wobei zur Erstellung der Genaktivitätsdaten solche spezifischen Genloci, sense und/oder antisense Stränge von prä-mRNA und/oder mRNA, small RNA, insbesondere scRNA, snoRNA, micro RNA, siRNA, dsRNA, ncRNA oder transposable Elemente, Gene und/oder Genfragmente verwendet werden, welche eine Sequenzhomologie von mindestens ca. 10%, insbesondere ca. 20%, vorzugsweise ca. 50%, besonders bevorzugt ca. 80% zu den Polynukleotidsequenzen gemäß SEQ-ID NO: 1 bis SEQ-ID NO: 669 aufweisen.

1 1. Verwendung mindestens eines Polynukleotids, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ-ID NO: 1 bis SEQ-ID NO: 152 und/oder deren Genloci und/oder deren Transkripten und/oder Fragmenten davon, zur Herstellung eines Assays zur Beurteilung, ob bei einem Patienten ein pathophysiologischer Zustand vorliegt, und/oder zur Feststellung des Schweregrades und/oder des Verlaufs des pathophysiologischen Zustands.

12. Verwendung nach einem der Ansprüche 4 bis 1 1 , dadurch gekennzeichnet, dass der pathophysiologische Zustand ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: SIRS, Sepsis und deren Schweregraden; sepsisähnlichen Zuständen; septischem Schock; infektiösem/nicht-infektiösem Multiorganversagen; lokaler/systemischer Infektion; Verbesserung/Verschlechterung eines pathophysiologischen Zustandes, insbesondere Sepsis; Responder/non-Responder für eine bestimmte Therapie; Fokus einer Infektion; Ursachen eines pathophysiologischen Zustandes, insbesondere Klassifizierung nach gram-positiv und/oder gram-negativ.

13. Verwendung nach einem der Ansprüche 4 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Probennukleinsäure RNA, insbesondere Gesamt-RNA oder mRNA, oder DNA, insbesondere cDNA, ist.

14. Kit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 3, enthaltend mindestens einen Multigenbiomarker, welcher eine Mehrzahl von Polynukleotidsequenzen umfasst, die aus dem Pool von SEQ-ID NO: 1 bis SEQ-ID NO: 669 und/oder deren Genloci und/oder deren Transkripten und/oder Fragmenten davon ausgewählt sind, und/oder Primer und/oder Sonden und/oder Antisensenukleotide hierfür, wobei der Multigenbiomarker spezifisch für einen pathophysiologischen Zustand eines Patienten ist und solche Zustände einschließt, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: SIRS, Sepsis und deren Schweregraden; sepsisähnlichen Zuständen; septischem Schock; infektiösem/nicht-infektiösem Multiorganversagen; Überlebenswahrscheinlichkeit bei Sepsis; lokaler/systemischer Infektion; Responder/non-Responder für eine bestimmte Therapie; Fokus einer Infektion; Ursachen eines pathophysiologischen Zustandes, insbesondere Klassifizierung einer Infektion nach gram-positiven oder gram-negativen Erregern.

15. Kit nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die

Polynukleotidsequenzen auch Genloci, sense und/oder antisense Stränge von prä-mRNA und/oder mRNA, small RNA, insbesondere scRNA, snoRNA, micro RNA, siRNA, dsRNA , ncRNA oder transposable Elemente umfassen.