DE102007036678A1

DE102007036678A1 - Verwendung von Polynukleotiden zur Erfassung von Genaktivitäten für die Unterscheidung zwischen lokaler und systemischer Infektion

Info

Publication number: DE102007036678A1
Application number: DE200710036678
Authority: DE
Inventors: Stefan Dr. Rußwurm
Original assignee: SIRS Lab GmbH
Current assignee: SIRS Lab GmbH
Priority date: 2007-08-03
Filing date: 2007-08-03
Publication date: 2009-02-05
Anticipated expiration: 2027-08-04
Also published as: US20100203534A1; CA2699433A1; EP2179054A1; JP2010535017A; DE102007036678B4; WO2009018962A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Polynukleotiden mit einer Länge von 2 bis 100% der Anzahl der Nukleotide der einzelnen Sequenzen gemäß SEQ-ID Nr. 1 bis SEQ-ID Nr. 69 und/oder deren Genloci und/oder deren Transkripte zur Erfassung von Genaktivitäten für die Unterscheidung eines mit einer lokalen Infektion einhergehenden Zustandes von einem mit einer systemischen Infektion einhergehenden Zustand eines Patienten, wobei sämtliche Sequenzen gemäß SEQ-ID Nr. 1 bis SEQ-ID Nr. 69 verwendet werden; sowie ein Verfahren und einen Kit zur Durchführung des Verfahrens.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Polynukleotiden und/oder deren Genloci und/oder deren Transkripte zur Erfassung von Genaktivitäten für die Unterscheidung eines mit einer lokalen Infektion einhergehenden Zustandes von einem mit einer systemischen Infektion einhergehenden Zustand eines Patienten gemäß Anspruch 1 sowie die Verwendung von aus Patientenproben erhaltenen Genaktivitäten für die Unterscheidung eines mit einer lokalen Infektion einhergehenden Zustandes von einem mit einer systemischen Infektion einhergehenden Zustand eines Patienten gemäß Anspruch 3 und Anspruch 15. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur in vitro Messung von Genaktivitäten gemäß Anspruch 17 sowie einen Kit gemäß Anspruch 25.
Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere Markergene und/oder deren Fragmente und ihre Verwendung zur Differenzierung lokaler von systemischen Infektionen mittels Genexpressionsanalysen. Die Erfindung betrifft ferner von den Markergenen abgeleitete PCR-Primer und Sonden.
Bakterienzellwandbestandteile wie Lipopolysaccharide verursachen Veränderungen der Cytokinkonzentrationen im Blut (Mathiak 2003) und einzelne Proteinmarker wie Procalcitonin (PCT) und Mannan-binding lectin (MBL) werden zur Anzeige postoperativer Infektionen benutzt (Siassi 2005). Die Immunantwort von Blut auf bakterielle Pathogene ist auch mittels funktioneller Genomik charakterisierbar (Feezor und Moldawer 2003, M. Foti et al, 2006)) und bakterielle Proteine verursachen Veränderungen der Transkription und Translation in Wirtszellen (Flo 2004). Genexpressionsprofile können daher auch zur Bestimmung der Mechanismen antibakterieller Substanzen verwendet werden (Hutter 2004). Eine Transkriptionsanalyse von Genen in einer Blutprobe wurde eingesetzt um Unterschiede bei überlebenden und nicht-überlebenden Sepsispatienten zu charakterisieren (Pachot 2006).
Obwohl Expressionsveränderungen einzelner Gene bei verschiedenen Erkrankungen bekannt sind und auch bei lokaler Infektion einzelne Expressionsänderungen im Muskelgewebe der Maus (A. Boelen, 2005) und mehrere in Epithelzellen bei lokaler viraler Infektion von Hühnern (X. Wang, 2006) oder in der Darmmukosa von Schweinen (T. A. Niewold, 2006) beschrieben wurden, sind keine Markergene und deren Transkripte sowie die kombinierte Verwendung mehrerer quantitativer Transkriptionswerte aus Vollblutproben und Blutzellen zur Differenzierung lokaler von systemischen Infektionen bekannt. Jedoch ist aus der Literatur (Rittirsch et al., 2006 und Esmond, 2004) bekannt, dass an Tiermodellen durchgeführte Expressionsanalysen nicht unbedingt auf die humane Pathophysiologie übertragbar sind.
Die Quantifizierung von Transkripten (auch mRNA und small RNA, insbesondere microRNA sowie weitere RNAs) mit veränderlicher Konzentration aus Blut, aus Blutzellen und aus Zellen aus Organen und peripherem Gewebe, welche in Vollblut lokalisiert sind, stellen eine Voraussetzung für Blut-basierte Hilfsmittel der Diagnostik dar.
Ausgangspunkt für die in der vorliegenden Patentanmeldung offenbarte Erfindung ist die Erkenntnis, dass Genaktivitäten verschiedener Gene, welche in Blutzellen vorkommen, in Proben eines Individuums bei lokaler und systemischer Infektion sich von den Genaktivitäten der betroffenen Gene von Individuen, bei denen keine Infektion, keine lokale oder systemische Infektion diagnostiziert wurde, unterscheiden und gemeinsam oder einzeln als Markergene mit erkrankungsbedingter Konzentrationsänderung von Transkripten aus Blut verwendet werden können. Eine Normalisierung oder relative Quantifizierung der Aktivitäten dieser Gene kann als Hilfsmittel zur Diagnose, Prognose, Therapie- und Verlaufskontrolle genutzt werden.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, Mittel und Verfahren zur Verfügung zu stellen, welche eine Differenzierung lokaler von systemischer Infektion, Diagnose und/oder Verlaufskontrolle und/oder Therapie ermöglicht durch Unterscheidung krankheitsbedingter Genexpressionsänderungen in einer biologischen Probe.
Diese Aufgabe wird durch die Merkmale der Ansprüche 1, 3 und 15 gelöst.
Verfahrenstechnisch wird die Aufgabe durch die Merkmale des Anspruchs 17 gelöst.
Ein Kit gemäß Anspruch 25 löst die Aufgabe ebenfalls.
Die Unteransprüche stellen bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung dar.
Definitionen:
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung werden folgende Definitionen verwendet:
Lokale Infektion: Eine lokale infektion ist eine Infektion, bei der die Erreger am Infektionsort verbleiben und nur an dieser Stelle Symptome verursachen, ohne sich im Körper weiterzuverteilen. Eine lokale infektion ist beispielsweise eine Infektion der Atemwege, ein Durchfall oder ein Furunkel an der Haut.
Eine systemische Infektion ist eine Infektion, bei der sich die Erreger über ein gesamtes Organsystem oder den gesamten Organismus ausbreiten.
Biologische Flüssigkeit: Als biologische Flüssigkeiten im Sinne der Erfindung werden alle Körperflüssigkeiten der Säugetiere, einschließlich des Menschen, verstanden.
Gen: Ein Gen ist ein Abschnitt auf der Desoxyribonukleinsäure (DNA), der die Grundinformationen zur Herstellung einer biologisch aktiven Ribonukleinsäure (RNA) enthält. Als Gene im Sinne der Erfindung werden auch alle abgeleiteten DNA-Sequenzen, Partialsequenzen und synthetische Analoga (beispielsweise Peptido-Nukleinsäuren (PNA)) verstanden. Die auf Bestimmung der Genexpression auf RNA-Ebene bezogene Beschreibung der Erfindung stellt somit ausdrücklich keine Einschränkung sondern nur eine beispielhafte Anwendung dar.
Genlocus: Genlocus (Genort) ist die Position eines Gens im Genom. Besteht das Genom aus mehreren Chromosomen, ist die Position innerhalb des Chromosoms gemeint, auf dem sich das Gen befindet. Verschiedene Ausprägungen oder Varianten dieses Gens werden als Allele bezeichnet, die sich alle an derselben Stelle auf dem Chromosom, nämlich dem Genlocus befinden. Somit beinhaltet der Begriff „Genlocus" einerseits die reine genetische Information für ein spezifisches Genprodukt und andererseits sämtliche regulatorische DNA-Abschnitte sowie sämtliche zusätzlichen DNA-Sequenzen, welche mit dem Gen am Genlocus in irgendeinem funktionellen oder nicht funktionellen Zusammenhang stehen.
Genaktivität: Unter Genaktivität wird das Maß der Fähigkeit eines Gens verstanden, transkribiert zu werden und/oder Translationsprodukte zu bilden.
Genexpression: Der Vorgang, ein Genprodukt zu bilden und/oder Ausprägung eines Genotyps zu einem Phänotyp.
Markergen: Ein Markergen ist ein Gen, welches eine erkrankungsbezogene Änderung seiner Expression und Transkription über verschiedene RNA Proben zeigt und dessen veränderliche Genaktivität der Diagnose, Verlaufs- und Therapiekontrolle über verschiedene Proben dient.
Hybridisierungsbedingungen: Dem Fachmann wohl bekannte physikalische und chemische Parameter, welche die Etablierung eines thermodynamischen Gleichgewichtes aus freien und gebundenen Molekülen beeinflussen können. Im Interesse optimaler Hybridisierungsbedingungen müssen Zeitdauer des Kontaktes der Sonden- und Probenmoleküle, Kationenkonzentration im Hybridisierungspuffer, Temperatur, Volumen sowie Konzentrationen und -verhältnisse der hybridisierenden Moleküle aufeinander abgestimmt werden.
Amplifikationsbedingungen: Sich zyklisch verändernde Reaktionsbedingungen, welche die Vervielfältigung des Ausgangsmateriales in Form von Nukleinsäuren ermöglichen. Im Reaktionsgemisch liegen die Einzelbausteine (Desoxynukleotide) für die entstehenden Nukleinsäuren vor, ebenso wie kurze Oligonukleotide, welche sich an komplementäre Bereiche im Ausgangsmaterial anlagern können, sowie ein Nukleinsäure-Synthese-Enzym, Polymerase genannt. Dem Fachmann wohl bekannte Kationenkonzentrationen, pH-Wert, Volumen und die Dauer und Temperatur der einzelnen sich zyklisch wiederholenden Reaktionsschritte sind von Bedeutung für den Ablauf der Amplifikation.
Primer: Als Primer wird in der vorliegenden Erfindung ein Oligonukleotid bezeichnet, das als Startpunkt für DNA-replizierende Enzyme wie die DNA-Polymerase dient. Primer können sowohl aus DNA als auch aus RNA bestehen (Primer3, siehe z. B. http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi des MIT)
Sonde: In der vorliegenden Anmeldung ist eine Sonde ein Nukleinsäurefragment (DNA oder RNA), das mit einer molekularen Markierung (z. B. Fluoreszenzlabel, insbesondere molecular beacons, TagMan^®-Sonden, Isotopenmarkierung, usw.) versehen werden kann und zur sequenzspezifischen Detektion von Ziel-DNA- und/oder Ziel-RNA-Molekülen eingesetzt wird.
PCR: ist die Abkürzung für die englische Bezeichnung „Polymerase Chain Reaction" (Polymerase-Kettenreaktion). Die Polymerase-Kettenreaktion ist eine Methode, um DNA in vitro außerhalb eines lebenden Organismus mit Hilfe einer DNA-abhängigen DNA Polymerase zu vervielfältigen. PCR wird insbesondere gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt, um kurze Teile – bis zu etwa 3.000 Basenpaare – eines interessierenden DNA-Strangs zu vervielfältigen. Dabei kann es sich um ein Gen oder auch nur um einen Teil eines Gens oder auch um nicht kodierende DNA-Sequenzen handeln. Es ist dem Fachmann wohl bekannt, dass eine Reihe von PCR-Verfahren im Stand der Technik bekannt sind, welche alle durch den Begriff „PCR" mit umfasst sind. Dies gilt insbesondere für die „real-time-PCR".
PCR-Primer: Typischerweise benötigt eine PCR zwei Primer, um auf den beiden Einzelsträngen der DNA jeweils den Startpunkt der DNA-Synthese festzulegen, wodurch der zu vervielfältigende Bereich von beiden Seiten begrenzt wird. Derartige Primer sind dem Fachmann wohlbekannt, beispielsweise aus der Website „Primer3", siehe z. B. http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi des MIT.
Transkript: Für die Zwecke der vorliegenden Anmeldung wird unter einem Transkript jegliches RNA-Produkt verstanden, welches anhand einer DNA-Vorlage hergestellt wird.
small RNA: Kleine RNAs im Allgemeinen. Vertreter dieser Gruppe sind insbesondere, jedoch nicht ausschließlich:

a) scRNA (small cytoplasmatic RNA), welche eines von mehreren kleinen RNA-Molekülen im Cytoplasma eines Eukaryonten ist.
b) snRNA (small nuclear RNA), eine der vielen kleinen RNA-Formen, die nur im Zellkern vorkommen. Einige der snRNAs spielen beim Spleißen oder bei anderen RNA-verarbeitenden Reaktionen eine Rolle.
c) small non-Protein-coding RNAs, welche die sogenannten small nucleolar RNAs (snoRNAs), microRNAs (miRNAs), short interfering RNAs (siRNAs) und small double-stranded RNAs (dsRNAs) einschließen, welche die Genexpression auf vielen Ebenen, einschließlich der Chromatin-Architektur, RNA-Editierung, RNA-Stabilität, Translation und möglicherweise auch Transkription und Spleißen. Im Allgemeinen werden diese RNAs auf mehrfachem Wege prozessiert aus den Introns und Exons längerer Primärtranskripte, einschließlich proteincodierender Transkripte. Obwohl etwa nur 1,2% des Humangenoms Proteine codiert, wird ein großer Teil dennoch transkribiert. Tatsächlich bestehen ca. 98% der in Säugern und Menschen gefundenen Transkripte aus non-Protein-coding RNAs (ncRNA) aus Introns von proteincodierenden Genen und den Exons und Introns von nicht proteincodierenden Genen, einschließlich vieler, welche anti-sense zu proteincodierenden Genen sind oder mit diesen überlappen.

Small nucleolar RNAs (snoRNAs) regulieren die sequenzspezifische Modifikation von Nukleotiden in Target-RNAs. Hierbei treten zwei Typen von Modifikationen auf, nämlich 2'-O-Ribosemethylierung und Pseudouridylierung, welche durch zwei große snoRNA-Familien reguliert werden, die einerseits box C/D-snoRNAs und andererseits box H/ACA snoRNAs genannt werden. Derartige snoRNAs weisen eine Länge von etwa 60 bis 300 Nukleotiden auf.
miRNAs (microRNAs) und siRNAs (short interfering RNAs) sind noch kleinere RNAs mit im Allgemeinen 21 bis 25 Nukleotiden. miRNAs stammen aus endogenen kurzen Hairpin-Vorläuferstrukturen und benutzen gewöhnlich andere loci mit ähnlichen – jedoch nicht identischen Sequenzen als Ziel translationaler Repression.
siRNAs entstehen aus längeren doppelsträngigen RNAs oder langen Hairpins, oftmals exogenen Ursprungs. Sie haben gewöhnlich homologe Sequenzen an demselben Locus oder woanders im Genom zum Ziel, wo sie am sogenannten gene silencing, ein Phänomen, welches auch RNAi genannt wird, beteiligt sind.
Die Grenzen zwischen miRNAs und siRNAs sind jedoch fließend.

d) Zusätzlich kann der Begriff "small RNA" auch sogenannte transposable Elemente (TEs) und insbesondere Retroelemente umfassen, welche ebenfalls für die Zwecke der vorliegenden Erfindung unter dem Begriff „small RNA" verstanden werden.

Die Erfindung beschreibt die Identifikation von neuen Markergenen aus Blut, geeignete Mikroarray-Sonden und ihre Verwendung, auch in Kombination, zur Bestimmung von normalisierten und quantitativen Expressionsdaten aus Blut und Blutzellen in Microarrays, real-time PCR assays und anderen Messsystemen mit oder ohne Amplifikation und mit verschiedenen Quantifizierungs- und Visualisierungsmöglichkeiten zur Bestimmung lokaler Entzündungen und zur Differenzierung von generalisierten systemischen Entzündungen, Infektionen und daraus resultierenden Immunreaktionen bei der systemischen Reaktion darauf.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man in einer Probe einer biologischen Flüssigkeit, insbesondere Blutprobe oder einer Gewebeprobe eines Individuums die Aktivität von einem oder mehreren Markergenen durch Feststellung der Anwesenheit und der Menge des Genprodukts auch relativ zu den Mengen der Genprodukte von Kontrollgenen oder normalisiert oder quantifiziert über weitere, dem Fachmann bekannten Verfahren, zwischen lokaler und systemischer Infektion unterscheiden kann.

Offenbart werden hierzu Gensequenzen aus Blut und Blutzellen sowie daraus abgeleitete Sonden, welche zur Bestimmung, Visualisierung, Normalisierung und Quantifizierung von Genaktivitäten und Transkripten verwendet werden können. Die Sequenzen der Oligonukleotidsonden in bevorzugter Ausführung sind in Tabelle 1 bis 5 dargelegt und entsprechen dem im beigefügten Sequenzprotokoll SEQ-ID No 1 bis SEQ-ID No 69. Dabei können die Sequenzen der Oligonukleotidsonden auch weitere Sequenzen, in bevorzugter Ausführung von einer Länge von 50–100 Nukleotiden annehmen, welche spezifisch Transkripte der in Tabelle 1 bis 5 dargelegten Gene mit Sequenzen SEQ-ID No 1 bis SEQ-ID No 69 binden. Die Länge und Kombination der in Amplifikationsverfahren wie PCR verwendeten Sequenzen kann beliebig sein soweit sie die gewünschte enzymatische Manipulation und Amplifikation unterstützen.

Seq Nr.	Tabelle 1
Seq Nr.	Immunantwort
1	CD59	NM_000611
2	CD59	NM_203331
3	CD59	NM_203330
4	CD59	NM_203329
5	TNFSF8	NM_001244
6	CCL4	NM_002984
7	CCL5	NM_002985
8	CCL19	NM_006274
9	CD74	NM_001025159
10	CD74	NM_004355
11	CD74	NM_001025158
12	CCL26	NM_006072
13	IFNA14	NM_002172
14	IFNA21	NM_002175
15	IFNA16	NM_002173
16	TNIP1	NM_006058

Seq Nr.	Tabelle 2
Seq Nr.	Regulierung des Zellzyklus
17	CLK1	NM_004071
18	CLK1	NM_001024646
19	MAPK7	NM_139033
20	MAPK7	NM_139032
21	MAPK7	NM_002749
22	MAPK7	NM_139034
23	UBE2V1	NM_021988
24	UBE2V1	NM_199144
25	UBE2V1	NM_022442
26	UBE2V1	NM_001032288
27	Kua-EUV	NM_199203
28	Kua-EUV	NM_003349
29	DUSP6	NM_001946
30	DUSP6	NM_022652

Seq Nr.	Tabelle 3
Seq Nr.	Positive Regulierung der 1-kappaB kinase/NF-kappaB Kaskade
31	HMOX1	NM_002133
32	CASP1	NM_033292
33	CASP1	NM_001223
34	CASP1	NM_033293
35	CASP1	NM_033294
36	CASP1	NM_033295
37	RHOA	NM_001664

Seq Nr.	Tabelle 4
Seq Nr.	Zelloberflächenrezeptoren-vermittelte Signal Transduktion
38	IL7R	NM_002185
39	DOK2	NM_003974
40	MYD88	NM_002468

Seq Nr.	Tabelle 5
Seq Nr.	Sonstige Signalwege
41	CCR2	NM 000647
42	CCR2	NM 000648
43	GPR109A	NM 177551
44	GZMB	NM_004131
45	CLU	NM_001831
46	CLU	NM_203339
47	ATP2B1	NM_001001323
48	ATP2B1	NM_001682
49	CLIC1	NM_001288
50	MAP2K1	NM_002755
51	ARPC1B	NM_005720
52	TNFAIP2	NM_006291
53	CCBP2	NM_001296
54	ZNF746	NM_152557
55	MXI1	NM_005962
56	MXI1	NM_130439
57	MXI1	NM_001008541
58	DMD	NM_004009
59	DMD	NM_004010
60	DMD	NM_000109
61	DMD	NM_004006
62	NSMAF	NM_003580
63	CD82	NM_001031700
64	CD82	NM_001024844
65	FLJ43146 fis	AK125136
66	C4orf18	NM_001031700
67	C4orf18	NM_016613
68	FLOT1	NM_005803
69	ZFP36L2	NM_006887

Die Markergene können einzeln oder in Kombination von mehreren verwendet werden. Üblicherweise kann die Aktivität von Markergenen wie hier beschrieben mit Hybridisierungssonden für Microarrays oder PCR Primern und real-time PCR bestimmt werden. Die Markergene und ihre Expressionsprodukte können aber auch mit anderen dem Fachmann bekannten Methoden wie beispielsweise NASBA (Nucleic Acid Sequence-based Amplification) und in verschiedener Kombination ermittelt werden. Sie können auch mit einer Reihe weiterer Methoden oder Visualisierungsmöglichkeiten wie beispielsweise mittels Strand displacement oder mit Hilfe monoklonaler Antikörper bestimmt werden. Sonden können für das Gen, das Expressionsprodukt (mRNA), Fragmente oder Expressionszwischenprodukte, welche nicht komplett zu mRNA prozessiert werden, eingesetzt werden.
In weiteren Ausführungen binden die Sonden eine spezifische Region der hier offenbarten Markergene oder ihrer Transkripte. Die Sonden können aber mit jeder Region der hier offenbarten Gensequenzen oder daraus transkribierten Sequenzen Wechselwirken. Die Primer und Sonden können über fortlaufende Basenpaarung Wechselwirken müssen aber nicht kontinuierlich mit der kompletten komplementären Sequenz Wechselwirken, die Pufferzusammensetzungen, Salzkonzentrationen, Waschschritte und Temperaturen können hier variabel gewählt werden.
Ebenso können diese Veränderungen der Markergene mit den Expressionswerten (oder daraus abgeleiteten Daten wie z. B. Durchschnittswerten) einer oder mehrerer Referenzproben verglichen werden, welche nicht gleichzeitig mit der Zielprobe ermittelt werden müssen, sondern beispielsweise nach Art einer Kalibrierung oder als Werte oder Tabelle in einer Datenbank abgelegt werden.
Eine Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass man Expressionswerte unter Anwendung von Markergenen der Tabelle 1 bis 5 sowie Nukleinsäuren und Transkripte dieser Markergene aus Blut und aus Blutzellen durch Vergleich der Expressionswerte mit einem oder mehreren Kontrollgenen (wie in der nicht vorveröffentlichten Patentanmeldung DE 10 2007 010 252.8 ) und durch Quantifizierung der Markergenexpressionswerte in Bezug zur Markernukleinsäure ermittelt.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass Nukleinsäuren und DNA Sonden mit den Sequenzen nach Tabelle 1 bis 5 und deren Bindung von RNA inklusive small RNA, insbesondere microRNA, siRNA und/oder Repeats und/oder von Transkripten (RNA oder mRNA) in Blut oder aus Blutzellen von Genen nach Tabelle 1 bis 5 in beliebiger Kombination in Lösung oder immobilisiert auf Oberflächen oder Partikeln oder Beads und die Verwendung der gebundenen Transkripte dieser Gene zur Normalisierung durch Vergleich der gebundenen Mengen (Expressionswerte) der Nukleinsäuren mit einer oder mehreren an Sonden gebundenen Markernukleinsäuren und zur Quantifizierung in Bezug zur gebundenen Markernukleinsäure verwendet werden.
Eine Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren zur ex vivo, in vitro Unterscheidung lokaler und systemischer Infektion basierend durch In-Bezug-Setzen der RNA-Mengen aus Kontrollgen und Markergen, folgende Schritte umfasst:
Verwendung nach einem der Ansprüche 3 bis 6 als Ein- oder Ausschlusskriterium von Patienten mit lokaler oder systemischer Infektion in klinische Studien der Phasen 2–4.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass man die Markergen-RNA vor dem Messen der Markergen-RNA mit der DNA hybridisiert und die Markierungssignale des Kontroll-RNA/DNA-Komplexes erfasst, ggf. weiter transformiert und gegebenenfalls in Form einer Kalibrierkurve oder -tabelle ablegt.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass RNA der Markergene oder Teile davon über Sequenzierung oder teilweise Sequenzierung beispielsweise über Pyrosequenzierung identifiziert und quantifiziert werden.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass als Markergen-RNA mRNA oder microRNA verwendet wird.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass die DNA zur spezifischen Bindung der Markergen-RNA oder deren in vitro Transkripte an vorbestimmten Bereichen auf einem Träger in Form eines Microarrays angeordnet, insbesondere immobilisiert, wird.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der biologischen Probe um die eines Menschen handelt.
Diese Sequenzen mit der Sequenz-ID No. 1 bis zur Sequenz-ID No. 69 sind durch den Umfang der vorliegenden Erfindung mit umfasst und sind dem angefügten 69 Sequenzen umfassenden, Sequenzprotokoll, das somit Teil der Erfindung ist, im Einzelnen offenbart.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass die immobilisierten oder freien Sonden abgeleitetet von Sequenzen entsprechend Tabelle 1 bis 5 markiert werden. Für diese Ausführungsform finden z. B. selbstkomplementäre Oligonukleotide, sogenannte Molecular beacons, als Sonden Verwendung. Sie tragen an ihren Enden ein Fluorophor/Quencher-Paar, so dass sie in Abwesenheit einer komplementären Sequenz in einer gefalteten Haarnadelstruktur vorliegen und erst mit einer entsprechenden Probensequenz ein Fluoreszenzsignal liefern. Die Haarnadelstruktur der Molecular Beacons ist so lange stabil, bis die Probe an der spezifischen Fängersequenz hybridisiert, was zu einer Konformationsänderung und damit auch Freisetzung der Reporterfluoreszenz führt.
Als Markergene im Sinne der Erfindung werden alle abgeleiteten DNA-Sequenzen, Partialsequenzen und synthetischen Analoga (beispielsweise Peptidonukleinsäuren, PNA) so wie Aptamere verstanden. Die auf Bestimmung der Genexpression auf RNA-Ebene bezogene Beschreibung der Erfindung stellt keine Einschränkung sondern nur eine beispielhafte Anwendung dar.
Eine Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt in der Ermittlung von Messdaten der differentiellen Genexpression aus Vollblut, zur Unterscheidung zwischen lokaler und systemischer Infektion. Hierzu wird die RNA der Markergene aus dem Vollblut von entsprechenden Patienten isoliert. Die RNA wird anschließend markiert, beispielsweise radioaktiv mit ³²P oder mit Farbstoffmolekülen (Fluoreszenz). Als Markierungsmoleküle können alle im Stand der Technik zu diesem Zwecke bekannten Moleküle und/oder Detektionssignale eingesetzt werden. Entsprechende Moleküle und/oder Markierungsverfahren sind dem Fachmann ebenfalls bekannt.

1. Die so markierte RNA wird anschließend mit auf einem Microarray immobilisierten DNA-Molekülen hybridisiert. Die auf dem Microarray immobilisierten DNA-Moleküle stellen eine spezifische Auswahl der Gene gemäß der vorliegenden Erfindung zur Unterscheidung von lokaler und systemischer Infektion dar.
2. Die Intensitätssignale der hybridisierten Moleküle werden im Anschluss durch im Stand der Technik wohl bekannte, geeignete Messgeräte (Phosporimager, Microarray-Scanner) gemessen und durch weitere softwaregestützte Auswertungen analysiert. Aus den gemessenen Signalintensitäten werden die Expressionsverhältnisse zwischen den Markergenen der Patientenprobe und den Kontrollgenen bestimmt. Aus den Expressionsverhältnissen der unter- und/oder überregulierten Gene lassen sich, wie in den nachstehend dargestellten Experimenten, Rückschlüsse auf die Unterscheidung von lokaler und systemischer Infektion ziehen.
3. Eine weitere Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht in der Messung der differentiellen Genexpression für die therapiebegleitende Bestimmung der Wahrscheinlichkeit, dass Patienten auf die geplante Therapie ansprechen werden, und/oder für die Bestimmung des Ansprechens auf eine spezialisierte Therapie und/oder auf die Festlegung des Therapieendes im Sinne eines „drug monitoring" bei Patienten mit nachgewiesener systemischer Infektion und deren Schweregrade. Hierzu wird aus den in zeitlichen Abständen gesammelten Blutproben des Patienten die RNA (Test-RNA und Kontroll-RNA) isoliert. Die verschiedenen RNA-Proben werden zusammen markiert und mit ausgewählten Markergenen sowie Kontrollgenen, welche auf einem Microarray immobilisiert sind, hybridisiert. Aus den Expressionsverhältnissen zwischen einzelnen oder mehreren Kontrollgenen und Markergenen lässt sich somit beurteilen, welche Wahrscheinlichkeit besteht, dass Patienten auf die geplante Therapie ansprechen werden und/oder ob die begonnene Therapie wirksam ist und/oder wie lange die Patienten noch entsprechend therapiert werden müssen und/oder ob der maximale Therapieeffekt mit der verwendeten Dosis und Dauer schon erreicht worden ist. Eine weitere Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht in der Verwendung der RNA der erfindungsgemäßen Gene zur Gewinnung von quantitativen Informationen durch hybridisierungsunabhängige Verfahren, insbesondere enzymatische oder chemische Hydrolyse, Surface Plasmon Resonanz-Verfahren (SPR-Verfahren), anschließende Quantifizierung der Nukleinsäuren und/oder von Derivaten und/oder Fragmenten derselben
4. Die mittels PCR (auch weitere Amplifikationsverfahren wie beispielsweise NASBA) amplifizierten und quantifizierten Transkripte von Kontrollgenen stellen eine weitere Ausführungsform gemäß der vorliegenden Erfindung zur Normalisierung von Genexpressionsdaten bei der Unterscheidung von lokaler und systemischer Infektion und deren Schweregrade dar. Die Intensitätssignale der amplifizierten Transkripte werden im Anschluss durch geeignete Messgeräte (PCR-Fluoreszenzdetektor) gemessen und durch weitere softwaregestützte Auswertungen analysiert. Aus den gemessenen Signalintensitäten werden die Expressionsverhältnisse zwischen den Markergenen der Patientenprobe und den Kontrollgenen bestimmt. Aus den Expressionsverhältnissen der unter- und/oder überregulierten Gene lassen sich, wie in den nachstehend dargestellten Experimenten, Rückschlüsse auf die Unterscheidung zwischen lokaler und systemischer Infektion ggf. deren Schweregrade ziehen.

Eine weitere Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht in der Normalisierung einer ggf. amplifizierten mRNA Menge in mehreren Proben umfassend a) einen Vergleich der Expressionswerte einer oder mehrerer Nukleinsäuren ausgewählt aus SEQ ID 1 bis SEQ-ID 69 über verschiedene Proben; b) Ableitung eines Wertes zur Normalisierung von Expressionswerten einer oder mehrerer Nukleinsäuren ausgewählt aus SEQ ID 1 bis SEQ-ID 69 über mehrere Proben und c) eine Normalisierung der Expression anderer Nukleinsäuren, welche aus mehreren Proben isoliert wurden, basierend auf Schritt b) Die Erfindung kann ferner einen Kit betreffen, der eine Auswahl von Polynucleotiden mit den Sequenzen gemäß SEQ-ID 1 bis SEQ-ID 69 und/oder Genfragmenten davon mit wenigstens 1–100, in bevorzugter Ausführung 1–5 und 1–10 Nukleotiden zur Bestimmung von Genexpressionsprofilen in vitro in einer Patientenprobe, für die Verwendung als Markergene enthält.
Die Erfindung kann ferner auch einen Kit betreffen, der eine Auswahl von Hybridisierungssonden gemäß SEQ-ID No. 1, bis SEQ-ID No. 69 und/oder Genfragmenten davon mit wenigstens 50 Nukleotiden zur Bestimmung von Genexpressionsprofilen in vitro in einer Patientenprobe enthält, für die Verwendung als Markergene.
Eine alternative Ausführungsform der vorliegenden Erfindung liegt in einer Verwendung von in vitro aus wenigstens einer Patientenprobe erhaltenen Genaktivitäten für die Unterscheidung eines mit einer lokalen Infektion einhergehenden Zustandes von einem mit einer systemischen Infektion einhergehenden Zustand eines Patienten, wobei die Genaktivitäten erhalten werden aus einem Verfahren mit folgenden Schritten:

a) Isolieren von Proben-Nukleinsäuren aus einer aus einem Patienten stammenden Probe;
b) In-Kontakt-Bringen und Vervielfältigung der Nukleinsäuresequenzen gemäß SEQ-ID No. 1 bis SEQ-ID No. 69 mit synthetischen markierten oder unmarkierten Oligonukleotidprimern unter Amplifikationsbedingungen, wobei die Länge des vervielfältigten Abschnittes 50 bis 3000 Nukleotide umfasst und die Marker diejenigen Genprodukte darstellen, welche in unterschiedlicher Menge in Patienten mit lokaler und systemischer Infektion vorliegen;
c) Erfassen des Verlaufes der Vervielfältigung durch qualitative, semiquantitative oder quantitative Messung der vervielfältigten Nukleinsäurestränge und Erstellung eines Genaktivitätsdatensatzes durch Vergleich der Amplifikationssignale, welche ein Maß für die amplifizierte Nukleinsäuremenge sind, mit den Amplifikationssignalen einer Menge von Referenz-Nukleinsäuren.

Eine weitere Anwendung der über Microarrayanalyse oder anderen Quantifizierungsmethoden wie z. B. real-time PCR ermittelten Genaktivitäten und Genexpressionsdaten besteht in der Anwendung zur Unterscheidung von lokaler und systemischer Infektion für die elektronische Weiterverarbeitung zum Zweck der Herstellung von Software für Diagnosezwecke (z. B. zur Einschätzung der Schwere einer individuellen Immunantwort insbesondere bei bakterieller Infektion, auch im Rahmen von Patientendatenmanagementsystemen oder Expertensystemen) oder zur Modellierung zellulärer Signalübertragungswege.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens eines der Polynucleotide gemäß SEQ-ID No 1 bis SEQ-ID No 69, insbesondere Nukleinsäuresonden oder deren Komplementäre zur Bindung der Transkripte oder deren Komplementäre der Markergene verwendet werden.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass die synthetischen Analoga der Markergene bzw. die synthetischen Oligonukleotide, welche die Transkripte der Kontrollgene binden, insbesondere ca. 60 Basenpaare umfassen.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass als detektierbarer Marker ein radioaktiver Marker, insbesondere ³²P, ¹⁴C, ¹²⁵I, ³³P oder ³H verwendet wird.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass als detektierbarer Marker ein nicht radioaktiver Marker, insbesondere ein Farb- oder Fluoreszenzmarker, ein Enzymmarker oder Immunmarker, und/oder quantum dots oder ein elektrisch messbares Signal, insbesondere Potential- und/oder Leitfähigkeits- und/oder Kapazitätsänderung, z. B. bei Hybridisierungen, verwendet wird.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass die Markergen-RNA und Kontrollgen-RNA und/oder enzymatische oder chemische Derivate davon dieselbe Markierung tragen.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass die Markergen-RNA und Kontrollgen-RNA und/oder enzymatische oder chemische Derivate unterschiedliche Markierungen tragen.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure-Sonden auf ein Trägermaterial wie z. B. Glas oder Kunststoff, immobilisiert werden.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass die einzelnen DNA-Moleküle über eine kovalente Bindung an das Trägermaterial immobilisiert werden.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass die einzelnen DNA Moleküle mittels elektrostatischer- und/oder Dipol-Dipol- und/oder hydrophobe Wechselwirkungen und/oder Wasserstoffbrücken an das Trägermaterial immobilisiert werden.
Es ist dem Fachmann klar, dass die in den Ansprüchen und der Beschreibung dargelegten einzelnen Merkmale der Erfindung ohne jede Einschränkung beliebig miteinander kombinierbar sind.
Ein Kit gemäß Anspruch 25 sowie Cluster von Polynucleotiden lösen die Aufgabe ebenfalls.
Ferner dient die vorliegende Erfindung der therapiebegleitenden Verlaufsbeurteilung von Patienten mit lokaler oder systemischer Infektion.
Die vorliegende Erfindung kann auch zur Herstellung von „in silico" Expertensystemen und/oder zur „in silico" – Modellierung von zelluläreren Signalübertragungswegen verwendet werden.
Zur Erstellung des Genexpressionsprofiles gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Mehrzahl von spezifischen Genen und/oder Genfragmenten verwendet, welche ausgewählt werden aus der Gruppe in Tabellen 1 bis 5 bestehend aus SEQ-ID No. 1 bis SEQ-ID No. 69 sowie Genfragmenten davon mit wenigstens 5–2000, bevorzugt 20–200, mehr bevorzugt 20–80 Nukleotiden.
Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von in vitro aus einer Patientenprobe erhaltenen Genexpressionsprofilen und/oder von den hierfür verwendeten Sonden, welche ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus SEQ-ID No. 1 bis SEQ-ID No. 69 sowie Genfragmenten davon mit wenigstens 5–2000, bevorzugt 20–200, mehr bevorzugt 20–80 Nukleotiden, zum Ausschalten oder Einschalten und/oder zur Aktivitätsveränderung von Zielgenen und/oder zur Bestimmung der Genaktivität zur Überwachung lokaler oder systemischer Infektion und Verlauf eine lokalen Infektion zu einer systemischen Infektion eines Patienten.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens ein spezifisches Markergen und/oder Genfragment ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus SEQ-ID No. 1 bis SEQ-ID No. 69 sowie Genfragmenten davon mit wenigstens 5–2000, bevorzugt 20–200, mehr bevorzugt 20–80 Nukleotiden.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens 2 bis 69 unterschiedliche cDNAs verwendet werden.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass die in SEQ-ID No. 1–SEQ-ID No. 69 aufgelisteten Gene oder Genfragmente und/oder von deren RNA abgeleiteten Sequenzen ersetzt werden durch entsprechende synthetische Analoga, Aptamere sowie Peptidonukleinsäuren.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass die synthetischen Analoga der Gene 5–100, insbesondere ca. 70 Basenpaare umfassen.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass die Genaktivitäten mittels Hybridisierungsverfahren bestimmt werden.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass die Genaktivität mittels Microarrays bestimmt wird.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass die Genaktivität durch hybridisierungsunabhängige Verfahren, insbesondere enzymatische und/oder Amplifikationsverfahren, vorzugsweise PCR, anschließende Quantifizierung der Nukleinsäuren und/oder von Derivaten und/oder Fragmenten derselben, bestimmt wird.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass Zellproben gegebenenfalls einer lytischen Behandlung unterzogen werden, um deren Zellinhalte freizusetzen.
Die auf Blut bezogene Beschreibung der Erfindung stellt nur eine beispielhafte Anwendung der Erfindung dar.
Für die Zwecke einer vollständigen Offenbarung der vorliegenden Lehre wird festgestellt, dass mit den ursprünglich eingereichten Ansprüchen auch sämtliche und/oder – Kombinationen der Ansprüche für den Fachmann mit offenbart sind.
Die Daten der Patienten können aus den Tabellen 6 bis 8 entnommen werden.
Weitere Vorteile und Merkmale ergeben sich aus den Ausführungsbeispielen sowie anhand der Zeichnung.
Es zeigt:
1 eine Heatmap zur Darstellung einer zufälligen Auswahl aus den relevanten Genen für die Unterscheidung zwischen lokaler und systemischer Infektion.
Ausführungsbeispiele
Mikroarray-Experimentbeschreibung

(Nach der Minimum Information About a Microarray Experiment [MIAME] Checkliste – Neuauflage Januar 2005, basierend auf Brazma et al. 2001) auf welches hiermit vollinhaltlich Bezug genommen wird)

Einlesen der Slides/technische Spezifikationen des Scanners

a) Scanner: Auflichtfluoreszenz-Scanner	GenePix 40008 konfokaler (Axon Instruments)
b) Software zum Scannen:	Genfix Pro 4.0 bzw. 5.0
c) Scan-Parameter: Laser-Power:	Cy3 Kanal – 100% Cy5 Kanal – 100%
PMT-Spannung:	Cy3 Kanal – 700 V Cy5 Kanal – 800 V
d) räumliche Auflösung (pixel space) – 10 µm.

Auslesen und Prozessieren der Daten
Im Rahmen der Experimente wurde RNA aus 59 Blutproben von Patienten hybridisiert. Jedes RNA-Paar (Patient gegen Vergleichs-RNA) wurde auf einem Mikroarray cohybridisiert. Dabei wurde die Patienten-RNA mit einem rot fluoreszierenden und die Vergleichs-RNA mit einem grün fluoreszierenden Farbstoff markiert. Die digitalisierten Bilder des hybridisierten Arrays wurden mit der GenePix Pro 4.0 bzw. 5.0 Software von Axon Instruments ausgewertet. Zur Spot-Detektion, Signalquantifizierung und Bewertung der Spot-Qualität wurde die GenePix^TM Analysis Software verwendet. Die Spots wurden entsprechend der Einstellungen in der GenePix^TM Software mit 100 = „good", 0 = "found", –50 = "not found", –75 = "absent", –100 = "bad" markiert. Die Rohdaten werden in einer entsprechenden Datei abgelegt.
Normalisierung, Transformation und Datenauswahlverfahren
e) Transformation und Normalisierung der Signaldaten
Die Signaldaten wurden unter Verwendung von Box-Cox Potenztransformationen (Box and Cox 1964), Median und MAD (Median der absoluten Abweichungen vom Median) normalisiert.
f) Filtern
Die technischen Replikate (mehrfache Spots derselben Probe) auf dem Mikroarray werden aus den korrigierten und transformierten Signalintensitäten abhängig von ihrer Spot-Qualität herausgefiltert. Für jeden Spot werden die Replikate mit der höchsten Kennzeichnung ausgewählt und die zugehörige Signalintensität gemittelt. Die Expression von Spots mit ausschließlich nicht messbaren Replikaten werden mit „NA" (not available) gekennzeichnet.
Ausführungsbeispiel 1

Identifizierung von Markergenen zur Identifizierung lokaler infektion oder systemischer Infektion aus Blut und aus Blutzellen:

Messung der Genexpression:
Es wurde die Genexpression von 51 ITS-Patienten gemessen. Es handelte sich um 15 Patienten mit einer lokalen und 36 Patienten mit einer systemischen Infektion. In der Analyse wurde pro Patient ein ITS-Tag berücksichtigt (Tabelle 6).
Als Referenzproben dienten die Gesamt-RNA aus Zelllinien SIG-M5.

Alle Patientenproben wurden mit der Referenzprobe jeweils auf einem Microarray co-hybridisiert.

	Table 6
	Patienten Daten
Kriterien	lokale Infektion	systemische Infektion
Anzahl Patienten	15	36
Sterblichkeit	6,7%	55,5%
Geschlecht [w/m]	5/10	12/24
Alter [Jahre]	66 (10)	68,5 (13,5)
SIRS Kriterien	3 (1)	3 (1)
SOFA Score	7 (2,5)	10 (3,5)
Anzahl Organdysfunktionen	2 (1)	3 (1)
PCT [ng/ml]	4,6 (6,4)	7,6 (25,0)
CRP [mg/l]	191 (132,2)	202 (146,3)
WBC [Anzahl/1]	13100 (8250)	13200 (8250)

Experimentelle Beschreibung:
Blutabnahme und RNA-Isolation
Das Vollblut der Patienten wurde auf der Intensivstation von den Patienten mittels des PAXGene Kits gemäß den Vorgaben des Herstellers (Qiagen) abgenommen. Nach Abnahme des Vollblutes wurde die Gesamt-RNA der Proben unter Anwendung des PAXGene Blood RNA Kits gemäß den Vorgaben des Herstellers (Qiagen) isoliert.
Zellkultivierung
Für die Zellkultivierung (Kontrollproben) wurden 19 Kryozellkulturen (SIGM5) (eingefroren in flüssigem Stickstoff) genutzt. Die Zellen wurden jeweils mit 2 ml Iscove's Medium (Biochrom AG) beimpft ergänzt mit 20% fetalen Kälber Serum (FCS). Die Zellkulturen wurden anschließend für 24 Stunden bei 37°C unter 5% CO₂ in 12-well Platten inkubiert. Danach wurde der Inhalt von 12 Wells in 2 Teile mit jeweils dem gleichen Volumen geteilt, so dass schließlich 3 Platten des gleichen Formats (insgesamt 36 Wells) zur Verfügung standen. Die Kultivierung wurde anschließend für 24 Stunden unter den gleichen Bedingungen fortgeführt. Im Anschluss daran wurden die resultierenden Kulturen von 12 Wells jeder Platte vereint und zentrifugiert (1000 × g, 5 min, Raumtemperatur). Der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet in 40 ml des oben genannten Mediums gelöst. Diese 40 ml gelöste Zellen wurden in zwei 250 ml Kolben zu gleichen Teilen aufgeteilt und nach 48 Stunden Inkubation und Zugabe von 5 ml des oben genannten Mediums wiederum inkubiert. Von den restlichen 2 ml der zwei verbleibenden Platten wurden 80 µl in leere Wells der gleichen Platten gegeben, welche bereits vorher mit 1 ml des Mediums präpariert waren. Nach 48 Stunden Inkubation wurde nur eine der 12 Well-Platten wie folgt prozessiert: Aus jedem Well wurden 500 µl entnommen und vereint. Die daraus resultierenden 6 ml wurden in einen 250 ml Kolben gegeben, welcher ca. 10 ml frisches Medium enthielt. Dieses Gemisch wurde mit 1000 × g 5 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert und in 10 ml des oben genannten Mediums suspendiert. Die anschließende Zellzählung ergab folgendes Ergebnis: 1,5 × 10⁷ Zellen pro ml, 10 ml Gesamtvolumen, Gesamtzahl der Zellen: 1,5 × 10⁸. Da die Zellzahl noch nicht ausreichend war, wurden 2,5 ml der oben genannten Zellsuspension in 30 ml des oben genannten Mediums in einen 250 ml (75 cm²) Kolben gegeben (insgesamt 4 Kolben). Nach 72 Stunden Inkubationszeit wurden jeweils 20 ml frischen Mediums in die Kolben gegeben. Nach folgender 24-ständiger Inkubation erfolgte die Zellzählung wie oben beschrieben, die eine Gesamtzellzahl von 3,8 × 10⁸ Zellen ergab. Um die gewünschte Zellzahl von 2 × 10⁶ Zellen zu erreichen, wurden die Zellen in 47,5 ml des oben genannten Mediums in 4 Kolben resuspendiert. Nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden wurden die Zellen zentrifugiert und zweimal mit Phosphatpuffer ohne Ca¹⁺ und Mg²⁺ (Biochrom AG) gewaschen.
Die Isolation der Gesamt-RNA erfolgt mittels des NucleoSpin RNA L Kits (Machery&Nagel) entsprechend den Angaben des Herstellers. Die oben beschriebene Prozedur wurde wiederholt bis die erforderliche Zellzahl erreicht wurde. Dies war erforderlich, um die erforderliche Menge von 6 mg Gesamt-RNA zu erreichen, was etwa einer Effizienz von 600 μg RNA pro 10⁸ Zellen entspricht.
Reverse Transkription/Markierung/Hybridisierung
Nach Abnahme des Vollblutes wurde die Gesamt-RNA der Proben unter Verwendung des PAXGene Blood RNA Kits (PreAnalytiX) gemäß den Vorgaben des Herstellers isoliert und auf ihre Qualität geprüft. Von jeder Probe wurden 10 µg Gesamt-RNA aliquotiert und zusammen mit 10 µg Gesamt-RNA aus SIGM5-Zellen als Referenz-RNA zu komplementärer DNA (cDNA) mit der reversen Transkriptase Superscript II (Invitrogen) umgeschrieben und die RNA anschließend durch alkalische Hydrolyse aus dem Ansatz entfernt. Im Reaktionsansatz wurde ein Teil des dTTP durch Aminoallyl-dUTP (AA-dUTP) ersetzt, um später die Kopplung des Fluoreszenzfarbstoffes an die cDNA zu ermöglichen.
Nach der Aufreinigung des Reaktionsansatzes wurden die cDNA der Proben und Kontrollen mit den Fluoreszenzfarbstoffen Alexa 647 und Alexa 555 kovalent markiert und auf einem Microarray der Firma SIRS-Lab hybridisiert. Auf dem verwendeten Microarray befinden sich 5308 immobilisierte Polynukleotide mit einer Länge von 55–70 Basenpaaren, die jeweils ein humanes Gen repräsentieren und Kontrollspots zur Qualitätssicherung. Ein beispielhafter Microarray unterteilt sich in 28 Subarrays mit einem Raster von 15 × 15 Spots.
Die Hybridisierung und das anschließende Waschen bzw. Trocknen wurde in der Hybridisierungsstation HS 400 (Tecan) nach Angaben des Herstellers über 10,5 Stunden bei 42°C durchgeführt. Die verwendete Hybridisierungslösung besteht aus den jeweiligen gelabelten cDNA-Proben, 3,5 × SSC (1 × SSC enthält 150 mM Natriumchlorid und 15 mM Natriumcitrat), 0,3% Natriumdodecylsulfat (VN) 25% Formamid (VN) und je 0,8 µg µl-1 cot-1 DNA, Hefe t-RNA und poly-A RNA. Das anschließende Waschen der Mikroarrays wurde mit nachfolgendem Programm bei Raumtemperatur durchgeführt: je 90 Sekunden spülen mit Waschpuffer 1 (2 × SSC, 0,03% Natriumdodecylsulfat), mit Waschpuffer 2 (1 × SSC) und abschließend mit Waschpuffer 3 (0,2 × SSC). Danach wurden die Mikroarrays unter einem Stickstoffstrom mit einem Druck von 2,5 bar bei 30°C über 150 Sekunden getrocknet.
Nach der Hybridisierung wurden die Hybridisierungssignale der Microarrays mit einem GenePix 4000B Scanner (Axon) ausgelesen und die Expressionsverhältnisse der differenziert exprimierten Gene mit der Software GenePix Pro 4.0 bzw. 5.0 (Axon) bestimmt.
Auswertung:
Für die Auswertung wurde die mittlere Intensität eines Spots als der Medianwert der zugehörigen Spotpixel bestimmt.
Normalisierung:
Für die weiteren Analysen wurden nur die roten Signalintensitäten verwendet. Jedes Array wurde einzeln unter Verwendung von Box Cox Potenztransformationen (Box and Cox 1964, Median und MAD (Median der absoluten Abweichungen vom Median) normalisiert.
Auswahl der Klassifikator Genproben:
Die Auswahl der Klassifikator Genproben erfolgte unter Verwendung eines sogenannten Filters. Zuerst wurden die 1000 Genproben mit dem größten Variationskoeffizienten bestimmt. Anschließend wurden die beiden Gruppen (lokale bzw. systemische Infektion) auf der Basis dieser 1000 Genproben unter Verwendung des Mann-Whitney Tests miteinander verglichen. Die Genproben mit einem p-Wert <= 0.001 wurden mittels des Hodges-Lehmann Schätzers angeordnet und diejenigen Gensonden, die den größten Schätzwert (Absolutbetrag) aufwiesen, für die Klassifikation verwendet.
Klassifikation:
Zur Klassifikation wurde die Methode der k nächsten Nachbarn mit k = 3 verwendet. Der Klassifikationsfehler wurde mittels 100 Wiederholungen einer 10-fach Kreuzvalidierung geschätzt.
Optimale Anzahl von Genproben:
Das Minimum des mittels Kreuzvalidierung geschätzten Klassifikationsfehlers wurde für 69 Genproben erzielt. Die Festlegung auf die in Tabelle 1–5 angegebenen 69 Genproben erfolgte unter Verwendung der Bootstrap-Methode. So wurde die Auswahl der besten 69 Genproben mittels Bootstrap-Stichproben 5000-mal wiederholt und anschließend die Genproben nach der Häufigkeit ihrer Auswahl sortiert.
Klassifikationsfehler:
Der mittels 100 Wiederholungen einer 10-fach Kreuzvalidierung geschätzte Klassifikationsfehler für die in Tabelle 1–5 angegebenen 69 Genproben liegt insgesamt bei 15,7%. In der Gruppe der Patienten mit lokaler Infektion beträgt der Fehler 26,7%, in der Gruppe der Patienten mit systemischer Infektion 11,1%. Die Patienten mit systemischer Infektion werden also mit einer Sicherheit von annähernd 90% erkannt.
Ausführungsbeispiel 2
Validierung der Klassifikatorgene anhand eines Patienten Verlaufs von systemischer zu lokaler Infektion.
Messung der Genexpression:
Es wurde die Genexpression von einem zufällig ausgewählten ITS-Patienten, dessen Infektion sich von systemisch nach lokal verändert, gemessen. In der Analyse wurden 8 aufeinanderfolgende ITS-Tage des Patienten berücksichtigt.
Als Referenzproben dienten die Gesamt-RNA aus Zelllinien SIG-M5.
Alle Patientenproben wurden mit der Referenzprobe jeweils auf einem Microarray Co-hybridisiert (Tabelle 7, 8)

Tabelle 7

Allgemeine Daten des Patienten

Geschlecht Männlich

Alter [Jahre] 80

Aufnahmediagnose Atherosklerotische Herzkrankheit

APACHE-II-Score 29

SAPS-II-Score 44
Normalisierung:
Für die weiteren Analysen wurden nur die roten Signalintensitäten verwendet. Jedes Array wurde einzeln unter Verwendung von Box-Cox Potenztransformationen, Median und MAD (Median der absoluten Abweichungen vom Median) normalisiert.
Auswahl der Klassifikator Genproben:
Für die Klassifikation der Patiententage wurde ein Subset von 31 Gensonden verwendet, welches sich wie folgt zusammensetzt:
Seq-ID: 5, 6, 9, 10–14, 17, 18, 23–26, 31, 37, 38, 40, 43, 45–48, 51, 53, 55–57, 62, 66, 67.
Klassifikation:
Die Klassifikation wurde mittels der Methode der k nächsten Nachbarn mit k = 3 durchgeführt. Als Trainingsdatensatz wurden die in Ausführungsbeispiel 1 beschriebenen Patienten verwendet.
Klassifikationsfehler:
Es wurden alle Patiententage (Tag 1–6: systemische Infektion, Tag 7,8: lokale Infektion) richtig klassifiziert.
Im Folgenden sind alternative Ausführungsformen der Erfindung angegeben, welche die Aufgabe ebenfalls lösen können:
Alternativen

A.) Verwendung wenigstens eines Polynukleotides mit einer Länge von 2 bis 100% der Anzahl der Nukleotide der einzelnen Sequenzen gemäß SEQ-ID Nr. 1 bis SEQ-ID Nr. 69 und/oder deren Genloci und/oder deren Transkripte zur Erfassung von Genaktivitäten für die Unterscheidung eines mit einer lokalen Infektion einhergehenden Zustandes von einem mit einer systemischen Infektion einhergehenden Zustand eines Patienten, wobei wenigstens eine der Sequenzen gemäß SEQ-ID Nr. 1 bis SEQ-ID Nr. 69 verwendet wird.
B.) Verwendung nach A, dadurch gekennzeichnet, dass die Genaktivitäten mittels Hybridisierungsverfahren, insbesondere solchen auf Microarrays und/oder enzymatischen Verfahren, insbesondere Amplifikationsverfahren, bevorzugt PCR, vorzugsweise real-time PCR, erstellt werden.
C.) Verwendung von in vitro aus wenigstens einer Patientenprobe erhaltenen Genaktivitäten für die Unterscheidung eines mit einer lokalen Infektion einhergehenden Zustandes von einem mit einer systemischen Infektion einhergehenden Zustand eines Patienten, wobei die Genaktivitäten erhalten werden aus einem Verfahren mit folgenden Schritten: a) Isolieren von Proben-Nukleinsäuren aus einer aus einem Patienten stammenden Probe; b) Markieren von Proben-Nukleinsäuren und/oder Sonden-Nukleinsäuren mit einem detektierbaren Marker, wobei die Sonden-Nukleinsäuren Gene und/oder Genloci oder deren Transkripte repräsentieren, die eine Unterscheidung eines mit einer lokalen Infektion einhergehenden Zustandes von einem mit einer systemischen Infektion einhergehenden Zustandes eines Patienten ermöglichen und wobei die Sonden-Nukleinsäure wenigstens ein Polynukleotid gemäß SEQ-ID Nr. 1 bis SEQ-ID Nr. 69 umfasst oder wenigstens ein solches Polynukleotid mit einer Länge von 2 bis 100% der Anzahl der Nukleotide der einzelnen Sequenzen gemäß SEQ-ID Nr. 1 bis SEQ-ID Nr. 69 umfasst; c) In-Kontakt-Bringen der Proben-Nukleinsäuren mit den Sonden-Nukleinsäuren unter Hybridisierungsbedingungen; d) Erfassen, insbesondere quantitatives Erfassen, der Markierungssignale der hybridisierten Proben-Nukleinsäuren und der Sonden-Nukleinsäuren; e) Vergleichen der in Schritt d) erhaltenen Markierungssignale mit wenigstens einem Referenzwert, um eine Aussage darüber zu treffen, ob bei einem Patienten ein mit einer lokalen Infektion einhergehender Zustand oder ein mit einer systemischen Infektion einhergehender Zustand vorliegt.
D.) Verwendung der Genaktivitätsdaten nach C, für die therapiebegleitende Verlaufsbeurteilung einer Infektion von einer lokalen Infektion zu einer systemischen Infektion oder einer systemischen Infektion zu einer lokalen Infektion und/oder für die Ermittlung einer geeigneten Therapie.
E.) Verwendung nach C oder D, für die Klassifizierung von Patienten mit lokaler oder systemischer Infektion.
F.) Verwendung nach C bis E, wobei die in ihrem Expressionsverhalten vergleichbaren Genaktivitäten der Polynukleotide mit den SEQ-IDs No 1 bis 69 zu Genaktivitätsclustern zusammengefasst werden.
G.) Verwendung nach C bis D als Ein- oder Ausschlußkriterium von Patienten mit lokaler oder systemischer Infektion in klinische Studien der Phasen 2–4.
H.) Verwendung nach C bis G zur Erstellung von Genaktivitätsdaten für die elektronische Weiterverarbeitung.
I.) Verwendung nach C bis H, wobei die erhaltenen Genaktivitätsdaten zur Herstellung von Software für die Beschreibung der individuellen Prognose und/oder Krankheitsverlauf eines Patienten, als Hilfsmittel für Diagnosezwecke und/oder Patientendatenmangementsysteme eingesetzt werden.
J.) Verwendung nach C bis I, wobei die in vitro aus einer Patientenprobe erhaltenen Genaktivitätsdaten zur Herstellung von klinischen Expertensystemen und/oder zur Modellierung von zellulären Signalübertragungswegen eingesetzt werden.
K.) Verwendung nach C bis J, wobei zur Erstellung der Genaktivitätsdaten solche spezifischen Gene und/oder Genfragmente verwendet werden, welche eine Sequenzhomologie von mindestens ca. 10%, insbesondere ca. 20%, vorzugsweise ca. 50%, besonders bevorzugt ca. 80% zu den Polynukleotidsequenzen gemäß SEQ-ID No. 1 bis SEQ-ID No. 69 aufweisen.
L.) Verwendung nach K, wobei die Genfragmente insbesondere 5–1000, bevorzugt 20–200, vorzugsweise 20–80 Nukleotide, umfassen.
M.) Verwendung nach C bis L, dadurch gekennzeichnet, dass die Proben-Nukleinsäure RNA, insbesondere Gesamt-RNA ist, die Sondennukleinsäure DNA, insbesondere cDNA, oder mRNA ist.
N.) Verwendung nach C bis M, dadurch gekennzeichnet, dass die Genaktivitätsdaten ein Genexpressionsprofil bilden.
O.) Verwendung von in vitro aus wenigstens einer Patientenprobe erhaltenen Genaktivitäten für die Unterscheidung eines mit einer lokalen Infektion einhergehenden Zustandes von einem mit einer systemischen Infektion einhergehenden Zustand eines Patienten, wobei die Genaktivitäten erhalten werden aus einem Verfahren mit folgenden Schritten: a. Isolieren von Proben-Nukleinsäuren aus einer aus einem Patienten stammenden Probe; b. In-Kontakt-Bringen und Vervielfältigung wenigstens einer der Nukleinsäuresequenzen gemäß SEQ-ID No. 1 bis SEQ-ID No. 69 mit synthetischen markierten oder unmarkierten Oligonukleotidprimern unter Amplifikationsbedingungen, wobei die Länge des vervielfältigten Abschnittes 50 bis 2000 Nukleotide umfasst und die Marker diejenigen Genprodukte darstellen, welche in unterschiedlicher Menge in Patienten mit lokaler und systemischer Infektion vorliegen; c. Erfassen des Verlaufes der Vervielfältigung durch qualitative, semiquantitative oder quantitative Messung der vervielfältigten Nukleinsäurestränge und Erstellung eines Genaktivitätsdatensatzes durch Vergleich der Amplifikationssignale, welche ein Maß für die amplifizierte Nukleinsäuremenge sind, mit den Amplifikationssignalen einer Menge von Referenz-Nukleinsäuren.
P.) Verwendung nach O, dadurch gekennzeichnet, dass der Amplifikationsansatz weitere Bestandteile, insbesondere Desoxynukleotide, Polymerasen, Salze, Puffer und sich an Nukleinsäuren anlagernde Fluoreszenzfarbstoffe, enthält.
Q.) Verfahren zur in vitro Messung von Genaktivitäten für eine Unterscheidung eines mit einer lokalen Infektion einhergehenden Zustandes von einem mit einer systemischen Infektion einhergehenden Zustand eines Patienten, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst: a. Isolieren von Proben-Nukleinsäuren aus einer aus einem Patienten stammenden Probe; b. Markieren von Proben-Nukleinsäuren und/oder wenigstens einer Sonden-Nukleinsäure mit einem detektierbaren Marker, wobei die Sonden-Nukleinsäuren Gene und/oder Genloci und/oder deren Transkripte repräsentieren, die eine Unterscheidung eines mit einer lokalen Infektion einhergehenden Zustandes von einem mit einer systemischen Infektion einhergehenden Zustandes eines Patienten ermöglichen und wobei die Sonden-Nukleinsäure wenigstens ein Polynukleotid gemäß SEQ-ID Nr. 1 bis SEQ-ID Nr. 69 oder ein solches Polynukleotid mit einer Länge von 2 bis 100% der Anzahl der Nukleotide der einzelnen Sequenzen gemäß SEQ-ID Nr. 1 bis SEQ-ID Nr. 69 umfasst; c. In-Kontakt-Bringen der Proben-Nukleinsäuren mit den Sonden-Nukleinsäuren unter Hybridisierungsbedingungen; d. quantitatives Erfassen der Markierungssignale der hybridisierten Proben-Nukleinsäuren und der Sonden-Nukleinsäuren; e. Vergleichen der in Schritt d) erhaltenen Markierungssignale mit wenigstens einem Referenzwert, um eine Aussage darüber zu treffen, ob bei einem Patienten ein mit einer lokalen Infektion einhergehender Zustand oder ein mit einer systemischen Infektion einhergehender Zustand vorliegt.
R.) Verfahren nach Q, dadurch gekennzeichnet, dass die Genfragmente 5 bis 1000, bevorzugt 20–200, vorzugsweise 20–80 Nukleotide umfassen.
S.) Verfahren nach Q bis R, dadurch gekennzeichnet, dass die Polynukleotide gemäß Seq-ID No 1 bis SEQ-ID No 69 und/oder davon abgeleiteten Sequenzen ersetzt werden durch: synthetische Analoga, Aptamere, Spiegelmere sowie Peptido- und Morpholinonukleinsäuren.
T.) Verfahren nach S, dadurch gekennzeichnet, dass die synthetischen Analoga der Gene 20–100, insbesondere ca. 70 Basenpaare umfassen.
U.) Verfahren nach Q bis T, dadurch gekennzeichnet, dass die Genaktivität mittels Microarrays bestimmt wird.
V.) Verfahren nach Q bis U, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe ausgewählt wird aus: Gewebe, Körperflüssigkeiten, insbesondere Blut, Serum, Plasma, Urin, Speichel oder Zellen oder Zellkomponenten; oder eine Mischung davon.
W.) Verfahren nach Q bis V, dadurch gekennzeichnet, dass Proben, insbesondere Zellproben, einer lytischen Behandlung unterzogen werden, um deren Zellinhalte freizusetzen.
X.) Verfahren nach Q bis W, dadurch gekennzeichnet, dass die Proben-Nukleinsäure RNA, insbesondere Gesamt-RNA ist, die Sondennukleinsäure DNA, insbesondere cDNA, oder mRNA ist.
Y.) Kit, enthaltend wenigstens eine der Polynukleotidsequenzen SEQ-ID No. 1–SEQ-ID No. 69 und/oder Primer und/oder Sonden und/oder Antisensenukleotide hierfür oder die spezifisch für die Feststellung des Zustands einer Infektion (lokal oder systemisch) eines Patienten sind, und/oder Polynukleotide mit einer Länge von 2 bis 100% der Anzahl der Nukleotide der einzelnen Sequenzen gemäß SEQ-ID Nr. 1 bis SEQ-ID Nr. 69 zur Bestimmung von Genaktivitäten in vitro in einer Patientenprobe, und/oder für die Feststellung des Verlaufs einer Infektion eines Patienten von lokal zu systemisch oder von systemisch zu lokal.
Z.) Kit nach Y, dadurch gekennzeichnet, dass die Polynukleotidsequenzen auch Genloci, mRNA, small RNA, insbesondere scRNA, snoRNA, microRNA, siRNA, dsRNA, ncRNA oder transposable Elemente umfassen.

LITERATURVERZEICHNIS

1. Boelen A, Kwakkel J, Alkemade A, et al. Induction of type 3 deiodinase activity in inflammatory cells of mice with chronic local inflammation. Endocrinology. 2005 Dec; 146(12):5128–34. Epub 2005 Sep 8.
2. Box G, Cox D. An analysis of transformations (with discussion). Journal of the Royal Society B 1964; 26, 211–252.
3. Brazma A, Hingamp P, Quackenbush J, et al, Minimum information about a microarray experiment (MIAME)-toward standards for microarray data. Nat Genet. 2001 Dec; 29(4):365–71.
4. Feezor RJ, Moldawer LL. Genetic Polymorphisms, Functional Genomics and the Host Inflammatory Response to Injury and Inflammation. Nestle Nutr Workshop Ser Clin Perform Programme. 2003;8:15–32; discussion 32–7.
5. Flo TH, Smith KD, Sato S, et al. Lipocalin 2 mediates an innate immune response to bacterial infection by sequestrating iron. Nature. 2004 Dec 16; 432(7019):917–21. Epub 2004 Nov 7.
6. Foti M, Granucci F, Pelizzola M, et al. Dendritic cells in pathogen recognition and induction of immune responses: a functional genomics approach. J Leukoc Biol. 2006 May; 79(5):913–6.
7. Hodges JL, Lehmann EL. Estimates of location based on rank tests. The Annales of Mathematical Statistics 1963; 34, 598–611.
8. Hutter B, Schaab C, Albrecht S, et al, Prediction of Mechanisms of Action of Antibacterial Compounds by Gene Expression Profiling. Antimicrob Agents Chemother. 2004 Aug; 48(8):2838–44.
9. Mathiak G, Kabir K, Grass G, et al. Lipopolysaccharides from different bacterial sources elicit disparate cytokine responses in whole blood assays. Int J Mol Med. 2003 Jan; 11(1):41–4.
10. Niewold TA, Veldhuizen EJ, van der Meulen J, et al. The early transcriptional response of pig small intestinal mucosa to invasion by Salmonella enterica serovar typhimurium DT104. Mol Immunol. 2007 Feb; 44(6):1316–22. Epub 2006 Aug 1.
11. Pachot A, Lepape A, Vey S, et al. Systemic transcriptional analysis in survivor and non-survivor septic shock patients: a preliminary study. Immunol Lett. 2006 Jul 15;106(1):63–71. Epub 2006 May 17.
12. Haste T, Tibshirani R, Friedman J. The Elements of Statistical Learning; Data mining, Inference, and Prediction. Springer 2001.
13. Siassi M, Riese J, Steffensen R, et al. Mannan-binding lectin and procalcitonin measurement for prediction of postoperative infection. Crit Care. 2005 Oct 5;9(5):R483–9. Epub 2005 Jul 19.
14. Wang X, Rosa AJ, Oliverira HN, et al. Transcriptome of local innate and adaptive immunity during early phase of infectious bronchitis viral infection. Vital Immunol. 2006 Winter; 19(4):768–74.

In 1 ist eine sogenannte Heatmap für die Darstellung einer zufälligen Auswahl aus den relevanten Genen für die Unterscheidung zwischen lokaler und systemischer Infektion wiedergegeben.
Dargestellt sind in der 1 in den Zeilen die normalisierten und am Mittelwert (d. h., für jedes Gen wird der Mittelwert über alle Patienten ermittelt) zentrierten Expressionsdaten der einzelnen Transkripte. Die Spalten stehen für die verschiedenen Patienten. Hell-grau/weiß steht für Expression höher als der Mittelwert und dunkel-grau/schwarz für Expression niedriger als der Mittelwert.
Der hell-graue Balken oberhalb der Heatmap steht für die Patienten mit lokaler Infektion, der dunkel-graue Balken für die Patienten mit systemischer Infektion. Für die Zeilen (Transkripte) wurde zudem ein hierarchisches Clustering durchgeführt unter der Verwendung der dem Fachmann bekannten Methode "complete", wobei als Abstand der Korrelationsabstand nach Pearson verwendet wurde. Anhand des Dendrogramms auf der linken Seite erkennt man, dass die Transkripte im Wesentlichen in 4 Cluster eingeteilt werden können. SEQUENZPROTOKOLL
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

- DE 102007010252 [0039]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

- Feezor und Moldawer 2003, M. Foti et al, 2006 [0003]
- http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi [0022]
- http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi [0025]
- Minimum Information About a Microarray Experiment [MIAME] Checkliste – Neuauflage Januar 2005, basierend auf Brazma et al. 2001 [0082]
- Boelen A, Kwakkel J, Alkemade A, et al. Induction of type 3 deiodinase activity in inflammatory cells of mice with chronic local inflammation. Endocrinology. 2005 Dec; 146(12):5128–34. Epub 2005 Sep 8 [0111]
- Box G, Cox D. An analysis of transformations (with discussion). Journal of the Royal Society B 1964; 26, 211–252 [0111]
- Brazma A, Hingamp P, Quackenbush J, et al, Minimum information about a microarray experiment (MIAME)-toward standards for microarray data. Nat Genet. 2001 Dec; 29(4):365–71 [0111]
- Feezor RJ, Moldawer LL. Genetic Polymorphisms, Functional Genomics and the Host Inflammatory Response to Injury and Inflammation. Nestle Nutr Workshop Ser Clin Perform Programme. 2003;8:15–32; discussion 32–7 [0111]
- 5. Flo TH, Smith KD, Sato S, et al. Lipocalin 2 mediates an innate immune response to bacterial infection by sequestrating iron. Nature. 2004 Dec 16; 432(7019):917–21. Epub 2004 Nov 7 [0111]
- Foti M, Granucci F, Pelizzola M, et al. Dendritic cells in pathogen recognition and induction of immune responses: a functional genomics approach. J Leukoc Biol. 2006 May; 79(5):913–6 [0111]
- Hodges JL, Lehmann EL. Estimates of location based on rank tests. The Annales of Mathematical Statistics 1963; 34, 598–611 [0111]
- Hutter B, Schaab C, Albrecht S, et al, Prediction of Mechanisms of Action of Antibacterial Compounds by Gene Expression Profiling. Antimicrob Agents Chemother. 2004 Aug; 48(8):2838–44 [0111]
- Mathiak G, Kabir K, Grass G, et al. Lipopolysaccharides from different bacterial sources elicit disparate cytokine responses in whole blood assays. Int J Mol Med. 2003 Jan; 11(1):41–4 [0111]
- Niewold TA, Veldhuizen EJ, van der Meulen J, et al. The early transcriptional response of pig small intestinal mucosa to invasion by Salmonella enterica serovar typhimurium DT104. Mol Immunol. 2007 Feb; 44(6):1316–22. Epub 2006 Aug 1 [0111]
- Pachot A, Lepape A, Vey S, et al. Systemic transcriptional analysis in survivor and non-survivor septic shock patients: a preliminary study. Immunol Lett. 2006 Jul 15;106(1):63–71. Epub 2006 May 17 [0111]
- Haste T, Tibshirani R, Friedman J. The Elements of Statistical Learning; Data mining, Inference, and Prediction. Springer 2001 [0111]
- Siassi M, Riese J, Steffensen R, et al. Mannan-binding lectin and procalcitonin measurement for prediction of postoperative infection. Crit Care. 2005 Oct 5;9(5):R483–9. Epub 2005 Jul 19 [0111]
- Wang X, Rosa AJ, Oliverira HN, et al. Transcriptome of local innate and adaptive immunity during early phase of infectious bronchitis viral infection. Vital Immunol. 2006 Winter; 19(4):768–74 [0111]

Claims

Verwendung von Polynukleotiden mit einer Länge von 2 bis 100% der Anzahl der Nukleotide der einzelnen Sequenzen gemäß SEQ-ID Nr. 1 bis SEQ-ID Nr. 69 und/oder deren Genloci und/oder deren Transkripte zur Erfassung von Genaktivitäten für die Unterscheidung eines mit einer lokalen Infektion einhergehenden Zustandes von einem mit einer systemischen Infektion einhergehenden Zustand eines Patienten, wobei sämtliche Sequenzen gemäß SEQ-ID Nr. 1 bis SEQ-ID Nr. 69 verwendet werden.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Genaktivitäten mittels Hybridisierungsverfahren, insbesondere solchen auf Microarrays und/oder enzymatischen Verfahren, insbesondere Amplifikationsverfahren, bevorzugt PCR, vorzugsweise real-time PCR, erstellt werden.
Verwendung von in vitro aus wenigstens einer Patientenprobe erhaltenen Genaktivitäten für die Unterscheidung eines mit einer lokalen Infektion einhergehenden Zustandes von einem mit einer systemischen Infektion einhergehenden Zustand eines Patienten, wobei die Genaktivitäten erhalten werden aus einem Verfahren mit folgenden Schritten: a) Isolieren von Proben-Nukleinsäuren aus einer aus einem Patienten stammenden Probe; b) Markieren von Proben-Nukleinsäuren und/oder Sonden-Nukleinsäuren mit einem detektierbaren Marker, wobei die Sonden-Nukleinsäuren Gene und/oder Genloci oder deren Transkripte repräsentieren, die eine Unterscheidung eines mit einer lokalen Infektion einhergehenden Zustandes von einem mit einer systemischen Infektion einhergehenden Zustandes eines Patienten ermöglichen und wobei die Sonden-Nukleinsäuren sämtliche Polynukleotide gemäß SEQ-ID Nr. 1 bis SEQ-ID Nr. 69 umfassen oder solche Polynukleotide mit einer Länge von 2 bis 100% der Anzahl der Nukleotide der einzelnen Sequenzen gemäß SEQ-ID Nr. 1 bis SEQ–ID Nr. 69 umfassen; c) In-Kontakt-Bringen der Proben-Nukleinsäuren mit den Sonden-Nukleinsäuren unter Hybridisierungsbedingungen; d) quantitatives Erfassen der Markierungssignale der hybridisierten Proben-Nukleinsäuren und der Sonden-Nukleinsäuren; e) Vergleichen der in Schritt d) erhaltenen Markierungssignale mit wenigstens einem Referenzwert, um eine Aussage darüber zu treffen, ob bei einem Patienten ein mit einer lokalen Infektion einhergehender Zustand oder ein mit einer systemischen Infektion einhergehender Zustand vorliegt.
Verwendung der Genaktivitätsdaten nach Anspruch 3, für die therapiebegleitende Verlaufsbeurteilung einer Infektion von einer lokalen Infektion zu einer systemischen Infektion oder einer systemischen Infektion zu einer lokalen Infektion und/oder für die Ermittlung einer geeigneten Therapie.
Verwendung nach Anspruch 3 oder 4, für die Klassifizierung von Patienten mit lokaler oder systemischer Infektion.
Verwendung nach einem der Ansprüche 3 bis 5, wobei die in ihrem Expressionsverhalten vergleichbaren Genaktivitäten der Polynukleotide mit den SEQ-IDs No 1 bis 69 zu Genaktivitätsclustern zusammengefasst werden.
Verwendung nach einem der Ansprüche 3 bis 6 als Ein- oder Ausschlußkriterium von Patienten mit lokaler oder systemischer Infektion in klinische Studien der Phasen 2–4.
Verwendung nach einem der Ansprüche 3 bis 7 zur Erstellung von Genaktivitätsdaten für die elektronische Weiterverarbeitung.
Verwendung nach einem der Ansprüche 3 bis 8, wobei die erhaltenen Genaktivitätsdaten zur Herstellung von Software für die Beschreibung der individuellen Prognose und/oder Krankheitsverlauf eines Patienten, als Hilfsmittel für Diagnosezwecke und/oder Patientendatenmangementsysteme, eingesetzt werden.
Verwendung nach einem der Ansprüche 3 bis 9, wobei die in vitro aus einer Patientenprobe erhaltenen Genaktivitätsdaten zur Herstellung von klinischen Expertensystemen und/oder zur Modellierung von zellulären Signalübertragungswegen eingesetzt werden.
Verwendung nach einem der Ansprüche 3 bis 10, wobei zur Erstellung der Genaktivitätsdaten solche spezifischen Gene und/oder Genfragmente verwendet werden, welche eine Sequenzhomologie von mindestens ca. 10%, insbesondere ca. 20%, vorzugsweise ca. 50%, besonders bevorzugt ca. 80% zu den Polynukleotidsequenzen gemäß SEQ-ID No. 1 bis SEQ-ID No. 69 aufweisen.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei die Genfragmente insbesondere 5–1000, bevorzugt 20–200, vorzugsweise 20–80 Nukleotide, umfassen.
Verwendung nach einem der Ansprüche 3 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Proben-Nukleinsäure RNA, insbesondere Gesamt-RNA ist, die Sondennukleinsäure DNA, insbesondere cDNA, oder mRNA ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 3 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Genaktivitätsdaten ein Genexpressionsprofil bilden.
Verwendung von in vitro aus wenigstens einer Patientenprobe erhaltenen Genaktivitäten für die Unterscheidung eines mit einer lokalen Infektion einhergehenden Zustandes von einem mit einer systemischen Infektion einhergehenden Zustand eines Patienten, wobei die Genaktivitäten erhalten werden aus einem Verfahren mit folgenden Schritten: a) Isolieren von Proben-Nukleinsäuren aus einer aus einem Patienten stammenden Probe; b) In-Kontakt-Bringen und Vervielfältigung der Nukleinsäuresequenzen gemäß SEQ-ID No. 1 bis SEQ-ID No. 69 mit synthetischen markierten oder unmarkierten Oligonukleotidprimern unter Amplifikationsbedingungen, wobei die Länge des vervielfältigten Abschnittes 50 bis 2000 Nukleotide umfaßt und die Marker diejenigen Genprodukte darstellen, welche in unterschiedlicher Menge in Patienten mit lokaler und systemischer Infektion vorliegen; c) Erfassen des Verlaufes der Vervielfältigung durch qualitative, semiquantitative oder quantitative Messung der vervielfältigten Nukleinsäurestränge und Erstellung eines Genaktivitätsdatensatzes durch Vergleich der Amplifikationssignale, welche ein Maß für die amplifizierte Nukleinsäuremenge sind mit den Amplifikationssignalen einer Menge von Referenz-Nukleinsäuren.
Verwendung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass der Amplifikationsansatz weitere Bestandteile, insbesondere Deoxynukleotide, Polymerasen, Salze, Puffer und sich an Nukleinsäuren anlagernde Fluoreszenzfarbstoffe, enthalten.
Verfahren zur in vitro Messung von Genaktivitäten für eine Unterscheidung eines mit einer lokalen Infektion einhergehenden Zustandes von einem mit einer systemischen Infektion einhergehenden Zustand eines Patienten wobei das Verfahren folgende Schritte umfaßt: a) Isolieren von Proben-Nukleinsäuren aus einer aus einem Patienten stammenden Probe; b) Markieren von Proben-Nukleinsäuren und/oder Sonden-Nukleinsäuren mit einem detektierbaren Marker, wobei die Sonden-Nukleinsäuren Gene und/oder Genloci oder deren Transkripte repräsentieren, die eine Unterscheidung eines mit einer lokalen Infektion einhergehenden Zustandes von einem mit einer systemischen Infektion einhergehenden Zustandes eines Patienten ermöglichen und wobei die Sonden-Nukleinsäuren sämtliche Polynukleotide gemäß SEQ-ID Nr. 1 bis SEQ-ID Nr. 69 umfassen oder solche Polynukleotide mit einer Länge von 2 bis 100% der Anzahl der Nukleotide der einzelnen Sequenzen gemäß SEQ-ID Nr. 1 bis SEQ-ID Nr. 69 umfassen; c) In-Kontakt-Bringen der Proben-Nukleinsäuren mit den Sonden-Nukleinsäuren unter Hybridisierungsbedingungen; d) quantitatives Erfassen der Markierungssignale der hybridisierten Proben-Nukleinsäuren und der Sonden-Nukleinsäuren; e) Vergleichen der in Schritt d) erhaltenen Markierungssignale mit wenigstens einem Referenzwert, um eine Aussage darüber zu treffen, ob bei einem Patienten ein mit einer lokalen Infektion einhergehender Zustand oder ein mit einer systemischen Infektion einhergehender Zustand vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Genfragmente 5 bis 1000, bevorzugt 20–200, vorzugsweise 20–80 Nukleotide umfassen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Polynukleotide gemäß Seq-ID No 1 bis SEQ-ID No 69 und/oder davon abgeleiteten Sequenzen ersetzt werden durch: synthetische Analoga, Aptamere, Spiegelmere sowie Peptido- und Morpholinonukleinsäuren.
Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die synthetischen Analoga der Gene 20–100, insbesondere ca. 70 Basenpaare umfassen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Genaktivität mittels Microarrays bestimmt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe ausgewählt wird aus: Gewebe, Körperflüssigkeiten, insbesondere Blut, Serum, Plasma, Urin, Speichel oder Zellen oder Zellkomponenten; oder eine Mischung davon.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass Proben, insbesondere Zellproben, einer lytischen Behandlung unterzogen werden, um deren Zellinhalte freizusetzen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Proben-Nukleinsäure RNA, insbesondere Gesamt-RNA ist, die Sondennukleinsäure DNA, insbesondere cDNA, oder mRNA ist.
Kit, enthaltend die Polynukleotidsequenzen SEQ-ID No. 1–SEQ-ID No. 69 und/oder Primer und/oder Sonden und/oder Antisensenukleotide hierfür oder die spezifisch für die Feststellung des Zustands einer Infektion (lokal oder systemisch) eines Patienten sind, und/oder Polynukleotide mit einer Länge von 2 bis 100% der Anzahl der Nukleotide der einzelnen Sequenzen gemäß SEQ-ID Nr. 1 bis SEQ-ID Nr. 69 zur Bestimmung von Genaktivitäten in vitro in einer Patientenprobe, und/oder für die Feststellung des Verlaufs einer Infektion eines Patienten von lokal zu systemisch oder von systemisch zu lokal.
Kit nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Polynucleotidsequenzen auch Genloci, mRNA, small RNA, insbesondere scRNA, snoRNA, micro RNA, siRNA, dsRNA, ncRNA oder transposable Elemente umfassen.