DE102007063356A1

DE102007063356A1 - Verfahren zur Anreicherung von Phosphopeptiden

Info

Publication number: DE102007063356A1
Application number: DE102007063356A
Authority: DE
Inventors: Kerstin Dr. Steinert; Udo Dr. Roth; Jan Dr. Petzel
Original assignee: Qiagen GmbH
Current assignee: Qiagen GmbH
Priority date: 2007-12-28
Filing date: 2007-12-28
Publication date: 2009-07-02
Also published as: US20100273984A1; WO2009083252A3; WO2009083252A2

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Anreicherung von Phosphopeptiden, das dadurch gekennzeichnet ist, dass ein Träger eingesetzt wird, der auf seiner Oberfläche Phosphat- und/oder Phosphonatgruppen trägt, die mit Zirconiumionen funktionalisiert sind, wobei die mit Zirconiumionen funktionalisierten Phosphat- und/oder Phosphonatgruppen über flexible Linkerstrukturen an den Täger gebunden sind und die flexiblen Linkerstrukturen wenigstens eine Alkylkette aufweisen, die wenigstens 5 C-Atome aufweist.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Anreicherung/Isolierung von phosphorylierten Peptiden und Proteinen (nachfolgend zusammengefasst: Phosphopeptide) aus komplexen Probenmischungen unter Verwendung von speziell funktionalisierten Trägermaterialien.
Die Gesamtheit aller Proteine in einem Lebewesen, einem Gewebe, einer Zelle oder einem Zellkompartiment, unter exakt definierten Bedingungen und zu einem bestimmten Zeitpunkt, wird üblicherweise als Proteom bezeichnet. Das Proteom steht in einem Gleichgewicht ständiger Neusynthese von Proteinen bei gleichzeitigem Abbau nicht mehr benötigter Proteine. Damit ist das Proteom im Gegensatz zum relativ statischen Genom ständig Änderungen in seiner Zusammensetzung unterworfen. Diese Änderungen werden über komplexe Regulationsprozesse gesteuert.
Die Komplexität des zellulären Proteoms steigt exponentiell an, wenn posttranslationale Modifikationen der Proteine berücksichtigt werden. Die dynamische posttranslationale Modifikation von Proteinen ist oftmals entscheidend für den Erhalt und die Regulation der Proteinstruktur und -funktion. Derzeit sind mehrere hundert verschiedene posttranslationale Modifikationen von Proteinen bekannt, von denen die Phosphorylierung die weitaus prominenteste darstellt. Enzymatisch katalysierte Phosphorylierung und Dephosphorylierung ist ein wichtiges regulatorisches Element für die lebende Zelle. Organismen nutzen reversible Proteinphosphorylierung zur Kontrolle von fundamentalen zellulären Prozessen wie Signaltransduktion, Zellzyklus, dem Stoffwechsel sowie dem programmierten Zelltod und der Genexpression. Die transiente und reversible Phosphorylierung bestimmter Aminosäuren von an diesen Prozessen beteiligten Proteinen dient dabei der stringenten Kontrolle von Aktivität, Stabilität, Lokalisierung oder Interaktionen. Eine umfassende Analyse von Phosphopeptiden und die Bestimmung von Phosphorylierungsstellen ist demnach Voraussetzung für das Verständnis komplexer biologischer Systeme und oftmals auch von Krankheitsursachen.
Die Analyse und Identifizierung von Phosphopeptiden und die Identifizierung von Phosphorylierungsstellen muss in der Regel aufgrund der geringen Mengen durch empfindliche, massenspektrometrische Methoden erfolgen. Diese Methoden erfordern typischerweise die enzymatische Spaltung des zu analysierenden Phosphoproteins bzw. peptids in Fragmente, meistens in tryptische Peptide (erhältlich durch Spaltung mit Trypsin). Phosphorylierte Aminosäuren treten jedoch nur in solchen Peptiden auf, die Erkennungssequenzen für die an der Phosphorylierung beteiligten Enzyme enthalten. Die an regulatorischen Prozessen beteiligten Proteine sind in der Zelle jedoch in der Regel nur in relativ niedriger Abundanz vertreten und damit schwierig zu analysieren, da Peptide unterhalb einer bestimmten relativen Abundanz im Peptidgemisch nicht mehr sicher detektiert werden können. Zudem ist die transiente Phosphorylierung von Proteinen selten stöchiometrisch, so dass die phosphorylierte Form in der Regel gemeinsam mit der unphosphorylierten Form vorliegt. Entsprechend liegen Phosphopeptide selbst im Falle der Analyse eines zur Homogenität gereinigten Phosphoproteins im Gemisch mit nicht phosphorylierten Peptiden desselben Proteins vor, was die Analyse erschwert.
Um Phosphorylierungstellen in einem Protein zu identifizieren, werden regelmäßig massenspektrometrische Methoden eingesetzt. Nach Verdau eines Protein/Peptids oder einer Protein/Peptid Mischung werden die so gewonnen Peptide mittels Massenspektrometrie identifiziert. Da die phosphorylierten Peptide jedoch die Tendenz haben, schlechter als nicht-phosphorylierte Peptide zu ionisieren, sind Phosphopeptide in der Regel in komplexen Mischungen unterrepräsentiert oder sogar völlig suppremiert. Darüber hinaus erschweren die stöchiometrischen Effekte die Analyse (siehe oben).
Daher können schwache kleine Signale im Hintergrundrauschen verschwinden, so dass niedrig abundante Peptide – die jedoch oftmals gerade von zentraler Bedeutung sind – ohne vorherige Anreicherung möglicherweise nicht detektiert werden können. Daher werden die zu untersuchenden Phosphopeptide in der Regel zunächst angereichert, um sie für eine massenspektrometrische Analyse vorzubereiten und um Suppressionseffekte weitgehend zu vermeiden. Es wird geschätzt, dass im menschlichen Proteom etwa 100.000 potentielle Phosphorylierungsstellen in der Primärsequenz entsprechender Proteine codiert sind, von denen jedoch bisher nur etwa 2000 identifiziert werden konnten.
Strategien zur selektiven und effizienten Anreicherung phosphorylierter Peptide aus proteolytischen Extrakten phosphorylierter Proteine mit hoher Ausbeute sind demnach ein wichtiger Bestandteil einer umfassenden Analyse des Phosphoproteoms. Verschiedene Methoden wurden zu diesem Zweck entwickelt, darunter die Verwendung von Titanoxid, IMAC Methoden und Phosphoramidite basierte Verfahren. Mit diesen Verfahren können jedoch jeweils nur bestimmte Subpopulationen von Phosphopeptiden angereichert werden, während andere nicht angereichert werden (siehe beispielsweise: Reproducible isolation of distinct, overlapping segments of the phosphoproteome; Bodenmiller et al., Nature Methods 4(3), 2007, 231–237). Bspw. bevorzugen IMAC Oberflächen multiphosphorylierte Peptide wohingegen TiO2 bevorzugt monophosphorylierte Peptide anreichert.
Darüber hinaus erfolgen bei den im Stand der Technik bekannten Methoden auch unspezifische Interaktionen, bspw. bindet Fe-IMAC auch saure Peptide, was nachteilig für die Spezifität der Anreicherung ist.
In der letzten Zeit wurde der Einsatz von ZrO₂ als Alternative zu TiO₂ bekannt. Jedoch erwies sich die Bindung von Phosphopeptiden an ZrO₂ im Vergleich mit TiO₂ als weniger spezifisch, weswegen der Zusatz von Additiven empfohlen ist. Auch bereitet die Elution oftmals Probleme.
Zhou et al. (Zirconium phosphonate-modified porous silicon for highly specific capture of phosphopeptides and MALDI-TOF MS analysis, J. Prot. Res., 2006, 5, 2431–2437) offenbaren den Einsatz von mit Zr-Phosphonat modifizierten porösen Silikatoberflächen, wobei die Phosphonatgruppe direkt an das poröse Silicium gekoppelt ist. Zhou et al. konnten mit dieser Träger-Linkerstruktur eine relative spezifische Anreicherung von Phosphopeptiden gegenüber herkömmlichen Fe-IMAC Verfahren zeigen. Im Vergleich mit den Fe-IMAC Methoden konnte bei vergleichbarer Selektivität eine verbesserte Spezifität erzielt werden. Die Selektivität konnte jedoch nicht verbessert werden, d. h. es wurde nur ein Ausschnitt der in der Probe vorhandenen Phosphopeptide detektiert. Es ist jedoch wünschenswert, eine möglichst große Anzahl an verschiedenen Phosphopeptiden in einer komplexen Mischung zu analysieren, um insbesondere auch in geringen Mengen vorliegende Proteine möglichst vollständig zu erfassen.
Aufgrund der individuellen Nachteile der einzelnen Methoden wird daher regelmäßig eine Kombination verschiedener Methoden empfohlen, um ein breites Spektrum an Phosphopeptiden analysieren zu können.
Eine reproduzierbare Anreicherungsmethode für phosphorylierte Peptide zur Analyse des Phosphoproteoms sollte wegen der oft geringen Abundanz der Phosphoproteine und des substöchiometrischen Auftretens der Phosphorylierung eine möglichst quantitative Ausbeute des entsprechenden Phosphopeptides liefern, um auch niedrig abundante Phosphopeptide zu detektieren und so einer Analyse zugänglich zu machen. Gleichzeitig sollte die Anreicherungsmethode quantitative Reinheit liefern, um trotz der oben aufgeführten stöchiometrischen Effekte eine direkte Analyse der Phosphopeptide in der Probe zu erlauben.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren für die Anreicherung/Isolierung von Phosphopeptiden aus einer Probe bereitszustellen, das es erlaubt, ein möglichst breites Spektrum von Phosphopeptiden anzureichern.
Die vorliegende Erfindung löst diese Aufgabe durch ein Verfahren zur Anreicherung von Phosphopeptiden, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass zur Anreicherung ein Träger eingesetzt wird, der auf seiner Oberfläche Phosphat- und/oder Phosphonatgruppen trägt, die mit Zirconiumionen funktionalisierbar sind, wobei die Phosphat- und/oder Phosphonatgruppen über flexible Linkerstrukturen an den Träger gebunden sind und die flexiblen Linkerstrukturen wenigstens eine Alkylkette aufweisen, die wenigstens 5 C-Atome aufweist. Die Zirconiumionen werden bei Kontakt an den Phosphat bzw. Phosphonatgruppen immobilisiert, wodurch eine Trägeroberfläche bereitgestellt wird, mit der Phosphopeptide (d. h. Phosphopeptide und Phosphoproteine, der Begriff Phosphopeptide beinhaltet keine Größenbeschränkung) spezifisch gebunden und damit angereichert werden können.
Der Einsatz von mit Zirconiumionen (Zr⁴⁺)-Phosphonat-Gruppen funktionalisierten Trägermaterialien zur Anreicherung von Phosphopeptiden war im Stand der Technik bereits bekannt. Wie oben ausgeführt, konnten mit den herkömmlichen Methoden jedoch oftmals kein breites Spektrum an Phosphopeptiden angereichert und damit analysiert werden, d. h. ein Teil der phosphorylierten Peptide wurde nicht detektiert. Im Unterschied zum Stand der Technik werden bei dem erfindungsgemäßen Verfahren lange, flexible Linkerstrukturen eingesetzt, um die mit Zirconiumionen funktionalisierbaren Phosphat oder Phosphonat-Gruppen an den Träger zu binden. Dazu weisen die Linkerstrukturen wenigstens eine Alkylkette auf, die wenigstens 5, vorzugsweise ≥ 7, insbesondere ≥ 10 C-Atome aufweist. Durch den Einsatz der erfindungsgemäßen Linkerstrukturen wird eine flexible aber geordnete funktionalisierte Trägeroberfläche bereitgestellt. Eine solche Oberfläche hat sich als vorteilhaft erwiesen, um ein möglichst breites Spektrum von Phosphopeptiden anzureichern und somit einer Analyse zuzuführen. Die experimentellen Daten zeigen, dass mit dem erfindungsgemäßen Verfahren bzw. dem erfindungsgemäßen Träger mehr unterschiedliche Phosphopeptide detektiert werden können, als mit den im Stand der Technik bekannten Verfahren. Daher können mit dem erfindungsgemäßen Verfahren auch komplexe Proben, enthaltend viele unterschiedliche Phosphopeptide (d. h. Phosphopeptide und Phosphoproteine) analysiert werden, die normalerweise nicht oder nur begrenzt analysierbar wären, da Phosphopeptide geringer Abundanz verloren gingen. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können Proben ggf. sogar ungereinigt eingesetzt werden. Insgesamt erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren daher eine gute Abdeckung des Proteoms und ist eine wertvolle Ergänzung des Standes der Technik.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren lässt sich daher ein breites Spektrum an Phosphopeptiden anreichern, wobei die erfindungsgemäße Phosphat/Phosphonat-Zr⁴⁺ Technologie eine hohe Spezifität und Bindungsstärke ermöglicht, was wiederum vorteilhaft für die Qualität der Phosphopeptidanreicherung ist. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist daher ein hochspezifisches und effizientes Anreichern von Phosphopeptiden möglich. Die massenspektrometrische Untersuchung zeigt wenig und sogar gar keine unspezifische Bindung, so dass die meisten der bei einer massenspektroskopischen Untersuchung ermittelten Peaks von phosphorylierten und damit interessanten Peptiden herrührten.
Dieser Unterschied, der augenscheinlich auf die erfindungsgemäß einzusetzenden langen, flexiblen Linkerstrukturen zurückzuführen ist, war überraschend, da man zunächst davon ausgegangen ist, dass für die Bindungseigenschaften der Träger im Wesentlichen die eingesetzten Metallverbindungen von Bedeutung wären (hier: Zirconiumionen). Mit der vorliegenden Erfindung wurde jedoch gezeigt, dass auch die Umgebung, insbesondere die Anbindung der funktionellen Phosphat/Phosphonat-Zircioniumion Gruppe an den Träger von entscheidender Bedeutung für die Effizienz des Anreicherungsverfahrens ist. Um eine möglichst große Flexibilität der Linkerstruktur zu erzielen, weist die Alkylkette der Linkerstruktur vorzugsweise ≥ 10 oder sogar ≥ 13 C-Atome auf. Die Länge und die daraus resultierende Flexibilität der Linkerstruktur ermöglicht vermutlich eine bessere Interaktion der funktionellen Gruppen mit den unterschiedlichen Phosphopeptiden, wodurch mehr unterschiedliche Phosphopeptide gebunden werden.
Die vorliegende Erfindung stellt damit ein wertvolles Instrument zur Anreicherung und Analyse von Phosphopeptiden zur Verfügung, das die Analyse des Proteoms erleichtert und die bereits bekannten Methoden damit ergänzt.
Um die Flexibilität der Linkerstruktur weiter zu erhöhen, hat es sich als vorteilhaft erwiesen, wenigstens eine inerte Polymergruppe in die Linkerstruktur, beispielsweise in die Alkylkette, zu integrieren. Ein Beispiel für eine solche inerte Polymergruppe ist das Polyethylenglycol (PEG). Eine solche PEG-Gruppe (EO4) wurde beispielsweise in der für die Zwecke der Erfindung gut geeigneten Linkerstruktur HS C11 EO4 CH2CH2-PO3H2 eingesetzt. Diese trägt Phosphonatgruppen.
Eine Vielzahl von Trägern können mit dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden, so bspw. Platten, Filter, Säulchen, Polymerpartikel, magnetische Partikel, Silikapartikel, Silikaträger, Glassubstrate und beschichtete Substrate, wie bspw. MALDI-Träger. Wie oben ausgeführt, wird das Phosphoproteom vorzugsweise mittels MALDI untersucht.
Entsprechend wird vorzugsweise ein MALDI-Träger eingesetzt. MALDI-Substrate lassen sich gut mit den erfindungsgemäß einzusetzenden Linkerstrukturen funktionalisieren. Dadurch wird ein Werkzeug zur Anreicherung von Phosphopeptiden bereitgestellt, das nach Immobilisierung der Zirconiumionen auf den Phophat oder Phosphonat-Gruppen eine direkte Analyse der gebundenen Proben mittels MALDI ermöglicht. Dies erleichtert die Anwendung, da der Nutzer die Probe ggf. sogar ungereinigt auf den mit den erfindungsgemäßen Linkergruppen und der -PO₃Zr⁴⁺ bzw. -PO₄Zr⁴⁺ Gruppe funktionalisierten MALDI-Chip auftragen und direkt mit der Analyse beginnen kann. Dies ist ein großer Vorteil gegenüber dem Stand der Technik, bei dem oftmals Reinigungsschritte vor der eigentlichen MALDI-Analyse durchgeführt werden mussten, was jedoch das Risiko beinhaltete, bestimmte, in geringen Mengen vorliegende Phosphopeptide bei den der Analyse vorgelagerten Reinigungsschritten zu verlieren.
Die Linkerstruktur kann entweder kovalent oder nicht kovalent mit dem Träger verbunden sein. Beispiele für auf Grund ihrer Flexibilität und geordneten Struktur gut geeigneten Linkerstrukturen sind beispielsweise Silanisierungen, SAMs oder Langmuir-Blodgett Filme, die mit den erfindungsgemäßen Phosphat oder Phosphonatgruppen versehen werden.
Entsprechende Linkerstrukturen stellen eine flexible und gleichzeitig hoch geordnete Oberflächenstruktur bereit.
Wie ausgeführt können sowohl Phosphat als auch Phosphonatgruppen eingesetzt werden, um die Zirconiumionen an der Trägeroberfläche zu immobilisieren. Üblicherweise wird zunächst der mit den Phosphat- und/oder Phosphonatgruppen bestückte Träger hergestellt. Die Funktionalisierung mit Zirconiumionen erfolgt vorzugsweise erst kurz vor der eigentlichen Anreicherung und damit vor dem Auftragen der Probe. Jedoch kann die Funktionalisierung auch vorab erfolgen.
Verfahren zum Auftragen von Silangruppen, SAMs oder Langmuir-Blodgett Filmen sind im Stand der Technik wohl bekannt. Langmuir-Blodget Linkerstrukturen werden vorzugsweise über ionische oder elektrostatische Bindungen an den eigentlichen Träger, vorzugsweise ein MALDI-Substrat, gebunden. Die SAM Linkerstrukturen können beispielsweise über SH-Gruppen oder Disulfidgruppen an den Träger gebunden werden. Silanlinkerstrukturen werden in der Regel kovalent an den Träger gebunden. Dies erfolgt vorzugsweise über Si-O oder Si-C Bindungen.
Besonders bevorzugt ist eine Ausführungsform, bei der als Träger ein goldbeschichteter MALDI-Träger eingesetzt wird, der eine SAM-Schicht trägt, die mit PO₃Zr⁴⁺ oder PO₄Zr⁴⁺ Gruppen funktionalisiert ist. Wie ausgeführt wird der Träger vorzugsweise zunächst nur mit der Linkerstruktur und der Phosphat bzw. Phosphonatgruppe versehen. Dieser Träger wird dann vor der eigentlichen Analyse mit Zr⁴⁺-Ionen funktionalisiert, wodurch der Träger bereit zur Anreicherung ist. Wie ausgeführt, erfolgt die Funktionalisierung mit den Zirconiumionen vorzugsweise kurz vor dem Auftragen der eigentlichen Probe. Jedoch sind auch Ausführungsvarianten denkbar, bei der der Träger vorab mit Zirconiumionen beladen wird. Geeignete Träger sind bspw. aus Edelstahl, Silicium oder Glas.
Die sich an die Funktionalisierung des Trägers mit Zirconiumionen anschließende Anreicherung/Aufreinigung der Phosphopeptide erfolgt gemäß den im Stand der Technik bekannten herkömmlichen Methoden, wobei die üblichen Wasch und Bindepuffer eingesetzt werden können. Die üblicherweise eingesetzten Wasch- und Bindepuffer arbeiten in einem pH-Bereich < 3, um unspezifische Bindungen von sauren unphosphorylierten Peptiden zu unterdrücken. ACN (acrylnitril) wird oftmals im Waschpuffer eingesetzt, um mögliche hydrophobe Interaktionen zwischen hydrophoben Peptiden und den Linkern zu vermeiden.
Vorzugsweise wird ein MALDI-Träger eingesetzt, der eine Goldbeschichtung aufweist, wobei die Goldschicht mit folgenden SAMs funktionalisiert ist: HS C11 EO4 CH2CH2-PO3H2. Wie erkennbar ist, ist eine PEG-Gruppe (EO4) in die Alkylkette integriert. Nach der Thiolgruppe, die zur Anbindung der Linkerstruktur an den Träger genutzt wird, folgt eine Kette von 11 C- Atomen, eine PEG-Gruppe (EO4), eine weitere C2 Gruppierung und dann die Phosphonatgruppe, an die Zirconiumionen gebunden werden können.
Ferner wird mit der vorliegenden Erfindung ein Träger zur Anreicherung von Phosphopeptiden bereitgestellt, welcher dadurch gekennzeichnet ist, dass er auf seiner Oberfläche Phosphat- und/oder Phosphonatgruppen trägt, die mit Zirconiumionen funktionalisierbar sind, wobei die Phosphat- und/oder Phosphonatgruppen über flexible Linkerstrukturen an den Träger gebunden sind und die flexiblen Linkerstrukturen wenigstens eine Alkylkette aufweisen, die wenigstens 5, vorzugsweise wenigstens 10 C-Atome aufweist.
Wie oben ausführlich dargelegt wurde, ist ein solcher Träger mit langen, flexiblen Linkerstrukturen besonders geeignet, um ein möglichst breites Spektrum an Phosphopeptiden aufzureinigen, sofern er mit Zirconiumionen funktionalisiert wird. Vorteilhafte Weiterbildungen und Ausgestaltungen eines solchen Trägers wurden oben bereits im Detail beschrieben. Wir verweisen auf unsere obigen Ausführungen.
Gemäß einer Ausführungsform weist der Träger gebundene Phosphopeptide auf. Ein solcher Träger entsteht beispielsweise, sobald der erfindungsgemäße Träger zur Aufreinigung und Anreicherung von Phosphopeptiden eingesetzt wird.
Ferner wird mit der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Trägers zur Anreicherung von Phosphopeptiden bereitgestellt, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass ein Träger, der auf seiner Oberfläche Phosphat- und/oder Phosphonatgruppen aufweist, die über flexible Linkerstrukturen, die wenigstens eine Alkylkette mit wenigstens 5 C-Atomen aufweisen, an den Träger gebunden sind, mit Zirconiumionen in Kontakt gebracht wird, um auf dem Träger eine Phosphopeptide bindende funktionelle Oberfläche zu generieren.
Es sind verschiedene Methoden im Stand der Technik bekannt, um die Oberfläche eines Trägers mit beispielsweise SAMs, Langmuir-Blodgett Filmen oder Silangruppen zu funktionalisieren. Entsprechende Methoden sind beispielsweise in Nixon et al. (Palladium Porphyrin Containing Zirconium Phosphonate Langmuir-Blodgett Films Chem. Mater 1999, 11, 965–976) beschrieben. Es ist vorteilhaft, zunächst die Linkerstruktur mit der Phosphat oder Phosphonatgruppe an den Träger zu binden, bevor die Immobilisierung der Zirconiumionen erfolgt. Ein mehrstufiges Ablagerungsverfahren ist bevorzugt, welches sich sinngemäß auch auf die Abscheidung von SAM Strukturen und Silanisierungen übertragen lässt. Nachfolgend wird der Abscheidungsprozess auf Basis der Phosphonatalternative geschildert.
Zunächst wird eine Phosphonatschicht auf dem Träger abgeschieden. Phosphonate haben die Struktur RPO₃H₂. Die Gruppe R entspricht der flexiblen erfindungsgemäßen Linkerstruktur mit wenigstens 5, vorzugsweise mehr als 8, besonders bevorzugt mehr als 10 C-Atomen. Je nach Linkerstruktur (Langmuir-Blodgett Filmen, Silanisierungen oder SAM Strukturen) werden entweder kovalente oder nicht kovalente Verknüpfungen mit der Oberfläche des Trägers ausgebildet.
Nachdem die Phosphonat-Linkerstruktur auf den Träger aufgebracht ist, wird der so beschichtete Träger in eine Zirconiumlösung getaucht (bspw. ZrOCl₂), um Zirconiumionen an der Phosphonat-Gruppe zu immobilisieren und entsprechend die Phosphopeptide bindende funktionelle Gruppe auszubilden. Alternativ kann die Zirconiumlösung auf das Probenfeld aufgebracht werden, um eine Beladung zu erzielen. Der so präparierte Träger ist dann für die Nutzung zur Anreicherung von Phosphopeptiden vorbereitet.
Zur Silanisierung können beispielsweise Aminoalkylalkoxysilane eingesetzt werden. Um eine ausreichend flexible Linkerstruktur zur Verfügung zu stellen, weist die Aminoalkylalkoxysilangruppe vorzugsweise eine Alkylkette von wenigstens 5, vorzugsweise mehr als 8 und besonders bevorzugt ≥ 10 C-Atomen auf. Sie bildet nachher die eigentliche Linkerstruktur. Trägerstoffe, die mit entsprechenden Aminoalkylalkoxysilanen funktionalisiert wurden, können im Anschluss durch eine Behandlung mit beispielsweise POCl₃ mit Phosphonatgruppen versehen werden. Als letzter Schritt werden Zirconiumionen hinzugegeben, um eine PO₃Zr⁴⁺ Gruppe zu erzeugen, die hoch spezifisch Phosphopeptide bindet.
Self Assembeled Monolagers (SAMs) sind wohlgeordnete monomolekulare Filme, die eine große Flexibilität bieten, da sie auch variabel gestaltbar sind. Entsprechende Filme, die erfindungsgemäß als Linkerstrukturen eingesetzt werden können, können beispielsweise von Thiolverbindungen, wie beispielsweise omegasubstituierten Alkanthiolen und Disulfiden gebildet werden. Alklythiole weisen die Struktur R-(CH₂)_n-SH auf, wobei SH die Schwefel bzw. die Thiolkopfgruppe darstellt. n kann jede Zahl repräsentieren je nach gewünschter Länge der Linkerstruktur. Typischerweise liegt n zwischen 5 und 21. R entspricht hier der terminalen funktionellen Gruppe, vorliegend der -PO₃H₂ oder -PO₄H₂ Gruppe. Wie ausgeführt, wird die Phosphat bzw. Phosphonatgruppe mit den Zirconiumionen funktionalisiert. Wie oben erläutert, kann in die Alkylkette auch eine Polymergruppe, wie beispielsweise Polyethylenglycol eingelagert sein. Eine entsprechend funktionalisierte Linkerstruktur ermöglicht eine ernorme Flexibilität, die vorliegend überraschenderweise zu einem verbesserten Anreicherung von Phosphopeptiden führt. Dass dies über die Länge der Linkerstruktur erzielt werden kann, war überraschend.
Neben Thiolverbindungen können auch bspw. Dialkylsulfide eingesetzt werden.
SAMs erhält man bspw., indem man das Substrat, vorzugsweise einen MALDI-Träger, in eine verdünnte Lösung einer Thiolate ausbildenden Verbindung taucht, beispielsweise in Alkylthiolen (siehe oben). Nachfolgend wird ein mögliches Beschichtungsverfahren anhand eines Beispiels (Alkylthiols) erläutert. Jedoch kann auch jede andere Verbindung, die eine Thiolatschicht ausbilden kann, im Rahmen der vorliegenden Erfindung als Linkergruppe eingesetzt werden.
Die Alkylthiolverbindungen adsorbieren aufgrund der Schwefel-(SH) kopfgruppe stark an der Substratoberfläche, und formen dicht gepackte Monolayer, mit ausgefahrenen Hydrocarbonketten [-(CH₂)_n] Ketten. Es wird angenommen, dass die Thiolkopfgruppe nach der Chemisorption auf dem Substrat den Wasserstoff verliert, um ein Thiolat auszubilden. Da die Alkylthiolatverbindungen auf der Substratoberfläche über den Schwefelkopf verankert sind, weist die nach außen exponierte Oberfläche der SAM-Beschichtung die terminale Phosphat oder Phosphonatgruppe auf, die mit Zirconiumionen funktionalisiert werden kann. Dadurch wird eine Oberfläche zur Verfügung gestellt, die bestens für die Anreicherung von Phosphopeptiden ausgebildet ist. Dies insbesondere, da die geordneten flexiblen Strukturen beste Anbindungen an unterschiedlich große und unterschiedlich gestaltete Peptide ermöglicht.
Die Erfindung und die damit erzielten Vorteile werden nachfolgend in einigen Beispielen dargelegt.
Die Leistungsfähigkeit des erfindungsgemäßen Zirconiumphosphonatchips wurde mit herkömmlichen IMAC Chips (beladen mit Fe(III) oder Zr(IV) verglichen. Die Spezifität bzw. die Phosphopeptidbindungspräferenzen wurden anhand einer Peptidmischung (Invitrogen) getestet, die vier phosphorylierte und drei nicht phosphorylierte Peptide sowie ein extra synthetisches Threonin phosphoryliertes Peptid aufwies (phosphorylierte Peptide: pS, pY, pT, pTpY). 100 fmol dieser Mischung wurden zusammen mit 100 fmol eines Standard BSA Verdaus (Waters), der keine Phosphopeptide enthält, auf jeweils einen Spot des jeweiligen Chips aufgetragen. Die IMAC-Chips wurden gemäß den Herstellerinstruktionen prozessiert und mit DHB (1 mg pro ml) als Matrix fokussiert. Der erfindungsgemäße Chip wurde wie folgt behandelt:

– Waschen des Chips mit 70% ACN (einmalig)
– Erneutes Waschen mit 50% ACN/300 mM Essigsäure (einmalig)
– Äquilibrieren mit 300 mM Essigsäure (zweimal 2 Minuten)
– Beladen des Chips mit 100 mM Zirkonchlorid (ZrCl₄, inkubieren für 20 Minuten, alternativ funktioniert auch ZrOCl)
– Dreimaliges Waschen mit 300 mM Essigsäure
– Hinzugabe der Probe, verdünnt in 300 mM Essigsäure für 20 Minuten
– Dreimaliges Waschen mit 30% ACN/300 mM Essigsäure
– Eluieren mit DHB (1 mg/ml) in 1%iger H₃PO₄ und Trocknen (alternativ kann auch mit 0,5% H₃PO₄ gearbeitet werden, beschleunigt die Trocknung).

Sämtliche der Wasch- und Beladungslösungen hatten ein Volumen von 10 Mikroliter, die Elutionslösung von 2 Mikroliter.
1 zeigt entsprechend die mit unterschiedlichen Maldi-Chips erzielten Ergebnisse bei der Anreicherung von Phosphopeptiden mittels verschiedener: 100 fmol eines Mix aus fünf verschiedenen Phosphopeptiden und zahlreichen unphosphorylierten Peptiden wurden auf folgenden Maldi-Chips untersucht:

(a) einem patentgemäßen Zr-Phosphonat Chip;
(b) einem Zr-beladenen Mass Spec Focus Chip (QIAGEN) und
(c) einem Fe-beladenen Mass Spec Focus Chip (QIAGEN)

Die Proben wurden appliziert und wie beschrieben prozessiert. Mit einem Stern sind jeweils die angereicherten Phosphopeptid-Peaks gekennzeichnet. Es wird deutlich, dass der Zr-Phosphonat Chip eine hohe Spezifität aufweist, da 4 von 5 Phosphopeptiden detektiert wurden, aber nur ein falsch positives nicht-phosphoryliertes Peptid nachweisbar war. Nach Phosphopeptidaufreinigung auf den jeweiligen Mass Spec Focus Chips wurden zwar ebenfalls 4 von 5 Phosphopeptiden detektiert. Überraschenderweise liegt hier aber eine andere Selektivität vor, da an diesen Chiptypen ein an Threonin phosphoryliertes Peptid (1294 m/z) offensichtlich nicht gebunden hat, wohl aber ein an Serin phosphoryliertes (2193 m/z). Dieses wiederum konnte mit Hilfe des Zr-Phosphonat Chips nicht nachgewiesen werden. Gleichzeitig zeigen aber beide Mass Spec Focus Chips, insbesondere der Fe-beladene Chiptyp, gegenüber dem Zr-Phosphonat Chip eine geringere Spezifität, da hier eine größere Zahl an kontaminierenden, nicht-phosphorylierten Peptiden mitangereichert wurden.
2 veranschaulicht die Spezifität des Zr-Phosphonat Chips. Das obere Spektrum zeigt die Ergebnisse des folgenden Versuchs: 2 pmol beta-Caseinverdau wurden auf dem Chip appliziert und wie oben beschrieben prozessiert. Das untere Spektrum zeigt die Ergebnisse des folgenden Versuchs: 2 pmol beta-Caseinverdau wurden auf einen benachbarten Auftragspunkt des gleichen Chip appliziert, jedoch wurden keine der nachfolgenden Waschschritte durchgeführt. Mit einem Stern sind die jeweiligen Phosphopeptidpeaks markiert. „2+" weist auf doppelt geladene Ionen im Spektrum hin, während mit „PSD" post source decay Fragmente gekennzeichnet wurden, die in der Messung während des Ionisierungsprozess durch Verlust von Phosphorsäure entstehen. Aus dem Vergleich der beiden Spektren wird die hohe Reinigungseffizienz und damit verbundene Spezifität des Zr-Phosphonatchips deutlich. Der eingesetzte beta-Casein Verdau weist im Spektrum eine hohe Zahl an Peptidpeaks auf (unteres Spektrum), die bis auf die bindenden Phosphopeptide fast vollständig abgereinigt werden konnten (oberes Spektrum).
3 zeigt das Spektrum eines alpha-Casein Verdaus (2 pmol) nach Prozessierung auf dem Zr-Phosphonat Chip. Das käuflich erwerbbare alpha-Casein besitzt eine Vielzahl von Phosphorylierungsstellen, die nach Verdau und Prozessierung auf dem Chip detektiert werden konnten. Gleichzeitig wird auch hier die hohe Spezifität des Chips deutlich, da neben einer hohen Anzahl von Phosphopeptiden lediglich drei nicht-phosphorylierte Peptide nachweisbar waren. Dieses Spektrum wurde ebenfalls zum Vergleich zwischen den bei Zhou et al. (Zirconium phosphonate-modified porous silicon for highly specific capture of phosphopeptides and MALDI-TOF MS analysis, J. Prot. Res., 2006, 5, 2431–2437) aufgereinigten Phosphopeptiden und den hier gefundenen herangezogen (siehe Tab. 1).
Tab. 1 zeigt einen Vergleich der detektierten Phoshopeptidpeaks aus einem alpha-Casein Verdau nach Prozessierung auf einem patentgemäßen Zr-Phosphonatchip mit den von Zhou et al. gefundenen Phosphopeptiden. Zhou et al. führten die Aufreinigung von Phosphopeptiden ebenfalls auf einem Zr-Phosphonat funktionalisertem Träger für Maldi-TOF Analysen durch, der sich allerdings in der Art der verwendeten Linkerstruktur unterscheidet.

Aus dem Vergleich geht hervor, dass gegenüber der bei Zhou et al. beschriebenen Methodik mit der patentgemäßen Technologie eine höhere Zahl an Phosphopeptiden in der gleichen Anwendung (alpha-Caseinverdau) angereichert und nachgewiesen wurden.

Exp. Masse [M+H]+ Da	Beschrieben bei Zhou et al.
880.72 (2-fach geladen)	-
1466.97	X
1539.96	X
1661.19	X
1833.28	X
1848.16	X
1928.14	X
1944.13 (Met ox.)	-
2592.77	-
2619.45	X
2678.57	-
2703.86	-
2720.53	X
2746.87	-
2762.85 (Met ox.?)	-
2935.71	X
3008.61	X
3088.57	X

(„X" = detektiert/„-" = nicht detektiert)

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur

- Reproducible isolation of distinct, overlapping segments of the phosphoproteome; Bodenmiller et al., Nature Methods 4(3), 2007, 231–237 [0007]
- Zhou et al. (Zirconium phosphonate-modified porous silicon for highly specific capture of phosphopeptides and MALDI-TOF MS analysis, J. Prot. Res., 2006, 5, 2431–2437) [0010]
- Nixon et al. (Palladium Porphyrin Containing Zirconium Phosphonate Langmuir-Blodgett Films Chem. Mater 1999, 11, 965–976) [0033]
- Zhou et al. (Zirconium phosphonate-modified porous silicon for highly specific capture of phosphopeptides and MALDI-TOF MS analysis, J. Prot. Res., 2006, 5, 2431–2437) [0047]
- Zhou et al. [0048]
- Zhou et al. [0049]
- Zhou et al. [0049]

Claims

Verfahren zur Anreicherung von Phosphopeptiden, dadurch gekennzeichnet, dass ein Träger eingesetzt wird, der auf seiner Oberfläche Phosphat- und/oder Phosphonatgruppen trägt, die mit Zirconiumionen funktionalisiert sind, wobei die mit Zirconiumionen funktionalisierten Phosphat- und/oder Phosphonatgruppen über flexible Linkerstrukturen an den Träger gebunden sind und die flexiblen Linkerstrukturen wenigstens eine Alkylkette aufweisen, die wenigstens 5 C-Atome aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Linkerstrukturen eine Alkylkette aufweisen, die ≥ 10 C-Atome aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Linkerstruktur wenigstens eine inerte Polymer-Gruppe, vorzugsweise PEG aufweist, die in die Alkylkette integriert ist.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger eine Platte, ein Filter, ein Säulchen, ein magnetischer Partikel, ein Polymerpartikel, ein MALDI-Träger und/oder ein Silikaträger ist.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Linkerstrukturen kovalent oder nicht kovalent an den Träger gebunden sind.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Linkerstrukturen durch Silanisierung, SAMs oder Langmuir-Blodgett-Filme gebildet sind.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass Langmuir-Blodgett Linkerstrukturen über ionische oder elektrostatische Bindungen an den Träger gebunden werden, SAMs über SH-Gruppen oder Disulfidgruppen an den Träger gebunden werden und Silan-Linkerstrukturen kovalent, vorzugsweise über Si-O oder Si-C Bindungen, an den Träger gebunden werden.
Träger zur Anreicherung von Phosphopeptiden, dadurch gekennzeichnet, dass er auf seiner Oberfläche Phosphat- und/oder Phosphonatgruppen trägt, die mit Zirconiumionen funktionalisierbar sind, wobei die Phosphat- und/oder Phosphonatgruppen über flexible Linkerstrukturen an den Träger gebunden sind und die flexiblen Linkerstrukturen wenigstens eine Alkylkette aufweisen, die wenigstens 5 C-Atome aufweist.
Träger nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass er eine Struktur aufweist wie in einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 7 definiert.
Träger nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass er mit Zirconiumionen funktionalisiert ist und gegebenenfalls gebundene Phosphopeptide aufweist.
Verwendung eines Trägers nach Anspruch 8, 9 oder 10 zur Anreicherung von Phosphopeptiden.
Verfahren zur Herstellung eines Trägers nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche eines Trägers mit Phosphat- und/oder Phosphonatgruppen versehen wird, die über flexible Linkerstrukturen, die wenigstens eine Alkylkette mit wenigstens 5 C-Atomen aufweisen, an den Träger gebunden werden.
Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Phosphat- und/oder Phosphonatgruppen aufweisende Träger mit Zirconiumionen in Kontakt gebracht wird, um auf dem Träger eine Phosphopeptide bindende funktionelle Oberfläche zu generieren.
Kit zur Anreicherung von Phosphopeptiden, dadurch gekennzeichnet, dass er einen Träger gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 8 bis 10 aufweist, sowie optional Binde- und Waschpuffer.