DE102007059248A1 - Zelle, welche in der Lage ist, CO2 zu fixieren - Google Patents

Zelle, welche in der Lage ist, CO2 zu fixieren Download PDF

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine rekombinante Zelle, welche in der Lage ist, unter Ausnutzung eines Stoffwechselweges, bei dem aus Acetyl-CoA und Hydrogencarbonat Malonyl-Coenzym A, aus Malonyl-Coenzym A Malonatsemialdehyd, aus Malonatsemialdehyd 3-Hydroxypropionat, aus 3-Hydroxypropionat 3-Hydroxypropionyl-Coenzym A, aus 3-Hydroxypropionyl-Coenzym A Acryloyl-Coenzym A, aus Acryloyl-Coenzym A Propionyl-Coenzym A, aus Propionyl-Coenzym A und Hydrogencarbonat (S)-Methylmalonyl-Coenzym A, aus (S)-Methylmalonyl-Coenzym A (R)-Methylmalonyl-Coenzym A, aus (R)-Methylmalonyl-Coenzym A Succinat-semialdehyd, aus Succinat-semialdehyd 4-Hydroxybuttersäure, aus 4-Hydroxybuttersäure 4-Hydroxybutyryl-Coenzym A, aus 4-Hydroxybutyryl-Coenzym A Crotonyl-Coenzym A, Aus Crotonyl-Coenzym A 3-Hydroxybutyryl-Coenzym A, aus 3-Hydroxybutyryl-Coenzym A Acetoacetyl-Coenzym A und aus Acetoacetyl-Coenzym A zwei Äquivalente Acetyl-Coenzym A gebildet werden, aus Hydrogencarbonat organische Verbindungen mit mindestens zwei Kohlenstoffatomen zu bilden. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung einer rekombinanten Zelle, die durch dieses Verfahren erhältliche rekombinante Zelle, die Verwendung einer rekombinanten Zelle, ein Verfahren zur Herstellung einer organischen Verbindung mit mindestens zwei Kohlenstoffatomen, ein Verfahren zur Herstellung von Acrylsäure, ein Verfahren zur Herstellung von Methacrylsäure sowie ein Verfahren zur Herstellung von Poly(meth)acrylsäure oder ...

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine rekombinante Zelle, ein Verfahren zur Herstellung einer rekombinanten Zelle, die durch dieses Verfahren erhältliche rekombinante Zelle, die Verwendung einer rekombinanten Zelle, ein Verfahren zur Herstellung einer organischen Verbindung mit mindestens zwei Kohlenstoffatomen, ein Verfahren zur Herstellung von Acrylsäure, ein Verfahren zur Herstellung von Methacrylsäure sowie ein Verfahren zur Herstellung von Poly(meth)acrylsäure oder Poly(meth)acrylsäureestern.
  • Organische Verbindungen sind bedeutende industrielle Erzeugnisse. So werden beispielsweise Acrylsäure und Methacrylsäure zur Herstellung von Polymeren, Aminosäuren wie etwa Glutamat als Lebensmittelzusätze oder Alkohole wie etwa 1,2-Propandiol oder 1,3-Propandiol als Lösungsmittel eingesetzt.
  • Die großtechnische Herstellung derartiger organischer Verbindungen erfolgt entweder auf rein chemischem Wege (im Falle der Acrylsäure beispielsweise durch katalytische Gasphasenoxidation von Propylen), oder aber zumindest in Teilschritten auf biotechnologischem Weg (im Falle der Acrylsäure beispielsweise durch fermentative Umsetzung von Kohlenhydraten mittels rekombinanter Mikroorganismen unter Bildung von 3-Hydroxypropionsäure, welche anschließend chemisch zu Acrylsäure dehydratisiert werden kann). Ausgangsmaterialien für die großtechnische Herstellung organischer Verbindungen sind somit entweder Kohlenwasserstoffe, die als Produkte bei der Erdöl- oder Erdgasraffination anfallen, oder aber Biomasse, wie etwa Kohlenhydrate.
  • Es ist bekannt, dass die globale Erwärmung hauptsächlich durch Kohlendioxidgas verursacht wird, welches durch menschliches Handeln von Fabriken, industriellen Anlagen, Wärmekraftwerken, Automobilen usw. ausgestoßen wird. Die Reduzierung des Kohlendioxidgasausstoßes oder die Wiedergewinnung von Kohlendioxidgas, welches in der Atmosphäre vorkommt, wird somit als eine der wichtigsten Maßnahmen zum Schutz der Umwelt angesehen.
  • Es wurden verschiedene Verfahren vorgeschlagen, um die Emission oder den Gehalt an Kohlendioxidgas zu reduzieren. So schlägt GB-A-1263231 vor, CO2 in einem elektrolytischen Konzentrator zu konzentrieren. Nach der Entfernung von Wasser wird CO2 mit Wasserstoffgas, welches in einer Elektrolysezelle erzeugt wurde, in einem CO2-Reduktionsreaktor zu Kohlenstoff und Wasser umgesetzt. Der Nachteil dieses in der GB-A-1263231 beschriebenen Verfahrens besteht jedoch unter anderem darin, dass es ausschließlich die Herstellung von Kohlenstoff aus Kohlendioxid, nicht aber die selektive Herstellung großtechnisch interessanter, organischer Verbindungen, wie beispielsweise Acrylsäure oder Methacrylsäure, ermöglicht. Außerdem erfordert das in der GB-A-1263231 beschriebene Verfahren zunächst das Aufkonzentrieren von CO2 in elektrolytischen Konzentratoren, so dass dieses Verfahren sehr komplex und damit unwirtschaftlich ist.
  • Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, die sich aus dem Stand der Technik ergebenden Nachteile im Zusammenhang mit der Kohlendioxid-Fixierung zu überwinden.
  • Insbesondere lag der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zu Grunde, ein Verfahren anzugeben, mit dem Kohlendioxid aus der Atmosphäre fixiert und hieraus gezielt großtechnisch relevante, organische Verbindungen gebildet werden können. Auch sollte dieses Verfahren möglichst wenige Verfahrensschritte umfassen und darüber hinaus in kostengünstiger Weise betrieben werden können.
  • Einen Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet eine rekombinante Zelle, welche in der Lage ist, unter Ausnutzung eines Stoffwechselweges, bei dem aus Acetyl-CoA und Hydrogencarbonat Malonyl-Coenzym A, aus Malonyl-Coenzym A Malonatsemialdehyd, aus Malonatsemialdehyd 3-Hydroxypropionat, aus 3-Hydroxypropionat 3-Hydroxypropionyl-Coenzym A, aus 3-Hydroxypropionyl-Coenzym A Acryloyl-Coenzym A, aus Acryloyl-Coenzym A Propionyl-Coenzym A, aus Propionyl-Coenzym A und Hydrogencarbonat (S)-Methylmalonyl-Coenzym A, aus (S)-Methylmalonyl-Coenzym A (R)-Methylmalonyl-Coenzym A, aus (R)-Methylmalonyl-Coenzym A Succinatsemialdehyd, aus Succinatsemialdehyd 4-Hydroxybuttersäure, aus 4-Hydroxybuttersäure 4-Hydroxybutyryl-Coenzym A, aus 4-Hydroxybutyryl-Coenzym A Crotonyl-Coenzym A, aus Crotonyl-Coenzym A 3-Hydroxybutyryl-Coenzym A, aus 3-Hydroxybutyryl-Coenzym A Acetoacetyl-Coenzym A und aus Acetoacetyl-Coenzym A zwei Äquivalente Acetyl-Coenzym A gebildet werden, aus Hydrogencarbonat organische Verbindungen mit mindestens zwei Kohlenstoffatomen zu bilden.
  • Überraschenderweise wurde festgestellt, dass sich ein völlig neuer, in Metallosphaera sedula entdeckter Stoffwechselweg, bei dem aus einem Äquivalent Acetyl-Coenzym A und zwei Äquivalenten Hydrogencarbonat zunächst über Malonyl-Coenzym A, Malonat-Semialdehyd, 3-Hydroxypropionsäure, 3-Hydroxypropionyl-Coenzym A, Acrylyl-Coenzym A, Propionyl-Coenzym A und Methylmalonyl-Coenzym A gemäß dem aus Chloroflexus aurantiacus bekannten 3-Hydroxypropionat-Zyklus Succinyl-Coenzym A wird, welches dann im Unterschied zum bekannten 3-Hydroxypropionat-Zyklus nicht über Malyl-Coenzym A zu Acetyl-Coenzym A und Glyoxylat, sondern über Succinat-Semialdehyd, 4-Hydroxybuttersäure, 4-Hydroxybutyryl-Coenzym A, Crotonyl-Coenzym A, 3-Hydroxybutyryl-Coenzym A und Acetoacetyl-Coenzym A zu zwei Äquivalenten Acetyl-Coenzym A umgesetzt werden (siehe 1). Mittels dieses neu aufge fundenen Stoffwechselweges können somit zwei Äquivalente Hydrogencarbonat (welche bei dem Umsetzung von Acetyl-Coenzym A zu Malonyl-Coenzym A und bei der Umsetzung von Propionyl-Coenzym A zu Methylmalonyl-Coenzym A eingeführt werden) zu Acetyl-Coenzym A umgesetzt werden, aus dem dann über weitere Umsetzungsschritte entsprechende organische Verbindungen mit mehr als zwei Kohlenstoffatomen gebildet werden können.
  • Die Formulierung „unter Ausnutzung eines Stoffwechselweges, bei dem aus Acetyl-CoA und Hydrogencarbonat Malonyl-Coenzym A, aus Malonyl-Coenzym A Malonatsemialdehyd, aus Malonatsemialdehyd 3-Hydroxypropionat, aus 3-Hydroxypropionat 3-Hydroxypropionyl-Coenzym A, aus 3-Hydroxypropionyl-Coenzym A Acryloyl-Coenzym A, aus Acryloyl-Coenzym A Propionyl-Coenzym A, aus Propionyl-Coenzym A und Hydrogencarbonat (S)-Methylmalonyl-Coenzym A, aus (S)-Methylmalonyl-Coenzym A (R)-Methylmalonyl-Coenzym A, aus (R)-Methylmalonyl-Coenzym A Succinatsemialdehyd, aus Succinatsemialdehyd 4-Hydroxybutter-säure, aus 4-Hydroxybuttersaure 4-Hydroxybutyryl-Coenzym A, aus 4-Hydroxybutyryl-Coenzym A Crotonyl-Coenzym A, aus Crotonyl-Coenzym A 3-Hydroxybutyryl-Coenzym A, aus 3-Hydroxybutyryl-Coenzym A Acetoacetyl-Coenzym A und aus Acetoacetyl-Coenzym A zwei Äquivalente Acetyl-Coenzym A gebildet werden" ist dabei vorzugsweise so zu verstehen, dass in der Zelle mittels rekombinanter Methoden die Aktivität mindestens eines der Enzyme dieses Stoffwechselweges, beispielsweise durch Überexpression, erhöht ist, so dass ein gegenüber dem Wildtyp verstärkter Umsatz über diesen Stoffwechselweg erfolgt.
  • In diesem Zusammenhang ist es insbesondere bevorzugt, dass die rekombinante Zelle gegenüber ihrem Wildtyp derart mittels rekombinanter Verfahren verändert wurde, dass sie im Vergleich zu ihrem Wildtyp mehr organische Verbindungen mit mindestens zwei Kohlenstoffatomen aus Hydrogencarbonat, besonders bevor zugt mehr 3-Hydroxypropionsäure oder 3-Hydroxyisobuttersäure aus Hydrogencarbonat, zu bilden vermag.
  • Die Formulierung „dass sie im Vergleich zu ihrem Wildtyp mehr organische Verbindungen mit mindestens zwei Kohlenstoffatomen aus Hydrogencarbonat, besonders bevorzugt mehr 3-Hydroxypropionsäure oder 3-Hydroxyisobuttersäure aus Hydrogencarbonat, zu bilden vermag" betrifft auch den Fall, dass der Wildtyp der gentechnisch veränderten Zelle überhaupt keine organischen Verbindungen mit mindestens zwei Kohlenstoffatomen aus Hydrogencarbonat, zumindest aber keine nachweisbaren Mengen dieser organischen Verbindungen aus Hydrogencarbonat zu bilden vermag und erst nach der rekombinanten Veränderung nachweisbare Mengen dieser Komponenten gebildet werden können.
  • Unter einem „Wildtyp" einer Zelle wird vorzugsweise eine Zelle bezeichnet, deren Genom in einem Zustand vorliegt, wie er natürlicherweise durch die Evolution entstanden ist. Der Begriff wird sowohl für die gesamte Zelle als auch für einzelne Gene verwendet. Unter den Begriff „Wildtyp" fallen daher insbesondere nicht solche Zellen bzw. solche Gene, deren Gensequenzen zumindest teilweise durch den Menschen mittels rekombinanter Verfahren verändert worden sind.
  • Dabei ist es erfindungsgemäß besonders bevorzugt, dass die rekombinante Zelle derart verändert ist, dass sie in einem definierten Zeitintervall, vorzugsweise innerhalb von 24 Stunden, mindestens 2 mal, besonders bevorzugt mindestens 10 mal, darüber hinaus bevorzugt mindestens 100 mal, darüber hinaus noch mehr bevorzugt mindestens 1.000 mal und am meisten bevorzugt mindestens 10.000 mal mehr organische Verbindungen mit mindestens zwei Kohlenstoffatomen, besonders bevorzugt mehr 3-Hydroxypropionsäure oder 3-Hydroxyisobuttersäure, aus Hydrogencarbonat bildet als der Wildtyp der Zelle. Die Zunahme der Produktbildung kann dabei beispielsweise dadurch bestimmt werden, dass die erfindungs gemäße Zelle und die Wildtyp-Zelle jeweils getrennt unter gleichen Bedingungen (gleiche Zelldichte, gleiches Nährmedium, gleiche Kulturbedingungen) für ein bestimmtes Zeitintervall in einem geeigneten Nährmedium kultiviert werden und anschließend die Menge an Zielprodukt (organische Verbindung mit mindestens zwei Kohlenstoffatomen) im Nährmedium bestimmt wird.
  • Die erfindungsgemäßen rekombinanten Zellen können Prokaryonten oder Eukaryonten sein. Dabei kann es sich um Säugetierzellen (wie etwa Zellen aus dem Menschen), um pflanzliche Zellen oder um Mikroorganismen wie Hefen, Pilze oder Bakterien handeln, wobei Mikroorganismen besonders bevorzugt und Bakterien und Hefen am meisten bevorzugt sind.
  • Als Bakterien, Hefen oder Pilze sind insbesondere diejenigen Bakterien, Hefen oder Pilze geeignet, die bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Braunschweig, Deutschland, als Bakterien-, Hefeoder Pilz-Stämme hinterlegt sind. Erfindungsgemäß geeignete Bakterien gehören zu den Gattungen, die unter
    http://www.dsmz.de/species/bacteria.htm
    aufgeführt sind, erfindungsgemäß geeignete Hefen gehören zu denjenigen Gattungen, die unter
    http://www.dsmz.de/species/yeasts.htm
    aufgeführt sind und erfindungsgemäß geeignete Pilze sind diejenigen, die unter
    http://www.dsmz.de/species/fungi.htm
    aufgeführt sind.
  • Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen rekombinanten Zelle leitet sich diese von einer CO2-autotrophen Wildtyp-Zelle, insbesondere von einer CO2-autotrophen Wildtyp-Bakterienzelle ab, wobei unter einer CO2-autotrophen Wildtyp-Zelle bzw. einer CO2-autotrophen Wildtyp-Bakterienzelle vorzugsweise eine Zelle verstanden wird, deren Wildtyp bereits in der Lage ist, für die Bildung organischer Baustoffe CO2 als Kohlenstoffquelle zu verwenden.
  • Erfindungsgemäß besonders bevorzugte Zellen leiten sich ab von Archeae-Bakterien, insbesondere von Archeae-Bakterien der Gattungen Metallosphera, Sulfolobus oder Archaeoglubus, am meisten bevorzugt von Archeae-Bakterien der Art Metallosphaera hakonensis, Metallosphaera prunae, Metallosphaera sedula, Sulfolobus acidocaldarius, Sulfolobus brierleyi, Sulfolobus hakonensis, Sulfolobus metallicus, Sulfolobus shibatae, Sulfolobus solfataricus, Sulfolobus tokodaii, Archaeoglubus fulgidus, Archaeoglubus profundus oder Archaeoglubus veneficus ab. Neben diesen Archeae-Bakterien können sich die Zellen auch von Bakterien der Gattung Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus, Acinetobacter, Lactobacillus, Lactococcus, Candida, Pichia, Kluveromyces, Saccharomyces, Escherichia, Zymomonas, Yarrowia, Methylobacterium, Ralstonia, Pseudomonas, Burkholderia und Clostridium ableiten.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen, rekombinanten Zelle weist diese im Vergleich zu ihrem Wildtyp eine gesteigerte Aktivität mindestens eines der folgenden Enzyme E1 bis E16 auf:
    • – eines Enzyms E1, welches die Umsetzung von Carbonat und Acetyl-Coenzym A zu Malonyl-Coenzym A katalysiert;
    • – eines Enzyms E2, welches die Umsetzung von Malonyl-Coenzym A zu Malonatsemialdehyd katalysiert;
    • – eines Enzyms E3, welches die Umsetzung von Malonatsemialdehyd zu 3-Hydroxypropionsäure katalysiert;
    • – eines Enzyms E4, welches die Umsetzung von 3-Hydroxypropionsäure zu 3-Hydroxypropionyl-Coenzym A katalysiert;
    • – eines Enzyms E5, welches die Umsetzung von 3-Hydroxypropionyl-Coenzym A zu Acryloyl-Coenzym A katalysiert;
    • – eines Enzyms E6, welches die Umsetzung von Acryloyl-Coenzym A zu Propionyl-Coenzym A katalysiert;
    • – eines Enzyms E7, welches die Umsetzung von Carbonat und Propionyl-Coenzym A zu (S)-Methylmalonyl-Coenzym A katalysiert;
    • – eines Enzyms E8, welches die Umsetzung von (S)-Methylmalonyl-Coenzym A zu (R)-Methylmalonyl-Coenzym A katalysiert;
    • – eines Enzyms E9, welches die Umsetzung von (R)-Methylmalonyl-Coenzym A zu Succinyl-Coenzym A katalysiert;
    • – eines Enzyms E10, welches die Umsetzung von Succinyl-Coenzym A zu Succinatsemialdehyd katalysiert;
    • – eines Enzyms E11, welches die Umsetzung von Succinat-Semialdehyd zu 4-Hydroxybuttersäure katalysiert;
    • – eines Enzyms E12, welches die Umsetzung von 4-Hydroxybuttersäure zu 4-Hydroxybutyryl-Coenzym A katalysiert;
    • – E13 aufweist, welches die Umsetzung von 4-Hydroxybutyryl-Coenzym A zu Crotonyl-Coenzym A katalysiert;
    • – eines Enzyms E14, welches die Umsetzung von Crotonyl-Coenzym A zu (S)-3-Hydroxybutyryl-Coenzem A katalysiert;
    • – eines Enzyms E15, welches die Umsetzung von (S)-3-Hydroxybutyryl-Coenzem A zu Acetoacetyl-Coenzym A katalysiert;
    • – eines Enzyms E16, welches die Umsetzung von Acetoacetyl-Coenzym A zu zwei Molekülen Acetyl-Coenzym A katalysiert.
  • Von besonderer Bedeutung in diesem neu aufgefundenen Stoffwechselweg ist dasjenige Enzyms E13, welches die Umsetzung von 4-Hydroxybutyryl-Coenzem A zu Crotonyl-Coenzym A katalysiert.
  • Die nun folgenden Ausführungen zur Erhöhung der Enzymaktivität in Zellen gelten sowohl für die Erhöhung der Aktivität des Enzyms E13 als auch für alle nachfolgend genannten Enzyme, deren Aktivität gegebenenfalls erhöht werden kann, insbesondere auch für die Enzyme E1 bis E12 und E14 bis E16.
  • Grundsätzlich lässt sich eine Steigerung der enzymatischen Aktivität dadurch erzielen, dass man die Kopienzahl der Gensequenz bzw. der Gensequenzen erhöht, welche für das Enzym kodieren, einen starken Promotor verwendet oder ein Gen oder Allel nutzt, das für ein entsprechendes Enzym mit einer gesteigerten Aktivität kodiert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert. Erfindungsgemäß gentechnisch veränderte Zellen werden beispielsweise durch Transformation, Transduktion, Konjugation oder einer Kombination dieser Methoden mit einem Vektor erzeugt, der das gewünschte Gen, ein Allel dieses Gens oder Teile davon und einen die Expression des Gens ermöglichenden Vektor enthält. Die heterologe Expression wird insbesondere durch Integration des Gens oder der Allele in das Chromosom der Zelle oder einem extrachromosomal replizierenden Vektor erzielt.
  • Einen Überblick über die Möglichkeiten zur Erhöhung der Enzym-Aktivität in Zellen am Beispiel der Pyruvat-Carboxylase gibt DE-A-100 31 999 , die hiermit als Referenz eingeführt wird und deren Offenbarungsgehalt hinsichtlich der Mög lichkeiten zur Erhöhung der Enzym-Aktivität in Zellen einen Teil der Offenbarung der vorliegenden Erfindung bildet.
  • Die Expression der vorstehend und aller nachfolgend genannten Enzyme bzw. Gene ist mit Hilfe von 1- und 2-dimensionaler Proteingelauftrennung und anschließender optischer Identifizierung der Proteinkonzentration mit entsprechender Auswertesoftware im Gel nachweisbar. Wenn die Erhöhung einer Enzymaktivität ausschließlich auf einer Erhöhung der Expression des entsprechenden Gens basiert, so kann die Quantifizierung der Erhöhung der Enzymaktivität in einfacher Weise durch einen Vergleich der 1- oder 2-dimensionalen Proteinauftrennungen zwischen Wildtyp und gentechnisch veränderter Zelle bestimmt werden. Eine gebräuchliche Methode zur Präparation der Proteingele bei coryneformen Bakterien und zur Identifizierung der Proteine ist die von Hermann et al. (Electrophoresis, 22: 1712.23 (2001) beschriebene Vorgehensweise. Die Proteinkonzentration kann ebenfalls durch Western-Blot-Hybridisierung mit einem für das nachzuweisende Protein spezifischen Antikörper (Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. USA, 1989) und anschließender optische Auswertung mit entsprechender Software zur Konzentrationsbestimmung (Lohaus und Meyer (1989) Biospektrum, 5: 32–39; Lottspeich (1999), Angewandte Chemie 111: 2630–2647) analysiert werden. Die Aktivität von DNA-bindenden Proteinen kann mittels DNA-Band-Shift-Assays (auch als Gelretardation bezeichnet) gemessen werden (Wilson et al. (2001) Journal of Bacteriology, 183: 2151–2155). Die Wirkung von DNA-bindenden Proteinen auf die Expression anderer Gene kann durch verschiedene gut beschriebene Methoden des Reportergen-Assays nachgewiesen werden (Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. USA, 1989). Die intrazellulären enzymatischen Aktivitäten können nach verschiedenen beschriebenen Methoden (Donahue et al. (2000) Journal of Bacteriology 182 (19): 5624–5627; Ray et al. (2000) Journal of Bacteriology 182 (8): 2277–2284; Freedberg et al. (1973) Journal of Bacteriology 115 (3): 816–823) bestimmt werden. Sofern in den nachfolgenden Ausführungen keine konkreten Methoden zur Bestimmung der Aktivität eines bestimmten Enzyms angegeben werden, erfolgt die Bestimmung der Steigerung der Enzymaktivität und auch die Bestimmung der Verminderung einer Enzymaktivität vorzugsweise mittels der in Hermann et al., Electophoresis, 22: 1712–23 (2001), Lohaus et al., Biospektrum 5 32–39 (1998), Lottspeich, Angewandte Chemie 111: 2630–2647 (1999) und Wilson et al., Journal of Bacteriology 183: 2151–2155 (2001) beschriebenen Methoden.
  • Wird die Erhöhung der Enzymaktivität durch Mutation des endogenen Gens bewerkstelligt, so können derartige Mutationen entweder nach klassischen Methoden ungerichtet erzeugt werden, wie etwa durch UV-Bestrahlung oder durch mutationsauslösende Chemikalien, oder gezielt mittels gentechnologischer Methoden wie Deletion(en), Insertion(en) und/oder Nulkleotidaustausch(e). Durch diese Mutationen werden gentechnisch veränderte Zellen erhalten. Besonders bevorzugte Mutanten von Enzymen sind insbesondere auch solche Enzyme, die nicht mehr oder zumindest im Vergleich zum Wildtyp-Enzym vermindert feedbackinhibierbar sind.
  • Wird die Erhöhung der Enzymaktivität durch Erhöhung der Expression eines Enzyms bewerkstelligt, so erhöht man beispielsweise die Kopienzahl der entsprechenden Gene oder mutiert die Promotor- und Regulationsregion oder die Ribosomenbindungsstelle, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet. In gleicher Weise wirken Expressionskassetten, die stromaufwärts des Strukturgens eingebaut werden. Durch induzierbare Promotoren ist es zusätzlich möglich, die Expression zu jedem beliebigen Zeitpunkt zu steigern. Des Weiteren können dem Enzym-Gen als regulatorische Sequenzen aber auch sogenannte "Enhancer" zugeordnet sein, die über eine verbesserte Wechselwirkung zwischen RNA- Polymerase und DNA ebenfalls eine erhöhte Genexpression bewirken. Durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der m-RNA wird ebenfalls die Expression verbessert. Weiterhin wird durch Verhinderung des Abbaus des Enzymproteins ebenfalls die Enzymaktivität verstärkt. Die Gene oder Genkonstrukte liegen dabei entweder in Plasmiden mit unterschiedlicher Kopienzahl vor oder sind im Chromosom integriert und amplifiziert. Alternativ kann weiterhin eine Überexpression der betreffenden Gene durch Veränderung der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden. Anleitungen hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Martin et al. (Bio/Technology 5, 137–146 (1987)), bei Guerrero et al. (Gene 138, 35–41 (1994)), Tsuchiya und Morinaga (Bio/Technology 6, 428–430 (1988)), bei Eikmanns et al. (Gene 102, 93–98 (1991)), in EP-A-0 472 869 , im US 4,601,893 , bei Schwarzer und Pühler (Bio/Technology 9, 84–87 (1991), bei Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126–132 (1994)), bei LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001–1007 (1993)), in WO-A-96/15246 , bei Malumbres et al. (Gene 134, 15-24 (1993), in JP-A-10-229891 , bei Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191–195 (1998)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie. Die vorstehend beschriebenen Maßnahmen führen ebenso wie die Mutationen zu gentechnisch veränderten Zellen.
  • Zur Erhöhung der Expression der jeweiligen Gene werden zum Beispiel episomale Plasmide eingesetzt. Als Plasmide eignen sich insbesondere solche, die in coryneformen Bakterien repliziert werden. Zahlreiche bekannte Plasmidvektoren, wie zum Beispiel pZl (Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology 64: 549–554 (1989)), pEKEx1 (Eikmanns et al., Gene 107: 69–74 (1991)) oder pHS2-1 (Sonnen et al., Gene 107: 69–74 (1991)) beruhen auf den kryptischen Plasmiden pHM1519, pBL1 oder pGA1. Andere Plasmidvektoren, wie zum Beispiel solche, die auf pCG4 ( US 4,489,160 ) oder pNG2 (Serwold-Davis et al., FEMS Microbiology Letters 66: 119–124 (1990)) oder pAG1 ( US 5,158,891 ) beruhen, können in gleicher Weise eingesetzt werden.
  • Weiterhin eignen sich auch solche Plasmidevektoren, mit Hilfe derer man das Verfahren der Genamplifikation durch Integration in das Chromosom anwenden kann, so wie es beispielsweise von Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60: 126–132 (1994)) zur Duplikation bzw. Amplifikation des homthrB-Operons beschrieben wurde. Bei dieser Methode wird das vollständige Gen in einen Plasmidvektor kloniert, der in einem Wirt (typischerweise Escherichia coli), nicht aber in Corynebacterium glutamicum repliziert werden kann. Als Vektoren kommen beispielsweise pSUP301 (Simon et al., Bio/Technology 1: 784–791 (1983)), pK18mob oder pK19mob (Schäfer et al., Gene 145: 69–73 (1994)), pGEM-T (Promega Corporation, Madison, Wisconsin, USA), pCR2.1-TOPO (Shuman, Journal of Biological Chemistry 269: 32678–84 (1994)), pCR® Blunt (Invitrogen, Groningen, Niederlande), pEMI (Schrumpf et al., Journal of Bacteriology 173: 4510–4516)) oder pBGS8 (Spratt et al., Gene 41: 337–342 (1986)) in Frage. Der Plasmidvektor, der das zu amplifizierende Gen enthält, wird anschließend durch Konjugation oder Transformation in den gewünschten Stamm von Corynebacterium glutamicum überführt. Die Methode der Konjugation ist beispielsweise bei Schäfer et al., Applied and Environmental Microbiology 60: 756–759 (1994) beschrieben. Methoden zur Transformation sind beispielsweise bei Thierbach et al., Applied Microbiology and Biotechnology 29: 356–362 (1988), Dunican und Shivnan, Bio/Technology 7: 1067–1070 (1989) und Tauch et al., FEMS Microbiology Letters 123: 343–347 (1994) beschrieben. Nach homologer Rekombination mittels eines „cross-over"-Ereignisses enthält der resultierende Stamm mindestens zwei Kopien des betreffenden Gens.
  • Unter der vorstehend und in den nachfolgenden Ausführungen verwendeten Formulierung „eine gegenüber ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität eines Enzyms Ex" ist vorzugsweise stets eine um ein en Faktor von mindestens 2, besonders bevorzugt von mindestens 10, darüber hinaus bevorzugt von mindestens 100, darüber hinaus noch mehr bevorzugt von mindestens 1.000 und am meisten bevorzugt von mindestens 10.000 gesteigerte Aktivität des jeweiligen Enzyms EX zu verstehen. Weiterhin umfasst die erfindungsgemäße Zelle, welche „eine gegenüber ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität eines Enzyms Ex" aufweist, insbesondere auch eine Zelle, deren Wildtyp keine oder zumindest keine nachweisbare Aktivität dieses Enzyms Ex aufweist und die erst nach Erhöhung der Enzymaktivität, beispielsweise durch Überexpression, eine nachweisbare Aktivität dieses Enzyms Ex zeigt. In diesem Zusammenhang umfasst der Begriff „Überexpression" oder die in den nachfolgenden Ausführungen verwendete Formulierung „Erhöhung der Expression" auch den Fall, dass eine Ausgangszelle, beispielsweise eine Wildtyp-Zelle, keine oder zumindest keine nachweisbare Expression aufweist und erst durch rekombinante Verfahren eine nachweisbare Expression des Enzyms Ex induziert wird.
  • Erfindungsgemäß besonders bevorzugte rekombinante Zellen sind dabei diejenigen, bei denen die Aktivität folgender Enzyme oder Enzymkombinationen gesteigert ist: E1, E2, E3, E4, E5, E6, E7, E8, E9, E10, E11, E12, E13, E14, E15, E16, E1E2, E1E3, E1E4, E1E5, E1E6, E1E7, E1E8, E1E9, E1E10, E1E11, E1E12, E1E13, E1E14, E1E15, E1E16, E2E3, E2E4, E2E5, E2E6, E2E7, E2E8, E2E9, E2E10, E1E11, E2E12, E2E13, E2E14, E2E15, E2E16, E3E4, E3E5, E3E6, E3E7, E3E8, E3E9, E3E10, E3E11, E3E12, E3E13, E3E14, E3E15, E3E16, E4E5, E4E6, E4E7, E4E8, E4E9, E4E10, E4E11, E4E12, E4E13, E4E14, E4E15, E4E16, E5E6, E5E7, E5E8, E5E9, E5E10, E5E11, E5E12, E5E13, E5E14, E5E15, E5E16, E6E7, E6E8, E6E9, E6E10, E6E11, E6E12, E6E13, E6E14, E6E15, E6E16, E7E8, E7E9, E7E10, E7E11, E7E12, E7E13, E7E14, E7E15, E7E16, E8E9, E8E10, E8E11, E8E12, E8E13, E8E14, E8E15, E8E16, E9E10, E9E11, E9E12, E9E13, E9E14, E9E15, E9E16, E10E11, E10E12, E10E13, E10E14, E10E15, E10E16, E11E12, E11E13, E11E14, E11E15, E11E16, E12E13, E12E14, E12E15, E12E16, E13E14, E13E15, E13E16, E14E15, E14E16, E15E16, E1E2E7, E1E3E7, E1E4E7, E1E5E7, E1E6E7, E1E8E7, E1E9E7, E1E10E7, E1E11E7, E1E12E7, E1E13E7, E1E14E7, E1E15E7, E1E16E7, E1E2E7E13, E1E3E7E13, E1E4E7E13, E1E5E7E13, E1E6E7E13, E1E8E7E13, E1E9E7E13, E1E10E7E13, E1E11E7E13, E1E12E7E13, E1E14E7E13, E1E15E7E13, E1E16E7E13, E1E2E3E13, E1E2E3E13, E1E2E3E7E13 und E1E2E3E4E5E6E7E8E9E10E11E12E14E15E16, wobei E13, E1E13E7 und E1E2E3E13 und E1E2E3E7E13 besonders bevorzugt sind.
  • In diesem Zusammenhang ist es weiterhin bevorzugt, dass das Enzym
    E1 eine Acetyl-Coenzym A-Carboxylase (EC 6.4.1.2),
    E2 eine Malonyl-Coenzym A-Reduktase (EC 1.2.1.18),
    E3 eine Malonatsemialdehyd-Reduktase (EC 1.1.1.59),
    E4 eine 3-Hydroxypropionyl-Synthetase (EC 6.2.1.-),
    E5 eine 5,3-Hydroxypropionyl-Coenzym A-Dehydratase (EC 4.2.1.17),
    E6 eine Acryloyl-Coenzym A-Reduktase (EC 1.3.99.3),
    E7 eine Propionyl-Coenzym A-Carboxylase (EC 6.4.1.3),
    E8 eine Methylmalonyl-Coenzym A-Epimerase (EC 5.1.99.1)
    E9 eine Methylmalonyl-Coenzym A-Mutase (EC 5.4.99.2),
    E10 eine Succinyl-Coenzym A-Reduktase,
    E11 eine Succinatsemialdehyd-Reduktase (EC 1.1.1.61),
    E12 eine 4-Hydroxybutyryl-Coenzym A-Synthetase
    E13 eine 4-Hydroxybutyryl-Coenzym A-Dehydratase,
    E14 eine Crotonyl-Coenzym A-Hydratase (EC 4.2.1.17),
    E15 eine 3-Hydroxyacyl-Coenzym A-Dehydrogenase (EC 1.1.1.35), und
    E16 eine Acetoacetyl-Coenzym A-β-Ketothiolase (2.3.1.9)
    ist.
  • Das Enzym E1 wird vorzugsweise von Genen ausgewählt aus der Gruppe umfas send acaca, acacb, f5j5.21, fl5c21.2, t8p21.5, acc1, aar071wp, accA, accB, accC, accD, accC1 und accC2, kodiert, wobei accA, accC und accD am meisten bevorzugt sind. Ein Beispiel für eine geeignete Acetyl-Coenzym A-Carboxylase ist unter anderem diejenige aus Rhizobium leguminosarum, welche von der DNA-Sequenz gemäß SEQ.-ID.-Nr. 01 kodiert wird und welche die Aminosäuresequenz gemäß SEQ.-ID.-Nr. 02 aufweist.
  • Das Enzym E2 wird vorzugsweise wird vorzugsweise vom ioID-Gen kodiert.
  • Die Enzyme E5 und E14 werden vorzugsweise von Genen ausgewählt aus der Gruppe umfassend echS1, ehhadh, hadha, echs1-prov, cg4389, cg4389, cg6543, cg6984, cg8778, ech-1, ech-2, ech-3, ech-4, ech-5, ech-6, ech-7, FCAALL.314, fcaall.21, fox2, ecil, eci2, paaF, paaG, yfcX, fadB, faoA, rpfF, phaA, phaB, echA1, echA2, echA3, echA4, echA5, echA6, echA7, echA8, echA9, echA9, echA10, echA11, echA12, echA13, echA14, echA15, echA16, echA17, echA18, echA19, echA20, echA21, fad-1, fad-2, fad-3, dcaE, hcaA, fadJ, rsp0671, rsp0035, rsp0648, rsp0647, rs03234, rs03271, rs04421, rs04419, rs02820, rs02946, paaG1, paaG2, paaG3, ech, pksH, ydbS, eccH1, eccH2, pimF, fabJ1, fabJ2, caiD2, ysiB, yngF, yusL, fucA, cg10919, scf41.23, scd10.16, sck13.22, scp8.07c, stbac16h6.14, sc5f2a.15, sc6a5.38, hbd-1, hbd-2, hdb-3, hdb-4, hdb-5, hdb-6, hdb-7, hdb-8, hdb-9, hdb-10, fad-1, fad-2, fad-3, fad-4, fad-5, paaF-1, paaF-2, paaF-3, paaF-4, paaF-5, paaF-6, paaF-7 und crt kodiert.
  • Das Enzym E6 wird vorzugsweise von Genen ausgewählt aus der Gruppe umfassend acadl, acadm, acad10, acad11, acadm-prov, acadl-prov, mgc81873, cg12262, cg4703, cg4860, f3e22.5, afl213wp, acdC, fadE13, acd-1, acd-2, acd-3, acd-4, acd-5, acd-6, acd-7, acd-8, acd-9, acd-10, acd-11, acd-12, acd, fadE1, fadE2, fadE3, fadE4, fadE5, fadE6, fadE7, fadE13, fadE14, fadE15, fadE16, fadE17, fadE18, fadE19, fadE20, fadE21, fadE22, fadE23, fadE26, fadE27, fadE30, fadE31, fadE33, fadE35, fadE38, fadE45, fadE, caiA, aidB, RSp0036, RS03588, mmgC, acdA-3, bcd, acdA, acdH1, acdH2, acdH3, aidB, acdI und acdH kodiert.
  • Das Enzym E7 wird vorzugsweise von Genen ausgewählt aus der Gruppe umfassend pccA, pccB, LOC699844, MGC68650, LOC582365, LOC592281, pcca-1, pccb-1, gnyA, gnyB, accA, accA2, accB, accD1, accD2, accD3, accD4, accD5, accD6, mccA, cg10707, cg10708, cg12870, dtsR, dtsR1, dtsR2 und yngE kodiert. Ein Beispiel für eine geeignete Propionyl-Coenzym A-Carboxylase ist unter anderem diejenige aus Rhizobium leguminosarum, welche von der DNA-Sequenz gemäß SEQ.-ID.-Nr. 03 kodiert wird und welche die Aminosäuresequenz gemäß SEQ.-ID.-Nr. 04 aufweist.
  • Das Enzym E8 wird vorzugsweise vom mcee-Gen kodiert.
  • Das Enzym E9 wird vorzugsweise von Genen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus mut, mutA, mutB, sbm, sbmA, sbmB, sbm5, bhbA, mcmA, mcmA1, mcmA2, mcmB, mcm1, mcm2, mcm3, icmA, meaA1 und meaA2 kodiert.
  • Das Enzym E10 wird vorzugsweise von Genen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus aldH5F1, uga2, ald3, ald4, ald3, uga22, gabD, attK, attK1, attK2, XOO2614, gabD-1, gabD-2, gabD3, gabD4, gabD5, gabD6, gabG, thmS1, thmS2, ssdH, gabDch, gabDc, ypf10097, gabDf1, gabDf2, ssdA, sucD, cg10051, cg10480, 2SCG58.04 und SCD63.12 kodiert.
  • Das Enzym E11 wird vorzugsweise von Genen ausgewählt aus der Gruppe umfassend gbd, gbd1, gbd2, abfH und 4hbD kodiert.
  • Bei dem Enzym E13, welches die Umsetzung von 4-Hydroxybutyryl-Coenzym A zu Crotonyl-Coenzym A katalysiert, handelt es sich vorzugsweise um eine 4- Hydroxybutyryl-Coenzym A-Dehydratase. Ein erfindungsgemäß besonders geeignetes Enzym E13 ist beispielsweise eine 4-Hydroxybutyryl-Coenzym A-Dehydratase aus Sulfolobus solfataricus, welche von der DNA-Sequenz gemäß SEQ.-ID.-Nr. 05 kodiert wird und welche die Aminosäuresequenz gemäß SEQ.-ID.-Nr. 06 aufweist, oder eine 4-Hydroxybutyryl-Coenzym A-Dehydratase aus Sulfolobus tokodaii, welche von der DNA-Sequenz gemäß SEQ.-ID.-Nr. 07 kodiert wird und welche die Aminosäuresequenz gemäß SEQ.-ID.-Nr. 08 aufweist.
  • Das Enzym E15 wird vorzugsweise von Genen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus hibadh, cg15093, cg15093, cg4747, mwL2.23, t13k14.90, f19b15.150, hibA, ygbJ, mmsB, mmsB, garR, tsar, mmsB-1, mmsB-2, yfjR, ykwC, ywjF, hibD, glxR, SCM1.40c, hibD, ehhand, hadh2, hadhsc, hsd17B4, loc488110, had, mgC81885, hadh2-prov, cg3415, cg7113, ech-1, ech-8, ech-9, ard-1, yfcX, fadB, faoA, fadB2x, hbd-1, hbd-2, hbd-3, hbd-4, hbd-5, hbd-6, hbd-7, hbd-8, hbd-9, hbd-10, fadJ, rs04421, rs02946, rs05766, bbsD, bbsC, fadB1, fadB2, fadB5, hbdA, pimF, fabJ-1, fabJ, scbac19f3.11, sci35.13, scbac8d1.10c, sc5f2a.15, sc6a5.38, fadC2, fadC4, fadC5, fadC6, had und paaH kodiert.
  • Das Enzym E16 wird vorzugsweise von einem Gen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus acaT1, acaT2, RCJMB04_34i5, MGC69098, MGC81403, MGC81256, MGC83664, LOC759502, kat-1, ACAT2/EMB1276, erg10, atoB, yqeF, th1A, XOO1778, fadAx, phbA-1, phaA, phbA-2, atoB-2, bktB, tioL, thlA, paaJ, phbAch, phbAf, pimB, pcaF, mmgA, yhfS, th1, vraB, mvaC, thiL, fadA, th1A1, th1A2, th1A3, paaJ, fadA1, fadA2, fadA3, fadA4, fadA5, fadA6, fadA7, fadA8, fadA9, fadA10, fadA11, fadA12, cg12392, pcaF, catF, SC8F4.03, thiL1 und thiL2 kodiert.
  • Die Gen-Sequenzen der vorstehend im Zusammenhang mit den Enzymen E1, E2, E5, E6 bis E11 und E14 bis E16 genannten Gene können unter anderem der KEGG- Datenbank („Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes") entnommen werden.
  • Erfindungsgemäß besonders bevorzugt ist es, eine rekombinante Zelle einzusetzen, deren Wildtyp bereits in der Lage ist, Acetyl-Coenzym A über Malonyl-Coenzym A, Malonatsemialdehyd, 3-Hydroxypropionat, 3-Hydroxypropionyl-Coenzym A, Acryloyl-Coenzym A, Propionyl-Coenzym A, Methylmalonyl-Coenzym A, Succinyl-Coenzym A, Succinatsemialdehyd und 4-Hydroxybuttersäure zu 4-Hydroxybutyryl-Coenzym A umzusetzen (deren Wildtyp also bereits eine nachweisbare Aktivität der Enzyme E1 bis E12 aufweist) und welche zudem in der Lage ist, Crotonyl-Coenzym A über 3-Hydroxybutyyrl-Coenzym A und Acetoacetyl-Coenzym A zu zwei Äquivalenten Acetyl-Coenzym A umzusetzen (deren Wildtyp also bereits auch eine nachweisbare Aktivität der Enzyme E14 bis E16 aufweist), und in dieser Zelle die Aktivität des Enzyms E13 oder die Aktivität der Enzyme E1, E7 und E13 zu erhöhen.
  • Wie bereits eingangs erläutert, ist die erfindungsgemäße rekombinante Zelle, in der die Aktivität mindestens eines der Enzyms E1 bis E16 erhöht ist, in der Lage, aus zwei Äquivalenten Hydrogencarbonat ein Äquivalent Acetyl-Coenzym A herzustellen. Diese C2-Kohlenstoffeinheit kann nunmehr als Ausgangsprodukt für die Herstellung organischer Verbindungen mit mindestens zwei Kohlenstoffatomen durch die rekombinante Zelle dienen.
  • Vorzugsweise handelt es sich bei diesen organischen Verbindungen mit mindestens zwei Kohlenstoffatomen um eine C3-Verbindung, eine C4-Verbindung, eine C5-Verbindung, eine C6-Verbindung, eine C7-Verbindung, eine C8-Verbindung, eine C9-Verbindung, eine C10-Verbindung oder eine Verbindung mit mehr als 10 Kohlenstoffatomen. Unter diesen Verbindungen insbesondere bevorzugt sind organische Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Carbon saure, einer Dicarbonsäure, einer Hydroxycarbonsäure, einem Amin, einer Aminosäure, einem Keton und einem Alkohol.
  • Als Beispiele für organische Verbindungen, welche durch die erfindungsgemäße Zelle hergestellt werden können, seien insbesondere Verbindungen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Acrylsäure, Methacrylsäure, 3-Hydroxypropionsäure, 3-Hydroxyisobuttersäure, Lysin, Glutamat, Methionin, Phenylalanin, Asparaginsäure, Tryptophan, Threonin, Butanol, 1,2-Propandiol, 1,3-Propandiol, 2,3-Butandiol, 1,4-Butandiol, 1,6-Hexandiol, Glycerin, Sorbitol, Manitol, Xylitol, Arabinitol, Glukose, Aceton und Dihydroxyaceton genannt.
  • Soll die erfindungsgemäße rekombinante Zelle organische Verbindungen aus Hydrogencarbonat bereitstellen, die bereits als Intermediate in dem in der 1 gezeigten Stoffwechselweg gebildet werden, so kann es ausreichen, die Aktivität derjenigen Enzyme zu erhöhen, welche das Acetyl-Coenzym A, welches durch den in 1 gezeigten Stoffwechselweg aus zwei Äquivalenten Hydrogencarbonat gebildet wird, zu dieser entsprechenden Verbindung umsetzen. Sollen jedoch mittels der erfindungsgemäßen rekombinante Zellen organische Verbindungen bereitgestellt werden, die nicht unmittelbar in dem in der 1 dargestellten Stoffwechselweg gebildet werden, so kann es gegebenenfalls erforderlich sein, neben der Erhöhung der Aktivität eines oder mehrere der Enzyme E1 bis E16 auch die Aktivität von Enzymen zu erhöhen, welche an der Bildung derartiger Verbindungen aus Acetyl-Coenzym A oder aus irgendwelchen Intermediaten des in der 1 gezeigten Stoffwechselweges beteiligt sind.
  • Gemäß einer ersten, besonderen Variante der erfindungsgemäßen rekombinanten Zelle ist dieser in der Lage, aus Hydrogencarbonat 3-Hydroxypropionsäure zu bilden. Da 3-Hydroxypropionsäure als Intermediat in dem in der 1 dargestellten Stoffwechselweg gebildet wird, ist es gemäß dieser ersten Variante der erfindungsgemäßen rekombinanten Zelle insbesondere bevorzugt, wenn diese eine gesteigerte Aktivität folgender Enzyme oder Enzymkombinationen aufweist: E1, E2, E3, E1E13, E2E13, E3E13, E1E2E13, E1E3E13, E2E3E13, E1E2E7E13, E1E3E7E13, E2E3E7E13, E1E2, E1E3, E2E3 und E1E2E3E7E13, wobei als Enzyme E1, E2, E3, E7 und E13 diejenigen bevorzugt sind, die bereits vorstehend beschrieben worden sind.
  • Der vorstehend verwendete Begriff „3-Hydroxypropionsäure" beschreibt ebenso wie der nachstehend verwendete Begriff „3-Hydroxyisobuttersäure" stets die entsprechende C3- bzw. C4-Carbonsäure in derjenigen Form, in der sie nach Bildung durch die entsprechenden Mikroorganismen in Abhängigkeit vom pH-Wert vorliegt. Der Begriff umfasst somit stets die reine Säureform (3-Hydroxypropionsäure bzw. 3-Hydroxyisobuttersäure), die reine Basenform (3-Hydroxypropionat bzw. 3-Hydroxyisobutyrat) sowie Mischungen aus protonierter und deprotonierter Form der Säure.
  • Gemäß einer zweiten, besonderen Variante der erfindungsgemäßen rekombinanten Zelle ist dieser in der Lage, aus Hydrogencarbonat 3-Hydroxyisobuttersäure zu bilden. Im Zusammenhang mit dieser zweiten Variante der erfindungsgemäßen rekombinanten Zelle ist es insbesondere bevorzugt, dass diese neben einer gesteigerten Aktivität eines oder mehrerer der Enzyme E1 bis E16 auch eine gesteigerte Aktivität mindestens eines der Enzyme E17 und E18 aufweist:
    • – eines Enzyms E17, welches die Umsetzung von Propionyl-Coenzym A zu Methylmalonatsemialdehyd katalysiert;
    • – eines Enzyms E18, welches die Umsetzung von Methylmalonatsemialdehyd zu 3-Hydroxyisobuttersäure katalysiert.
  • In diesem Zusammenhang ist es besonders bevorzugt, dass das Enzym
    E17 eine Methylmalonatsemialdehyd-Dehydrogenase (EC 1.2.1.27), und
    E18 eine 3-Hydroxyisobutyrat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.31) oder eine 3-Hydroxyacyl-Coenzym A-Dehydrogenase (EC 1.1.1.35)
    ist.
  • Geeignete Gene für das Enzym E17 sind vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus aldh6al, cg17896, t22c12.10, ald6, putA1, mmsA, mmsA-1, mmsA-2, mmsA-3, mmsA-4, msdA, io1A und iolAB.
  • Geeignete Gene für das Enzym E18 sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus hibadh, cg15093, cg15093, cg4747, mwL2.23, t13k14.90, fl9b15.150, hibA, ygbJ, mmsB, mmsB, garR, tsar, mmsB-1, mmsB-2, yfjR, ykwC, ywjF, hibD, g1xR, SCM1.40c, hibD, ehhand, hadh2, hadhsc, hsd17B4, loc488110, had, mgC81885, hadh2-prov, cg3415, cg7113, ech-1, ech-8, ech-9, ard-1, yfcX, fadB, faoA, fadB2x, hbd-1, hbd-2, hbd-3, hbd-4, hbd-5, hbd-6, hbd-7, hbd-8, hbd-9, hbd-10, fadJ, rs04421, rs02946, rs05766, bbsD, bbsC, fadB1, fadB2, fadB5, hbdA, pimF, fabJ-1, fabJ, scbac19f3.11, sci35.13, scbac8d1.10c, sc5f2a.15, sc6a5.38, fadC2, fadC4, fadC5, fadC6, had und paaH. Weitere geeignete 3-Hudroxuisobuturat-Dehudrogenasen sind beispielsweise in Bannerjee et al. (1970), J. Biol. Chem, 245, Seiten 1.828 bis 1.835, Steele et al. (1992), J. Biol. Chem., 267, Seiten 13.585 bis 13.592, Harris et al. (1988), J. Biol. Chem., 263, Seiten 327 bis 331, Harris et al., Biochim. Biophys. Acta, 1645 (1), Seiten 89 bis 95, Hawes et al. (2000), Methods Enzymol., 324, Seiten 218 bis 228, Harris et al., J. Biol. Chem., 275 (49), Seiten 38.780 bis 38.786, Rougraff et al. (1988), J. Biol. Chem., 263(1), Seiten 327 bis 331, Robinson et al., J. Biol. Chem., 225, Seiten 511 bis 521, Hawes et al. (1995), Biochemistry, 34, Seiten 4.231 bis 4.237, Hasegawa J. (1981), Agric. Biol. Chem., 45, Seiten 2.805 bis 2814, Hawes et al. (1996), FERS Lett., 389, Seiten 263 bis 267, Hawes et al. (1996), Enzymology and Molecular Biology of Carbonyl Metabolism, Plenum Press, New York, Seiten 395 bis 402, Adams et al. (1994), Structure, 2, Seiten 651 bis 668, Zhang et al. (1999), Biochemistry, 38, Seiten 11.231 bis 11.238, Mirny et al., (1999), J. Mol. Biol., 291, Seiten 177 bis 196 und Lokanath et al. (2005), J Mol Biol., beschrieben. Die Offenbarung dieser Druckschriften wird hiermit als Referenz eingeführt und bildet einen Teil der Offenbarung der vorliegenden Erfindung.
  • Die Nukleotidsequenzen der vorstehend genannten Gene für die Enzyme E17 und E18 können unter anderem auch der KEGG-Datenbank entnommen werden.
  • Da Propionyl-Coenzym A bereits als Intermediat bei dem in 1 beschriebenen Stoffwechselweg gebildet wird, kann es sich bei dieser zweiten, besonderen Variante der erfindungsgemäßen rekombinanten Zelle insbesondere anbieten, neben der Erhöhung der Aktivität eines oder mehrer der Enzyme E17 und E18 auch die Aktivität eines oder mehrerer der Enzyme E1 bis E6 zu erhöhen.
  • Gemäß einer dritten, besonderen Variante der erfindungsgemäßen rekombinanten Zelle ist diese in der Lage, aus Hydrogencarbonat Pyruvat zu bilden. Im Zusammenhang mit dieser dritten Variante der erfindungsgemäßen rekombinanten Zelle ist es insbesondere bevorzugt, dass diese neben einer gesteigerten Aktivität eines oder mehrerer der Enzyme E1 bis E16 auch eine gesteigerte Aktivität eines Enzyms E19 aufweist, welches die Umsetzung von Acetyl-Coenzym A und Kohlendioxid zu Pyruvat katalysiert, wobei es sich bei diesem Enzym E19 vorzugsweise um eine Pyruvat-Synthase (EC 1.2.7.1) handelt. Gene für eine geeignete Pyruvat-Synthase können insbesondere ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus yccM, padE, padG, padI, padF, porA, porB, porC, porD, porG, nifJ, forA1, forA2, forB1, forB2, forG1, forG2, porA_1, porA_2, porB_1, porB_2, porC-1, porD-1, porD-2, porG-1, porG_2, porD-like, porA-like und porB-like. Die Nukleotidsequenzen der vorstehend genannten Gene für das Enzyme E19 können unter anderem auch der KEGG-Datenbank entnommen werden.
  • Einen Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet auch ein Verfahren zur Herstellung einer rekombinanten Zelle, welche in der Lage ist, aus Hydrogencarbonat organische Verbindungen mit mindestens zwei Kohlenstoffatomen zu bilden, umfassend den Verfahrensschritt der Erhöhung der Aktivität eines oder mehrer der Enzyme E1 bis E16 in der Zelle. Auch die durch dieses Verfahren erhältliche rekombinante Zelle leistet einen Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben.
  • Einen weiteren Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet insbesondere auch die Verwendung einer rekombinanten Zelle zur gezielten Herstellung organischer Verbindungen aus Hydrogencarbonat unter Ausnutzung eines Stoffwechselweges, bei dem aus Acetyl-CoA und Hydrogencarbonat Malonyl-Coenzym A, aus Malonyl-Coenzym A Malonatsemialdehyd, aus Malonatsemialdehyd 3-Hydroxypropionat, aus 3-Hydroxypropionat 3-Hydroxypropionyl-Coenzym A, aus 3-Hydroxypropionyl-Coenzym A Acryloyl-Coenzym A, aus Acryloyl-Coenzym A Propionyl-Coenzym A, aus Propionyl-Coenzym A und Hydrogencarbonat (S)-Methylmalonyl-Coenzym A, aus (S)-Methylmalonyl-Coenzym A (R)-Methylmalonyl-Coenzym A, aus (R)-Methylmalonyl-Coenzym A Succinatsemialdehyd, aus Succinatsemialdehyd 4-Hydroxybuttersäure, aus 4-Hydroxybuttersäure 4-Hydroxybutyryl-Coenzym A, aus 4-Hydroxybutyryl-Coenzym A Crotonyl-Coenzym A, aus Crotonyl-Coenzym A 3-Hydroxybutyryl-Coenzym A, aus 3-Hydroxybutyryl-Coenzym A Acetoacetyl-Coenzym A und aus Acetoacetyl-Coenzym A zwei Äquivalente Acetyl-Coenzym A gebildet werden.
  • Die Formulierung „zur gezielten Herstellung organischer Verbindungen aus Hydrogencarbonat" ist so zu verstehen, dass die Zelle in der Absicht eingesetzt wird, um organische Verbindungen mit mindestens zwei Kohlenstoffatomen aus Hydrogencarbonat herzustellen. Daher umfasst das gezielte Herstellen derartiger organischer Verbindungen insbesondere auch das in Kontakt bringen der erfindungsgemäßen rekombinanten Zelle mit einem Hydrogencarbonat-haltigen Nährmedium sowie mindestens einen Aufreinigungsschritt, mittels dessen die organischen Verbindungen nach ihrer Herstellung durch die Zellen isoliert werden können.
  • Bevorzugte Zellen und organische Verbindung sind wiederum diejenigen Zellen und organischen Verbindungen, die bereits eingangs im Zusammenhang mit den erfindungsgemäßen rekombinanten Zellen genannt worden sind, wobei als organische Verbindungen 3-Hydroxypropionsäure und 3-Hydroxyisobuttersäure besonders bevorzugt sind.
  • Einen Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet insbesondere auch ein Verfahren zur Herstellung von organischen Verbindungen mit mindestens zwei Kohlenstoffatomen, umfassend den Verfahrensschritt des in Kontakt bringens einer erfindungsgemäßen Zelle mit einem Hydrogencarbonatenthaltenden Nährmedium, vorzugsweise mit einem Nährmedium, in welches ein Kohlendioxid-haltiges Gas unter zumindest teilweiser Bildung von Hydrogencarbonat eingebracht wird, unter Bedingungen, unter denen aus dem Hydrogencarbonat organische Verbindungen mit mindestens zwei Kohlenstoffatomen gebildet werden, sowie gegebenenfalls Aufreinigung der organischen Verbindungen mit mindestens zwei Kohlenstoffatomen aus dem Nährmedium.
  • Die erfindungsgemäßen rekombinanten Zellen können kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch-Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed-batch-Verfahren (Zulaufverfahren) oder repeated fed-batch-V erfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Produktion organischer Verbindungen mit mindestens zwei Kohlenstoffatomen aus Hydrogencarbonat mit dem Nährmedium in Kontakt und somit kultiviert werden. Denkbar ist auch ein semi-kontinuierliches Verfahren, wie es in der GB-A-1009370 beschrieben wird. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden sind im Lehrbuch von Chmiel („Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik" (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas („Bioreaktoren und periphere Einrichtungen", Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994) beschrieben.
  • Das zu verwendende Kulturmedium muss in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) enthalten.
  • Als Kohlenstoffquelle, welche gegebenenfalls neben dem Hydrogencarbonat zugesetzt werden kann, können Kohlehydrate wie z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose, Öle und Fette wie z. B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosfett, Fettsäuren wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole wie z. B. Glycerin und Methanol, Kohlenwasserstoffe wie Methan, Aminosäuren wie L-Glutamat oder L-Valin oder organische Säuren wie z. B. Essigsäure verwendet werden.
  • Als Stickstoffquelle können organische Stickstoff-haltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
  • Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium-haltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muss weiterhin Salze von Metallen enthalten wie z. B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden.
  • Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie z. B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe wie z. B. Antibiotika hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoff-haltige Gasmischungen wie z. B. Luft in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 20°C bis 45°C und vorzugsweise bei 25°C bis 40°C.
  • Das Hydrogencarbonat wird dem Nährmedium vorzugsweise durch das Einbringen von Kohlendioxid-haltigem Gas zugesetzt. Als Kohlendioxid-haltiges Gas kann reines Kohlendioxid eingesetzt werden. Denkbar und erfindungsgemäß bevorzugt sind jedoch Kohlendioxid-reiche Gasgemische, insbesondere Gasgemische mit einem CO2-Anteil von mindestens 50 Vol-%, besonders bevorzugt mindestens 75 Vol-% und am meisten bevorzugt mindestens 90 Vol-%. Als Gasgemische kommen hier insbesondere die Abgase von Verbrennungsmotoren und Kohlekraftwerken in Betracht. Auch die Abgase von Brauerein oder Müllverbren nungsanlagen können als Ausgangsmaterial für geeignete Kohlendioxid-reiche Gasgemische dienen.
  • Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung einer organischen Verbindung mit mindestens zwei Kohlenstoffatomen werden Zellen eingesetzt, die in der Lage sind, 3-Hydroxypropionsäure oder 3-Hydroxyisobuttersäure aus Hydrogencarbonat herzustellen.
  • Auch sind Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von organischen Verbindungen mit mindestens zwei Kohlenstoffatomen denkbar, bei dem nicht die organischen Verbindungen mit mindestens zwei Kohlenstoffatomen selbst, sondern nur Vorläuferverbindungen für die Herstellung dieser organischen Verbindungen mit mindestens zwei Kohlenstoffatomen durch die erfindungsgemäße rekombinante Zelle gebildet werden. Diese Vorläuferverbindungen können dann mittels weiterer, gegebenenfalls rekombinanter Zellen, welche gegebenenfalls sogar in Co-Kultur mit den erfindungsgemäßen rekombinanten Zellen kultiviert werden, aufgenommen und in die gewünschte organische Verbindung mit mindestens zwei Kohlenstoffatomen überführt werden. Ein solches Verfahren könnte sich zum Beispiel bei der dritten, besonderen Variante der erfindungsgemäßen rekombinanten Zelle, welche in der Lage ist, Pyruvat aus zwei Äquivalenten Hydrogencarbonat und einem Äquivalent Kohlendioxid zu bilden, anbieten. Da Pyruvat könnte von anderen Zellen in weitere Zielprodukte überführt werden.
  • Die Aufreinigung der organischen Verbindung mit mindestens zwei Kohlenstoffatomen erfolgt vorzugsweise mittels dem Fachmann bekannter Verfahren zur Aufeinigung von Zielprodukten aus Fermentationslösungen. Diese Aufeinigung kann, ebenso wie die Herstellung der organischen Verbindungen durch die erfindungsgemäßen Zellen selbst, kontinuierlich oder diskontinuierlich erfolgen. Übli cherweise beginnt die Aufreinigung zunächst mit einem Abtrennen der erfindungsgemäßen Zellen aus dem Nährmedium, wobei im Falle einer kontinuierlichen Aufreinigung die Fermentationsbrühe kontinuierlich über einen Filter mit einer Ausschlußgröße in einem Bereich von 20 bis 200 kDa geführt wird, in dem eine Fest/Flüssig-Trennung stattfindet. Denkbar ist auch der Einsatz einer Zentrifuge, einer geeigneten Sedimentationsvorrichtung oder eine Kombination dieser Vorrichtungen, wobei es besonders bevorzugt ist, zumindest einen Teil der Mikroorganismen zunächst durch Sedimentation abzutrennen und anschließend die von den Mikroorganismen teilweise befreite Fermentationsbrühe einer Ultrafiltration oder Zentrifugationsvorrichtung zuzuführen.
  • Die weitere Aufreinigung des Zielproduktes (organische Verbindung mit mindestens zwei Kohlenstoffatomen) hängt von der Art des Zielproduktes ab, erfolgt aber üblicherweise in mehreren Trennstufen. Denkbar ist hier der Einsatz von dem Fachmann bekannten Trennvorrichtungen, wie etwa Trennvorrichtungen, die nach dem Prinzip der Elektrodialyse, der Umkehrosmose, der Ultrafiltration oder der Nanofiltration arbeiten.
  • Einen Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet auch ein Verfahren zur Herstellung von Acrylsäure oder Acrylsäureestern, umfassend die Verfahrensschritte
    • IA) Herstellung von 3-Hydroxypropionsäure durch das vorstehend beschriebene Verfahren zur Herstellung organischer Verbindungen mit mindestens zwei Kohlenstoffatomen, bei dem Zellen eingesetzt werden, die in der Lage sind, 3-Hydroxypropionsäure aus Hydrogencarbonat zu bilden, sowie gegebenenfalls Neutralisation der gegebenenfalls aufgereinigten 3-Hydroxypropionsäure;
    • IB) Dehydratisierung der 3-Hydroxypropionsäure unter Bildung von Acrylsäure sowie gegebenenfalls Veresterung der Acrylsäure.
  • Einen Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet auch ein Verfahren zur Herstellung von Methacrylsäure oder Methacrylsäureestern, umfassend die Verfahrensschritte
    • IIA) Herstellung von 3-Hydroxyisobuttersäure durch das vorstehend beschriebene Verfahren zur Herstellung organischer Verbindungen mit mindestens zwei Kohlenstoffatomen, bei dem Zellen eingesetzt werden, die in der Lage sind, 3-Hydroxyisobuttersäure aus Hydrogencarbonat zu bilden, sowie gegebenenfalls Neutralisation der gegebenenfalls aufgereinigten 3-Hydroxyisobuttersäure;
    • IIB) Dehydratisierung der 3-Hydroxyisobuttersäure unter Bildung von Methacrylsäure sowie gegebenenfalls Veresterung der Methacrylsäure.
  • Gemäß den Verfahrensschritten IB) und IIB) wird die 3-Hydroxypropionsäure bzw. die 3-Hydroxyisobuttersäure unter Bildung von Acrylsäure bzw. Methacrylsäure dehydratisiert, wobei hierzu entweder die aus der Fermenationslösung isolierte, reine Hydroxycarbonsäure oder aber die bei der Aufarbeitung der Fermenationslösung isolierte wässrige Hydroxycarbonsäure-Lösung eingesetzt werden kann, wobei diese gegebenenfalls noch vor der Dehydratisierung beispielsweise durch Destillation, gegebenenfalls in Gegenwart eines geeigneten Schleppmittels, aufkonzentriert wird.
  • Die Dehydratisierung kann grundsätzlich in flüssiger Phase oder in der Gasphase durchgeführt werden. Weiterhin ist es erfindungsgemäß bevorzugt, dass die Dehydratisierung in Gegenwart eines Katalysators erfolgt, wobei die Art des eingesetzten Katalysators davon abhängig ist, ob eine Gasphasen- oder eine Flüssig phasenreaktion durchgeführt wird. Vorzugsweise werden als Katalysatoren anorganische Säure wie beispielsweise Schwefelsäure oder Phosphorsäure eingesetzt, wobei es vorteilhaft sein kann, Trägermaterialien wie etwa natürliche oder synthetische silikatische Stoffe, insbesondere Mordenit, Montmorillonit, saure Zeolithe, oxidische oder silikatische Stoffe, beispielsweise Al2O3, TiO2; Oxide und Mischoxide, wie beispielsweise γ-Al2O3 und ZnO-Al2O3-Mischoxide der Heteropolysauren, einzusetzen, die mit anorganischen Säuren imprägniert sind.
  • Einen Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet auch ein Verfahren zur Herstellung von Poly(meth)acrylsäure oder Poly(meth)acrylsäureestern, umfassend die Verfahrensschritte
    • IIIA) Herstellung von (Meth)acrylsäure durch die vorstehend beschriebenen Verfahren zur Herstellung von Acrylsäure bzw. Methacrylsäure;
    • IIIB) radikalische Polymerisation der (Meth)Acrylsäure,
    wobei gegebenenfalls die Carboxylgruppen der (Meth)Acrylsäure bzw. die Carboxylatgruppe des (Meth)Acrylates vor oder nach der radikalischen Polymerisation zumindest teilweise verestert werden können.
  • BEISPIEL
  • 1. Herstellung eines Expressionsvektors
  • Es wurde ein Shuttle-Vektor pA, welcher auf dem Plasmid pRNI basiert, gemäß dem durch Berkner et al. in „Small Multicopy, non-integrative shuttle vectors based an the Plasmid pRN1 for Sulfolobus acidocaldarius and Sulfolobus solfataricus, model organisms of the (cren-)archaea", Nucleic Acids Research, Vol. 35 (12), Seiten 1 bis 12 (2007), eingesetzt. In diesen Shuttle-Vektor wurde das Gen für die Hydroxybutyryl-Coenzym A Dehydratase aus Sulfolobus solfataricus (SEQ.-ID.-Nr. 05) in Analogie zu der in Berkner et al. für das pyrEF-Gen beschriebene Vorgehensweise eingefügt.
  • 2. Transformation von Sulfolobus solfataricus-Zellen
  • Nach Methylierung des Shuttle-Vektors gemäß dem bei Berkner et al. beschriebenen Verfahren wurden der Vektor gemäß dem bei Berkner et al. beschriebenen Elektrooperation-Verfahren in Sulfolobus solfataricus-Zellen eingeführt.
  • 3. Kultivierung der rekombinanten Zellen
  • Die so erhaltenen erfindungsgemäßen Zellen wurden in Brock's Basal Salt Medium bei einem pH-Wert von 3,5, in welches kontinuierlich CO2-Gas eingeblasen wurde, kultiviert. SEQUENZEN
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  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Claims (19)

  1. Eine rekombinante Zelle, welche in der Lage ist, unter Ausnutzung eines Stoffwechselweges, bei dem aus Acetyl-CoA und Hydrogencarbonat Malonyl-Coenzym A, aus Malonyl-Coenzym A Malonatsemialdehyd, aus Malonatsemialdehyd 3-Hydroxypropionat, aus 3-Hydroxypropionat 3-Hydroxypropionyl-Coenzym A, aus 3-Hydroxypropionyl-Coenzym A Acryloyl-Coenzym A, aus Acryloyl-Coenzym A Propionyl-Coenzym A, aus Propionyl-Coenzym A und Hydrogencarbonat (S)-Methylmalonyl-Coenzym A, aus (S)-Methylmalonyl-Coenzym A (R)-Methylmalonyl-Coenzym A, aus (R)-Methylmalonyl-Coenzym A Succinatsemialdehyd, aus Succinatsemialdehyd 4-Hydroxybuttersäure, aus 4-Hydroxybuttersäure 4-Hydroxybutyryl-Coenzym A, aus 4-Hydroxybutyryl-Coenzym A Crotonyl-Coenzym A, aus Crotonyl-Coenzym A 3-Hydroxybutyryl-Coenzym A, aus 3-Hydroxybutyryl-Coenzym A Acetoacetyl-Coenzym A und aus Acetoacetyl-Coenzym A zwei Äquivalente Acetyl-Coenzym A gebildet werden, aus Hydrogencarbonat organische Verbindungen mit mindestens zwei Kohlenstoffatomen zu bilden.
  2. Die rekombinante Zelle nach Anspruch 1, wobei die Zelle im Vergleich zu ihrem Wildtyp eine gesteigerte Aktivität mindestens eines der folgenden Enzyme E1 bis E16 aufweist: – eines Enzyms E1, welches die Umsetzung von Carbonat und Acetyl-Coenzym A zu Malonyl-Coenzym A katalysiert; – eines Enzyms E2, welches die Umsetzung von Malonyl-Coenzym A zu Malonatsemialdehyd katalysiert; – eines Enzyms E3, welches die Umsetzung von Malonat-Semialdehyd zu 3-Hydroxypropionsäure katalysiert; – eines Enzyms E4, welches die Umsetzung von 3-Hydroxypropionsäure zu 3-Hydroxypropionyl-Coenzym A katalysiert; – eines Enzyms E5, welches die Umsetzung von 3-Hydroxypropionyl-Coenzym A zu Acryloyl-Coenzym A katalysiert; – eines Enzyms E6, welches die Umsetzung von Acryloyl-Coenzym A zu Propionyl-Coenzym A katalysiert; – eines Enzyms E7, welches die Umsetzung von Carbonat und Propionyl-Coenzym A zu (S)-Methylmalonyl-Coenzym A katalysiert; – eines Enzyms E8, welches die Umsetzung von (S)-Methylmalonyl-Coenzym A zu (R)-Methylmalonyl-Coenzym A katalysiert; – eines Enzyms E9, welches die Umsetzung von (R)-Methylmalonyl-Coenzym A zu Succinyl-Coenzym A katalysiert; – eines Enzyms E10, welches die Umsetzung von Succinyl-Coenzym A zu Succinatsemialdehyd katalysiert; – eines Enzyms E11, welches die Umsetzung von Succinat-Semialdehyd zu 4-Hydroxybuttersäure katalysiert; – eines Enzyms E12, welches die Umsetzung von 4-Hydroxybuttersäure zu 4-Hydroxybutyryl-Coenzym A katalysiert; – E13 aufweist, welches die Umsetzung von 4-Hydroxybutyryl-Coenzym A zu Crotonyl-Coenzym A katalysiert; – eines Enzyms E14, welches die Umsetzung von Crotonyl-Coenzym A zu (S)-3-Hydroxybutyryl-Coenzem A katalysiert; – eines Enzyms E15, welches die Umsetzung von (S)-3-Hydroxybutyryl-Coenzem A zu Acetoacetyl-Coenzym A katalysiert; – eines Enzyms E16, welches die Umsetzung von Acetoacetyl-Coenzym A zu zwei Molekülen Acetyl-Coenzym A katalysiert.
  3. Die rekombinante Zelle nach Anspruch 2, wobei das Enzym E1 eine Acetyl-Coenzym A-Carboxylase (EC 6.4.1.2), E2 eine Malonyl-Coenzym A-Reduktase (EC 1.2.1.18), E3 eine Malonatsemialdehyd-Reduktase (EC 1.1.1.59), E4 eine 3-Hydroxypropionyl-Synthetase (EC 6.2.1.-), E5 eine 5,3-Hydroxypropionyl-Coenzym A-Dehydratase (EC 4.2.1.17), E6 eine Acryloyl-Coenzym A-Reduktase (EC 1.3.99.3), E7 eine Propionyl-Coenzym A-Carboxylase (EC 6.4.1.3), E8 eine Methylmalonyl-Coenzym A-Epimerase (EC 5.1.99.1) E9 eine Methylmalonyl-Coenzym A-Mutase (EC 5.4.99.2), E10 eine Succinyl-Coenzym A-Reduktase, E11 eine Succinatsemialdehyd-Reduktase (EC 1.1.1.61), E12 eine 4-Hydroxybutyryl-Coenzym A-Synthetase E13 eine 4-Hydroxybutyryl-Coenzym A-Dehydratase, E14 eine Crotonyl-Coenzym A-Hydratase (EC 4.2.1.17), E15 eine 3-Hydroxyacyl-Coenzym A-Dehydrogenase (EC 1.1.1.35), und E16 eine Acetoacetyl-Coenzym A-β-Ketothiolase (2.3.1.9) ist.
  4. Die rekombinante Zelle nach einem der Ansprüche 2 oder 3, wobei die Zelle eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität der folgenden Enzyme E1 und E7 aufweist: – des Enzyms E1, welches die Umsetzung von Carbonat und Acetyl-Coenzym A zu Malonyl-Coenzym A katalysiert; – des Enzyms E7, welches die Umsetzung von Propionyl-Coenzym A zu (S)-Methylmalonyl-Coenzym A katalysiert.
  5. Die rekombinante Zelle nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die organische Verbindung eine C3-Verbindung, eine C4-Verbindung, eine C5-Verbindung, eine C6-Verbindung, eine C7-Verbindung, eine C8-Verbindung, eine C9-Verbindung, eine C10-Verbindung oder eine Verbindung mit mehr als 10 Kohlenstoffatomen ist.
  6. Die rekombinante Zelle nach Anspruch 5, wobei die organische Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Carbonsäure, einer Dicarbonsäure, einer Hydroxycarbonsäure, einem Amin, einer Aminosäure, einem Keton und einem Alkohol.
  7. Die rekombinante Zelle nach Anspruch 5 oder 6, wobei die organische Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Acrylsäure, Methacrylsäure, 3-Hydroxypropionsäure, 3-Hydroxyisobuttersäure, Lysin, Glutamat, Methionin, Phenylalanin, Asparaginsäure, Tryptophan, Threonin, Butanol, 1,2-Propandiol, 1,3-Propandiol, 2,3-Butandiol, 1,4-Butandiol, 1,6-Hexandiol, Glycerin, Sorbitol, Manitol, Xylitol, Arabinitol, Glukose, Aceton oder Dihydroxyaceton.
  8. Die rekombinante Zelle nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Zelle in der Lage ist, aus Hydrogencarbonat 3-Hydroxypropionsäure zu bilden.
  9. Die rekombinante Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Zelle in der Lage ist, aus Hydrogencarbonat 3-Hydroxyisobuttersäure zu bilden.
  10. Ein Verfahren zur Herstellung einer rekombinanten Zelle, welche in der Lage ist, aus Hydrogencarbonat organische Verbindungen mit mindestens zwei Kohlenstoffatomen zu bilden, umfassend den Verfahrensschritt der Erhöhung der Aktivität eines oder mehrer der in Anspruch 2 definierten Enzyme E1 bis E16 in der Zelle.
  11. Eine rekombinante Zelle, erhältlich durch ein Verfahren nach Anspruch 10.
  12. Verwendung einer rekombinanten Zelle zur gezielten Herstellung organischer Verbindungen aus Hydrogencarbonat unter Ausnutzung eines Stoffwechselweges, bei dem aus Acetyl-CoA und Hydrogencarbonat Malonyl-Coenzym A, aus Malonyl-Coenzym A Malonatsemialdehyd, aus Malonatsemialdehyd 3-Hydroxypropionat, aus 3-Hydroxypropionat 3-Hydroxypropionyl-Coenzym A, aus 3-Hydroxypropionyl-Coenzym A Acryloyl-Coenzym A, aus Acryloyl-Coenzym A Propionyl-Coenzym A, aus Propionyl-Coenzym A und Hydrogencarbonat (S)-Methylmalonyl-Coenzym A, aus (S)-Methylmalonyl-Coenzym A (R)-Methylmalonyl-Coenzym A, aus (R)-Methylmalonyl-Coenzym A Succinatsemialdehyd, aus Succinatsemialdehyd 4-Hydroxybuttersäure, aus 4-Hydroxybuttersäure 4-Hydroxybutyryl-Coenzym A, aus 4-Hydroxybutyryl-Coenzym A Crotonyl-Coenzym A, aus Crotonyl-Coenzym A 3-Hydroxybutyryl-Coenzym A, aus 3-Hydroxybutyryl-Coenzym A Acetoacetyl-Coenzym A und aus Acetoacetyl-Coenzym A zwei Äquivalente Acetyl-Coenzym A gebildet werden.
  13. Die Verwendung nach Anspruch 12, wobei die rekombinante Zelle zur gezielten Herstellung von 3-Hydroxypropionsäure oder 3-Hydroxyisobuttersäure verwendet wird.
  14. Ein Verfahren zur Herstellung von organischen Verbindungen mit mindestens zwei Kohlenstoffatomen, umfassend den Verfahrensschritt des in Kontakt bringens einer rekombinanten Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 9 oder 11 mit einem Hydrogencarbonat-haltigen Nährmedium unter Bedingungen, unter denen aus dem Hydrogencarbonat organische Verbindungen mit mindestens zwei Kohlenstoffatomen gebildet werden, sowie gegebenenfalls Aufreinigung der organischen Verbindungen mit mindestens zwei Kohlenstoffatomen aus dem Nährmedium.
  15. Das Verfahren nach Anspruch 14, wobei die rekombinante Zelle nach Anspruch 8 eingesetzt und 3-Hydroxypropionsäure aus dem Hydrogencarbonat gebildet wird.
  16. Das Verfahren nach Anspruch 14, wobei die rekombinante Zelle nach Anspruch 9 eingesetzt und 3-Hydroxyisobuttersäure aus dem Hydrogencarbonat gebildet wird.
  17. Ein Verfahren zur Herstellung von Acrylsäure oder Acrylsäureestern, umfassend die Verfahrensschritte IA) Herstellung von 3-Hydroxypropionsäure durch ein Verfahren nach Anspruch 15 sowie gegebenenfalls Neutralisation der 3-Hydroxypropionsäure; IB) Dehydratisierung der 3-Hydroxypropionsäure unter Bildung von Acrylsäure sowie gegebenenfalls Veresterung der Acrylsäure.
  18. Ein Verfahren zur Herstellung von Methacrylsäure oder Methacrylsäureestern, umfassend die Verfahrensschritte IIA) Herstellung von 3-Hydroxyisobuttersäure durch ein Verfahren nach Anspruch 16 sowie gegebenenfalls Neutralisation der 3-Hydroxyisobuttersäure; IIB) Dehydratisierung der 3-Hydroxyisobuttersäure unter Bildung von Methacrylsäure sowie gegebenenfalls Veresterung der Methacrylsaure.
  19. Ein Verfahren zur Herstellung von Poly(meth)acrylsäure oder Poly(meth)acrylsäureestern, umfassend die Verfahrensschritte IIIA) Herstellung von (Meth)acrylsäure durch ein Verfahren nach Anspruch 17 bzw. 18; IIIB) radikalische Polymerisation der (Meth)Acrylsäure, wobei gegebenenfalls die Carboxylgruppen der (Meth)Acrylsäure bzw. die Carboxylatgruppe des (Meth)Acrylates vor oder nach der radikalischen Polymerisation zumindest teilweise verestert werden können.
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