DE102007059248A1 - Recombinant cell capable of converting bicarbonate to organic compounds utilizes a 16-step metabolic pathway starting with acetyl coenzyme A - Google Patents
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Abstract
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft eine rekombinante Zelle, ein Verfahren zur Herstellung einer rekombinanten Zelle, die durch dieses Verfahren erhältliche rekombinante Zelle, die Verwendung einer rekombinanten Zelle, ein Verfahren zur Herstellung einer organischen Verbindung mit mindestens zwei Kohlenstoffatomen, ein Verfahren zur Herstellung von Acrylsäure, ein Verfahren zur Herstellung von Methacrylsäure sowie ein Verfahren zur Herstellung von Poly(meth)acrylsäure oder Poly(meth)acrylsäureestern.The The present invention relates to a recombinant cell, a method for producing a recombinant cell by this method available recombinant cell, the use of a recombinant Cell, a process for producing an organic compound having at least two carbon atoms, a process for the preparation of acrylic acid, a process for the production of methacrylic acid and a process for producing poly (meth) acrylic acid or poly (meth) acrylic esters.
Organische Verbindungen sind bedeutende industrielle Erzeugnisse. So werden beispielsweise Acrylsäure und Methacrylsäure zur Herstellung von Polymeren, Aminosäuren wie etwa Glutamat als Lebensmittelzusätze oder Alkohole wie etwa 1,2-Propandiol oder 1,3-Propandiol als Lösungsmittel eingesetzt.organic Connections are important industrial products. So be For example, acrylic acid and methacrylic acid Production of polymers, amino acids such as glutamate as food additives or alcohols such as 1,2-propanediol or 1,3-propanediol used as a solvent.
Die großtechnische Herstellung derartiger organischer Verbindungen erfolgt entweder auf rein chemischem Wege (im Falle der Acrylsäure beispielsweise durch katalytische Gasphasenoxidation von Propylen), oder aber zumindest in Teilschritten auf biotechnologischem Weg (im Falle der Acrylsäure beispielsweise durch fermentative Umsetzung von Kohlenhydraten mittels rekombinanter Mikroorganismen unter Bildung von 3-Hydroxypropionsäure, welche anschließend chemisch zu Acrylsäure dehydratisiert werden kann). Ausgangsmaterialien für die großtechnische Herstellung organischer Verbindungen sind somit entweder Kohlenwasserstoffe, die als Produkte bei der Erdöl- oder Erdgasraffination anfallen, oder aber Biomasse, wie etwa Kohlenhydrate.The large-scale production of such organic compounds either by purely chemical means (in the case of acrylic acid for example, by catalytic gas phase oxidation of propylene), or but at least in partial steps on biotechnological way (in the case the acrylic acid, for example by fermentation reaction of carbohydrates by recombinant microorganisms to form of 3-hydroxypropionic acid, which subsequently chemically dehydrated to acrylic acid). raw materials for the large-scale production of organic Compounds are thus either hydrocarbons, which as products incurred in oil or natural gas refining, or Biomass, such as carbohydrates.
Es ist bekannt, dass die globale Erwärmung hauptsächlich durch Kohlendioxidgas verursacht wird, welches durch menschliches Handeln von Fabriken, industriellen Anlagen, Wärmekraftwerken, Automobilen usw. ausgestoßen wird. Die Reduzierung des Kohlendioxidgasausstoßes oder die Wiedergewinnung von Kohlendioxidgas, welches in der Atmosphäre vorkommt, wird somit als eine der wichtigsten Maßnahmen zum Schutz der Umwelt angesehen.It is known that global warming mainly caused by carbon dioxide gas, which is caused by human Acting of factories, industrial plants, thermal power plants, Automobiles etc. is launched. The reduction of the Carbon dioxide gas emissions or the recovery of carbon dioxide gas, which occurs in the atmosphere is thus considered one of the most important environmental protection measures.
Es
wurden verschiedene Verfahren vorgeschlagen, um die Emission oder
den Gehalt an Kohlendioxidgas zu reduzieren. So schlägt
Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, die sich aus dem Stand der Technik ergebenden Nachteile im Zusammenhang mit der Kohlendioxid-Fixierung zu überwinden.Of the Present invention was based on the object resulting from the State of the art resulting disadvantages in connection with the carbon dioxide fixation to overcome.
Insbesondere lag der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zu Grunde, ein Verfahren anzugeben, mit dem Kohlendioxid aus der Atmosphäre fixiert und hieraus gezielt großtechnisch relevante, organische Verbindungen gebildet werden können. Auch sollte dieses Verfahren möglichst wenige Verfahrensschritte umfassen und darüber hinaus in kostengünstiger Weise betrieben werden können.Especially The present invention was based on the object, a method specify fixed with the carbon dioxide from the atmosphere and from this purpose specifically industrially relevant, organic Compounds can be formed. Also, this should be Procedures include as few process steps and In addition, operated in a cost effective manner can be.
Einen Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet eine rekombinante Zelle, welche in der Lage ist, unter Ausnutzung eines Stoffwechselweges, bei dem aus Acetyl-CoA und Hydrogencarbonat Malonyl-Coenzym A, aus Malonyl-Coenzym A Malonatsemialdehyd, aus Malonatsemialdehyd 3-Hydroxypropionat, aus 3-Hydroxypropionat 3-Hydroxypropionyl-Coenzym A, aus 3-Hydroxypropionyl-Coenzym A Acryloyl-Coenzym A, aus Acryloyl-Coenzym A Propionyl-Coenzym A, aus Propionyl-Coenzym A und Hydrogencarbonat (S)-Methylmalonyl-Coenzym A, aus (S)-Methylmalonyl-Coenzym A (R)-Methylmalonyl-Coenzym A, aus (R)-Methylmalonyl-Coenzym A Succinatsemialdehyd, aus Succinatsemialdehyd 4-Hydroxybuttersäure, aus 4-Hydroxybuttersäure 4-Hydroxybutyryl-Coenzym A, aus 4-Hydroxybutyryl-Coenzym A Crotonyl-Coenzym A, aus Crotonyl-Coenzym A 3-Hydroxybutyryl-Coenzym A, aus 3-Hydroxybutyryl-Coenzym A Acetoacetyl-Coenzym A und aus Acetoacetyl-Coenzym A zwei Äquivalente Acetyl-Coenzym A gebildet werden, aus Hydrogencarbonat organische Verbindungen mit mindestens zwei Kohlenstoffatomen zu bilden.a Contribute to the solution of the above-mentioned tasks a recombinant cell which is able to exploit a metabolic pathway in which acetyl-CoA and bicarbonate malonyl-coenzyme A, from malonyl-coenzyme A malonate semialdehyde, from malonate semialdehyde 3-hydroxypropionate, from 3-hydroxypropionate 3-hydroxypropionyl-coenzyme A, from 3-hydroxypropionyl-coenzyme A acryloyl-coenzyme A, from acryloyl-coenzyme A propionyl coenzyme A, from propionyl coenzyme A and bicarbonate (S) -methylmalonyl coenzyme A, from (S) -methylmalonyl-coenzyme A (R) -methylmalonyl-coenzyme A, from (R) -methylmalonyl-coenzyme A succinate semialdehyde, from succinate semialdehyde 4-hydroxybutyric acid, from 4-hydroxybutyric acid 4-hydroxybutyryl-coenzyme A, from 4-hydroxybutyryl-coenzyme A crotonyl-coenzyme A, from crotonyl-coenzyme A 3-hydroxybutyryl-coenzyme A, from 3-hydroxybutyryl-coenzyme A acetoacetyl-coenzyme A and acetoacetyl-coenzyme A two equivalents Acetyl coenzyme A can be formed from bicarbonate organic To form compounds with at least two carbon atoms.
Überraschenderweise
wurde festgestellt, dass sich ein völlig neuer, in Metallosphaera
sedula entdeckter Stoffwechselweg, bei dem aus einem Äquivalent
Acetyl-Coenzym A und zwei Äquivalenten Hydrogencarbonat
zunächst über Malonyl-Coenzym A, Malonat-Semialdehyd,
3-Hydroxypropionsäure, 3-Hydroxypropionyl-Coenzym A, Acrylyl-Coenzym
A, Propionyl-Coenzym A und Methylmalonyl-Coenzym A gemäß dem
aus Chloroflexus aurantiacus bekannten 3-Hydroxypropionat-Zyklus
Succinyl-Coenzym A wird, welches dann im Unterschied zum bekannten
3-Hydroxypropionat-Zyklus nicht über Malyl-Coenzym A zu
Acetyl-Coenzym A und Glyoxylat, sondern über Succinat-Semialdehyd,
4-Hydroxybuttersäure, 4-Hydroxybutyryl-Coenzym A, Crotonyl-Coenzym
A, 3-Hydroxybutyryl-Coenzym A und Acetoacetyl-Coenzym A zu zwei Äquivalenten
Acetyl-Coenzym A umgesetzt werden (siehe
Die Formulierung „unter Ausnutzung eines Stoffwechselweges, bei dem aus Acetyl-CoA und Hydrogencarbonat Malonyl-Coenzym A, aus Malonyl-Coenzym A Malonatsemialdehyd, aus Malonatsemialdehyd 3-Hydroxypropionat, aus 3-Hydroxypropionat 3-Hydroxypropionyl-Coenzym A, aus 3-Hydroxypropionyl-Coenzym A Acryloyl-Coenzym A, aus Acryloyl-Coenzym A Propionyl-Coenzym A, aus Propionyl-Coenzym A und Hydrogencarbonat (S)-Methylmalonyl-Coenzym A, aus (S)-Methylmalonyl-Coenzym A (R)-Methylmalonyl-Coenzym A, aus (R)-Methylmalonyl-Coenzym A Succinatsemialdehyd, aus Succinatsemialdehyd 4-Hydroxybutter-säure, aus 4-Hydroxybuttersaure 4-Hydroxybutyryl-Coenzym A, aus 4-Hydroxybutyryl-Coenzym A Crotonyl-Coenzym A, aus Crotonyl-Coenzym A 3-Hydroxybutyryl-Coenzym A, aus 3-Hydroxybutyryl-Coenzym A Acetoacetyl-Coenzym A und aus Acetoacetyl-Coenzym A zwei Äquivalente Acetyl-Coenzym A gebildet werden" ist dabei vorzugsweise so zu verstehen, dass in der Zelle mittels rekombinanter Methoden die Aktivität mindestens eines der Enzyme dieses Stoffwechselweges, beispielsweise durch Überexpression, erhöht ist, so dass ein gegenüber dem Wildtyp verstärkter Umsatz über diesen Stoffwechselweg erfolgt.The Formulation "taking advantage of a metabolic pathway, in which acetyl-CoA and bicarbonate malonyl-coenzyme A, from Malonyl coenzyme A malonate semialdehyde, from malonate semialdehyde 3-hydroxypropionate, from 3-hydroxypropionate 3-hydroxypropionyl-coenzyme A, from 3-hydroxypropionyl-coenzyme A acryloyl-coenzyme A, from acryloyl-coenzyme A propionyl-coenzyme A, from propionyl-coenzyme A and bicarbonate (S) -methylmalonyl-coenzyme A, from (S) -methylmalonyl-coenzyme A (R) -methylmalonyl-coenzyme A, from (R) -methylmalonyl-coenzyme A succinate semialdehyde, from succinate semialdehyde 4-hydroxybutyric acid, from 4-hydroxybutyric acid 4-hydroxybutyryl-coenzyme A, from 4-hydroxybutyryl-coenzyme A crotonyl-coenzyme A, from crotonyl-coenzyme A 3-hydroxybutyryl-coenzyme A, from 3-hydroxybutyryl-coenzyme A acetoacetyl-coenzyme A and from acetoacetyl-coenzyme A two equivalents of acetyl-coenzyme A "are preferably to be understood that in the cell by recombinant methods the activity at least one of the enzymes of this metabolic pathway, for example by overexpression, is increased, so that one over the wild type increased turnover via this metabolic pathway he follows.
In diesem Zusammenhang ist es insbesondere bevorzugt, dass die rekombinante Zelle gegenüber ihrem Wildtyp derart mittels rekombinanter Verfahren verändert wurde, dass sie im Vergleich zu ihrem Wildtyp mehr organische Verbindungen mit mindestens zwei Kohlenstoffatomen aus Hydrogencarbonat, besonders bevor zugt mehr 3-Hydroxypropionsäure oder 3-Hydroxyisobuttersäure aus Hydrogencarbonat, zu bilden vermag.In In this connection it is particularly preferred that the recombinant Cell compared to their wild type so by recombinant Procedure was changed, that compared to her Wild-type more organic compounds with at least two carbon atoms from bicarbonate, especially before given more 3-hydroxypropionic acid or 3-hydroxyisobutyric acid from bicarbonate can.
Die Formulierung „dass sie im Vergleich zu ihrem Wildtyp mehr organische Verbindungen mit mindestens zwei Kohlenstoffatomen aus Hydrogencarbonat, besonders bevorzugt mehr 3-Hydroxypropionsäure oder 3-Hydroxyisobuttersäure aus Hydrogencarbonat, zu bilden vermag" betrifft auch den Fall, dass der Wildtyp der gentechnisch veränderten Zelle überhaupt keine organischen Verbindungen mit mindestens zwei Kohlenstoffatomen aus Hydrogencarbonat, zumindest aber keine nachweisbaren Mengen dieser organischen Verbindungen aus Hydrogencarbonat zu bilden vermag und erst nach der rekombinanten Veränderung nachweisbare Mengen dieser Komponenten gebildet werden können.The Formulation "that they are more compared to their wild type organic compounds having at least two carbon atoms Bicarbonate, more preferably more 3-hydroxypropionic acid or 3-hydroxyisobutyric acid from bicarbonate "also concerns the case that the wild type of the genetically engineered changed cell no organic at all Compounds having at least two carbon atoms from bicarbonate, but at least no detectable amounts of these organic compounds from bicarbonate and only after the recombinant Change detectable amounts of these components formed can be.
Unter einem „Wildtyp" einer Zelle wird vorzugsweise eine Zelle bezeichnet, deren Genom in einem Zustand vorliegt, wie er natürlicherweise durch die Evolution entstanden ist. Der Begriff wird sowohl für die gesamte Zelle als auch für einzelne Gene verwendet. Unter den Begriff „Wildtyp" fallen daher insbesondere nicht solche Zellen bzw. solche Gene, deren Gensequenzen zumindest teilweise durch den Menschen mittels rekombinanter Verfahren verändert worden sind.Under A "wild-type" cell is preferably a cell whose genome is in a state as naturally originated through evolution. The term is used both for used the entire cell as well as for individual genes. The term "wild type" therefore does not apply in particular to such Cells or genes whose gene sequences are at least partially modified by humans using recombinant techniques have been.
Dabei ist es erfindungsgemäß besonders bevorzugt, dass die rekombinante Zelle derart verändert ist, dass sie in einem definierten Zeitintervall, vorzugsweise innerhalb von 24 Stunden, mindestens 2 mal, besonders bevorzugt mindestens 10 mal, darüber hinaus bevorzugt mindestens 100 mal, darüber hinaus noch mehr bevorzugt mindestens 1.000 mal und am meisten bevorzugt mindestens 10.000 mal mehr organische Verbindungen mit mindestens zwei Kohlenstoffatomen, besonders bevorzugt mehr 3-Hydroxypropionsäure oder 3-Hydroxyisobuttersäure, aus Hydrogencarbonat bildet als der Wildtyp der Zelle. Die Zunahme der Produktbildung kann dabei beispielsweise dadurch bestimmt werden, dass die erfindungs gemäße Zelle und die Wildtyp-Zelle jeweils getrennt unter gleichen Bedingungen (gleiche Zelldichte, gleiches Nährmedium, gleiche Kulturbedingungen) für ein bestimmtes Zeitintervall in einem geeigneten Nährmedium kultiviert werden und anschließend die Menge an Zielprodukt (organische Verbindung mit mindestens zwei Kohlenstoffatomen) im Nährmedium bestimmt wird.there it is particularly preferred according to the invention that the recombinant cell is altered to be in a defined time interval, preferably within 24 hours, at least 2 times, more preferably at least 10 times, above In addition, preferably at least 100 times, moreover more preferably at least 1,000 times, and most preferably at least 10,000 times more organic compounds with at least two carbon atoms, more preferably more 3-hydroxypropionic acid or 3-hydroxyisobutyric acid, from bicarbonate forms as the wild type of the cell. The increase the product formation can be determined, for example, by that the fiction, contemporary cell and the wild-type cell each separately under the same conditions (same cell density, same culture medium, same culture conditions) for a certain time interval in a suitable nutrient medium cultivated and then the amount of target product (organic compound with at least two carbon atoms) in the nutrient medium is determined.
Die erfindungsgemäßen rekombinanten Zellen können Prokaryonten oder Eukaryonten sein. Dabei kann es sich um Säugetierzellen (wie etwa Zellen aus dem Menschen), um pflanzliche Zellen oder um Mikroorganismen wie Hefen, Pilze oder Bakterien handeln, wobei Mikroorganismen besonders bevorzugt und Bakterien und Hefen am meisten bevorzugt sind.The recombinant cells of the invention may be prokaryotes or eukaryotes. These may be mammalian cells (such as human cells), plant cells or microorganisms such as yeasts, fungi or bacteria, microorganisms being particularly preferred and Bak Yeasts and yeasts are the most preferred.
Als
Bakterien, Hefen oder Pilze sind insbesondere diejenigen Bakterien,
Hefen oder Pilze geeignet, die bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen
und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Braunschweig, Deutschland, als Bakterien-,
Hefeoder Pilz-Stämme hinterlegt sind. Erfindungsgemäß geeignete
Bakterien gehören zu den Gattungen, die unter
aufgeführt
sind, erfindungsgemäß geeignete Hefen gehören
zu denjenigen Gattungen, die unter
aufgeführt
sind und erfindungsgemäß geeignete Pilze sind
diejenigen, die unter
aufgeführt
sind.Particularly suitable bacteria, yeasts or fungi are those bacteria, yeasts or fungi which are deposited as bacterial, yeast or fungal strains in the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ), Braunschweig, Germany. Bacteria suitable according to the invention belong to the genera under
Yeasts which are suitable according to the invention belong to those genera which are listed under
are listed and suitable fungi according to the invention are those under
are listed.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen rekombinanten Zelle leitet sich diese von einer CO2-autotrophen Wildtyp-Zelle, insbesondere von einer CO2-autotrophen Wildtyp-Bakterienzelle ab, wobei unter einer CO2-autotrophen Wildtyp-Zelle bzw. einer CO2-autotrophen Wildtyp-Bakterienzelle vorzugsweise eine Zelle verstanden wird, deren Wildtyp bereits in der Lage ist, für die Bildung organischer Baustoffe CO2 als Kohlenstoffquelle zu verwenden.According to a particularly preferred embodiment of the recombinant cell according to the invention, this is derived from a wild-type CO 2 -autotrophic cell, in particular from a wild-type CO 2 -autotrophic bacterial cell, wherein a CO 2 -autotrophic wild-type cell or a CO 2 - Autotrophic wild-type bacterial cell is preferably understood a cell whose wild-type is already able to use CO 2 as a carbon source for the formation of organic building materials.
Erfindungsgemäß besonders bevorzugte Zellen leiten sich ab von Archeae-Bakterien, insbesondere von Archeae-Bakterien der Gattungen Metallosphera, Sulfolobus oder Archaeoglubus, am meisten bevorzugt von Archeae-Bakterien der Art Metallosphaera hakonensis, Metallosphaera prunae, Metallosphaera sedula, Sulfolobus acidocaldarius, Sulfolobus brierleyi, Sulfolobus hakonensis, Sulfolobus metallicus, Sulfolobus shibatae, Sulfolobus solfataricus, Sulfolobus tokodaii, Archaeoglubus fulgidus, Archaeoglubus profundus oder Archaeoglubus veneficus ab. Neben diesen Archeae-Bakterien können sich die Zellen auch von Bakterien der Gattung Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus, Acinetobacter, Lactobacillus, Lactococcus, Candida, Pichia, Kluveromyces, Saccharomyces, Escherichia, Zymomonas, Yarrowia, Methylobacterium, Ralstonia, Pseudomonas, Burkholderia und Clostridium ableiten.Particularly according to the invention preferred cells are derived from Archeae bacteria, in particular from Archeae bacteria of the genera Metallosphera, Sulfolobus or Archaeoglubus, most preferred of Archeal bacteria of the species Metallosphaera hakonensis, Metallosphaera prunae, Metallosphaera sedula, Sulfolobus acidocaldarius, Sulfolobus brierleyi, Sulfolobus hakonensis, Sulfolobus metallicus, sulfolobus shibatae, sulfolobus solfataricus, sulfolobus tokodaii, Archaeoglubus fulgidus, Archaeoglubus profundus or Archaeoglubus veneficus. In addition to these Archeae bacteria can become the cells also of bacteria of the genus Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus, Acinetobacter, Lactobacillus, Lactococcus, Candida, Pichia, Kluveromyces, Saccharomyces, Escherichia, Zymomonas, Yarrowia, Methylobacterium, Ralstonia, Pseudomonas, Burkholderia and Clostridium.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen, rekombinanten Zelle weist diese im Vergleich zu ihrem Wildtyp eine gesteigerte Aktivität mindestens eines der folgenden Enzyme E1 bis E16 auf:
- – eines Enzyms E1, welches die Umsetzung von Carbonat und Acetyl-Coenzym A zu Malonyl-Coenzym A katalysiert;
- – eines Enzyms E2, welches die Umsetzung von Malonyl-Coenzym A zu Malonatsemialdehyd katalysiert;
- – eines Enzyms E3, welches die Umsetzung von Malonatsemialdehyd zu 3-Hydroxypropionsäure katalysiert;
- – eines Enzyms E4, welches die Umsetzung von 3-Hydroxypropionsäure zu 3-Hydroxypropionyl-Coenzym A katalysiert;
- – eines Enzyms E5, welches die Umsetzung von 3-Hydroxypropionyl-Coenzym A zu Acryloyl-Coenzym A katalysiert;
- – eines Enzyms E6, welches die Umsetzung von Acryloyl-Coenzym A zu Propionyl-Coenzym A katalysiert;
- – eines Enzyms E7, welches die Umsetzung von Carbonat und Propionyl-Coenzym A zu (S)-Methylmalonyl-Coenzym A katalysiert;
- – eines Enzyms E8, welches die Umsetzung von (S)-Methylmalonyl-Coenzym A zu (R)-Methylmalonyl-Coenzym A katalysiert;
- – eines Enzyms E9, welches die Umsetzung von (R)-Methylmalonyl-Coenzym A zu Succinyl-Coenzym A katalysiert;
- – eines Enzyms E10, welches die Umsetzung von Succinyl-Coenzym A zu Succinatsemialdehyd katalysiert;
- – eines Enzyms E11, welches die Umsetzung von Succinat-Semialdehyd zu 4-Hydroxybuttersäure katalysiert;
- – eines Enzyms E12, welches die Umsetzung von 4-Hydroxybuttersäure zu 4-Hydroxybutyryl-Coenzym A katalysiert;
- – E13 aufweist, welches die Umsetzung von 4-Hydroxybutyryl-Coenzym A zu Crotonyl-Coenzym A katalysiert;
- – eines Enzyms E14, welches die Umsetzung von Crotonyl-Coenzym A zu (S)-3-Hydroxybutyryl-Coenzem A katalysiert;
- – eines Enzyms E15, welches die Umsetzung von (S)-3-Hydroxybutyryl-Coenzem A zu Acetoacetyl-Coenzym A katalysiert;
- – eines Enzyms E16, welches die Umsetzung von Acetoacetyl-Coenzym A zu zwei Molekülen Acetyl-Coenzym A katalysiert.
- An enzyme E 1 which catalyzes the conversion of carbonate and acetyl coenzyme A to malonyl coenzyme A;
- An enzyme E 2 which catalyzes the conversion of malonyl coenzyme A to malonate semialdehyde;
- An enzyme E 3 which catalyzes the conversion of malonate semialdehyde to 3-hydroxypropionic acid;
- An enzyme E 4 which catalyzes the conversion of 3-hydroxypropionic acid to 3-hydroxypropionyl-coenzyme A;
- An enzyme E 5 which catalyzes the conversion of 3-hydroxypropionyl-coenzyme A into acryloyl-coenzyme A;
- An enzyme E 6 which catalyzes the reaction of acryloyl-coenzyme A into propionyl-coenzyme A;
- An enzyme E 7 which catalyzes the conversion of carbonate and propionyl coenzyme A to (S) -methylmalonyl coenzyme A;
- An enzyme E 8 which catalyzes the conversion of (S) -methylmalonyl-coenzyme A to (R) -methylmalonyl-coenzyme A;
- An enzyme E 9 which catalyzes the conversion of (R) -methylmalonyl-coenzyme A to succinyl-coenzyme A;
- An enzyme E 10 which catalyzes the conversion of succinyl-coenzyme A to succinic semialdehyde;
- An enzyme E 11 which catalyzes the conversion of succinate semialdehyde to 4-hydroxybutyric acid;
- An enzyme E 12 which catalyzes the conversion of 4-hydroxybutyric acid to 4-hydroxybutyryl-coenzyme A;
- - E 13 , which catalyzes the reaction of 4-hydroxybutyryl-coenzyme A to crotonyl-coenzyme A;
- An enzyme E 14 which catalyzes the conversion of crotonyl-coenzyme A to (S) -3-hydroxybutyryl-coenzyme A;
- An enzyme E 15 which catalyzes the conversion of (S) -3-hydroxybutyryl-coenzyme A to acetoacetyl-coenzyme A;
- - An enzyme E 16 , which is the reaction of acetoacetyl-coenzyme A to two molecules of acetyl-Coen catalyzed A zym.
Von besonderer Bedeutung in diesem neu aufgefundenen Stoffwechselweg ist dasjenige Enzyms E13, welches die Umsetzung von 4-Hydroxybutyryl-Coenzem A zu Crotonyl-Coenzym A katalysiert.Of particular importance in this newly discovered metabolic pathway is that enzyme E 13 which catalyzes the conversion of 4-hydroxybutyryl-coenzyme A into crotonyl-coenzyme A.
Die nun folgenden Ausführungen zur Erhöhung der Enzymaktivität in Zellen gelten sowohl für die Erhöhung der Aktivität des Enzyms E13 als auch für alle nachfolgend genannten Enzyme, deren Aktivität gegebenenfalls erhöht werden kann, insbesondere auch für die Enzyme E1 bis E12 und E14 bis E16.The following statements on increasing the enzyme activity in cells apply both to the increase in the activity of the enzyme E 13 and to all the enzymes mentioned below, the activity of which may optionally be increased, in particular also for the enzymes E 1 to E 12 and E 14 to E 16 .
Grundsätzlich lässt sich eine Steigerung der enzymatischen Aktivität dadurch erzielen, dass man die Kopienzahl der Gensequenz bzw. der Gensequenzen erhöht, welche für das Enzym kodieren, einen starken Promotor verwendet oder ein Gen oder Allel nutzt, das für ein entsprechendes Enzym mit einer gesteigerten Aktivität kodiert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert. Erfindungsgemäß gentechnisch veränderte Zellen werden beispielsweise durch Transformation, Transduktion, Konjugation oder einer Kombination dieser Methoden mit einem Vektor erzeugt, der das gewünschte Gen, ein Allel dieses Gens oder Teile davon und einen die Expression des Gens ermöglichenden Vektor enthält. Die heterologe Expression wird insbesondere durch Integration des Gens oder der Allele in das Chromosom der Zelle oder einem extrachromosomal replizierenden Vektor erzielt.in principle can be an increase in enzymatic activity Achieve by the copy number of the gene sequence or the Increases gene sequences encoding the enzyme, use a strong promoter or use a gene or allele, that for a corresponding enzyme with an increased activity coded and if necessary combined these measures. Genetically modified according to the invention Cells are transformed, for example, by transformation, transduction, Conjugation or a combination of these methods with a vector generates the desired gene, an allele of this gene or parts thereof and one that enables the expression of the gene Vector contains. The heterologous expression is particularly by Integration of the gene or alleles into the chromosome of the cell or an extrachromosomally replicating vector.
Einen Überblick über
die Möglichkeiten zur Erhöhung der Enzym-Aktivität
in Zellen am Beispiel der Pyruvat-Carboxylase gibt
Die
Expression der vorstehend und aller nachfolgend genannten Enzyme
bzw. Gene ist mit Hilfe von 1- und 2-dimensionaler Proteingelauftrennung
und anschließender optischer Identifizierung der Proteinkonzentration
mit entsprechender Auswertesoftware im Gel nachweisbar. Wenn die
Erhöhung einer Enzymaktivität ausschließlich
auf einer Erhöhung der Expression des entsprechenden Gens
basiert, so kann die Quantifizierung der Erhöhung der Enzymaktivität
in einfacher Weise durch einen Vergleich der 1- oder 2-dimensionalen
Proteinauftrennungen zwischen Wildtyp und gentechnisch veränderter
Zelle bestimmt werden. Eine gebräuchliche Methode zur Präparation
der Proteingele bei coryneformen Bakterien und zur Identifizierung
der Proteine ist die von
Wird die Erhöhung der Enzymaktivität durch Mutation des endogenen Gens bewerkstelligt, so können derartige Mutationen entweder nach klassischen Methoden ungerichtet erzeugt werden, wie etwa durch UV-Bestrahlung oder durch mutationsauslösende Chemikalien, oder gezielt mittels gentechnologischer Methoden wie Deletion(en), Insertion(en) und/oder Nulkleotidaustausch(e). Durch diese Mutationen werden gentechnisch veränderte Zellen erhalten. Besonders bevorzugte Mutanten von Enzymen sind insbesondere auch solche Enzyme, die nicht mehr oder zumindest im Vergleich zum Wildtyp-Enzym vermindert feedbackinhibierbar sind.Becomes the increase of enzyme activity by mutation of the endogenous gene, such Mutations generated either undirected by classical methods be such as by UV irradiation or by mutagenic Chemicals, or specifically by means of genetic engineering methods such as Deletion (s), insertion (s) and / or nucleotide exchange (s). By These mutations will be genetically engineered cells receive. Particularly preferred mutants of enzymes are in particular even those enzymes that are no longer or at least compared to Wild-type enzyme reduces feedback are inhibitable.
Wird
die Erhöhung der Enzymaktivität durch Erhöhung
der Expression eines Enzyms bewerkstelligt, so erhöht man
beispielsweise die Kopienzahl der entsprechenden Gene oder mutiert
die Promotor- und Regulationsregion oder die Ribosomenbindungsstelle,
die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet. In gleicher Weise
wirken Expressionskassetten, die stromaufwärts des Strukturgens
eingebaut werden. Durch induzierbare Promotoren ist es zusätzlich
möglich, die Expression zu jedem beliebigen Zeitpunkt zu
steigern. Des Weiteren können dem Enzym-Gen als regulatorische
Sequenzen aber auch sogenannte "Enhancer" zugeordnet sein, die über
eine verbesserte Wechselwirkung zwischen RNA- Polymerase und DNA
ebenfalls eine erhöhte Genexpression bewirken. Durch Maßnahmen
zur Verlängerung der Lebensdauer der m-RNA wird ebenfalls die
Expression verbessert. Weiterhin wird durch Verhinderung des Abbaus
des Enzymproteins ebenfalls die Enzymaktivität verstärkt.
Die Gene oder Genkonstrukte liegen dabei entweder in Plasmiden mit
unterschiedlicher Kopienzahl vor oder sind im Chromosom integriert
und amplifiziert. Alternativ kann weiterhin eine Überexpression
der betreffenden Gene durch Veränderung der Medienzusammensetzung
und Kulturführung erreicht werden. Anleitungen hierzu findet
der Fachmann unter anderem bei
Zur
Erhöhung der Expression der jeweiligen Gene werden zum
Beispiel episomale Plasmide eingesetzt. Als Plasmide eignen sich
insbesondere solche, die in coryneformen Bakterien repliziert werden.
Zahlreiche bekannte Plasmidvektoren, wie zum Beispiel pZl (
Weiterhin
eignen sich auch solche Plasmidevektoren, mit Hilfe derer man das
Verfahren der Genamplifikation durch Integration in das Chromosom
anwenden kann, so wie es beispielsweise von
Unter der vorstehend und in den nachfolgenden Ausführungen verwendeten Formulierung „eine gegenüber ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität eines Enzyms Ex" ist vorzugsweise stets eine um ein en Faktor von mindestens 2, besonders bevorzugt von mindestens 10, darüber hinaus bevorzugt von mindestens 100, darüber hinaus noch mehr bevorzugt von mindestens 1.000 und am meisten bevorzugt von mindestens 10.000 gesteigerte Aktivität des jeweiligen Enzyms EX zu verstehen. Weiterhin umfasst die erfindungsgemäße Zelle, welche „eine gegenüber ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität eines Enzyms Ex" aufweist, insbesondere auch eine Zelle, deren Wildtyp keine oder zumindest keine nachweisbare Aktivität dieses Enzyms Ex aufweist und die erst nach Erhöhung der Enzymaktivität, beispielsweise durch Überexpression, eine nachweisbare Aktivität dieses Enzyms Ex zeigt. In diesem Zusammenhang umfasst der Begriff „Überexpression" oder die in den nachfolgenden Ausführungen verwendete Formulierung „Erhöhung der Expression" auch den Fall, dass eine Ausgangszelle, beispielsweise eine Wildtyp-Zelle, keine oder zumindest keine nachweisbare Expression aufweist und erst durch rekombinante Verfahren eine nachweisbare Expression des Enzyms Ex induziert wird.The expression "an activity of an enzyme E x which is increased in relation to its wild-type" is preferably always an additional factor of at least 2, more preferably of at least 10, more preferably of at least 100, and moreover more preferably of at least 1,000 and most preferably of at least 10,000 increased activity of the respective enzyme E X. Furthermore, the cell according to the invention which "exhibits an activity of an enzyme E x which is increased compared to its wild type" comprises in particular also a cell whose wild-type has no or at least no detectable activity of this enzyme E x and only after increasing the enzyme activity, for example by overexpression, a detectable activity of this enzyme E x shows. In this context, the term "overexpression" or the expression "increase in expression" used in the following also encompasses the case that a starting cell, for example a wild-type cell, has no or at least no detectable expression and only by recombinant methods a detectable Expression of the enzyme E x is induced.
Erfindungsgemäß besonders bevorzugte rekombinante Zellen sind dabei diejenigen, bei denen die Aktivität folgender Enzyme oder Enzymkombinationen gesteigert ist: E1, E2, E3, E4, E5, E6, E7, E8, E9, E10, E11, E12, E13, E14, E15, E16, E1E2, E1E3, E1E4, E1E5, E1E6, E1E7, E1E8, E1E9, E1E10, E1E11, E1E12, E1E13, E1E14, E1E15, E1E16, E2E3, E2E4, E2E5, E2E6, E2E7, E2E8, E2E9, E2E10, E1E11, E2E12, E2E13, E2E14, E2E15, E2E16, E3E4, E3E5, E3E6, E3E7, E3E8, E3E9, E3E10, E3E11, E3E12, E3E13, E3E14, E3E15, E3E16, E4E5, E4E6, E4E7, E4E8, E4E9, E4E10, E4E11, E4E12, E4E13, E4E14, E4E15, E4E16, E5E6, E5E7, E5E8, E5E9, E5E10, E5E11, E5E12, E5E13, E5E14, E5E15, E5E16, E6E7, E6E8, E6E9, E6E10, E6E11, E6E12, E6E13, E6E14, E6E15, E6E16, E7E8, E7E9, E7E10, E7E11, E7E12, E7E13, E7E14, E7E15, E7E16, E8E9, E8E10, E8E11, E8E12, E8E13, E8E14, E8E15, E8E16, E9E10, E9E11, E9E12, E9E13, E9E14, E9E15, E9E16, E10E11, E10E12, E10E13, E10E14, E10E15, E10E16, E11E12, E11E13, E11E14, E11E15, E11E16, E12E13, E12E14, E12E15, E12E16, E13E14, E13E15, E13E16, E14E15, E14E16, E15E16, E1E2E7, E1E3E7, E1E4E7, E1E5E7, E1E6E7, E1E8E7, E1E9E7, E1E10E7, E1E11E7, E1E12E7, E1E13E7, E1E14E7, E1E15E7, E1E16E7, E1E2E7E13, E1E3E7E13, E1E4E7E13, E1E5E7E13, E1E6E7E13, E1E8E7E13, E1E9E7E13, E1E10E7E13, E1E11E7E13, E1E12E7E13, E1E14E7E13, E1E15E7E13, E1E16E7E13, E1E2E3E13, E1E2E3E13, E1E2E3E7E13 und E1E2E3E4E5E6E7E8E9E10E11E12E14E15E16, wobei E13, E1E13E7 und E1E2E3E13 und E1E2E3E7E13 besonders bevorzugt sind.Recombinant cells which are particularly preferred according to the invention are those in which the activity of the following enzymes or enzyme combinations is increased: E 1 , E 2 , E 3 , E 4 , E 5 , E 6 , E 7 , E 8 , E 9 , E 10 , E 11 , E 12 , E 13 , E 14 , E 15 , E 16 , E 1 E 2 , E 1 E 3 , E 1 E 4 , E 1 E 5 , E 1 E 6 , E 1 E 7 , E 1 E 8 , E 1 E 9 , E 1 E 10 , E 1 E 11 , E 1 E 12 , E 1 E 13 , E 1 E 14 , E 1 E 15 , E 1 E 16 , E 2 E 3 , E 2 E 4 , E 2 E 5 , E 2 E 6 , E 2 E 7 , E 2 E 8 , E 2 E 9 , E 2 E 10 , E 1 E 11 , E 2 E 12 , E 2 E 13 , E 2 E 14 , E 2 E 15 , E 2 E 16 , E 3 E 4 , E 3 E 5 , E 3 E 6 , E 3 E 7 , E 3 E 8 , E 3 E 9 , E 3 E 10 , E 3 E 11 , E 3 E 12 , E 3 E 13 , E 3 E 14 , E 3 E 15 , E 3 E 16 , E 4 E 5 , E 4 E 6 , E 4 E 7 , E 4 E 8 , E 4 E 9 , E 4 E 10 , E 4 E 11 , E 4 E 12 , E 4 E 13 , E 4 E 14 , E 4 E 15 , E 4 E 16 , E 5 E 6 , E 5 E 7 , E 5 E 8 , E 5 E 9 , E 5 E 10 , E 5 E 11 , E 5 E 12 , E 5 E 13 , E 5 E 14 , E 5 E 15 , E 5 E 16 , E 6 E 7 , E 6 E 8 , E 6 E 9 , E 6 E 10 , E 6 E 1 1 , E 6 E 12 , E 6 E 13 , E 6 E 14 , E 6 E 15 , E 6 E 16 , E 7 E 8 , E 7 E 9 , E 7 E 10 , E 7 E 11 , E 7 E 12 , E 7 E 13 , E 7 E 14 , E 7 E 15 , E 7 E 16 , E 8 E 9 , E 8 E 10 , E 8 E 11 , E 8 E 12 , E 8 E 13 , E 8 E 14 , E 8 E 15 , E 8 E 16 , E 9 E 10 , E 9 E 11 , E 9 E 12 , E 9 E 13 , E 9 E 14 , E 9 E 15 , E 9 E 16 , E 10 E 11 , E 10 E 12 , E 10 E 13 , E 10 E 14 , E 10 E 15 , E 10 E 16 , E 11 E 12 , E 11 E 13 , E 11 E 14 , E 11 E 15 , E 11 E 16 , E 12 E 13 , E 12 E 14 , E 12 E 15 , E 12 E 16 , E 13 E 14 , E 13 E 15 , E 13 E 16 , E 14 E 15 , E 14 E 16 , E 15 E 16 , E 1 E 2 E 7 , E 1 E 3 E 7 , E 1 E 4 E 7 , E 1 E 5 E 7 , E 1 E 6 E 7 , E 1 E 8 E 7 , E 1 E 9 E 7 , E 1 E 10 E 7 , E 1 E 11 E 7 , E 1 E 12 E 7 , E 1 E 13 E 7 , E 1 E 14 E 7 , E 1 E 15 E 7 , E 1 E 16 E 7 , E 1 E 2 E 7 E 13 , E 1 E 3 E 7 E 13 , E 1 E 4 E 7 E 13 , E 1 E 5 E 7 E 13 , E 1 E 6 E 7 E 13 , E 1 E 8 E 7 E 13 , E 1 E 9 E 7 E 13 , E 1 E 10 E 7 E 13 , E 1 E 11 E 7 E 13 , E 1 E 12 E 7 E 13 , E 1 E 14 E 7 E 13 , E 1 E 15 E 7 E 13 , E 1 E 16 E 7 E 13 , E 1 E 2 E 3 E 13 , E 1 E 2 E 3 E 13 , E 1 E 2 E 3 E 7 E 13 and E 1 E 2 E 3 E 4 E 5 E 6 E 7 E 8 E 9 E 10 E 11 E 12 E 14 E 15 E 16 , where E 13 , E 1 E 13 E 7 and E 1 E 2 E 3 E 13 and E 1 E 2 E 3 E 7 E 13 are particularly preferred.
In
diesem Zusammenhang ist es weiterhin bevorzugt, dass das Enzym
E1 eine Acetyl-Coenzym A-Carboxylase (EC 6.4.1.2),
E2 eine Malonyl-Coenzym A-Reduktase (EC 1.2.1.18),
E3 eine Malonatsemialdehyd-Reduktase (EC 1.1.1.59),
E4 eine 3-Hydroxypropionyl-Synthetase (EC
6.2.1.-),
E5 eine 5,3-Hydroxypropionyl-Coenzym
A-Dehydratase (EC 4.2.1.17),
E6 eine
Acryloyl-Coenzym A-Reduktase (EC 1.3.99.3),
E7 eine
Propionyl-Coenzym A-Carboxylase (EC 6.4.1.3),
E8 eine
Methylmalonyl-Coenzym A-Epimerase (EC 5.1.99.1)
E9 eine
Methylmalonyl-Coenzym A-Mutase (EC 5.4.99.2),
E10 eine
Succinyl-Coenzym A-Reduktase,
E11 eine
Succinatsemialdehyd-Reduktase (EC 1.1.1.61),
E12 eine
4-Hydroxybutyryl-Coenzym A-Synthetase
E13 eine
4-Hydroxybutyryl-Coenzym A-Dehydratase,
E14 eine
Crotonyl-Coenzym A-Hydratase (EC 4.2.1.17),
E15 eine
3-Hydroxyacyl-Coenzym A-Dehydrogenase (EC 1.1.1.35), und
E16 eine Acetoacetyl-Coenzym A-β-Ketothiolase
(2.3.1.9)
ist.In this context, it is further preferred that the enzyme
E 1 is an acetyl-coenzyme A carboxylase (EC 6.4.1.2),
E 2 a malonyl-coenzyme A reductase (EC 1.2.1.18),
E 3 is a malonate semialdehyde reductase (EC 1.1.1.59),
E 4 is a 3-hydroxypropionyl synthetase (EC 6.2.1.-),
E 5 is a 5,3-hydroxypropionyl-coenzyme A dehydratase (EC 4.2.1.17),
E 6 an acryloyl-coenzyme A reductase (EC 1.3.99.3),
E 7 is a propionyl-coenzyme A carboxylase (EC 6.4.1.3),
E 8 a methylmalonyl-coenzyme A-epimerase (EC 5.1.99.1)
E 9 is a methylmalonyl-coenzyme A mutase (EC 5.4.99.2),
E 10 is a succinyl-coenzyme A reductase,
E 11 is a succinic semialdehyde reductase (EC 1.1.1.61),
E 12 is a 4-hydroxybutyryl-coenzyme A synthetase
E 13 is a 4-hydroxybutyryl-coenzyme A dehydratase,
E 14 a crotonyl-coenzyme A hydratase (EC 4.2.1.17),
E 15 is a 3-hydroxyacyl-coenzyme A dehydrogenase (EC 1.1.1.35), and
E 16 an acetoacetyl-coenzyme A-β-ketothiolase (2.3.1.9)
is.
Das Enzym E1 wird vorzugsweise von Genen ausgewählt aus der Gruppe umfas send acaca, acacb, f5j5.21, fl5c21.2, t8p21.5, acc1, aar071wp, accA, accB, accC, accD, accC1 und accC2, kodiert, wobei accA, accC und accD am meisten bevorzugt sind. Ein Beispiel für eine geeignete Acetyl-Coenzym A-Carboxylase ist unter anderem diejenige aus Rhizobium leguminosarum, welche von der DNA-Sequenz gemäß SEQ.-ID.-Nr. 01 kodiert wird und welche die Aminosäuresequenz gemäß SEQ.-ID.-Nr. 02 aufweist.The enzyme E 1 is preferably encoded by genes selected from the group consisting of acaca, acacb, f5j5.21, fl5c21.2, t8p21.5, acc1, aar071wp, accA, accB, accC, accD, accC1 and accC2, with accA , accC and accD are most preferred. An example of a suitable acetyl-coenzyme A carboxylase is, inter alia, that of Rhizobium leguminosarum which is derived from the DNA sequence according to SEQ. ID. 01 is coded and which the amino acid sequence according to SEQ. 02 has.
Das Enzym E2 wird vorzugsweise wird vorzugsweise vom ioID-Gen kodiert.The enzyme E 2 is preferably encoded by the ioID gene.
Die Enzyme E5 und E14 werden vorzugsweise von Genen ausgewählt aus der Gruppe umfassend echS1, ehhadh, hadha, echs1-prov, cg4389, cg4389, cg6543, cg6984, cg8778, ech-1, ech-2, ech-3, ech-4, ech-5, ech-6, ech-7, FCAALL.314, fcaall.21, fox2, ecil, eci2, paaF, paaG, yfcX, fadB, faoA, rpfF, phaA, phaB, echA1, echA2, echA3, echA4, echA5, echA6, echA7, echA8, echA9, echA9, echA10, echA11, echA12, echA13, echA14, echA15, echA16, echA17, echA18, echA19, echA20, echA21, fad-1, fad-2, fad-3, dcaE, hcaA, fadJ, rsp0671, rsp0035, rsp0648, rsp0647, rs03234, rs03271, rs04421, rs04419, rs02820, rs02946, paaG1, paaG2, paaG3, ech, pksH, ydbS, eccH1, eccH2, pimF, fabJ1, fabJ2, caiD2, ysiB, yngF, yusL, fucA, cg10919, scf41.23, scd10.16, sck13.22, scp8.07c, stbac16h6.14, sc5f2a.15, sc6a5.38, hbd-1, hbd-2, hdb-3, hdb-4, hdb-5, hdb-6, hdb-7, hdb-8, hdb-9, hdb-10, fad-1, fad-2, fad-3, fad-4, fad-5, paaF-1, paaF-2, paaF-3, paaF-4, paaF-5, paaF-6, paaF-7 und crt kodiert.The enzymes E 5 and E 14 are preferably selected from the group comprising echS1, ehhadh, hadha, echs1-prov, cg4389, cg4389, cg6543, cg6984, cg8778, ech-1, ech-2, ech-3, ech- 4, ech-5, ech-6, ech-7, FCAALL.314, fcaall.21, fox2, ecil, eci2, paaF, paaG, yfcX, fadB, faoA, rpfF, phaA, phaB, echA1, echA2, echA3, echA4, echA5, echA6, echA7, echA8, echA9, echA9, echA10, echA11, echA12, echA13, echA14, echA15, echA16, echA17, echA18, echA19, echA20, echA21, fad-1, fad-2, fad-3, dcaE, hcaA, fadJ, rsp0671, rsp0035, rsp0648, rsp0647, rs03234, rs03271, rs04421, rs04419, rs02820, rs02946, paaG1, paaG2, paaG3, ech, pksH, ydbS, eccH1, eccH2, pimF, fabJ1, fabJ2, caiD2, ysiB, yngF, yusL, fucA, cg10919, scf41.23, scd10.16, sck13.22, scp8.07c, stbac16h6.14, sc5f2a.15, sc6a5.38, hbd-1, hbd-2, hdb-3, hdb-4, hdb-5, hdb-6, hdb-7, hdb-8, hdb-9, hdb-10, fad-1, fad-2, fad-3, fad-4, fad-5, paaF 1, paaF-2, paaF-3, paaF-4, paaF-5, paaF-6, paaF-7 and crt.
Das Enzym E6 wird vorzugsweise von Genen ausgewählt aus der Gruppe umfassend acadl, acadm, acad10, acad11, acadm-prov, acadl-prov, mgc81873, cg12262, cg4703, cg4860, f3e22.5, afl213wp, acdC, fadE13, acd-1, acd-2, acd-3, acd-4, acd-5, acd-6, acd-7, acd-8, acd-9, acd-10, acd-11, acd-12, acd, fadE1, fadE2, fadE3, fadE4, fadE5, fadE6, fadE7, fadE13, fadE14, fadE15, fadE16, fadE17, fadE18, fadE19, fadE20, fadE21, fadE22, fadE23, fadE26, fadE27, fadE30, fadE31, fadE33, fadE35, fadE38, fadE45, fadE, caiA, aidB, RSp0036, RS03588, mmgC, acdA-3, bcd, acdA, acdH1, acdH2, acdH3, aidB, acdI und acdH kodiert.The enzyme E 6 is preferably selected from the group consisting of acadl, acadm, acad10, acad11, acadmpro, acadl-prov, mgc81873, cg12262, cg4703, cg4860, f3e22.5, afl213wp, acdC, fadE13, acd-1 acd-2, acd-3, acd-4, acd-5, acd-6, acd-7, acd-8, acd-9, acd-10, acd-11, acd-12, acd, fadE1, fadE2 , stringE3, stringE4, stringE5, stringE6, stringE7, stringE13, stringE14, stringE15, stringE16, stringE17, stringE18, stringE19, stringE20, stringE21, stringE22, stringE23, stringE26, stringE27, stringE30, stringE31, stringE33, stringE35, stringE38, stringE45, stringE , caiA, aidB, RSp0036, RS03588, mmgC, acdA-3, bcd, acdA, acdH1, acdH2, acdH3, aidB, acdI and acdH.
Das Enzym E7 wird vorzugsweise von Genen ausgewählt aus der Gruppe umfassend pccA, pccB, LOC699844, MGC68650, LOC582365, LOC592281, pcca-1, pccb-1, gnyA, gnyB, accA, accA2, accB, accD1, accD2, accD3, accD4, accD5, accD6, mccA, cg10707, cg10708, cg12870, dtsR, dtsR1, dtsR2 und yngE kodiert. Ein Beispiel für eine geeignete Propionyl-Coenzym A-Carboxylase ist unter anderem diejenige aus Rhizobium leguminosarum, welche von der DNA-Sequenz gemäß SEQ.-ID.-Nr. 03 kodiert wird und welche die Aminosäuresequenz gemäß SEQ.-ID.-Nr. 04 aufweist.The enzyme E 7 is preferably selected from the group consisting of pCCA, pCCB, LOC699844, MGC68650, LOC582365, LOC592281, pcca-1, pccb-1, gnyA, gnyB, accA, accA2, accB, accD1, accD2, accD3, accD4 , accD5, accD6, mccA, cg10707, cg10708, cg12870, dtsR, dtsR1, dtsR2 and yngE. An example of a suitable propionyl-coenzyme A carboxylase is, inter alia, that from Rhizobium leguminosarum which is derived from the DNA sequence according to SEQ. ID. 03 is coded and which the amino acid sequence according to SEQ. 04 has.
Das Enzym E8 wird vorzugsweise vom mcee-Gen kodiert.The enzyme E 8 is preferably encoded by the mcee gene.
Das Enzym E9 wird vorzugsweise von Genen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus mut, mutA, mutB, sbm, sbmA, sbmB, sbm5, bhbA, mcmA, mcmA1, mcmA2, mcmB, mcm1, mcm2, mcm3, icmA, meaA1 und meaA2 kodiert.The enzyme E 9 is preferably encoded by genes selected from the group consisting of mut, mutA, mutB, sbm, sbmA, sbmB, sbm5, bhbA, mcmA, mcmA1, mcmA2, mcmB, mcm1, mcm2, mcm3, icmA, meaA1 and meaA2 ,
Das Enzym E10 wird vorzugsweise von Genen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus aldH5F1, uga2, ald3, ald4, ald3, uga22, gabD, attK, attK1, attK2, XOO2614, gabD-1, gabD-2, gabD3, gabD4, gabD5, gabD6, gabG, thmS1, thmS2, ssdH, gabDch, gabDc, ypf10097, gabDf1, gabDf2, ssdA, sucD, cg10051, cg10480, 2SCG58.04 und SCD63.12 kodiert.The enzyme E 10 is preferably selected from genes consisting of the group consisting of aldH5F1, uga2, ald3, ald4, ald3, uga22, gabD, attK, attK1, attK2, XOO2614, gabD-1, gabD-2, gabD3, gabD4, gabD5, gabD6, gave gab, thmS1, thmS2, ssdH, gaveDch, gaveDc, ypf10097, gaveDf1, gaveDf2, ssdA, sucD, cg10051, cg10480, 2SCG58.04 and SCD63.12.
Das Enzym E11 wird vorzugsweise von Genen ausgewählt aus der Gruppe umfassend gbd, gbd1, gbd2, abfH und 4hbD kodiert.The enzyme E 11 is preferably encoded by genes selected from the group comprising gbd, gbd1, gbd2, abfH and 4hbD.
Bei dem Enzym E13, welches die Umsetzung von 4-Hydroxybutyryl-Coenzym A zu Crotonyl-Coenzym A katalysiert, handelt es sich vorzugsweise um eine 4- Hydroxybutyryl-Coenzym A-Dehydratase. Ein erfindungsgemäß besonders geeignetes Enzym E13 ist beispielsweise eine 4-Hydroxybutyryl-Coenzym A-Dehydratase aus Sulfolobus solfataricus, welche von der DNA-Sequenz gemäß SEQ.-ID.-Nr. 05 kodiert wird und welche die Aminosäuresequenz gemäß SEQ.-ID.-Nr. 06 aufweist, oder eine 4-Hydroxybutyryl-Coenzym A-Dehydratase aus Sulfolobus tokodaii, welche von der DNA-Sequenz gemäß SEQ.-ID.-Nr. 07 kodiert wird und welche die Aminosäuresequenz gemäß SEQ.-ID.-Nr. 08 aufweist.The enzyme E 13 , which catalyzes the conversion of 4-hydroxybutyryl-coenzyme A into crotonyl-coenzyme A, is preferably a 4-hydroxybutyryl-coenzyme A dehydratase. An enzyme E 13 which is particularly suitable according to the invention is, for example, a Sulfolobus solfataricus 4-hydroxybutyryl-coenzyme A dehydratase, which is derived from the DNA sequence according to SEQ. ID. 05 is coded and which the amino acid sequence according to SEQ. 06, or a Sulfolobus tokodaii 4-hydroxybutyryl-coenzyme A dehydratase derived from the DNA sequence according to SEQ. ID. 07 is coded and which the amino acid sequence according to SEQ. 08 has.
Das Enzym E15 wird vorzugsweise von Genen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus hibadh, cg15093, cg15093, cg4747, mwL2.23, t13k14.90, f19b15.150, hibA, ygbJ, mmsB, mmsB, garR, tsar, mmsB-1, mmsB-2, yfjR, ykwC, ywjF, hibD, glxR, SCM1.40c, hibD, ehhand, hadh2, hadhsc, hsd17B4, loc488110, had, mgC81885, hadh2-prov, cg3415, cg7113, ech-1, ech-8, ech-9, ard-1, yfcX, fadB, faoA, fadB2x, hbd-1, hbd-2, hbd-3, hbd-4, hbd-5, hbd-6, hbd-7, hbd-8, hbd-9, hbd-10, fadJ, rs04421, rs02946, rs05766, bbsD, bbsC, fadB1, fadB2, fadB5, hbdA, pimF, fabJ-1, fabJ, scbac19f3.11, sci35.13, scbac8d1.10c, sc5f2a.15, sc6a5.38, fadC2, fadC4, fadC5, fadC6, had und paaH kodiert.The enzyme E 15 is preferably selected from genes selected from the group consisting of hibadh, cg15093, cg15093, cg4747, mwL2.23, t13k14.90, f19b15.150, hibA, ygbJ, mmsB, mmsB, garR, tsar, mmsB-1, mmsB-2, yfjR, ykwC, ywjF, hibD, glxR, SCM1.40c, hibD, ehhand, hadh2, hadhsc, hsd17B4, loc488110, had, mgC81885, hadh2-prov, cg3415, cg7113, ech-1, ech-8, ech-9, ard-1, yfcX, fadB, faoA, fadB2x, hbd-1, hbd-2, hbd-3, hbd-4, hbd-5, hbd-6, hbd-7, hbd-8, hbd- 9, hbd-10, fadJ, rs04421, rs02946, rs05766, bbsD, bbsC, fadB1, fadB2, fadB5, hbdA, pimF, fabJ-1, fabJ, scbac19f3.11, sci35.13, scbac8d1.10c, sc5f2a.15, sc6a5.38, fadC2, fadC4, fadC5, fadC6, had and paaH encoded.
Das Enzym E16 wird vorzugsweise von einem Gen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus acaT1, acaT2, RCJMB04_34i5, MGC69098, MGC81403, MGC81256, MGC83664, LOC759502, kat-1, ACAT2/EMB1276, erg10, atoB, yqeF, th1A, XOO1778, fadAx, phbA-1, phaA, phbA-2, atoB-2, bktB, tioL, thlA, paaJ, phbAch, phbAf, pimB, pcaF, mmgA, yhfS, th1, vraB, mvaC, thiL, fadA, th1A1, th1A2, th1A3, paaJ, fadA1, fadA2, fadA3, fadA4, fadA5, fadA6, fadA7, fadA8, fadA9, fadA10, fadA11, fadA12, cg12392, pcaF, catF, SC8F4.03, thiL1 und thiL2 kodiert.The enzyme E 16 is preferably selected from a gene selected from the group consisting of acaT1, acaT2, RCJMB04_34i5, MGC69098, MGC81403, MGC81256, MGC83664, LOC759502, cat-1, ACAT2 / EMB1276, erg10, atoB, yqeF, th1A, XOO1778, fadAx , phbA-1, phaA, phbA-2, atoB-2, bktB, tioL, thlA, paaJ, phbAch, phbAf, pimB, pcaF, mmGA, yhfS, th1, vraB, mvaC, thiL, fAdA, th1A1, th1A2, th1A3 , paaJ, fadA1, fadA2, fadA3, fadA4, fadA5, fadA6, fadA7, fadA8, fadA9, fadA10, fadA11, fadA12, cg12392, pcaF, catF, SC8F4.03, thiL1, and thiL2.
Die Gen-Sequenzen der vorstehend im Zusammenhang mit den Enzymen E1, E2, E5, E6 bis E11 und E14 bis E16 genannten Gene können unter anderem der KEGG- Datenbank („Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes") entnommen werden.The gene sequences of the genes mentioned above in connection with the enzymes E 1 , E 2 , E 5 , E 6 to E 11 and E 14 to E 16 can, inter alia, the KEGG database ("Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes") be removed.
Erfindungsgemäß besonders bevorzugt ist es, eine rekombinante Zelle einzusetzen, deren Wildtyp bereits in der Lage ist, Acetyl-Coenzym A über Malonyl-Coenzym A, Malonatsemialdehyd, 3-Hydroxypropionat, 3-Hydroxypropionyl-Coenzym A, Acryloyl-Coenzym A, Propionyl-Coenzym A, Methylmalonyl-Coenzym A, Succinyl-Coenzym A, Succinatsemialdehyd und 4-Hydroxybuttersäure zu 4-Hydroxybutyryl-Coenzym A umzusetzen (deren Wildtyp also bereits eine nachweisbare Aktivität der Enzyme E1 bis E12 aufweist) und welche zudem in der Lage ist, Crotonyl-Coenzym A über 3-Hydroxybutyyrl-Coenzym A und Acetoacetyl-Coenzym A zu zwei Äquivalenten Acetyl-Coenzym A umzusetzen (deren Wildtyp also bereits auch eine nachweisbare Aktivität der Enzyme E14 bis E16 aufweist), und in dieser Zelle die Aktivität des Enzyms E13 oder die Aktivität der Enzyme E1, E7 und E13 zu erhöhen.According to the invention, it is particularly preferred to use a recombinant cell whose wild-type is already capable of acetyl-coenzyme A via malonyl-coenzyme A, malonate semialdehyde, 3-hydroxypropionate, 3-hydroxypropionyl-coenzyme A, acryloyl-coenzyme A, propionyl-coenzyme A, methylmalonyl coenzyme A, succinyl coenzyme A, succinate semialdehyde and 4-hydroxybutyric acid to 4-hydroxybutyryl coenzyme A implement (ie their wild type already has a detectable activity of the enzymes E 1 to E 12 ) and which is also able to To convert crotonyl-coenzyme A via 3-hydroxybutyryl-coenzyme A and acetoacetyl-coenzyme A to two equivalents of acetyl-coenzyme A (the wild type thus already has a detectable activity of the enzymes E 14 to E 16 ), and in this cell the activity of Enzyme E 13 or the activity of the enzymes E 1 , E 7 and E 13 increase.
Wie bereits eingangs erläutert, ist die erfindungsgemäße rekombinante Zelle, in der die Aktivität mindestens eines der Enzyms E1 bis E16 erhöht ist, in der Lage, aus zwei Äquivalenten Hydrogencarbonat ein Äquivalent Acetyl-Coenzym A herzustellen. Diese C2-Kohlenstoffeinheit kann nunmehr als Ausgangsprodukt für die Herstellung organischer Verbindungen mit mindestens zwei Kohlenstoffatomen durch die rekombinante Zelle dienen.As already explained at the outset, the recombinant cell according to the invention, in which the activity of at least one of the enzymes E 1 to E 16 is increased, is capable of converting from two equivalents of bicarbonate to one eq to produce valent acetyl coenzyme A. This C 2 carbon unit can now serve as a starting material for the preparation of organic compounds having at least two carbon atoms by the recombinant cell.
Vorzugsweise handelt es sich bei diesen organischen Verbindungen mit mindestens zwei Kohlenstoffatomen um eine C3-Verbindung, eine C4-Verbindung, eine C5-Verbindung, eine C6-Verbindung, eine C7-Verbindung, eine C8-Verbindung, eine C9-Verbindung, eine C10-Verbindung oder eine Verbindung mit mehr als 10 Kohlenstoffatomen. Unter diesen Verbindungen insbesondere bevorzugt sind organische Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Carbon saure, einer Dicarbonsäure, einer Hydroxycarbonsäure, einem Amin, einer Aminosäure, einem Keton und einem Alkohol.Preferably, these organic compounds having at least two carbon atoms are a C 3 compound, a C 4 compound, a C 5 compound, a C 6 compound, a C 7 compound, a C 8 compound, a C 9 compound, a C 10 compound or a compound with more than 10 carbon atoms. Among these compounds, particularly preferred are organic compound selected from the group consisting of a carboxylic acid, a dicarboxylic acid, a hydroxycarboxylic acid, an amine, an amino acid, a ketone and an alcohol.
Als Beispiele für organische Verbindungen, welche durch die erfindungsgemäße Zelle hergestellt werden können, seien insbesondere Verbindungen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Acrylsäure, Methacrylsäure, 3-Hydroxypropionsäure, 3-Hydroxyisobuttersäure, Lysin, Glutamat, Methionin, Phenylalanin, Asparaginsäure, Tryptophan, Threonin, Butanol, 1,2-Propandiol, 1,3-Propandiol, 2,3-Butandiol, 1,4-Butandiol, 1,6-Hexandiol, Glycerin, Sorbitol, Manitol, Xylitol, Arabinitol, Glukose, Aceton und Dihydroxyaceton genannt.When Examples of organic compounds, which by the can be produced according to the invention cell, in particular compounds are selected from the Group consisting of acrylic acid, methacrylic acid, 3-hydroxypropionic acid, 3-hydroxyisobutyric acid, Lysine, glutamate, methionine, phenylalanine, aspartic acid, Tryptophan, threonine, butanol, 1,2-propanediol, 1,3-propanediol, 2,3-butanediol, 1,4-butanediol, 1,6-hexanediol, glycerol, sorbitol, manitol, xylitol, Arabinitol, glucose, acetone and dihydroxyacetone.
Soll
die erfindungsgemäße rekombinante Zelle organische
Verbindungen aus Hydrogencarbonat bereitstellen, die bereits als
Intermediate in dem in der
Gemäß einer
ersten, besonderen Variante der erfindungsgemäßen
rekombinanten Zelle ist dieser in der Lage, aus Hydrogencarbonat
3-Hydroxypropionsäure zu bilden. Da 3-Hydroxypropionsäure
als Intermediat in dem in der
Der vorstehend verwendete Begriff „3-Hydroxypropionsäure" beschreibt ebenso wie der nachstehend verwendete Begriff „3-Hydroxyisobuttersäure" stets die entsprechende C3- bzw. C4-Carbonsäure in derjenigen Form, in der sie nach Bildung durch die entsprechenden Mikroorganismen in Abhängigkeit vom pH-Wert vorliegt. Der Begriff umfasst somit stets die reine Säureform (3-Hydroxypropionsäure bzw. 3-Hydroxyisobuttersäure), die reine Basenform (3-Hydroxypropionat bzw. 3-Hydroxyisobutyrat) sowie Mischungen aus protonierter und deprotonierter Form der Säure.The term "3-hydroxypropionic acid" as used above, as well as the term "3-hydroxyisobutyric acid" used below, always describes the corresponding C 3 - or C 4 -carboxylic acid in the form in which they are formed after formation by the corresponding microorganisms as a function of the pH Value is present. The term thus always includes the pure acid form (3-hydroxypropionic acid or 3-hydroxyisobutyric acid), the pure base form (3-hydroxypropionate or 3-hydroxyisobutyrate) and mixtures of protonated and deprotonated form of the acid.
Gemäß einer zweiten, besonderen Variante der erfindungsgemäßen rekombinanten Zelle ist dieser in der Lage, aus Hydrogencarbonat 3-Hydroxyisobuttersäure zu bilden. Im Zusammenhang mit dieser zweiten Variante der erfindungsgemäßen rekombinanten Zelle ist es insbesondere bevorzugt, dass diese neben einer gesteigerten Aktivität eines oder mehrerer der Enzyme E1 bis E16 auch eine gesteigerte Aktivität mindestens eines der Enzyme E17 und E18 aufweist:
- – eines Enzyms E17, welches die Umsetzung von Propionyl-Coenzym A zu Methylmalonatsemialdehyd katalysiert;
- – eines Enzyms E18, welches die Umsetzung von Methylmalonatsemialdehyd zu 3-Hydroxyisobuttersäure katalysiert.
- An enzyme E 17 which catalyzes the conversion of propionyl-coenzyme A to methylmalonate semialdehyde;
- An enzyme E 18 which catalyzes the conversion of methylmalonate semialdehyde to 3-hydroxyisobutyric acid.
In
diesem Zusammenhang ist es besonders bevorzugt, dass das Enzym
E17 eine Methylmalonatsemialdehyd-Dehydrogenase
(EC 1.2.1.27), und
E18 eine 3-Hydroxyisobutyrat-Dehydrogenase
(EC 1.1.1.31) oder eine 3-Hydroxyacyl-Coenzym A-Dehydrogenase (EC
1.1.1.35)
ist.In this connection it is particularly preferred that the enzyme
E 17 is a methylmalonate semialdehyde dehydrogenase (EC 1.2.1.27), and
E 18 is a 3-hydroxyisobutyrate dehydrogenase (EC 1.1.1.31) or a 3-hydroxyacyl-coenzyme A dehydrogenase (EC 1.1.1.35)
is.
Geeignete Gene für das Enzym E17 sind vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus aldh6al, cg17896, t22c12.10, ald6, putA1, mmsA, mmsA-1, mmsA-2, mmsA-3, mmsA-4, msdA, io1A und iolAB.Suitable genes for the enzyme E 17 are preferably selected from the group consisting of aldh6al, cg17896, t22c12.10, ald6, putA1, mmsA, mmsA-1, mmsA-2, mmsA-3, mmsA-4, msdA, io1A and iolAB.
Geeignete
Gene für das Enzym E18 sind ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus hibadh, cg15093, cg15093, cg4747, mwL2.23,
t13k14.90, fl9b15.150, hibA, ygbJ, mmsB, mmsB, garR, tsar, mmsB-1,
mmsB-2, yfjR, ykwC, ywjF, hibD, g1xR, SCM1.40c, hibD, ehhand, hadh2,
hadhsc, hsd17B4, loc488110, had, mgC81885, hadh2-prov, cg3415, cg7113,
ech-1, ech-8, ech-9, ard-1, yfcX, fadB, faoA, fadB2x, hbd-1, hbd-2,
hbd-3, hbd-4, hbd-5, hbd-6, hbd-7, hbd-8, hbd-9, hbd-10, fadJ, rs04421,
rs02946, rs05766, bbsD, bbsC, fadB1, fadB2, fadB5, hbdA, pimF, fabJ-1,
fabJ, scbac19f3.11, sci35.13, scbac8d1.10c, sc5f2a.15, sc6a5.38,
fadC2, fadC4, fadC5, fadC6, had und paaH. Weitere geeignete 3-Hudroxuisobuturat-Dehudrogenasen
sind beispielsweise in
Die Nukleotidsequenzen der vorstehend genannten Gene für die Enzyme E17 und E18 können unter anderem auch der KEGG-Datenbank entnommen werden.The nucleotide sequences of the abovementioned genes for the enzymes E 17 and E 18 can also be taken from the KEGG database, among others.
Da
Propionyl-Coenzym A bereits als Intermediat bei dem in
Gemäß einer dritten, besonderen Variante der erfindungsgemäßen rekombinanten Zelle ist diese in der Lage, aus Hydrogencarbonat Pyruvat zu bilden. Im Zusammenhang mit dieser dritten Variante der erfindungsgemäßen rekombinanten Zelle ist es insbesondere bevorzugt, dass diese neben einer gesteigerten Aktivität eines oder mehrerer der Enzyme E1 bis E16 auch eine gesteigerte Aktivität eines Enzyms E19 aufweist, welches die Umsetzung von Acetyl-Coenzym A und Kohlendioxid zu Pyruvat katalysiert, wobei es sich bei diesem Enzym E19 vorzugsweise um eine Pyruvat-Synthase (EC 1.2.7.1) handelt. Gene für eine geeignete Pyruvat-Synthase können insbesondere ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus yccM, padE, padG, padI, padF, porA, porB, porC, porD, porG, nifJ, forA1, forA2, forB1, forB2, forG1, forG2, porA_1, porA_2, porB_1, porB_2, porC-1, porD-1, porD-2, porG-1, porG_2, porD-like, porA-like und porB-like. Die Nukleotidsequenzen der vorstehend genannten Gene für das Enzyme E19 können unter anderem auch der KEGG-Datenbank entnommen werden.According to a third, particular variant of the recombinant cell according to the invention, the latter is able to form pyrogen from bicarbonate. In connection with this third variant of the recombinant cell according to the invention, it is particularly preferred that in addition to an increased activity of one or more of the enzymes E 1 to E 16 also has an increased activity of an enzyme E 19 , which is the reaction of acetyl coenzyme A and Catalyses carbon dioxide to pyruvate, which is preferably a pyruvate synthase (EC 1.2.7.1) in this enzyme E 19 . In particular, genes for a suitable pyruvate synthase can be selected from the group consisting of yccM, padE, padG, padI, padF, porA, porB, porC, porD, porG, nifJ, forA1, forA2, forB1, forB2, forG1, forG2, porA_1, PorA_2, PorB_1, PorB_2, PorC-1, PorD-1, PorD-2, PorG-1, PorG_2, PorD-like, PorA-like and PorB-like. The nucleotide sequences of the abovementioned genes for the enzyme E 19 can also be taken from the KEGG database.
Einen Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet auch ein Verfahren zur Herstellung einer rekombinanten Zelle, welche in der Lage ist, aus Hydrogencarbonat organische Verbindungen mit mindestens zwei Kohlenstoffatomen zu bilden, umfassend den Verfahrensschritt der Erhöhung der Aktivität eines oder mehrer der Enzyme E1 bis E16 in der Zelle. Auch die durch dieses Verfahren erhältliche rekombinante Zelle leistet einen Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben.A contribution to the solution of the abovementioned objects is also provided by a method for producing a recombinant cell which is capable of forming from bicarbonate organic compounds having at least two carbon atoms, comprising the step of increasing the activity of one or more of the enzymes E 1 to E 16 in the cell. Also, the recombinant cell obtainable by this method makes a contribution to the solution of the above-mentioned objects.
Einen weiteren Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet insbesondere auch die Verwendung einer rekombinanten Zelle zur gezielten Herstellung organischer Verbindungen aus Hydrogencarbonat unter Ausnutzung eines Stoffwechselweges, bei dem aus Acetyl-CoA und Hydrogencarbonat Malonyl-Coenzym A, aus Malonyl-Coenzym A Malonatsemialdehyd, aus Malonatsemialdehyd 3-Hydroxypropionat, aus 3-Hydroxypropionat 3-Hydroxypropionyl-Coenzym A, aus 3-Hydroxypropionyl-Coenzym A Acryloyl-Coenzym A, aus Acryloyl-Coenzym A Propionyl-Coenzym A, aus Propionyl-Coenzym A und Hydrogencarbonat (S)-Methylmalonyl-Coenzym A, aus (S)-Methylmalonyl-Coenzym A (R)-Methylmalonyl-Coenzym A, aus (R)-Methylmalonyl-Coenzym A Succinatsemialdehyd, aus Succinatsemialdehyd 4-Hydroxybuttersäure, aus 4-Hydroxybuttersäure 4-Hydroxybutyryl-Coenzym A, aus 4-Hydroxybutyryl-Coenzym A Crotonyl-Coenzym A, aus Crotonyl-Coenzym A 3-Hydroxybutyryl-Coenzym A, aus 3-Hydroxybutyryl-Coenzym A Acetoacetyl-Coenzym A und aus Acetoacetyl-Coenzym A zwei Äquivalente Acetyl-Coenzym A gebildet werden.a further contribution to the solution of the aforementioned tasks in particular also makes use of a recombinant cell for the targeted production of organic compounds from bicarbonate taking advantage of a metabolic pathway in which acetyl-CoA and bicarbonate malonyl coenzyme A, malonyl coenzyme A malonate semialdehyde, from malonate semialdehyde 3-hydroxypropionate, from 3-hydroxypropionate 3-hydroxypropionyl-coenzyme A, from 3-hydroxypropionyl-coenzyme A acryloyl-coenzyme A, from acryloyl-coenzyme A propionyl-coenzyme A, from propionyl-coenzyme A and bicarbonate (S) -methylmalonyl-coenzyme A, from (S) -methylmalonyl-coenzyme A (R) -methylmalonyl coenzyme A, from (R) -methylmalonyl-coenzyme A succinate semialdehyde, from succinic semialdehyde 4-hydroxybutyric acid, from 4-hydroxybutyric acid 4-hydroxybutyryl-coenzyme A, from 4-hydroxybutyryl-coenzyme A crotonyl-coenzyme A, from crotonyl-coenzyme A 3-hydroxybutyryl-coenzyme A, from 3-hydroxybutyryl-coenzyme A acetoacetyl-coenzyme A and acetoacetyl-coenzyme A two equivalents Acetyl-coenzyme A are formed.
Die Formulierung „zur gezielten Herstellung organischer Verbindungen aus Hydrogencarbonat" ist so zu verstehen, dass die Zelle in der Absicht eingesetzt wird, um organische Verbindungen mit mindestens zwei Kohlenstoffatomen aus Hydrogencarbonat herzustellen. Daher umfasst das gezielte Herstellen derartiger organischer Verbindungen insbesondere auch das in Kontakt bringen der erfindungsgemäßen rekombinanten Zelle mit einem Hydrogencarbonat-haltigen Nährmedium sowie mindestens einen Aufreinigungsschritt, mittels dessen die organischen Verbindungen nach ihrer Herstellung durch die Zellen isoliert werden können.The Formulation "for the targeted production of organic compounds From bicarbonate "is to be understood that the cell in the Intention is used to make organic compounds with at least produce two carbon atoms from bicarbonate. Therefore includes the targeted production of such organic compounds in particular also bringing the inventive invention recombinant cell with a bicarbonate-containing nutrient medium and at least one purification step, by means of which the organic compounds after their production by the cells can be isolated.
Bevorzugte Zellen und organische Verbindung sind wiederum diejenigen Zellen und organischen Verbindungen, die bereits eingangs im Zusammenhang mit den erfindungsgemäßen rekombinanten Zellen genannt worden sind, wobei als organische Verbindungen 3-Hydroxypropionsäure und 3-Hydroxyisobuttersäure besonders bevorzugt sind.preferred In turn, cells and organic compounds are those cells and organic compounds already related in the beginning with the recombinant cells according to the invention have been mentioned, wherein as organic compounds 3-hydroxypropionic acid and 3-hydroxyisobutyric acid are particularly preferred.
Einen Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet insbesondere auch ein Verfahren zur Herstellung von organischen Verbindungen mit mindestens zwei Kohlenstoffatomen, umfassend den Verfahrensschritt des in Kontakt bringens einer erfindungsgemäßen Zelle mit einem Hydrogencarbonatenthaltenden Nährmedium, vorzugsweise mit einem Nährmedium, in welches ein Kohlendioxid-haltiges Gas unter zumindest teilweiser Bildung von Hydrogencarbonat eingebracht wird, unter Bedingungen, unter denen aus dem Hydrogencarbonat organische Verbindungen mit mindestens zwei Kohlenstoffatomen gebildet werden, sowie gegebenenfalls Aufreinigung der organischen Verbindungen mit mindestens zwei Kohlenstoffatomen aus dem Nährmedium.a Contribute to the solution of the above-mentioned tasks in particular also a process for the production of organic Compounds having at least two carbon atoms, comprising the Process step of bringing into contact a inventive Cell with a hydrogen carbonate containing nutrient medium, preferably with a nutrient medium into which a carbon dioxide-containing Gas introduced with at least partial formation of bicarbonate is, under conditions, among which from the bicarbonate organic Compounds having at least two carbon atoms are formed, and optionally purification of the organic compounds with at least two carbon atoms from the nutrient medium.
Die
erfindungsgemäßen rekombinanten Zellen können
kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch-Verfahren (Satzkultivierung)
oder im fed-batch-Verfahren (Zulaufverfahren) oder repeated fed-batch-V erfahren
(repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Produktion organischer
Verbindungen mit mindestens zwei Kohlenstoffatomen aus Hydrogencarbonat
mit dem Nährmedium in Kontakt und somit kultiviert werden. Denkbar
ist auch ein semi-kontinuierliches Verfahren, wie es in der
Das
zu verwendende Kulturmedium muss in geeigneter Weise den Ansprüchen
der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen
von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch
Als Kohlenstoffquelle, welche gegebenenfalls neben dem Hydrogencarbonat zugesetzt werden kann, können Kohlehydrate wie z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose, Öle und Fette wie z. B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosfett, Fettsäuren wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole wie z. B. Glycerin und Methanol, Kohlenwasserstoffe wie Methan, Aminosäuren wie L-Glutamat oder L-Valin oder organische Säuren wie z. B. Essigsäure verwendet werden.When Carbon source, which optionally in addition to the bicarbonate can be added, carbohydrates such as. Glucose, Sucrose, lactose, fructose, maltose, molasses, starch and cellulose, oils and fats such. Soybean oil, Sunflower oil, peanut oil and coconut oil, fatty acids such as Palmitic acid, stearic acid and linoleic acid, Alcohols such. As glycerol and methanol, hydrocarbons such Methane, amino acids such as L-glutamate or L-valine or organic Acids such. As acetic acid can be used.
Als Stickstoffquelle können organische Stickstoff-haltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.When Nitrogen source can be organic nitrogen-containing compounds such as peptone, yeast extract, meat extract, malt extract, corn steep liquor, Soybean meal and urea or inorganic compounds such as Ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate and ammonium nitrate are used. The nitrogen sources can used singly or as a mixture.
Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium-haltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muss weiterhin Salze von Metallen enthalten wie z. B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden.When Phosphorus source can phosphoric acid, potassium dihydrogen phosphate or dipotassium hydrogen phosphate or the corresponding sodium-containing ones Salts are used. The culture medium must continue to salts of Metals include such. As magnesium sulfate or iron sulfate, the necessary for growth. Finally, you can essential growth factors such as amino acids and vitamins in addition used for the above-mentioned substances. The culture medium In addition, suitable precursors may be added become. The stated feedstocks can be used to culture in Formed as a one-off approach or as appropriate be fed during cultivation.
Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie z. B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe wie z. B. Antibiotika hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoff-haltige Gasmischungen wie z. B. Luft in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 20°C bis 45°C und vorzugsweise bei 25°C bis 40°C.For pH control of the culture, basic compounds such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia or ammonia water or acidic compounds such as phosphoric acid or sulfuric acid are suitably used. To control the foam development antifoams such. B. fatty acid polyglycol esters are used. To maintain the stability of plasmids can the medium suitable nete selective substances such. B. antibiotics are added. In order to maintain aerobic conditions, oxygen or oxygen-containing gas mixtures such. For example, air is introduced into the culture. The temperature of the culture is usually 20 ° C to 45 ° C, and preferably 25 ° C to 40 ° C.
Das Hydrogencarbonat wird dem Nährmedium vorzugsweise durch das Einbringen von Kohlendioxid-haltigem Gas zugesetzt. Als Kohlendioxid-haltiges Gas kann reines Kohlendioxid eingesetzt werden. Denkbar und erfindungsgemäß bevorzugt sind jedoch Kohlendioxid-reiche Gasgemische, insbesondere Gasgemische mit einem CO2-Anteil von mindestens 50 Vol-%, besonders bevorzugt mindestens 75 Vol-% und am meisten bevorzugt mindestens 90 Vol-%. Als Gasgemische kommen hier insbesondere die Abgase von Verbrennungsmotoren und Kohlekraftwerken in Betracht. Auch die Abgase von Brauerein oder Müllverbren nungsanlagen können als Ausgangsmaterial für geeignete Kohlendioxid-reiche Gasgemische dienen.The bicarbonate is preferably added to the nutrient medium by the introduction of carbon dioxide-containing gas. As carbon dioxide-containing gas pure carbon dioxide can be used. However, carbon dioxide-rich gas mixtures, in particular gas mixtures having a CO 2 content of at least 50% by volume, more preferably at least 75% by volume and most preferably at least 90% by volume, are conceivable and preferred according to the invention. As gas mixtures come here in particular the exhaust gases of internal combustion engines and coal power plants into consideration. The exhaust gases from breweries or Müllverbren nungsanlagen can serve as a starting material for suitable carbon dioxide-rich gas mixtures.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung einer organischen Verbindung mit mindestens zwei Kohlenstoffatomen werden Zellen eingesetzt, die in der Lage sind, 3-Hydroxypropionsäure oder 3-Hydroxyisobuttersäure aus Hydrogencarbonat herzustellen.According to one particularly preferred embodiment of the invention Process for the preparation of an organic compound with at least Two carbon atoms are used in cells capable are 3-hydroxypropionic acid or 3-hydroxyisobutyric acid to produce from bicarbonate.
Auch sind Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von organischen Verbindungen mit mindestens zwei Kohlenstoffatomen denkbar, bei dem nicht die organischen Verbindungen mit mindestens zwei Kohlenstoffatomen selbst, sondern nur Vorläuferverbindungen für die Herstellung dieser organischen Verbindungen mit mindestens zwei Kohlenstoffatomen durch die erfindungsgemäße rekombinante Zelle gebildet werden. Diese Vorläuferverbindungen können dann mittels weiterer, gegebenenfalls rekombinanter Zellen, welche gegebenenfalls sogar in Co-Kultur mit den erfindungsgemäßen rekombinanten Zellen kultiviert werden, aufgenommen und in die gewünschte organische Verbindung mit mindestens zwei Kohlenstoffatomen überführt werden. Ein solches Verfahren könnte sich zum Beispiel bei der dritten, besonderen Variante der erfindungsgemäßen rekombinanten Zelle, welche in der Lage ist, Pyruvat aus zwei Äquivalenten Hydrogencarbonat und einem Äquivalent Kohlendioxid zu bilden, anbieten. Da Pyruvat könnte von anderen Zellen in weitere Zielprodukte überführt werden.Also are embodiments of the method according to the invention for the preparation of organic compounds having at least two Carbon atoms conceivable in which not the organic compounds with at least two carbon atoms themselves, but only precursor compounds for the preparation of these organic compounds with at least two carbon atoms by the inventive recombinant cell are formed. These precursor compounds can then by means of further, optionally recombinant Cells, which may even co-culture with the inventive Recombinant cells are cultured, taken up and in the desired converted organic compound having at least two carbon atoms become. Such a procedure could be, for example in the third, particular variant of the invention recombinant cell capable of producing pyruvate of two equivalents To form bicarbonate and one equivalent of carbon dioxide, to offer. Because pyruvate could be from other cells in more Target products are transferred.
Die Aufreinigung der organischen Verbindung mit mindestens zwei Kohlenstoffatomen erfolgt vorzugsweise mittels dem Fachmann bekannter Verfahren zur Aufeinigung von Zielprodukten aus Fermentationslösungen. Diese Aufeinigung kann, ebenso wie die Herstellung der organischen Verbindungen durch die erfindungsgemäßen Zellen selbst, kontinuierlich oder diskontinuierlich erfolgen. Übli cherweise beginnt die Aufreinigung zunächst mit einem Abtrennen der erfindungsgemäßen Zellen aus dem Nährmedium, wobei im Falle einer kontinuierlichen Aufreinigung die Fermentationsbrühe kontinuierlich über einen Filter mit einer Ausschlußgröße in einem Bereich von 20 bis 200 kDa geführt wird, in dem eine Fest/Flüssig-Trennung stattfindet. Denkbar ist auch der Einsatz einer Zentrifuge, einer geeigneten Sedimentationsvorrichtung oder eine Kombination dieser Vorrichtungen, wobei es besonders bevorzugt ist, zumindest einen Teil der Mikroorganismen zunächst durch Sedimentation abzutrennen und anschließend die von den Mikroorganismen teilweise befreite Fermentationsbrühe einer Ultrafiltration oder Zentrifugationsvorrichtung zuzuführen.The Purification of the organic compound having at least two carbon atoms is preferably carried out by means of methods known to those skilled in the Purification of target products from fermentation solutions. This reconciliation can, as well as the production of the organic Compounds by the cells according to the invention itself, continuously or discontinuously. Usually The purification begins with a separation of the first cells according to the invention from the nutrient medium, in the case of a continuous purification, the fermentation broth continuously over a filter with an exclusion size is conducted in a range of 20 to 200 kDa, in the a solid / liquid separation takes place. It is also possible the use of a centrifuge, a suitable sedimentation device or a combination of these devices, with particular preference is, at least part of the microorganisms first separated by sedimentation and then the by The microorganisms partially freed fermentation broth an ultrafiltration or centrifugation device.
Die weitere Aufreinigung des Zielproduktes (organische Verbindung mit mindestens zwei Kohlenstoffatomen) hängt von der Art des Zielproduktes ab, erfolgt aber üblicherweise in mehreren Trennstufen. Denkbar ist hier der Einsatz von dem Fachmann bekannten Trennvorrichtungen, wie etwa Trennvorrichtungen, die nach dem Prinzip der Elektrodialyse, der Umkehrosmose, der Ultrafiltration oder der Nanofiltration arbeiten.The further purification of the target product (organic compound with at least two carbon atoms) depends on the type of Target product from, but usually takes place in several Plates. Conceivable here is the use of known in the art Separators, such as separators, according to the principle Electrodialysis, reverse osmosis, ultrafiltration or Nanofiltration work.
Einen Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet auch ein Verfahren zur Herstellung von Acrylsäure oder Acrylsäureestern, umfassend die Verfahrensschritte
- IA) Herstellung von 3-Hydroxypropionsäure durch das vorstehend beschriebene Verfahren zur Herstellung organischer Verbindungen mit mindestens zwei Kohlenstoffatomen, bei dem Zellen eingesetzt werden, die in der Lage sind, 3-Hydroxypropionsäure aus Hydrogencarbonat zu bilden, sowie gegebenenfalls Neutralisation der gegebenenfalls aufgereinigten 3-Hydroxypropionsäure;
- IB) Dehydratisierung der 3-Hydroxypropionsäure unter Bildung von Acrylsäure sowie gegebenenfalls Veresterung der Acrylsäure.
- IA) Preparation of 3-hydroxypropionic acid by the process described above for the preparation of organic compounds having at least two carbon atoms, in which cells are used which are capable of forming 3-hydroxypropionic acid from bicarbonate, and optionally neutralization of the optionally purified 3-hydroxypropionic acid ;
- IB) dehydration of the 3-hydroxypropionic acid to form acrylic acid and optionally esterification of the acrylic acid.
Einen Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet auch ein Verfahren zur Herstellung von Methacrylsäure oder Methacrylsäureestern, umfassend die Verfahrensschritte
- IIA) Herstellung von 3-Hydroxyisobuttersäure durch das vorstehend beschriebene Verfahren zur Herstellung organischer Verbindungen mit mindestens zwei Kohlenstoffatomen, bei dem Zellen eingesetzt werden, die in der Lage sind, 3-Hydroxyisobuttersäure aus Hydrogencarbonat zu bilden, sowie gegebenenfalls Neutralisation der gegebenenfalls aufgereinigten 3-Hydroxyisobuttersäure;
- IIB) Dehydratisierung der 3-Hydroxyisobuttersäure unter Bildung von Methacrylsäure sowie gegebenenfalls Veresterung der Methacrylsäure.
- IIA) Preparation of 3-hydroxyisobutyric acid by the process described above for producing organic compounds having at least two carbon atoms, in which cells are used which are capable of forming 3-hydroxyisobutyric acid from bicarbonate, and optionally neutralization of the optionally purified 3-hydroxyisobutyric acid ;
- IIB) dehydration of the 3-hydroxyisobutyric acid to form methacrylic acid and optionally esterification of methacrylic acid.
Gemäß den Verfahrensschritten IB) und IIB) wird die 3-Hydroxypropionsäure bzw. die 3-Hydroxyisobuttersäure unter Bildung von Acrylsäure bzw. Methacrylsäure dehydratisiert, wobei hierzu entweder die aus der Fermenationslösung isolierte, reine Hydroxycarbonsäure oder aber die bei der Aufarbeitung der Fermenationslösung isolierte wässrige Hydroxycarbonsäure-Lösung eingesetzt werden kann, wobei diese gegebenenfalls noch vor der Dehydratisierung beispielsweise durch Destillation, gegebenenfalls in Gegenwart eines geeigneten Schleppmittels, aufkonzentriert wird.According to the Process steps IB) and IIB) is the 3-hydroxypropionic acid or the 3-hydroxyisobutyric acid to form acrylic acid or methacrylic dehydrated, this either the pure hydroxycarboxylic acid isolated from the fermentation solution or in the workup of the fermentation solution isolated aqueous hydroxycarboxylic acid solution can be used, this optionally still before Dehydration, for example by distillation, optionally in the presence of a suitable entraining agent.
Die Dehydratisierung kann grundsätzlich in flüssiger Phase oder in der Gasphase durchgeführt werden. Weiterhin ist es erfindungsgemäß bevorzugt, dass die Dehydratisierung in Gegenwart eines Katalysators erfolgt, wobei die Art des eingesetzten Katalysators davon abhängig ist, ob eine Gasphasen- oder eine Flüssig phasenreaktion durchgeführt wird. Vorzugsweise werden als Katalysatoren anorganische Säure wie beispielsweise Schwefelsäure oder Phosphorsäure eingesetzt, wobei es vorteilhaft sein kann, Trägermaterialien wie etwa natürliche oder synthetische silikatische Stoffe, insbesondere Mordenit, Montmorillonit, saure Zeolithe, oxidische oder silikatische Stoffe, beispielsweise Al2O3, TiO2; Oxide und Mischoxide, wie beispielsweise γ-Al2O3 und ZnO-Al2O3-Mischoxide der Heteropolysauren, einzusetzen, die mit anorganischen Säuren imprägniert sind.The dehydration can in principle be carried out in the liquid phase or in the gas phase. Furthermore, it is preferred according to the invention that the dehydration takes place in the presence of a catalyst, wherein the type of catalyst used depends on whether a gas phase or a liquid phase reaction is carried out. The catalysts used are preferably inorganic acid such as, for example, sulfuric acid or phosphoric acid, it being advantageous to use support materials such as natural or synthetic silicatic substances, in particular mordenite, montmorillonite, acidic zeolites, oxidic or siliceous substances, for example Al 2 O 3 , TiO 2 ; Oxides and mixed oxides, such as γ-Al 2 O 3 and ZnO-Al 2 O 3 mixed oxides of heteropolyacids, which are impregnated with inorganic acids.
Einen Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet auch ein Verfahren zur Herstellung von Poly(meth)acrylsäure oder Poly(meth)acrylsäureestern, umfassend die Verfahrensschritte
- IIIA) Herstellung von (Meth)acrylsäure durch die vorstehend beschriebenen Verfahren zur Herstellung von Acrylsäure bzw. Methacrylsäure;
- IIIB) radikalische Polymerisation der (Meth)Acrylsäure,
- IIIA) Preparation of (meth) acrylic acid by the above-described processes for the preparation of acrylic acid or methacrylic acid;
- IIIB) radical polymerization of (meth) acrylic acid,
BEISPIELEXAMPLE
1. Herstellung eines Expressionsvektors1. Preparation of an expression vector
Es wurde ein Shuttle-Vektor pA, welcher auf dem Plasmid pRNI basiert, gemäß dem durch Berkner et al. in „Small Multicopy, non-integrative shuttle vectors based an the Plasmid pRN1 for Sulfolobus acidocaldarius and Sulfolobus solfataricus, model organisms of the (cren-)archaea", Nucleic Acids Research, Vol. 35 (12), Seiten 1 bis 12 (2007), eingesetzt. In diesen Shuttle-Vektor wurde das Gen für die Hydroxybutyryl-Coenzym A Dehydratase aus Sulfolobus solfataricus (SEQ.-ID.-Nr. 05) in Analogie zu der in Berkner et al. für das pyrEF-Gen beschriebene Vorgehensweise eingefügt.It was a shuttle vector pA, which is based on the plasmid pRNI, according to the method described by Berkner et al. in "Small Multicopy, non-integrative shuttle vectors based on the plasmid pRN1 for Sulfolobus acidocaldarius and Sulfolobus solfataricus, model organisms of the (cren-) archaea ", Nucleic Acids Research, Vol. 35 (12), pages 1 to 12 (2007). In this shuttle vector became the gene for hydroxybutyryl-coenzyme A dehydratase from Sulfolobus solfataricus (SEQ. ID. 05) in analogy to the in Berkner et al. procedure described for the pyrEF gene inserted.
2. Transformation von Sulfolobus solfataricus-Zellen2. Transformation of sulfolobus solfataricus cells
Nach Methylierung des Shuttle-Vektors gemäß dem bei Berkner et al. beschriebenen Verfahren wurden der Vektor gemäß dem bei Berkner et al. beschriebenen Elektrooperation-Verfahren in Sulfolobus solfataricus-Zellen eingeführt.To Methylation of the shuttle vector according to the Berkner et al. described methods were the vector according to the in Berkner et al. described electro-surgery procedure in sulfolobus solfataricus cells introduced.
3. Kultivierung der rekombinanten Zellen3. Cultivation of the recombinant cell
Die so erhaltenen erfindungsgemäßen Zellen wurden in Brock's Basal Salt Medium bei einem pH-Wert von 3,5, in welches kontinuierlich CO2-Gas eingeblasen wurde, kultiviert. SEQUENZEN The cells according to the invention thus obtained were cultured in Brock's Basal Salt Medium at a pH of 3.5, in which CO 2 gas was continuously injected. Sequences
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