DE102007019184A1 - Mikroorganismus zur Herstellung von Bernsteinsäure - Google Patents

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Abstract

Die Erfindung betrifft einen isolierten genetisch veränderten Mikroorganismus, wobei das Gen IDH1 sowie zumindest eines der Gene SDH2 und DIC1 unter der Kontrolle eines ersten Promotors steht, welcher durch einen Kultivierungszusatz zu einem Wachstumskulturmedium reprimiert wird und in Abwesenheit des Kultivierungszusatzes aktiv ist, wobei die Gene der Gruppe "PYC1, ACS1, CIT1, ACO1, ICL1, MSL1 und CIT2 optional auch MDH3" konstitutiv aktiv sind, sowie Verwendungen eines solchen Mikroorganismus, insbesondere zur Herstellung von Bernsteinsäure.

Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die Erfindung betrifft einen Mikroorganismus mit dem Gen IDH1 sowie mit zumindest einem der Gene SDH2 und/oder DIC1, Verwendungen eines solchen Mikroorganismus und ein Verfahren zu dessen Herstellung.
  • Stand der Technik und Hintergrund der Erfindung
  • Dicarbonsäuren haben ein großes ökonomisches Potential, weil sie als Vorläufersubstanzen für zahlreiche Chemikalien verwendet werden können. Zum Beispiel dient Bernsteinsäure als Vorstufe für die Herstellung von Kunststoffen auf der Basis von 1,4-Butanediol, Tetrahydrofuran und Gamma-Butyrolacton. Bernsteinsäure wird heute chemisch durch katalytische Hydrierung von Maleinsäureanhydrid zu Bersteinsäureanhydrid und nachfolgender Wasseranlagerung, bzw. durch direkte katalytische Hydrierung von Maleinsäure hergestellt.
  • Bernsteinsäure wird auch von vielen Mikroorganismen ausgehend von Zuckern oder Aminosäuren unter physiologischen Umgebungsbedingungen gebildet. Unter anaeroben Bedingungen werden in der Regel neben Bernsteinsäure weitere Gärendprodukte wie Ethanol, Milchsäure, Essigsäure und Ameisensäure gebildet. Die Biosynthese von Bernsteinsäure mit ihrem hohen Sauerstoffanteil erfordert eine reduktive CO2-Fixierung.
  • Bernsteinsäure ist ein Metabolit, der normalerweise durch anaerobe Fermentationsprozesse angereichert wird. Während die Ausbeute und Anreicherung des Produktes unter anaeroben Bedingungen vielfach besser ist als unter aeroben Bedingungen, liegt der Nachteil in einem ausschließlich anaeroben Prozess in einer technischen Begrenzung der Biomassen-Herstellung und einer geringen Produktivität des mikrobiellen Produzenten. Somit ist ein relativ geringer Biomassen/Produkt Wirkungsgrad die Folge. Zudem ist es schwierig, strikt anaerobe Mikroorganismen technisch zu handhaben.
  • Verschiedene Mikroorganismen, die in Lage sind unter anaeroben Bedingungen Bernsteinsäure zu synthetisieren, sind bekannt. Die Literaturstelle US 5,143,834 beschreibt eine Variante von A. succiniciproducens. Es handelt sich dabei um einen obligat anaeroben Mikroorganismus, der nur moderate Mengen an Bernsteinsäure herstellen kann und zudem nicht in der Lage ist, hohe osmotische Drücke und Salzkonzentrationen zu tolerieren. Die Literaturstelle US 7,063,968 beschreibt ein mikrobielles Isolat aus Rinder-Pansen, Mannheimia sp. 55E, welches in der Lage ist, sowohl unter aeroben als auch anaeroben Bedingungen organische Säuren zu synthetisieren. Dabei handelt es sich allerdings nicht um eine spezifische Anreicherung von Bernsteinsäure, sondern um ein Gemisch aus verschiedenen organischen Säuren, wie Ameisensäure, Essigsäure, Milchsäure und Bernsteinsäure. Nachteil dieses Produzenten ist, dass eine ökonomische Verwendung des Stammes nur schwer möglich, wenn nicht unmöglich ist, da zur Gewinnung von Bernsteinsäure aufwendige Anreicherungs- und Aufreinigungsverfahren angewendet werden müssten. Die Literaturstelle US 5,869,301 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Dicarbonsäuren in einem zweistufigen Fermentationsprozesses mit E. coli AFP-111, wobei in einer ersten Phase mikrobielle Biomasse unter aeroben Bedingungen hergestellt und in einer zweiten Phase die Produktion von Bernsteinsäure anaerob durchgeführt wird. Die erste Phase der Biomassengewinnung ist in diesem Prozess limitiert, da die Glukose-Konzentration im Fed-Batch Prozess auf 1 g/L beschränkt sein muss, um eine Acetat-Anreicherung zu vermeiden, die sowohl den Biomassengewinnungsprozess, als auch die Bernsteinsäureproduktion stört. Somit ist die Biomassengewinnung mit diesem Prozess nur begrenzt möglich. Des weiteren unterliegt der Biosyntheseweg für die Bernsteinsäure in diesem Prozess einer starken Katabolit-Repression, da Gene der Glykolyse, des Zitronensäurezyklus und Glyoxylatweges durch Glukose stark reprimiert sind, wie aus der Literaturstelle DeRisi J. L., Iyer V. R., Brown P. O., Science. 278(5338): 680–686 (1997) bekannt. Das hat zur Folge, dass die Synthese von Bernsteinsäure in Gegenwart von Glukose weitestgehend reprimiert und damit stark begrenzt ist.
  • Technisches Problem der Erfindung
  • Der Erfindung liegt daher das technische Problem zu Grunde, ein Verfahren und einen Mikroorganismus zu dessen Durchführung anzugeben, welches es ermöglicht, Biomasse ohne Limitierungen im Fermentationsprozess zu gewinnen, eine Carbonsäure des Glyoxylatzyklus, insbesondere Bernsteinsäure, ohne Katabolit-Repression im Biosyntheseweg im Produktionsprozess herzustellen und eine möglichst geringe Nebenprodukt-Anreicherung während der Produktionsphase zu gewährleisten.
  • Grundzüge der Erfindung und bevorzugte Ausführungsformen
  • Zur Lösung dieses technischen Problems lehrt die Erfindung einen isolierten genetisch veränderten Mikroorganismus, wobei das Gen IDH1 sowie zumindest eines der Gene DIC1 und SDH2, oder beide dieser Gene, unter der Kontrolle eines ersten fremden Promotors steht, welcher durch einen Kultivierungszusatz zu einem Wachstumskulturmedium reprimiert wird und in Abwesenheit des Kultivierungszusatzes aktiv ist, sowie die Verwendung eines solchen Mikroorganismus in einem Verfahren zur Herstellung einer Carbonsäure des Glyoxylatzyklus, insbesondere einer Dicarbonsäure, beispielsweise Bernsteinsäure, mit den folgenden Verfahrensstufen: a) der Mikroorganismus wird in dem Wachstumskulturmedium kultiviert und vermehrt, b) anschließend wird der Mikroorganismus in ein Produktionskulturmedium transferiert, welches den den ersten Promotor reprimierenden Kultivierungszusatz enthält, oder es wird dem Wachstumskulturmedium der den ersten Promotor reprimierende Kultivierungszusatz zugegeben und (ggf. unter aeroben oder anaeroben Bedingungen) kultiviert, und c) anschließend an Stufe b) oder während der Stufe b) wird die Carbonsäure aus dem Kulturüberstand abgetrennt und optional aufgereinigt.
  • Mit dem erfindungsgemäßen Mikroorganismus bzw. Verfahren lassen sich des Weiteren durch geeignete Genrepressionen gezielt verschiedene Intermediate des Glyoxylat- bzw. Zitratzyklus als Endprodukte des Herstellungsverfahrens gewinnen. Wenn die Gene IDH1, SDH2 und DIC1 unter der Kontrolle des ersten fremden Promotors stehen, ist die entstehende Carbonsäure Bernsteinsäure (Succinat). Wenn die Gene SDH2 und DIC1 nicht unter der Kontrolle des ersten fremden Promotors stehen und die Gene IDH1, FUM1 und OSM1 unter der Kontrolle des ersten fremden Promotors stehen ist die enstehende Carbonsäure Fumarsäure (Fumarat). Wenn die Gene FUM1 und OSM1 nicht unter der Kontrolle des ersten fremden Promotors stehen und die Gene IDH1 und MDH3 unter der Kontrolle des ersten fremden Promotors stehen ist die entstehende Carbonsäure Apfelsäure (Malat). Wenn das Gen MDH3 nicht unter der Kontrolle des ersten fremden Promotors steht und die Gene IDH1 und CIT2 unter der Kontrolle des ersten fremden Promotors stehen, ist die entstehende Carbonsäure Oxalessigsäure (Oxalacetat).
  • Die Erfindung nutzt die folgenden Erkenntnisse und erreicht die folgenden Vorteile.
  • Während der Atmung der Zellen werden aus dem Zitratzyklus, in dem Bernsteinsäure ein Intermediat ist, Reduktionsäquivalente gewonnen, die zum Aufbau eines Potentials innerhalb des mitochondrialen Membransystems führen. Dieses Membranpotential dient dann im Verlauf der Atmungskette der Energiegewinnung in Form von ATP. Zudem wird Kohlenstoff über den Zitratzyklus in anabolischen Prozessen effizient in Biomasse umgewandelt. Diese Form der Energetisierung ist sehr effizient und führt zu einem optimalen Wachstum der Zellen. Sie ist allerdings nur möglich, solange der Zitratzyklus und die Atmungskette in der mitochondrialen Membran abläuft. Neben dem Zitratzyklus läuft in der Hefe Saccharomyces cerevisiae der Glyoxylat-Stoffwechselweg ab (siehe auch 1). Er stellt eine Art „Kurzschluss" des Zitrat-Zyklus dar, da dem Stoffwechselweg Isozitrat als Metabolit entzogen wird, und je ein Molekül Bernsteinsäure und Glyoxylat gebildet werden. Solange der Zitrat-Zyklus aktiv ist, fließen Bernsteinsäure und Glyoxylat wieder zurück in den Zitratzyklus, indem ein Molekül Acetyl-CoA (aus Ethanol oder Acetat) an Glyoxylat gebunden und daraus Malat gebildet wird. Der Glyoxylatzyklus ermöglicht es der Zelle, C2-Kohlenstoffquellen über Acetyl-CoA Kohlenstoff-verlustfrei in den Zitratzyklus einzuspeisen, da die beiden oxidativen Decarboxylierungsschritte von Isocitrat zu Succinyl-CoA umgangen werden.
  • Natürlicherweise ist der Glyoxylatzyklus, beispielsweise in einer Hefezelle, in Anwesenheit von Glukose transkriptionell stark reprimiert, was zur Folge hat, dass dieser Stoffwechselweg nicht aktiv ist. Erst wenn Glukose vollständig verbraucht ist und Ethanol im Kulturmedium angereichert wird, werden die beteiligten Gene transkriptionell dereprimiert. Diese Form der Regulation ist durch die biologische Bedeutung des Glyoxylat-Stoffwechselweges erklärt, nämlich der Wiederauffüllung bzw. Verstoffwechselung von C2-Kohlenstoffverbindungen, wie Ethanol oder Acetat, um den Kohlenstoffverlust durch Bildung dieser C2-Kohlenstoffverbindungen während des glykolytischen Abbaus zu kompensieren. Man findet den Biosyntheseweg insbesondere bei Pflanzen, Pilzen und Hefen.
  • Eine Anreicherung von Bernsteinsäure während der Atmungsphase (aeroben Phase) und somit der Phase, in welcher der Mikroorganismus Biomasse gewinnt, ist nicht sinnvoll, weil der Kohlenstoff für anabolische Prozesse vollständig gebraucht wird. Ist allerdings der Biomassenzuwachs in der stationären Phase durch Limitierung von Medienbestandteilen beendet, wird der Zitrat-Zyklus von der Zelle nicht mehr benötigt. Dieser Zeitpunkt kann genutzt werden, um eine gezielte Anreicherung von Bernsteinsäure durch die Kultur zu bewirken, indem der Kohlenstofffluss in den Glyoxylatzyklus und somit effizient in die Bernsteinsäuresysnthese umgelenkt wird.
  • Um diese metabolische Umlenkung des Kohlenstoffflusses zu erreichen, wird der Zitratzyklus nach den Intermediaten Isocitrat und Succinat unterbrochen, so dass der Kohlenstofffluss in den Glyoxylatzyklus umgeleitet wird, sowie die Weiterverstoffwechselung von Succinat unterbunden bzw. zu weiteren Intermediaten des Glyoxylatzyklus umgesteuert wird. Des Weiteren wird der Transport des Succinats aus dem Glyoxylatzyklus in das Mitochondrium unterbunden, so dass dieses dem im Mitochondrium lokalisierten Zitratzyklus nicht mehr zur Verfügung steht. Außerdem muss der natürliche regulatorische Mechanismus der Zelle überwunden werden, da für eine effiziente Kohlenstoffverwertung in Bernsteinsäure über den Glyoxylatweg, Glukose, welche natürlicherweise den Stoffwechselweg reprimiert, als Kohlenstoffquelle verwendet wird.
  • Für einen Prozess, bei dem zunächst in einer ersten Wachstumsphase Biomasse angereichert und in einer zweiten Phase effizient Bernsteinsäure produziert und in das Kulturmedium abgegeben werden soll, muss ein Mikroorganismus durch molekulargenetische Methoden so verändert werden, dass der Zitrat-Zyklus nach der Wachstumsphase unterbrochen und der Glyoxylatzyklus in Gegenwart von Glukose aktiviert wird, also dereprimiert ist. Ist ein solch modifizierter Mikroorganismus nicht mehr auf den Zuwachs von Biomasse angewiesen, kann der Kohlenstofffluss von Glukose hoch effizient in eine Carbonsäure bzw. Bernsteinsäure erfolgen. Die metabolische Situation in einem solchen Stamm ist in 2 dargestellt. Zum Vergleich ist in 1 die metabolische Situation eines wild-Typ Stammes dargestellt.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren, sowie der hierin einsetzbare erfindungsgemäße Mikroorganismus erfüllen diese Erfordernisse. Es handelt sich um einen gentechnisch veränderten oder durch genetische Mutation veränderten Mikroorganismus und ein dazugehöriges Fermentationsverfahren, bei dem zunächst während einer ersten Phase (Atmungsphase) ein optimaler Biomasse-Zuwachs des mikrobiellen Produzenten gewährleistet ist und anschließend, in einer zweiten Phase (Produktionsphase) die Anreicherung von Carbonsäuren, beispielsweise Bernsteinsäure, aus primären Kohlenstoff-Quellen (z. B. Glukose) und CO2 (anaplerotische Auffüllreaktion, CO2 Fixierung), angeschlossen wird. Während der Produktionsphase ist durch genetische Veränderung des Mikroorganismus der Zitratzyklus nach den Intermediaten Isocitrat und Succinat unterbrochen und der Transport des Succinats aus dem Glyoxylatzyklus unterbunden, wie vorstehend beschrieben. Außerdem ist während der Produktionsphase die Katabolit-Repression ausgeschaltet, was zur Folge hat, dass auch in Gegenwart von C6-Kohlenstoff-Molekülen die effiziente Biosynthese und Anreicherung von Carbonsäuren bzw. Bernsteinsäure im Kulturüberstand erfolgt. Die Steuerung der metabolischen Prozesse in den verschiedenen Verfahrensstufen erfolgt dabei durch Zugabe bzw. nicht-Zugabe oder Entzug des Kultivierungszusatzes, welcher den ersten Promotor reprimiert bzw. dessen Abwesenheit für die Aktivität des ersten Promotors notwendig ist.
  • Bevorzugt ist es daher auch, wenn der Kultivierungszusatz nicht Organismus-endogen ist. Dann kann eine sehr einfache Steuerung des ersten Promotors und somit der durch den Promotor regulierten Gene durch Zugabe des Kultivierungszusatzes zum Kulturmedium oder dessen nicht- Zugabe bzw. Abtrennung erfolgen. Bei dem Kultivierungszusatz kann es sich beispielsweise um ein Antibiotikum aus der Gruppe der Tetracycline, insbesondere Tetracyclin, handeln.
  • Der Promotor ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus "tetO2 und tetO7". Bei dem verwendeten Promotor handelt es sich insbesondere um den tetO7 Promotor, welcher mit einer weiteren Komponente, dem transkriptionellen Transaktivator (tTA) ein Promotorsystem bildet, welches in der Literaturstelle Gari E. et al., YEAST 13: 837-848 (1997) beschrieben ist. Unter Verwendung dieses Promotors wird dem Medium während der Wachstumsphase zur Biomasseanreicherung kein Kultivierungszusatz beigefügt und der respirative Metabolismus funktioniert normal. Wenn am Ende der Wachstumsphase der Kultivierungszusatz zugefüttert wird, ist der Promotor und damit die Genexpression reprimiert und der Kohlenstoff kann nicht mehr über den Zitrat-Zyklus verstoffwechselt werden und steht damit vollständig dem Glyoxylatweg und der effizienten Carbonsäuren- bzw. Bernsteinsäure-Produktion zur Verfügung.
  • Bevorzugterweise handelt es sich bei dem Mikroorganismus um eine Hefezelle, beispielsweise die Hefe Saccharomyces cerevisiae. Die Verwendung von Hefe für den Herstellprozess bietet gegenüber etablierten Verfahren folgende Vorteile: Hefe ist sehr tolerant gegenüber organischen Säuren und Ethanol, Hefe ist sehr osmotolerant, Hefe kann in relativ kurzer Zeit zu großen Mengen Biomasse kultiviert werden, Hefe besitzt einen Glyoxylat-Biosyntheseweg zur verlustfreien Nutzung von Kohlenstoff während der Biomassengewinnung und zur verlustfreien Nutzung von Kohlenstoff zur Carbonsäuren bzw. Bernsteinsäure-Produktion und Hefe lässt sich durch einfache, sehr gut etablierte genetische und gentechnische Werkzeuge in komplexer Weise molekularbiologisch verändern. Zudem ist Hefe ein robuster und bewährter Produktionsorganismus für industrielle Maßstäbe (siehe auch Herstellung von Bioethanol) und betreibt keine gemischte Säuregärung, wie beispielsweise E. coli oder A. Succinogenes. Neben den Carbonsäuren entstehen somit praktisch keinen weiteren Gärendprodukte neben Ethanol, das sich leicht abtrennen läßt.
  • Zur Verbesserung der Effizienz und Ausbeute wird es sich empfehlen, das wild-typ Gen IDH1, SDH 2 und/oder DIC1 zu deletieren oder inaktivieren, beispielsweise durch Austausch des nativen Promotors dieser Gene durch ein reprimierbares Promotorsystem. Dadurch ist gewährleistet, dass diese Gene in der Produktionsphase, Stufe b), nicht aktiv sind, was die Produktion von Carbonsäuren bzw. Bernsteinsäure aus den o. g. Gründen stören würde.
  • Weiterhin bevorzugt zur Ausbeuteverbesserung und Produktionssteigerung ist es, wenn eines oder mehrere verschiedene oder alle der Gene aus der Gruppe "PYC1, ACS1, CIT1, ACO1, ICL1, MLS1, MDH3 und CIT2" enthalten ist und unter der Kontrolle eines konstitutiv aktiven zweiten Promotors steht. Vorzugsweise handelt es sich hierbei um den ADH1-Promotor.
  • Ein erfindungsgemäßer Mikroorganismus ist zur Herstellung von Bernsteinsäure besonders gut geeignet.
  • Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es bevorzugt, wenn die Stufe a) bis zu einer Zelldichte von zumindest 100 g Biotrockenmasse/l, vorzugsweise zumindest 120 g/l, höchstvorzugsweise zumindest 140 g/l, durchgeführt wird. Die Stufe b) kann bis zu einer Carbonsäurekonzentration von zumindest 0,4 Mol/l, vorzugsweise zumindest 0,8 Mol/l, höchstvorzugsweise zumindest 1,0 Mol/l, durchgeführt werden. In Stufe a) kann ein pH im Bereich von 4 bis 9, vorzugsweise von 6 bis 8, und eine Salzkonzentration im Bereich von 0,01 bis 0,5 Mol/l, vorzugsweise von 0,05 bis 0,2 Mol/l, höchstvorzugsweise von 0,05 bis 0,1 Mol/l, eingestellt werden. In Stufe b) kann ein pH im Bereich von 4 bis 9, vorzugsweise von 6 bis 8, und eine Salzkonzentration im Bereich von 0,01 bis 0,5 Mol/l, vorzugsweise von 0,05 bis 0,2 Mol/l, höchstvorzugsweise von 0,05 bis 0,1 Mol/l, eingestellt werden. Die Stufe a) wird vorzugsweise bei einer Temperatur von 20 bis 35°C, vorzugsweise von 28 bis 30°C, und für eine Dauer von 1 bis 1000 h, vorzugsweise von 2 bis 500 h, höchstvorzugsweise 2 bis 200 h, durchgeführt. In Stufe b) ist eine Durchführung bei einer Temperatur von 15 bis 40°C, vorzugsweise von 20 bis 35°C, höchstvorzugsweise 28 bis 30°C, und für eine Dauer von 1 bis 1000 h, vorzugsweise von 2 bis 500 h, höchstvorzugsweise 2 bis 200 h, bevorzugt.
  • Als Kulturmedien für die Stufe a) kommt beispielsweise WMVIII-Medium (Lang C., Looman A. C., Appl Microbiol Biotechnol. 44(1–2): 147–156 (1995)) in Frage. Dabei liegt die Tetracyclin-Menge im Kulturmedium vorzugsweise unterhalb von 20 mg/l, bevorzugt unterhalb von 10 mg/l, höchstvorzugsweise unterhalb von 1 mg/l, bis hin zu Werten, die unterhalb der Nachweisgrenze liegen.
  • Als Kulturmedium für die Stufe b) kommt beispielsweise WMVIII-Medium in Frage, auch ist ein übliches Melasse-Medium einsetzbar. Dabei liegt die Tetracyclin-Menge bevorzugt oberhalb von 1 mg/l, höchstvorzugsweise oberhalb von 3 mg/l. Als Bereiche kommen beispielsweise 1 bis 3 mg/l oder 3 bis 15 mg/l in Frage.
  • Die Stufe c) kann anschließend an die Stufe b) durchgeführt werden. Dann wird der Kulturüberstand von den Mikroorganismen abgetrennt, beispielsweise durch Filtration oder Zentrifugation. Die Stufe c) kann aber auch während der Stufe b) durchgeführt werden, und zwar kontinuierlich oder diskontinuierlich. In letzterem Falle wird zumindest ein Teil des Kulturüberstandes entnommen und durch neues Kulturmedium ersetzt und dieser Vorgang ggf. mehrfach wiederholt. Aus dem entnommenen Kulturüberstand wird die Bernsteinsäure gewonnen. Eine kontinuierliche Abtrennung kann über geeignete Membranen oder durch Leiten eines Stromes des Kulturmediums über eine Vorrichtung zur Abtrennung der Bernsteinsäure erfolgen.
  • Die Erfindung betrifft schließlich ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Mikroorganismus, wobei in dem wild-typ Mikroorganismus oder in einem gentechnisch gegenüber dem wild-typ veränderten oder mutierten Ausgangsorganismus das wild-typ Gen IDH1, SDH2 und/oder DIC1 deletiert oder inaktiviert wird, und wobei dieses Gen bzw. diese Gene unter der Kontrolle eines ersten Promotors, welcher durch einen Kultivierungszusatz zu einem Wachstumskulturmedium reprimiert wird und in Abwesenheit des Kultivierungszusatzes aktiv ist. Dieser Promotor sowie der zum Tetracyclin-regulierten Promotorsystem gehörende tTA, wird in den Mikroorganismus eingeführt und der Mikroorganismus hiermit transformiert.
  • Dabei wird vorzugsweise eines oder mehrere verschiedene oder alle der Gene aus der Gruppe "PYC1, ACS1, CIT1, ACO1, ICL1, MLS1, MDH3 und CIT2" unter der Kontrolle eines konstitutiv aktiven zweiten Promotors in den Mikroorganismus eingeführt und der Mikroorganismus hiermit transformiert. Der erste Promotor kann insbesondere der tetO7-Promotor und der zweite Promotor der ADH1 Promotor sein.
  • Die im Rahmen der Erfindung verwendeten Gene und Promotoren bzw. deren Nukleinsäuresequenzen sind mit den folgenden Accession No. der NCBI Datenbank bzw. in den folgenden Literaturstellen beschrieben:
    IDH1: Z71313 Y13139
    SDH2: Z73146 Y13138
    DIC1: EF059331
    FUM1: NC001148
    OSM1: NC001142
    PYC1: Z72584 Y13135
    ACS1: AY723758
    CIT1: Z71616 Y13139
    ACO1: M33131
    ICL1: X65554
    MLS1: X64407 S50520
    MDH3: M98763
    CIT2: Z11113
    tetO und tTA: Gari E. et al., YEAST 13: 837–848 (1997)
    ADH1: Lang C., Looman A. C., Appl Microbiol Biotechnol. 44(1–2): 147–156 (1995)
  • Die Transformation von Hefezellen kann in fachüblicher Weise erfolgen und hierzu wird auf die Literaturstellen Schiestl R.H., et al., Curr Genet. Dec, 16(5–6): 339–346 (1989), oder Manivasakam P., et al., Nucleic Acids Res. Sep 11, 21(18): 4414–4415 (1993), oder Morgan R.J., Experientia Suppl., 46: 155–166 (1983) verwiesen.
  • Zur Transformation geeignete Vehikel, insbesondere Plasmide, sind beispielsweise aus den Literaturstellen Naumovski L., et al., J Bacteriol, 152(1): 323–331 (1982), Broach J. R., eta al., Gene, 8(1): 121–133 (1979), Sikorski R. S., et al., Genetics, 122(1) 19–27 (1989). Bei diesen vectoren handelt es sich um Yep24, Yepl3, pRS-Vektorserie, sowie um YCp19 oder pYEXBX.
  • Die Herstellung von im Rahmen der Erfindung geeigneten Expressionskassetten erfolgt typischerweise durch Fusion des Promotors mit der für das Gen kodierenden Nukleinsäuresequenz und gff. einem Terminator nach üblichen Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie beispielsweise in den Literaturstellen Maniatis T., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, USA, 1989, oder Sihlavy T. J., et al., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, USA, 1984, oder Ausubel F. M., et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience, 1987, beschrieben.
  • Im Folgenden wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.
  • Beispiel 1: Herstellung eines Mikroorganismus mit Tetracyclin-reguliertem Promotorsystem
  • Um eine Unterbrechung des Zitrat-Zyklus nach Beendigung des Biomassezuwachses zu erreichen, werden erfindungsgemäß drei Gene dieses Stoffwechselweges durch regulierbare Promotoren kontrolliert. Es handelt sich um das Gen IDH1, welches die erste Untereinheit der NAD-abhängigen Isozitrat-Dehydrogenase codiert und um das Gen SDH2, welches für eine Untereinheit der Succinat-Dehydrogenase codiert, sowie das Gen DIC1, welches für den mitochondrialen Dicarboxylat-Transporter kodiert. Eine Ausschaltung dieser Enzymaktivitäten hat zur Folge, dass Isozitrat, das Substrat des Glyoxylatzyklus, nicht mehr über den Zitrat-Zyklus in 2-Oxoglutarat umgewandelt wird und Bernsteinsäure nicht in Fumarat verstoffwechselt wird, sowie das Succinat aus dem Glyoxylatzyklus nicht mehr in das Mitochondrium transportiert und somit nicht mehr dem im Mitochondrium lokalisierten Zitratzyklus zugeführt wird. Der Zitrat-Zyklus ist somit unterbrochen. Die zu verwendenden Promotoren haben die wichtige Eigenschaft, während der Wachstumsphase aktiv zu sein, um ein Funktionieren des Zitrat-Zyklus zu ermöglichen und in der Produktionsphase durch Zugabe eines Repressors möglichst stark reprimiert zu sein. Diese Regulation wird, neben dem reprimierbaren tetO-Promotor, durch die zweite Komponente des Tetracyclin-regulierten Promotorsystems ermöglicht. Hierbei handelt es sich um den transkriptionellen Transaktivator (tTA), welcher ein Fusionsprotein aus einer Operatorbindungsdomäne und einer Aktivierungsdomäne darstellt. tTA bindet an den tetO-Promotor, was die Transkription des nachgeschalteten Gens zur Folge hat. Antibiotika aus der Gruppe der Tetracycline induzieren eine Konformationsänderung des tTA, was zu dessen Ablösung vom tetO-Promotor führt und dadurch die Transkription des nachgeschalteten Gens unterbunden wird. Um die Funktion des tetO-Promotors zu gewährleisten, ist also auch das Gen für den tTA in das Genom des entsprechenden Mikroorganismus zu integrieren. Dafür steht beispielsweise der LEU2-Locus zur Verfügung.
  • Isozitrat-Dehydrogenase, Succinat-Dehydrogenase und Dicarboxylat-Transporter werden während der Wachstumsphase unter der Kontrolle des durch Tetracyclin reprimierbaren tetO Promotors exprimiert. Während der Produktionsphase werden die Enzymaktivitäten reguliert ausgeschaltet. Saccharomyces cerevisiae wird so verändert, dass die natürlichen Promotoren der drei Zielgene durch den reprimierbarenbaren Promotor z. B. durch zielgerichtete Integration in das Hefegenom ausgetauscht werden.
  • Die Konstruktion des so erhaltenen Hefestammes S. cerevisiae GRFura3 tTA tetOprom-SDH2 und tetOprom-IDH1 und tetOprom-DIC1 ergibt sich aus der folgenden Tabelle 1. Tabelle 1
    Stamm Beschreibung
    GRFura3 leu2, ura3, his3
    GRFura3tTA tTA::Leu2, leu2, ura3, his3
    GRFura3tTArepr.SDH2 tetOprom::sdh2prom, leu2, his3, ura3
    GRFura3 tTA::Leu2, tetOprom::sdh2prom, tetOprom::idh1prom,
    repr.SDH2 tetOprom::dic1prom, leu2, his3, ura3
    repr.IDH1
    repr.DIC1
    =GRFura3tTArepr.SDH2
    repr.IDH1repr.DIC1
  • Beispiel 2: Mikroorganismus mit konstitutiv aktiver Bernsteinsäuresynthese
  • Da der Glyoxylatzyklus und andere Reaktionen auf dem Weg zur Bernsteinsäurebiosynthese natürlicherweise in der Hefezelle in Anwesenheit von Glukose transkriptionell stark reprimiert sind, mit der Folge, dass dieser Biosyntheseweg nicht aktiv ist, werden alle, oder eine Auswahl von Enzymen dieses Stoffwechselweges und die Pyruvat-Carboxylase, dem Enzym, welches für die anaplerotischen Auffüllreaktion (CO2 Fixierung) verantwortlich ist, während der Produktionsphase zur Biosynthese von Bernsteinsäure aus Glukose transkriptionell vorzugsweise dereguliert. Für die deregulierte Expression der Gene in der Hefe Saccharomyces cerevisiae wird der konstitutive ADH1 Promotor verwendet, der durch Modifizierung der natürlichen Sequenz über einen sehr langen Zeitraum zu einer konstitutiven, von Glukose und Ethanol unabhängigen, Expression führt (siehe Lang C., Looman A. C., Appl Microbiol Biotechnol. 44(1–2): 147–156. (1995)). Transkriptionell dereguliert werden die Gene PYC1, ACS1, CIT1, ACO1, ICL1, MLS1, MDH3 und CIT2. Zu diesem Zweck wird ein Expressionssystem verwendet, welches die gleichzeitige transkripionell deregulierte Expression von PYC1, ACS1, CIT1, ACO1, ICL1, MLS1, MDH3 und CIT2 ermöglicht. Die einzelnen Gene (PYC1, ACS1, CIT1, ACO1, ICL1, MLS1, MDH3 und CIT2) wurden aus chromosomaler Hefe-DNA des Stammes S. cerevisiae S288c mittels PCR amplifiziert und mit Restriktionslinkern versehen und anschließend einzeln in das Hefe Chromosom unter der Kontrolle des konstitutiven ADH1 Promotors integriert.
  • Die Konstruktion des so erhaltenen Hefestammes S. cerevisiae ergibt sich aus der Tabelle 2. Tabelle 2
    Stamm Beschreibung
    GRFura3tTa tTA::Leu2, tetOprom::sdh2prom, tetO7prom::idh1prom,
    repr.SDH2 tetOprom::dic1prom his3, ura3, leu2
    repr.IDH1
    repr.DIC1
    GRFura3tTA tTA::Leu2, tetOprom::sdh2prom, tetO7prom::idh1prom,
    repr.SDH2 tetO7prom::dic1prom, derPYC1::pyc1, his3, ura3, leu2
    repr.IDH1
    repr.DIC1
    der.PYC1
    GRFura3tTA tTA::Leu2, tetOprom::sdh2prom, tetOprom::idh1prom,
    repr.SDH2 tetOprom::dic1prom, der.PYC1::pyc1, der.ACS1::acs1, his3, ura3,
    repr.IDH1 leu2
    repr.DIC1
    der.PYC1
    der.ACS1
    GRFura3tTA tTA::Leu2, tetOprom::sdh2prom, tetOprom::idh1prom,
    repr.SDH2 tetOprom::dic1prom, der.PYC1::pyc1, der.ACS1::acs1,
    repr.IDH1 der.CITI::cit1, his3, ura3, leu2
    repr.DIC1
    der.PYC1
    der.ACS1
    der.CIT1
    GRFura3tTA tTA::Leu2, tetOprom::sdh2prom, tetOprom::idh1prom,
    repr.SDH2 tetOprom::dic1prom, der.PYC1::pyc1, derACS1::acs1,
    repr.IDH1 der.CIT1::cit1, der.ACO1::aco1, his3, ura3, leu2
    repr.DIC1
    der.PYC1
    der.ACS1
    der.CIT1
    der.ACO1
    GRFura3tTA tTA::Leu2, tetOprom::sdh2prom, tetOprom::idh1prom,
    repr.SDH2 tetOprom::dic1prom, der.PYC1::pyc1, derACS1::acs1,
    repr.IDH1 derCIT1::cit1, der.ACO1::aco1, der.ICL1::icl1, his3, ura3, leu2
    repr.DIC1
    der.PYC1
    der.ACS1
    der.CIT1
    der.ACO1
    der.ICL1
    GRFura3tTA tTA::Leu2, tetOprom::sdh2prom, tetOprom::idh1prom,
    repr.SDH2 tetOprom::dic1prom, der.PYC1::pyc1, der.ACS1::acs1,
    repr.IDH1 der.CIT1::cit1, der.ACO1::aco1, der.ICL1::icl1, der.MLS1::mls1,
    repr.DIC1 his3, ura3, leu2
    der.PVC1
    der.ACS1
    der.CIT1
    der.ACO1
    der.ICL1
    der.MLS1
    GRFura3tTA tTA::Leu2, tetOprom::sdh2prom, tetOprom::idh1prom,
    repr.SDH2 tetOprom::dic1prom, der.PYC1::pyc1, der.ACS1::acs1,
    repr.IDH1 der.CIT1::cit1, der.ACO1::aco1, der.ICL1::icl1, der.MLS1::mls1,
    reprq.DIC1 der.MDH3::mdh3, his3, ura3, leu2
    der.PYC1
    der.ACS1
    der.CIT1
    der.ACO1
    der.ICL1
    der.MLS1
    der.MDH3
    GRFura3tTA tTA::Leu2, tetOprom::sdh2prom, tetOprom::idh1prom,
    repr.SDH2 tetOprom::dic1prom, der.PYC1::pyc1, der.ACS1::acs1,
    repr.IDH1 der.CIT1::cit1, der.ACO1::aco1, der.ICL1::icl1, der.MLS1::mls1,
    repr.DIC1 der.MDH3::mdh3, der.CIT2::cit2, his3, ura3, leu2
    der.PVC1
    der.ACS1
    der.CIT1
    der.ACO1
    der.ICL1
    der.MLS1
    der.MDH3
    der.CIT2
  • Beispiel 3: Expression des transkriptionellen Transaktivators unter der Kontrolle des CMV-Promotors am Locus LEU2 in S. cerevisiae GRFura3.
  • Die kodierende Nukleinsäuresequenz für die tTA-Expressionskassette wurde durch PCR unter Verwendung von Standardmethoden amplifiziert, so dass das resultierende Fragment aus folgenden Komponenten besteht: loxP-kanMX-loxP-CMVprom.-tTA (YEAST 20: 1255–1262, 2003). Als Primer wurden Oligonukleotid-Sequenzen ausgewählt, die an den 5' und 3' Überhängen je die 5' oder die 3' Sequenz des LEU2-Gens enthalten und im annealenden Bereich die Sequenzen 5' der loxP-Region und 3' des tTA-Gens. So ist gewährleistet, dass einerseits das gesamte Fragment inklusive KanR und tTA amplifiziert werden und anderseits dieses Fragment anschließend in Hefe transformiert werden kann und durch homologe Rekombination dieses gesamte Fragment in den LEU2-Genlocus der Hefe integriert.
  • Als Selektionsmarker dient die Resistenz gegen G418. Der resultierende Stamm S. cerevisiae GRFura3 tTA enthält eine Kopie des Genes tTA unter der Kontrolle des CMV-Promotors. Um die Resistenz gegen G418 anschließend wieder zu entfernen, wird der entstandene Hefestamm mit dem cre Rekombinase Vektor pSH47 (Guldener U, Heck S, Fielder T, Beinhauer J, Hegemann JH. (1996) A new efficient gene disruption cassette for repeated use in budding yeast. Nucleic Acids Res. Jul 1;24(13): 2519–24.) transformiert. Durch diesen Vektor wird die cre Rekombinase in der Hefe exprimiert, was zur Folge hat, dass der Sequenz-Bereich innerhalb der beiden loxP-Sequenzen heraus rekombiniert. Dies hat zur Folge, dass lediglich eine der beiden loxP-Sequenzen und die CMVprom.-tTA Kassete in dem ursprünglichen LEU2-Genlocus enthalten bleibt. Die Folge ist, das der Hefestamm die G418-Resistenz wieder verliert und damit geeignet ist, weitere Gene mittels dieses crelox Systems in den Hefestamm zu integrieren bzw. zu entfernen. Der Vektor pSH47 kann daraufhin durch eine Gegenselektion auf YNB-Agarplatten supplimentiert mit Uracil (20 mg/L) und FOA (5-Fluoroorotic acid) (1 g/L) wieder entfernt werden. Dazu müssen die Zellen, die dieses Plasmid tragen, zunächst unter nicht selektiven Bedingungen kultiviert werden und anschließend auf FOAhaltigen Selektivplatten angezogen werden. Unter diesen Bedingungen können lediglich Zellen wachsen, die nicht in der Lage sind, Uracil selbst zu synthetisieren. Dies sind in diesem Fall Zellen, die kein Plasmid (pSH47) mehr enthalten.
  • Beispiel 4: Expression von SDH2 unter der Kontrolle des Tetracyclin-regulierbaren tetO7-Promotors in S. cerevisise GRFura3.
  • Die kodierende Nukleinsäuresequenz für die tetO7-Promotorkassette wurde durch PCR unter Verwendung von Standardmethoden amplifiziert, so dass das resultierende Fragment aus folgenden Komponenten besteht: loxP-kanMX-loxP-ADH1term.-tetO7operator-CYC1prom (YEAST 13: 837–848 (1997); Nucleic Acid Research 24(13): 1519–2524 (1996)). Als Primer wurden Oligonukleotid-Sequenzen ausgewählt, die an den 5' und 3' Überhängen je die 5' oder die 3' Sequenz des nativen Promotors des SDH2-Gens enthalten und im annealenden Bereich die Sequenzen 5' der loxP-Region und 3' des CYC1prom. So ist gewährleistet, dass einerseits das gesamte Fragment inklusive KanR und tetO7-Promotor amplifiziert werden und anderseits dieses Fragment anschließend in Hefe transformiert werden kann und durch homologe Rekombination dieses gesamte Fragment in den SDH2-Genlocus der Hefe, vor den codierenden Bereich des Gens SDH2, integriert.
  • Als Selektionsmarker dient die Resistenz gegen G418. Der resultierende Stamm S. cerevisiae GRFura3 repr.SDH2 enthält eine Kopie des Genes SDH2 unter der Kontrolle des Tetracyclin-regulierten tetO7-Promotors und des nativen SDH2-Terminators. Um die Resistenz gegen G418 anschließend wieder zu entfernen, wird der entstandene Hefestamm mit dem cre Rekombinase Vektor pSH47 (Guldener U, Heck S, Fielder T, Beinhauer J, Hegemann JH. (1996) A new efficient gene disruption cassette for repeated use in budding yeast. Nucleic Acids Res. Jul 1;24(13): 2519–24.) transformiert. Durch diesen Vektor wird die cre Rekombinase in der Hefe exprimiert, was zur Folge hat, dass der Sequenz-Bereich innerhalb der beiden loxP- Sequenzen heraus rekombiniert. Dies hat zur Folge, dass lediglich eine der beiden loxP-Sequenzen und die tetO7-Promotorkassete vor der codierenden Sequenz des Gens SDH2 enthalten bleibt. Die Folge ist, das der Hefestamm die G418-Resistenz wieder verliert und damit geeignet ist, weitere Gene mittels dieses cre-lox Systems in den Hefestamm zu integrieren bzw. zu entfernen. Der Vektor pSH47 kann daraufhin durch eine Gegenselektion auf YNB-Agarplatten supplimentiert mit Uracil (20 mg/L) und FOA (5-Fluoroorotic acid) (1 g/L) wieder entfernt werden. Dazu müssen die Zellen, die dieses Plasmid tragen, zunächst unter nicht selektiven Bedingungen kultiviert werden und anschließend auf FOA-haltigen Selektivplatten angezogen werden. Unter diesen Bedingungen können lediglich Zellen wachsen, die nicht in der Lage sind, Uracil selbst zu synthetisieren. Dies sind in diesem Fall Zellen, die kein Plasmid (pSH47) mehr enthalten.
  • Beispiel 5: Expression von IDH1 unter der Kontrolle des Tetracyclin-regulierbaren tetO7-Promotors in S. cerevisiae GRFura3.
  • Die kodierende Nukleinsäuresequenz für die tetO7-Promotorkassette wurde durch PCR unter Verwendung von Standardmethoden amplifiziert, so dass das resultierende Fragment aus folgenden Komponenten besteht: loxP-kanMX-loxP-ADH1term.-tetO7operator-CYC1prom (YEAST 13: 837–848 (997); Nucleic Acid Research 24(13): 1519–2524 (1996)). Als Primer wurden Oligonukleotid-Sequenzen ausgewählt, die an den 5' und 3' Überhängen je die 5' oder die 3' Sequenz des nativen Promotors des IDH1-Gens enthalten und im annealenden Bereich die Sequenzen 5' der loxP-Region und 3' des CYC1prom. So ist gewährleistet, dass einerseits das gesamte Fragment inklusive KanR und tetO7-Promotor amplifiziert werden und anderseits dieses Fragment anschließend in Hefe transformiert werden kann und durch homologe Rekombination dieses gesamte Fragment in den IDH1-Genlocus der Hefe, vor den codierenden Bereich des Gens IDH1, integriert.
  • Als Selektionsmarker dient die Resistenz gegen G418. Der resultierende Stamm S. cerevisiae GRFura3 repr.IDH1 enthält eine Kopie des Genes IDH1 unter der Kontrolle des Tetracyclin-regulierten tetO7-Promotors und des nativen IDH1-Terminators. Um die Resistenz gegen G418 anschließend wieder zu entfernen, wird der entstandene Hefestamm mit dem cre Rekombinase Vektor pSH47 (Guldener U, Heck S, Fielder T, Beinhauer J, Hegemann JH. (1996) A new efficient gene disruption cassette for repeated use in budding yeast. Nucleic Acids Res. Jul 1;24(13): 2519–24.) transformiert. Durch diesen Vektor wird die cre Rekombinase in der Hefe exprimiert, was zur Folge hat, dass der Sequenz-Bereich innerhalb der beiden loxP-Sequenzen heraus rekombiniert. Dies hat zur Folge, dass lediglich eine der beiden loxP-Sequenzen und die tetO7-Promotorkassete vor der codierenden Sequenz des Gens IDH1 enthalten bleibt. Die Folge ist, das der Hefestamm die G418-Resistenz wieder verliert und damit geeignet ist, weitere Gene mittels dieses cre-lox Systems in den Hefestamm zu integrieren bzw. zu entfernen. Der Vektor pSH47 kann daraufhin durch eine Gegenselektion auf YNB- Agarplatten supplimentiert mit Uracil (20 mg/L) und FOA (5-Fluoroorotic acid) (1 g/L) wieder entfernt werden. Dazu müssen die Zellen, die dieses Plasmid tragen, zunächst unter nicht selektiven Bedingungen kultiviert werden und anschließend auf FOA-haltigen Selektivplatten angezogen werden. Unter diesen Bedingungen können lediglich Zellen wachsen, die nicht in der Lage sind, Uracil selbst zu synthetisieren. Dies sind in diesem Fall Zellen, die kein Plasmid (pSH47) mehr enthalten.
  • Beispiel 6: Expression von DIC1 unter der Kontrolle des Tetracyclin-regulierbaren tetO7-Promotors in S. cerevisiae GRFura3.
  • Die kodierende Nukleinsäuresequenz für die tetO7-Promotorkassette wurde durch PCR unter Verwendung von Standardmethoden amplifiziert, so dass das resultierende Fragment aus folgenden Komponenten besteht: loxP-kanMX-loxP-ADH1term.-tetO₇operator-CYC1prom (YEAST 13: 837–848 (997); Nucleic Acid Research 24(13): 1519-2524 (1996)). Als Primer wurden Oligonukleotid-Sequenzen ausgewählt, die an den 5' und 3' Überhängen je die 5' oder die 3' Sequenz des nativen Promotors des DIC1-Gens enthalten und im annealenden Bereich die Sequenzen 5' der loxP-Region und 3' des CYC1prom. So ist gewährleistet, dass einerseits das gesamte Fragment inklusive KanR und tetO7-Promotor amplifiziert werden und anderseits dieses Fragment anschließend in Hefe transformiert werden kann und durch homologe Rekombination dieses gesamte Fragment in den DIC1-Genlocus der Hefe, vor den codierenden Bereich des Gens DIC1, integriert.
  • Als Selektionsmarker dient die Resistenz gegen G418. Der resultierende Stamm S. cerevisiae GRFura3 repr.DIC1 enthält eine Kopie des Genes DIC1 unter der Kontrolle des Tetracyclin-regulierten tetO7-Promotors und des nativen DIC1-Terminators. Um die Resistenz gegen G418 anschließend wieder zu entfernen, wird der entstandene Hefestamm mit dem cre Rekombinase Vektor pSH47 (Guldener U, Heck S, Fielder T, Beinhauer J, Hegemann JH. (1996) A new efficient gene disruption cassette for repeated use in budding yeast. Nucleic Acids Res. Jul 1;24(13): 2519–24.) transformiert. Durch diesen Vektor wird die cre Rekombinase in der Hefe exprimiert, was zur Folge hat, dass der Sequenz-Bereich innerhalb der beiden loxP-Sequenzen heraus rekombiniert. Dies hat zur Folge, dass lediglich eine der beiden loxP-Sequenzen und die tetO7-Promotorkassete vor der codierenden Sequenz des Gens IDH1 enthalten bleibt. Die Folge ist, das der Hefestamm die G418-Resistenz wieder verliert und damit geeignet ist, weitere Gene mittels dieses cre-lox Systems in den Hefestamm zu integrieren bzw. zu entfernen. Der Vektor pSH47 kann daraufhin durch eine Gegenselektion auf YNB-Agarplatten supplimentiert mit Uracil (20 mg/L) und FOA (5-Fluoroorotic acid) (1 g/L) wieder entfernt werden. Dazu müssen die Zellen, die dieses Plasmid tragen, zunächst unter nicht selektiven Bedingungen kultiviert werden und anschließend auf FOA-haltigen Selektivplatten angezogen werden. Unter diesen Bedingungen können lediglich Zellen wachsen, die nicht in der Lage sind, Uracil selbst zu synthetisieren. Dies sind in diesem Fall Zellen, die kein Plasmid (PSH47) mehr enthalten.
  • Beispiel 7: Expression von PYC1, ACS1, CIT1, ACO1, CIT2, ICL1, MLS1 und MDH3 unter der Kontrolle des konstitutive ADH1-Promotors in S. cerevisiae GRFura3tTArepr.SDH2repr.IDH1repr.DIC1.
  • Nachfolgende Beschreibung gilt für die sequenzielle Durchführung der Integration von transkripionell deregulierten Genen für die aufgeführten Gene nach gleichem Ablaufschema.
  • Die kodierenden Nukleinsäuresequenz für die Expressionskassette aus ADH1prom – PYC1 (ACS1, CIT1, ACO1, CIT2, ICL1, MLS1, MDH3) – TRP1term. wurde durch PCR unter Verwendung von Standardmethoden aus dem Vektor pFlat-PYC1 (ACS1, CIT1, ACO1, CIT2, ICL1, MLS1, MDH3) amplifiziert. Das erhaltene DNA-Fragment wurde nach einer Klenow-Behandlung in den Vekor pUG6 in die EcoRV-Schnittstelle Blunt-end einkloniert und ergab den Vektor pUG6-PYC1 (ACS1, CIT1, ACO1, CIT2, ICL1, MLS1, MDH3). Nach Plasmidisolation wurde ein erweitertes Fragment aus dem Vektor pUG6-PYC1 (ACS1, CIT1, ACO1, CIT2, ICL1, MLS1, MDH3) mittels PCR amplifiziert, so dass das resultierende Fragment aus folgenden Komponenten besteht: loxP-kanMX-loxP-ADHlprom- PYC1 (ACS1, CIT1, ACO1, CIT2, ICL1, MSL1, MDH3)-Tryptophan-Terminator. Als Primer wurden Oligonukleotid-Sequenzen ausgewählt, die an den 5' und 3' Überhängen je die 5' oder die 3' Sequenz des PYC1 (ACS1, CIT1, ACO1, CIT2, ICL1, MLS1, MDH3) -Gens enthalten und im annealenden Bereich die Sequenzen 5' der loxP-Regionen und 3' des Tryptophan-Terminators. So ist gewährleistet, dass einerseits das gesamte Fragment inklusive KanR und PYC1 (ACS1, CIT1, ACO1, CIT2, ICL1, MLS1, MDH3) amplifiziert werden und anderseits dieses Fragment anschließend in Hefe transformiert werden kann und durch homologe Rekombination dieses gesamte Fragment entsprechend in den PYC1 (ACS1, CIT1, ACO1, CIT2, ICL1, MSL1, MDH3)-Genlocus der Hefe integriert.
  • Als Selektionsmarker dient jeweils die Resistenz gegen G418. Der final resultierende Stamm S. cerevisiae GRFura3tTArepr.SDH2repr.IDH1repr.DIC1dereg.PYC1ACS1CIT1ACO 1ICL1MLS1MDH3CIT2 enthält je eine Kopie der Gene SDH2, IDH1 und DIC1 unter der Kontrolle des tetO7-Promotors und der nativen Terminatoren und je eine Kopie der Gene PYC1, CIT1, ACS1, ACO1, ICL1, MLS1, MDH3 und CIT2 unter der Kontrolle des konstitutiven ADH1 Promotors und des TRP1 Terminators. Um die Resistenz gegen G418 anschließend jeweils wieder zu entfernen, wird der jeweils entstandene Hefestamm mit dem cre Rekombinase Vektor pSH47 (Guldener U, Heck S, Fielder T, Beinhauer J, Hegemann JH. (1996) A new efficient gene disruption cassette for repeated use in budding yeast. Nucleic Acids Res. Jul 1;24(13): 2519–24.) transformiert. Durch diesen Vektor wird die cre Rekombinase in der Hefe exprimiert, was zur Folge hat, dass der Sequenz-Bereich innerhalb der beiden loxP-Sequenzen heraus rekombiniert. Dies hat zur Folge, dass lediglich eine der beiden loxP-Sequenzen und die jeweilige Expressions-Kassette in dem ursprünglichen entsprechenden Genlocus enthalten bleibt. Die Folge ist, das der Hefestamm die G418-Resistenz wieder verliert und damit geeignet ist, weitere Gene mittels dieses cre-lox Systems in den Hefestamm zu integrieren bzw. zu entfernen. Der Vektor pSH47 kann daraufhin durch eine Gegenselektion auf YNB-Agarplatten supplimentiert mit Uracil (20 mg/L) und FOA (5-Fluoroorotic acid) (1 g/L) wieder entfernt werden. Dazu müssen die Zellen, die dieses Plasmid tragen, zunächst unter nicht selektivien Bedingungen kultiviert werden und anschließend auf FOA-haltigen Selektivplatten angezogen werden. Unter diesen Bedingungen können lediglich Zellen wachsen, die nicht in der Lage sind, Uracil selbst zu synthetisieren. Dies sind in diesem Fall Zellen, die kein Plasmid (pSH47) mehr enthalten.
  • Beispiel 8: Bestimmung des Bernsteinsäuregehaltes in Hefekulturen des vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Hefestammes im Vergleich zum entsprechenden Kontroll-Stamm S. cerevisiae GRFura3
  • Der vorstehend beschrieben erfindungsgemäße Hefestamm und S. cerevisiae GRFura3 werden jeweils für 48 Stunden in WMVIII-Medium (Lang und Lomann, 1995) bei 28°C und 160 rpm in einem 20 ml Kulturvolumen kultiviert. Anschließend werden 500 μl dieser Vorkultur in eine 50 ml Hauptkultur des gleichen Mediums überführt und jeweils für 2 Tage bei 28°C und 160 rpm in einem Schikanekolben kultiviert. Nach Gewinnung des zellfreien Kulturüberstandes werden der Gehalt an Bernsteinsäure, Essigsäure und Ethanol mittels HPCL Analyse bestimmt. Es ergeben sich bei dem erfindungsgemäßen Hefestamm stark erhöhte Bernsteinsäurekonzentrationen, verglichen mit dem Vergleichsstamm.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Claims (18)

  1. Isolierter genetisch veränderter Mikroorganismus, wobei das Gen IDH1 sowie zumindest eines der Gene DIC1 und SDH2, oder beide dieser Gene, unter der Kontrolle eines ersten fremden Promotors steht, welcher durch einen Kultivierungszusatz zu einem Wachstumskulturmedium reprimiert wird und in Abwesenheit des Kultivierungszusatzes aktiv ist.
  2. Isolierter Mikroorganismus nach Anspruch 1, wobei zusätzlich zumindest eines oder mehrere der Gene FUM1, OSM1, MDH3 und CIT2 unter der Kontrolle des ersten fremden Promotors steht.
  3. Mikroorganismus nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Kultivierungszusatz nicht Organismus-endogen, vorzugsweise ein Antibiotikum aus der Gruppe der Tetracycline, insbesondere Tetracyclin, ist.
  4. Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Promotor ausgewählt ist aus der Gruppe der Tetracyclin-regulierten tetO-Promotoren.
  5. Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Mikroorganismus eine Hefezelle ist.
  6. Mikroorganismus nach Anspruch 5, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus "Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces, Saccharomycecopsis, Saccharomycodes, Schizosaccharomyces, Wickerhamia, Debayomyces, Hansenula, Hanseniaspora, Pichia, Kloeckera, Candida, Zygosaccharomyces, Ogataea, Kuraishia, Komagataella, Yarrowia, Metschnikowia, Williopsis, Nakazawaea, Kluyveromyces, Cryptococcus, Torulaspora, Bullera, Rhodotorula, Willopsis, Kloeckera und Sporobolomyces".
  7. Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das wild-typ Gen IDH1 und zumindest eines der Gene SDH2 und DIC2 deletiert oder inaktiviert, beispielsweise durch Deletion des nativen Promotors dieser Gene oder des kodierenden Bereichs dieser Gene, ist.
  8. Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei eines oder mehrere verschiedene oder alle der Gene aus der Gruppe "PYC1, ACS1, CIT1, ACO1, ICL1, MLS1 und CIT2, optional auch MDH3" enthalten ist und unter der Kontrolle eines konstitutiv aktiven zweiten Promotors, vorzugsweise des ADH1-Promotors, steht.
  9. Verwendung eines Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Herstellung von Bernsteinsäure.
  10. Verwendung eines Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 1 bis 8 in einem Verfahren zur Herstellung von einer Carbonsäure des Glyoxylat- und/oder Zitrat-Zyklus mit den folgenden Verfahrensstufen: a) der Mikroorganismus wird in dem Wachstumskulturmedium unter aeroben Bedingungen kultiviert und vermehrt, b) anschließend wird der Mikroorganismus entweder in ein Produktionskulturmedium transferiert, welches den den ersten Promotor reprimierenden Kultivierungszusatz enthält, oder es wird dem Wachstumskulturmedium der den ersten Promotor reprimierenden Kultivierungszusatz zugegeben und unter optional anaeroben Bedingungen kultiviert und c) anschließend an Stufe b) oder während der Stufe b) wird die Carbonsäure aus dem Kulturüberstand abgetrennt und optional aufgereinigt.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Gene IDH1, SDH2 und DIC1 unter der Kontrolle des ersten fremden Promotors stehen und die entstehende Carbonsäure Bernsteinsäure ist, oder wobei die Gene SDH2 und DIC1 nicht unter der Kontrolle des ersten fremden Promotors stehen, wobei die Gene IDH1, FUM1 und OSM1 unter der Kontrolle des ersten fremden Promotors stehen und wobei die Carbonsäure Fumarsäure ist, oder wobei die Gene FUM1 und OSM1 nicht unter der Kontrolle des ersten fremden Promotors stehen, wobei die Gene IDH1 und MDH3 unter der Kontrolle des ersten fremden Promotors stehen und wobei die Carbonsäure Apfelsäure ist, oder wobei das Gen MDH3 nicht unter der Kontrolle des ersten fremden Promotors steht, wobei die Gene IDH1 und CIT2 unter der Kontrolle des ersten fremden Promotors stehen und wobei die Carbonsäure Oxalessigsäure ist.
  12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, wobei die Stufe a) bis zu einer Zelldichte von zumindest 100 g Biotrockenmasse/l, vorzugsweise zumindest 120 g Biotrockenmasse/l, höchstvorzugsweise zumindest 140 g Biotrockenmasse/l, durchgeführt wird.
  13. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, wobei die Stufe b) bis zu einer Carbonsäurekonzentration von zumindest 0,4 Mol/l, vorzugsweise zumindest 0,8 Mol/l, höchstvorzugsweise zumindest 1,0 Mol/l, durchgeführt wird.
  14. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 13, wobei die Stufe a) bei einer Temperatur von 20 bis 35°C, vorzugsweise von 28 bis 30°C, und für eine Dauer von 1 bis 1000 h, vorzugsweise von 2 bis 500 h, höchstvorzugsweise 2 bis 200 h, durchgeführt wird.
  15. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 14, wobei die Stufe b) bei einer Temperatur von 15 bis 40°C, vorzugsweise von 20 bis 35°C, und für eine Dauer von 1 bis 1000 h, vorzugsweise von 2 bis 500 h, höchstvorzugsweise 2 bis 200 h, durchgeführt wird.
  16. Verfahren zur Herstellung eines Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei in dem wild-Typ Mikroorganismus oder in einem gentechnisch gegenüber dem wild-Typ veränderten oder mutierten Ausgangsorganismus das wild-Typ Gen IDH1 sowie zumindest eines der Gene SDH2 und DIC1, oder beide dieser Gene, deletiert oder inaktiviert wird, und wobei das Gen IDH1 sowie zumindest eines der Gene SDH2 und DIC1, oder beide dieser Gene, unter der Kontrolle eines ersten Promotors, welcher durch einen Kultivierungszusatz zu einem Wachstumskulturmedium reprimiert wird und in Abwesenheit des Kultivierungszusatzes aktiv ist, in den Mikroorganismus eingeführt und der Mikroorganismus hiermit transformiert wird.
  17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei eines oder mehrere verschiedene oder alle der Gene aus der Gruppe "PYC1, ACS1, CIT1, ACO1, ICL1, MLS1 und CIT2, optional auch MDH3" unter der Kontrolle eines konstitutiv aktiven zweiten Promotors in den Mikroorganismus eingeführt und der Mikroorganismus hiermit transformiert wird.
  18. Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, wobei der erste Promotor ein tetO-Promotor und der zweite Promotor der ADH1 Promotor ist.
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