CN101720357B - 用于生产琥珀酸的微生物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分离的遗传修饰的微生物，其中基因SDH2和DIC1的至少一种以及基因IDH1在第一启动子的控制下，其中所述第一启动子通过培养添加剂被阻遏于生长培养基，在缺乏所述培养添加剂时所述启动子是有活性的。作为包含“PYC1、ACS1、CIT1、ACO1、ICL1、MLS1和CIT2，以及任选地还有MDH3”的组的一部分的基因是组成性活性的。本发明还涉及这类微生物的应用，尤其是用于生产琥珀酸。

Description

用于生产琥珀酸的微生物
技术领域
本发明涉及包含基因SDH2和/或DIC1的至少一种以及基因IDH1的微生物，涉及这样的微生物的应用以及涉及用于其生产的方法。
背景技术
二羧酸具有高度的经济潜力，因为它们可以被用作许多化学制品的前体物质。例如，琥珀酸用作用于基于1，4-丁二醇、四氢呋喃和γ-丁内酯的塑料生产的初始阶段。今天，琥珀酸通过马来酸酐催化水合为琥珀酸酐并随后水加成或通过马来酸的直接催化水合而化学生产。
琥珀酸也通过许多微生物在生理环境条件下从糖或氨基酸形成。在厌氧条件下，除了琥珀酸外，通常形成进一步发酵终产物如乙醇、乳酸、乙酸和蚁酸，。具有其高氧含量的琥珀酸的生物合成需要CO2的还原固定(reduktive CO2-Fixierung)。
琥珀酸是代谢物，其通常通过厌氧发酵过程富集。而厌氧条件下所述产物的产率和富集是需氧条件下的几倍，完全厌氧过程的缺点是生物量(biomassen)生产的技术限制和微生物生产者的低生产力。因此，结果是较低的生物量/产物效率。此外，难以严格地技术处理厌氧微生物。
能够在厌氧条件下合成琥珀酸的多种微生物在本领域是已知的。文件US 5,143,834描述了产琥珀酸厌氧螺菌(A.succiniciproducens)的变异体。这是专性的厌氧微生物，其仅可以产生中等量的琥珀酸，此外不能耐受高渗透压和盐浓度。文件US 7,063,968描述了微生物瘤胃分离物，曼海姆菌(Mannheimia sp.)55E，其能够在需氧和厌氧条件下合成有机酸。然而，这不是琥珀酸的特异性富集，而是不同有机酸的混合物，如蚁酸、乙酸、乳酸、和琥珀酸。这种生产者的缺点是所述菌株的经济应用即使不是不可能，也仅仅是很难实现的，因为为了获得琥珀酸，不得不采用昂贵的富集和纯化方法。文件US 5,869,301描述了用于在两步发酵过程中利用大肠杆菌(E.coli)AFP-111生产二羧酸的方法，其中在第一阶段微生物的生物量在需氧条件下产生，在第二阶段，琥珀酸的生产以厌氧方式进行。生物量产生的第一阶段被限制在这个过程中，因为，在分批供料过程中葡萄糖浓度必须被限制为1g/L，以便避免扰乱生物量生产过程和琥珀酸生产的乙酸盐的富集。因此，通过这个过程的产生生物量的可能性非常小。此外，在这个过程中琥珀酸的生物合成途径受到强烈的代谢物阻遏，因为糖酵解、柠檬酸循环和乙醛酸途径的基因被葡萄糖强烈地阻遏，这可以从文件DeRisi J.L.，Iyer V.R.，Brown P.O.，Science 278(5338)：680-686(1997)获知。结果是在存在葡萄糖时琥珀酸的合成被很大程度地阻遏并由此受到强烈受限。
根据文件US 6,190,914的微生物是本领域已知的，其中通过合适的转录因子和激酶的调变(modulation)，多种基因的葡萄糖阻遏被减少。但在其中无法获取通过这样的微生物生产有机酸，特别是以及进一步获取用于生产针对有机酸而被优化的微生物。
发明目的
因此本发明的技术目的是详细说明一种方法和用于实施后者的微生物，其允许在发酵过程中没有限制地生产生物量，产生乙醛酸循环的羧酸，尤其是琥珀酸，而在生产过程中没有生物合成途径中的代谢物阻遏，以及确保在所述生产阶段期间尽可能低的副产品富集。
发明基础和优选的实施方式
为了实现这个技术目的，本发明教导了分离的遗传修饰的微生物，其中基因DIC1和SDH2的至少一种或二者以及基因IDH1在第一外源启动子的控制下，所述第一外源启动子通过培养添加剂被阻遏于生长培养基，在缺乏所述培养添加剂时所述启动子是有活性的，以及这样的微生物在用于产生乙醛酸循环的羧酸(尤其是二羧酸，例如琥珀酸)的方法中的应用，所述方法包括下面的步骤：a)所述微生物在生长培养基中被培养并繁殖；b)随后所述微生物被转移入生产培养基，所述生产培养基包含阻遏所述第一启动子的培养添加剂，或者阻遏所述第一启动子的培养添加剂被加入到所述生长培养基并被培养(如果在需氧或厌氧条件下适用)；以及c)在步骤b)后或步骤b)期间，从培养物上清液分离羧酸并任选地被纯化。
此外，通过根据本发明的微生物或方法，通过合适的基因阻遏，乙醛酸或柠檬酸循环的多种中间产物可以作为所述生产方法的终产物被特异性产生。当基因IDH1、SDH2和DIC1在第一外源启动子的控制下时，产生的羧酸为琥珀酸(琥珀酸盐)。当基因SDH2和DIC1不在第一外源启动子的控制下，并且基因IDH1、FUM1和OSM1在第一外源启动子的控制下时，产生的羧酸为延胡索酸(延胡索酸盐)。当基因FUM1和OSM1不在第一外源启动子的控制下，并且基因IDH1和MDH3在第一外源启动子的控制下时，产生的羧酸为马来酸(苹果酸盐)。当基因MDH3不在第一外源启动子的控制下，并且基因IDH1和CIT2在第一外源启动子的控制下时，产生的羧酸为草酰乙酸(草酰乙酸盐)。
本发明利用下面的发现并实现下面的优点。
在细胞呼吸期间，还原当量()从柠檬酸循环获得，其中琥珀酸是中间产物，所述还原当量导致线粒体膜系统内电位的产生。这种膜电位随后在呼吸链的过程中用于产生ATP形式的能量。此外，碳在合成代谢过程中通过柠檬酸循环被有效地转化为生物量。这种形式的增能(Energetisierung)非常有效并且导致细胞的最佳生长。然而只要柠檬酸循环和呼吸链存在于线粒体膜中，它就仅是可能的。除了柠檬酸循环，乙醛酸代谢途径在酵母酿酒酵母(Saccharomvcescerevisiae)中存在(还参见图1)。它是一类“简化的”(″Kurzschluss″)柠檬酸循环，因为异柠檬酸作为代谢物从所述代谢途径去除，一分子的琥珀酸和乙醛酸各自被形成。只要柠檬酸循环是活化的，那么琥珀酸和乙醛酸将通过分子乙酰辅酶A(乙醇或乙酸的)被结合到乙醛酸而流回到柠檬酸循环，并从其中产生苹果酸。乙醛酸循环允许细胞通过乙酰辅酶A进入柠檬酸循环而无碳损失地供应C2碳源，因为从异柠檬酸到琥珀酰辅酶A的两个氧化脱羧步骤被旁路化。
天然地，乙醛酸循环，例如在酵母细胞中，在存在葡萄糖时，在转录上被强烈地阻遏，结果是这个代谢途径不是活化的。仅在葡萄糖完全耗尽时，并且乙醇在培养基中富集时，涉及的基因在转录上被去阻遏。这个形式的调节通过乙醛酸代谢途径的生物学含义被解释，即，C2碳化合物如乙醇或乙酸的再补充或代谢，以便在糖降解分解期间通过这些C2碳化合物的产生来补充碳损失。所述生物合成途径尤其在植物、真菌和酵母中被发现。
琥珀酸在呼吸阶段(需氧阶段)期间的富集以及由此所述阶段(其中微生物获得生物量)没有意义，因为碳被充分需要用于合成代谢过程。然而如果通过限制培养基成分终止稳定期中生物量的增加，那么柠檬酸循环不再被细胞所需。这个时间可以用于通过培养通过碳通量偏移入乙醛酸循环并由此有效进入琥珀酸合成来实现琥珀酸的特异性富集。
为了实现碳通量的这种代谢偏移，在中间产物异柠檬酸和琥珀酸后柠檬酸循环被中断，以便碳通量偏移进入乙醛酸循环，琥珀酸的进一步代谢被防止或改道为乙醛酸循环的进一步的中间产物。此外，琥珀酸从乙醛酸循环进入线粒体的转运被中断，以便它不再可用于位于线粒体内的柠檬酸循环。此外，细胞的天然调节机制必须被克服，因为为了琥珀酸中通过乙醛酸途径的有效碳开发，葡萄糖(其天然阻遏所述代谢途径)被用作碳源。
对于其中最初在第一生长阶段，生物量将被富集，在第二阶段，琥珀酸将被有效地产生并被转移到培养基中的过程，微生物必须通过分子-遗传方法被修饰以便柠檬酸循环在生长阶段后被中断，乙醛酸循环在存在葡萄糖时被活化，即，去阻遏。如果这样修饰的微生物不再依赖于生物量的增加，那么葡萄糖的碳通量可以高度有效地发生进入羧酸或琥珀酸。在这样的菌株中的代谢情形在图2中示出。为了比较目的，野生型菌株的代谢情形在图1中示出。
根据本发明的方法和可以用在这样的方法中的根据本发明的微生物满足这些要求。它是被遗传修饰或通过遗传突变的微生物和相应的发酵方法，其中最初在第一阶段(呼吸阶段)期间，微生物生产者的生物量的最佳增加被确保，随后在第二阶段(生产阶段)中，来自主要碳源(如葡萄糖)和CO2(添补反应，CO2固定)的羧酸，例如琥珀酸的富集随后。在生产阶段期间，通过微生物的遗传修饰，柠檬酸循环在中间产物异柠檬酸和琥珀酸后被中断，琥珀酸从乙醛酸循环的转运被防止，如上所述。此外，在生产阶段期间，代谢物阻遏无效，结果是即使在C6碳分子的存在下，在培养物上清液中也存在羧酸或琥珀酸的有效生物合成和富集。在多个步骤中代谢过程的控制通过添加或不添加或去除培养添加剂而发生，其中所述培养添加剂阻遏第一启动子，或其存在对于第一启动子的活性是必需的。
因此还优选培养添加剂在生物体中不是内源性的。随后，第一启动子和进而由所述启动子调节的基因的非常简单的控制过程可以通过添加培养添加剂到培养基或不添加培养添加剂或分离培养添加剂来实施。所述培养添加剂可以为例如来自四环素组的抗生素，尤其是四环素。
所述启动子优选地选自包括″tetO2和tetO7″的组。采用的启动子尤其是tetO7启动子，其与第二成分一起形成转录反式激活蛋白(transcriptional transactivator)(tTA)，在文件Gari E.et al.，YEAST13：837-848(1997)中描述的启动子系统。通过利用这个启动子，在用于生物量富集的生长阶段期间没有培养添加剂被加入到培养基，呼吸代谢正常运行。如果在生长阶段末，培养添加剂被加入，那么所述启动子和进而基因表达被阻遏，碳不能再通过柠檬酸循环而被代谢，因此完全可以利用乙醛酸途径并达到有效的羧酸或琥珀酸生产。
优选地，所述微生物为酵母细胞，例如酵母酿酒酵母。用于生产过程的酵母的使用与已建立的方法相比提供了下面的优点：酵母对于有机酸和乙醇非常耐受，酵母是非常渗透耐性的，酵母可以在较短时间内被培养到大量的生物量，酵母具有用于生物量产生期间碳的无损耗使用和用于羧酸或琥珀酸生产的碳的无损耗使用的乙醛酸生物合成途径，以及酵母可以通过非常简单的、非常充分地建立的遗传工具以复杂方式容易地被分子-生物学修饰。此外，酵母是强壮的和被证明的在工业规模上的生产生物体(还参见生物乙醇生产)，并且不造成混合酸发酵，如，例如，大肠杆菌(E.coli)或琥珀酸放线杆菌(A.Succinogenes)。因此，除了羧酸，实际上没有另外的发酵终产物产生，除了可以被容易分离的乙醇。
为了提高效率和产率，建议使野生型基因IDH1、SDH2和/或DIC1缺失或失活，例如，通过这些基因的天然启动子被可阻遏的启动子系统置换。由此，确保这些基因在生产阶段，步骤b)中是非活性的，基于上述原因，其将影响羧酸或琥珀酸的生产。
此外，为了提高产率和增加生产，优选一个或多个不同的或全部的来自组″PYC1、ACS1、CIT1、ACO1、ICL1、MLS1、MDH3、和CIT2″的基因被包括并在组成性活性第二启动子的控制下。优选地，这是ADH1启动子。
根据本发明的微生物特别适合于琥珀酸的生产。
对于根据本发明的方法，优选步骤a)被实施直到至少100g干生物量/l，优选至少120g/l最优选至少140g/l的细胞密度。步骤b)可以被实施直到至少0.4mol/l，优选至少0.8mol/l，最优选至少1.0mol/l的羧酸浓度。在步骤a)中，范围是4～9，优选6～8的pH，以及范围是0.01～0.5mol/l，优选至少0.05～0.2mol/l，最优选0.05～0.1mol/l的盐浓度可以被调节。在步骤b)中，范围是4～9，优选6～8的pH，以及范围是0.01～0.5mol/l，优选至少0.05～0.2mol/l，最优选0.05～0.1mol/l的盐浓度可以被调节。步骤a)优选在20～35℃，优选28～30℃的温度下被实施，实施时间为1～1,000h，优选2～500h，最优选2～200h。在步骤b)中，优选温度15～40℃，优选20～35℃，最优选28～30℃，时间为1～1,000h，优选2～500h，最优选2～200h。
作为用于步骤a)的培养基，例如WMVIII培养基(Lang C.，LoomanA.C.，Appl.Microbiol.Biotechnol.44(1-2)：147-156(1995))可以被使用。培养基中四环素的量少于20mg/l，优选少于10mg/l，最优选少于1mg/l，降至低于检测极限的值。
作为用于步骤b)的培养基，例如WMVIII培养基可以被使用，但是通常的糖蜜培养基也可以被使用。四环素的量优选多于1mg/l，最优选多于3mg/l。1～3mg/l或3～15mg/l的范围可以被使用。
步骤c)可以在步骤b)后被实施。随后，培养物上清液从微生物被分离，例如，通过过滤或离心。然而，步骤c)也可以在步骤b)期间被实施，连续或不连续地。在后面的情况中，至少部分培养物上清液被移出并被新的培养基置换，这个过程被重复，如果适用，重复几次。从被移出的培养物上清液，获得琥珀酸。连续分离可以通过合适的膜或通过引导培养基的通量通过用于分离琥珀酸的装置来实施。
最后，本发明涉及用于生产根据本发明的微生物的方法，其中野生型微生物中或与野生型相比被遗传修饰的或突变的微生物中，野生型基因IDH1、SDH2和/或DIC1被缺失或失活，并且其中这个基因或这些基因在第一启动子的控制下，其中所述第一启动子被生长培养基的培养添加剂阻遏并在缺乏所述培养添加剂时是有活性的。这个启动子和属于四环素-调节的启动子系统的tTA被引入到所述微生物中，并且所述微生物被其转化。
优选地，来自组″PYC1、ACS1、CIT1、ACO1、ICL1、MLS1、MDH3、和CIT2″的基因的一种或多种不同的或全部在组成性活性第二启动子的控制下被引入到所述微生物中，并且所述微生物被其转化。第一启动子尤其可以为tetO7启动子，第二启动子可以为ADH1启动子。
用于本发明的目的的基因和启动子，或其核酸序列用下面的NCBI数据库的编号Nos.描述或在下面的文件中描述：
IDH1：Z71313 Y13139
SDH2：Z73146 Y13138
DIC1：EF059331
FUM1：NC001148
OSM1：NC001142
PYC1：Z72584 Y13135
ACS1：AY723758
CIT1：Z71616 Y13139
ACO1：M33131
ICL1：X65554
MLS1：X64407 S50520
MDH3：M98763
CIT2：Z11113
tetO和tTA：Gari E.et al.，YEAST 13：837-848(1997)ADH1：Lang C.，LoomanA.C.，Appl Microbiol Biotechnol.44(1-2)：147-156(1995)
酵母细胞的转化可以以常规方式进行，其相关参考文献为文件Schiestl R.H.etal.，Curr Genet.Dec，16(5-6)：339-346(1989)，或Manivasakam P.et al.，Nucleic AcidsRes.Sep 11，21(18)：4414-4415(1993)，或Morgan A.J.，Experientia Suppl.，46：155-166(1983)。
适于转化的载体，尤其是质粒为，例如，从文件Naumovski L.et al.，JBacteriol，152(1)：323-331(1982)，Broach J.R.et al.，Gene，8(1)：121-133(1979)，Sikorski R.S.et al.，Genetics，122(1)_19-27(1989)已知的。这些载体为Yep24、Yep 13、pRS-载体系列、和YCp19或pYEXBX。
适用于本发明的目的的表达盒的生产通常根据常规重组和克隆技术，通过启动子与编码所述基因的核酸序列以及如果适用，终止子的融合来进行，如，例如在文件ManiatisT.et al.，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY，USA，1989，或Sihlavy T.J.，at al.，Experiments with GeneFusions，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY，USA，1984，或Ausubel F.M.et al.，Current Protocols in Molecular Biology，GreenePublishingAssoc.and Wiley-Interscience，1987中描述的。
下面，描述独立意义的本发明的替换方式和/或改进。上面的解释和变体的合适的部分也可以在下面描述的替换方式和/或改进中以类似的方式使用，反之亦然。
改进包括在所有的替换方法中葡萄糖阻遏级联的激酶和转录因子的影响。替换方法包括使用还原的(reductive)柠檬酸循环，用于提高酵母中，例如借助酵母酿酒酵母，呼吸中心代谢的有机酸的生产效率。
下面，用于生产琥珀酸和呼吸中心代谢的其他有机酸的优化的方法通过酵母菌株，尤其是具有减少的葡萄糖阻遏的酿酒酵母酵母菌株进行描述。
减少的葡萄糖阻遏通过特异性影响″Crabtree″-阳性酵母中负责葡萄糖阻遏的合适的转录因子和激酶实现。这样，有机羧酸，尤其是酵母的呼吸中心代谢的二羧酸和羟基脂肪酸，如，例如，琥珀酸、延胡索酸、苹果酸、草酰乙酸的生产效率在生产时间和产率方面被提高。
在细胞呼吸期间，从底物如葡萄糖起始，碳没有被转化为乙醇或甘油，如在发酵期间，但是进入呼吸中心代谢，即，柠檬酸循环或乙醛酸循环(参见图3a.)、b.)和c.))。当碳通过这两个循环，NADH或NADPH形式的氧化还原当量被形成，其电子被转移到呼吸链的第一蛋白复合体，其位于线粒体内膜。这些电子随后将通过呼吸链的另外的蛋白复合体逐步传递氧到最终的电子受体，所述氧随后被还原为水。这个被控制的氢氧反应释放的能量被用于克服梯度转运质子进入线粒体的膜间空间，其随后在回流入线粒体时将通过呼吸链的复合体V驱动所谓的“质子泵”，由此产生ATP形式的能量。
在发酵条件下，与呼吸相比(其中每分子葡萄糖38ATP可以被产生)，酵母产生，除了甘油，主要是乙醇(参见图3c.))并且每分子葡萄糖仅产生2个ATP形式的能当量。在发酵期间，通过乙醇或甘油的合成，NADH被再氧化成NAD，在呼吸期间，通过递送氧上的电子，NADH不被再氧化成NAD，因为在厌氧条件下，不可利用氧作为最终的电子受体。在发酵条件下，仅非常少的碳经历呼吸中心代谢，以致柠檬酸循环的中间产物作为用于合成生长必须的氨基酸的前体分子仍然是可利用的。
酵母酿酒酵母是“Crabtree”-阳性的。这意味着所述酵母在主要碳源上发酵，如葡萄糖，即使在有氧条件下，也不呼吸。这个发酵活性可以从由培养基中已经存在的约100mg/l葡萄糖的葡萄糖浓度起始观察到，因为在这个浓度，酵母细胞的呼吸容量的限制被实现。这个的原因是在存在葡萄糖时，呼吸中心代谢的多个基因，即，柠檬酸和乙醛酸循环的基因(参见图3a.)和b.))和呼吸链的基因被在转录上强烈地阻遏(Gancedo 1998)。这个现象还称为葡萄糖或代谢物阻遏。负责葡萄糖阻遏的机制还没有被充分阐明。然而，已知多个活化和阻遏转录因子和激酶负责葡萄糖阻遏级联。
此外，负责可替换的碳源的代谢的所有基因在存在葡萄糖时被强烈地阻遏，以致所述酵母将总是首先开发葡萄糖作为底物，这就是为什么它还称为“亲葡萄糖的(glucophil)”(Gancedo 1998)。仅在所有的葡萄糖耗尽时，用于可置换的碳源的代谢的基因、呼吸代谢和呼吸链的基因，以及氧化应激反应的基因被表达(Haurie et al.2001)。在培养基中的葡萄糖被耗尽时，这个转录表达特点的显著改变被称为“双峰移动(diauxishershift)”。在所述“双峰移动”期间，存在呼吸方向上呼吸-发酵平衡的移动。酵母细胞从发酵变为呼吸，并且现在可以代谢发酵期间由呼吸代谢产生的乙醇。“双峰移动”仅存在，如果葡萄糖消耗过程中的代谢物阻遏被中止。与野生型菌株相比，尽管存在葡萄糖，也不表现出任何或减少的葡萄糖阻遏的酵母菌株更适合于在主要碳源上产生二羧酸，如琥珀酸、延胡索酸、苹果酸和草酰乙酸，因为这些酸是柠檬酸和乙醛酸循环的中间产物，其基因受到这个阻遏。减少的葡萄糖阻遏导致呼吸方向上呼吸-发酵平衡的移动，其具有的结果是完整的呼吸系统的增长和在希望的有机酸方向上通过中心代谢的碳通量的增加。
在呼吸条件下，进一步的乙醛酸循环(参见图3b.))被增加。乙醛酸代谢途径的生物学意义是C2-碳化合物如乙醇和乙酸的再补充或代谢，其可以通过乙醛酸循环被供应而没有碳损失入代谢，由此C2-化合物的生长将仅变得可能。在通过乙醛酸循环的有机酸的生产期间，存在的优点是柠檬酸循环中异柠檬酸到琥珀酰-CoA的两个氧化脱羧步骤，由此两倍CO2形式的碳的损失(参见图3e.))可以被旁路化。
碳通量进入乙醛酸循环的偏移由此显著地有助于酵母中有机酸生产期间产率的提高。最终，在柠檬酸循环中释放的CO2的碳起源于相应的底物如葡萄糖或起源于CO2固定(添补反应)。柠檬酸和乙醛酸循环的多种酶，其基因被葡萄糖转录阻遏，也在蛋白水平受到由葡萄糖的调节或失活。由此这些基因的在转录上去调节不足以获得活性基因产物。蛋白水平上的失活影响也必须被旁路化，其可以通过减少的葡萄糖阻遏获得。
实例是乙醛酸循环的主要酶之一，异柠檬酸裂合酶(Icl1p，图3b.)1)。这种酶，其对于有机酸的有效生产是必需的，在存在葡萄糖时受到通过磷酸化的失活和增加的蛋白水解降解(Lopez-Boado et al.1988；Ordiz et al.1996)。
下面，根据权利要求的本发明的替换方法的可替换的，但是也任意可结合的特征被解释。细胞溶质苹果酸脱氢酶(Mdh2p)，也受到由葡萄糖诱导的增加的蛋白水解降解(Hung et al.2004)。细胞溶质苹果酸脱氢酶被用于通过柠檬酸循环的还原部分的琥珀酸合成，从丙酮酸和草酰乙酸、苹果酸和延胡索酸起始到琥珀酸(图3f.)1)。还原性柠檬酸循环，即，柠檬酸循环的非环状返回部分(图3f.)是用于琥珀酸在葡萄糖上生产期间化学计算最大摩尔产率的先决条件。仅结合乙醛酸循环的还原性柠檬酸循环允许琥珀酸生产期间通过NADH再氧化到NAD+和CO2固定最高达到每mol葡萄糖1.71mol琥珀酸的最大产率。
剥夺细胞溶质苹果酸脱氢酶(Mdh2p)的葡萄糖-诱导的蛋白水解降解的另一可能性是最初的12个N-末端氨基酸以及，任选地，C-末端脯氨酸缩短的Mdh2p蛋白的过度表达。最初的12个N-末端氨基酸和C-末端脯氨酸对于Mdh2p的降解是必需的(Hung，Brown etal.2004)。
通过柠檬酸循环的还原部分的琥珀酸生产的另一瓶颈是苹果酸到延胡索酸的反应(图3f.)2)。这种反应由酶延胡索酸酶(Fum 1p)催化。它是呼吸中心代谢的几种酶之一，其没有同工酶。然而，它位于细胞溶质及线粒体内。单一的翻译产物的定位由N-末端线粒体靶向序列和蛋白折叠决定(Sass et al.2003)。
苹果酸到延胡索酸的反应是热力学上非常不利的，因为延胡索酸酶对延胡索酸的亲和力是对苹果酸的17倍。因此，采用酵母酿酒酵母的天然延胡索酸酶，有效利用用于琥珀酸生产的柠檬酸循环的还原部分是不可能的。
为了克服这些问题，延胡索酸酶必须在酵母中异源地表达，所述酶优选源自生物体，其天然进行混合的酸发酵。在这些生物体中，还原性柠檬酸循环有效地多，因为在混合酸发酵中，琥珀酸是天然发酵终产品。这样的生物体的延胡索酸酶的热力学在苹果酸到延胡索酸的反应方面比酿酒酵母有利地多。作为用于异源表达的延胡索酸酶的供体生物体，例如，大肠杆菌、产琥珀酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillumsucciniciproducens)、琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)、Mannheimia succiniciproducens、谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)可以被使用。
用于通过还原性柠檬酸循环的琥珀酸生产的最后步骤是延胡索酸到琥珀酸的反应。这种反应在细胞溶质中由酶延胡索酸还原酶(Frds1p，图3f.)3)催化。这种酶的过度表达增加还原的琥珀酸生产的效率。
因此，本发明还教导了分离的遗传修饰的微生物，其中天然基因MDH2的截短的变体被引入到所述微生物中，和/或天然基因FUM1被来自与所述微生物不同的生物体的基因FUM1置换，和/或其中基因FRDS1被过度表达，和/或PYC1和/或PYC2之一或二者被过度表达。
优选地，基因MDH2的截短的变体编码MDH2蛋白，其最初的12个N-末端氨基酸和可选地C-末端脯氨酸被缩短。
所述微生物可以为酵母，尤其选自包含以下的组：“酿酒酵母、酵母菌属(Saccharomyces)、复膜孢子酵母属(Saccharomycecopsis)、类酵母属(Saccharomycodes)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、威克酵母属(Wickerhamia)、德巴利氏酵母属(Debayomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、有孢汉逊酵母属(Hanseniaspora)、毕赤氏酵母属(Pichia)、克勒克酵母属(Kloeckera)、假丝酵母属(Candida)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、Ogataea、Kuraishia、Komagataella、Yarrowia、梅奇氏酵母属(Metschnikowia)、拟威尔酵母属(Williopsis)、Nakazawaea、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、隐球酵母属(Cryptococcus)、孢圆酵母属(Torulaspora)、布勒掷孢酵母属(Bullera)、红酵母(Rhodotorula)、Willopsis、克勒克酵母属(Kloeckera)和掷孢酵母属(Sporobolomyces)”，基因FUM1可以选自包含下列的组的生物体：“大肠杆菌(Escherichiacoli)、厌氧螺菌(Anaerobiospirillum)、放线杆菌、曼氏杆菌(Mannheimia)、棒状杆菌”。来自包括“FRDS1、PYC1和PYC2”的组的基因的至少一种可以在第二外源组成性活性启动子的控制下，例如ADH1-启动子的控制下。
优选地，两种天然基因MDH2和FUM1被置换或补充，和/或两种基因FRDS1和PYC1被过度表达。
这样的微生物可以用于具有大大增加的产率的琥珀酸的生产。这是通过以下实现的：a)所述微生物可选地在生长培养基中在需氧条件下被培养和繁殖，b)随后所述微生物在可选地厌氧条件下被培养，以及c)步骤b)后或步骤b)期间，琥珀酸从培养物上清液被分离并可选地被纯化。至于步骤a)到c)中的条件，上面的解释以类似的方式应用。
根据本发明的微生物可以通过下面产生：在野生型微生物中或在初始的生物体中(相对于野生型被遗传修饰或突变)，野生型基因MDH2或FUM1之一或者二者，被缺失或失活或补充，所述补充通过MDH2基因和/或外源FUM1基因的各自的变体被引入到所述微生物中，并且所述微生物被其转化，和/或通过基因FRDS1、PYC1和PYC2的至少一种，优选至少两种基因FRDS1和PYC1，在第二启动子控制下被引入到所述微生物中，并且所述微生物被其转化。
用于生产二羧酸的呼吸模式的另一优点是酶丙酮酸羧化酶(Pyc1p和Pyc2p)的增加的表达，其催化丙酮酸到草酰乙酸的反应，其中CO2形式的碳被固定(参见图3d))。丙酮酸羧化酶的酶促反应是柠檬酸循环的还原部分(图3f.))和糖异生的第一步。糖异生，即，储存物质糖原的构建，主要发生在呼吸条件下(Haurie，Perrot et al.2001)。在这种酶促步骤中的CO2固定允许具有平坦(evened-out)或甚至正性的CO2平衡的过程，其关于所述过程具有大的环境关联性。
此外，在下面的本发明的所有上述替换方法描述的改进中，甘油和乙醇形式(参见图3.c))的副产品的产生和进而产率损失通过呼吸的增加被减少，因为甘油和乙醇代表酵母的发酵终产物。
在“双峰移动”的过程中的表达特点的改变涉及酿酒酵母中约6000个基因的几乎四分之一(Young et al.2003)。这些深刻的改变由代谢物阻遏级联的一些激酶和转录因子诱导，其均在多个靶基因的启动子区中产生调节作用。这显示除了呼吸中心代谢的基因，还有数量众多的另外的基因由葡萄糖阻遏。为了酵母中有机酸的有效生产，因此通过过度表达仅仅在转录上去调节中心代谢的基因是不充分。必须剥夺这种阻遏的呼吸系统的多种另外的葡萄糖-阻遏的基因。这涉及编码线粒体转运系统、氧化还原当量的交换、呼吸链的蛋白和线粒体生源(biogenese)的基因。在没有或减少的葡萄糖阻遏的酵母菌株中，完整的呼吸系统在主要碳源和其他碳源上更有效。由于二羧酸，如琥珀酸、延胡索酸、苹果酸和草酰乙酸是呼吸代谢的中间产物，这样的菌株非常适合于这些酸的生产。由于菌株稳定性和效率的原因，仅有限数量的基因可以个别地在转录上去调节，多种基因的葡萄糖-诱导的阻遏的中止仅可以通过在高级水平上影响负责这种阻遏的合适的转录因子来实现。
在酵母酿酒酵母中，代谢物阻遏级联的几种激酶和转录因子是已知的并被研究，其在呼吸系统的它们的靶基因的启动子区阻遏地起作用。此外，转录因子是已知的并被研究，其在“双峰移动”过程中导致它们的靶基因的增加的表达，即，以诱导性或活化方式起作用。为了在高级水平上葡萄糖阻遏的中止或减少，并因此用于呼吸系统的许多基因的活化，合适的激酶和转录因子必须被阻遏或活化。这样，呼吸系统的有机酸的生产效率可以被提高。
总之，具有减少的或中止的葡萄糖阻遏的酵母菌株已经通过合适的激酶和转录因子的活化或阻遏用于在主要碳源上呼吸中心代谢的有机二羧酸的生产，与野生型菌株相比，具有下面的优点：
·通过柠檬酸和乙醛酸循环的碳通量被增加
·所述菌株具有更高和更快的生长
·乙醇和甘油形式的副产品的较少产生
·乙醛酸循环被扩大
·负责中心代谢中的CO2固定的酶被表达到增加的程度
·呼吸系统，如线粒体转运系统、呼吸链、线粒体生源和用于氧化还原当量的交换的所有基因是有活性的
·柠檬酸和乙醛酸循环的酶在蛋白质水平上被剥夺葡萄糖-诱导的负性调节
这些优点导致关于生产时间和产率的更有效的生产。此外，通过更少的CO2被产生和更多的CO2被固定，生态效率增加。
所述酵母细胞不仅表现出在葡萄糖上的代谢物阻遏，而且表现出在其他可发酵的C6和C5糖上的代谢物阻遏，例如半乳糖或核糖，在不可发酵的碳源如，例如甘油上，也到较低的程度(Gancedo 1998)。因此，在葡萄糖-去阻遏的菌株中，在所有可发酵和许多不可发酵的碳源上可以预期更有效的生产。
在本文中，一方面转录因子将被命名。
Snf1p/Snf4p复合体属于蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶并且对于“双峰移动”的过程中葡萄糖阻遏的中止扮演中心角色。Snf1p/Snf4p复合体的位置在所述级联的层级中在顶部上非常远，其负责葡萄糖阻遏或去阻遏。在“双峰移动”的过程中，Snf1p/Snf4p复合体被磷酸化Snf1激酶Sak1p、Tos1p和Elm1p并由此被活化(Rubenstein et al.2006)。活化的复合体位于细胞核中，其中它影响位于层级水平中的进一步的下游的两个转录因子。这些是蛋白Mig1p和Cat8p(Treitel et al.1998)。
锌指蛋白Mig1p是转录阻遏物，其募集蛋白Tup1p和Cyc8p，以便随后作为复合体结合到多个葡萄糖-阻遏的基因的启动子的相应共有序列，由此随后的基因的转录被防止(Treitel and Carlson 1995)。
Cat8p是转录活化蛋白并在培养基中不再有葡萄糖时，诱导至少34种基因的表达。这些主要是乙醛酸循环的基因，其是酵母中有机酸的有效生产所必需的。此外，负责乙醛酸和柠檬酸循环的中间产物的胞内运输的一些基因受到Cat8p的调节(Haurie，Perrot etal.2001)。
活性Snf1p/Snf4p复合体磷酸化Mig1蛋白，进而其被失活并被从细胞核转位(translocalized)(De Vit et al.1997)并磷酸化Cat8p和Sip1p，功能同源物，其导致这两个蛋白的活化。
因此，位于细胞核内的活性Snf1p/Snf4p复合体显著地有助于葡萄糖阻遏的中止，因为它直接影响阻遏级联的另外的转录因子。这个复合体由蛋白Snf1p和Snf4p，以及分别的蛋白Gal83p、Sip1p和Sip2p之一组成(Jiang and Carlson 1997)。后面的蛋白对总复合体在细胞内的定位有影响并代表复合体的链接。Snf4p是调节亚基，Snf1p是催化亚基。Snf1p通过3个冗余激酶Sak1p、Tos1p或Elm1p之一磷酸化位置210处的氨基酸苏氨酸而被活化。Glc7p/Reg1p I型蛋白磷酸酶针对这个磷酸化起作用(Santangelo 2006)。Reg1p是这个蛋白磷酸酶的调节亚基并通过结合到Glc7p引导这个复合体到一系列的底物，其参与包括葡萄糖阻遏、细胞生长、及糖原产生的不同的过程中(Cui et al.2004)。Reg1p与Snf1蛋白的激酶结构域相互作用并引导Glc7p到Snf1p的活化环，其导致Snf1p的脱磷酸和失活，由此导致许多基因的葡萄糖阻遏。
Frederick et al.(1996)能够鉴定Reg1p-Reg2p的同源物。Δreg1或Δreg2突变体在可发酵和不可发酵的碳源上表现出明显较慢的生长。Δreg1Δreg2双重突变体甚至具有更严重的缺陷(Frederick and Tatchell1996)。Δreg1Δreg2突变体中REG2的过度表达在生长方面减轻这些缺陷，然而强烈减少的葡萄糖阻遏没有被影响。这表明主要是Reg1p对于维持葡萄糖阻遏起作用。
为了即使在存在葡萄糖时也保持Snf1p/Snf4p在活性状态，可以设想两种机制。首先，蛋白Sak1p，其作为主要激酶负责磷酸化并由此负责Snf1p/Snf4p复合体的活化，将通过基因SAK1的在转录上去调节被过度表达。
此外，通过Glc7p/Reg1p蛋白磷酸酶的脱磷酸将被防止。GLC7的阻遏或缺失导致无法存活的细胞，由此这通过基因REG 1的阻遏或缺失仅是可能的。
通过这两种措施，Sak1p和Glc7p/Reg1p之间的调节斗争在活性Snf1p/Snf4p复合体的方向上可以被移动，其显著地有助于葡萄糖阻遏的中止。
Hap2/3/4/5蛋白质复合体调节大量的葡萄糖-阻遏的基因。这些是呼吸链和柠檬酸循环的主要基因。作为活化蛋白，它诱导“双峰移动”期间这些基因的转录并强烈有助于呼吸-发酵平衡在呼吸方向上的移动。基因HAP2、HAP3和HAP5被组成性表达(McNabb andPinto2005)。HAP4仅通过在不可发酵的碳源上的生长被天然地表达。在HAP4过度表达突变体的培养期间，观察到这个突变，与野生型相比，导致提高的生长率、生物量和乙酸盐生产，并导致减少的乙醇和甘油生产(Blomet al.2000)。Hap2/3/4/5蛋白复合体通过柠檬酸循环和呼吸容量的碳通量被增加和线粒体生源被促进来扩大呼吸系统。
通过Hap4p的过度表达，由此有机羧酸的生产效率，尤其是酵母的呼吸中心代谢的二羧酸和羟基脂肪酸，如，例如琥珀酸，延胡索酸、苹果酸、草酰乙酸的生产效率，在生产时间和产率方面被提高。
受到葡萄糖阻遏的大多数基因通过几个转录因子被调节。在这些基因的启动子区，可以发现非常常见的用于几个转录因子，例如Mig1p、Hap2/4/5/6p、Cat8p等的结合结构域。
此外，这些蛋白质互相调节。Cat8p的转录例如在葡萄糖存在下受到严格的阻遏，主要通过Mig1蛋白，其还阻遏基因SNF1的转录(Schullerand Entian 1991)。在基因HAP4的启动子区中，Mig1p结合序列也被鉴定(Gancedo 1998)。可以显示葡萄糖阻遏级联的几个转录因子的影响具有加性效应(Lascaris et al.2004)。因此这变得清楚，即，仅超过一个转录因子或复合体的结合的影响可以导致代谢物阻遏的全面减少或消失。
因此，本发明还包括分离的遗传修饰的微生物，尤其是作为上述变体之一的改进，其中基因HAP4或SAK1的一个被过度表达，或者其中两个基因HAP4和SAK1被过度表达，和/或基因REG1被阻遏或缺失。
优选地，这是Crabtree-阳性酵母，尤其选自包括下面的组：“酿酒酵母、酵母菌属、复膜孢子酵母属、类酵母属、裂殖酵母属、威克酵母属、德巴利氏酵母属、汉逊酵母属、有孢汉逊酵母属、毕赤氏酵母属、克勒克酵母属、假丝酵母属、接合酵母属、Ogataea、Kuraishia、Komagataella、Yarrowia、梅奇氏酵母属、拟威尔酵母属、Nakazawaea、Kluyverornyces、隐球酵母属、孢圆酵母属、布勒掷孢酵母属、红酵母、Willopsis、克勒克酵母属和掷孢酵母属”。
尤其是，基因HAP4或SAK1之一或者二者可以在第二外源、组成性活性启动子，尤其是ADH1-启动子的控制下。
这样的微生物通常适于生产有机羧酸，尤其是琥珀酸、延胡索酸、苹果酸、草酰乙酸、乳酸、乙酸、和/或蚁酸，具有提高的产率。何种羧酸以特别高的产率形成，依赖于进一步的遗传测量，如上所述。关于所述羧酸的生产，以类似的方式应用上面的解释。
最后，本发明涉及用于生产这样的微生物的方法，其中在野生型微生物中或在相对于野生型被遗传修饰的或突变的初始的生物体中，野生型基因REG1缺失或失活，和/或其中基因HAP4或SAK1的至少一种，优选二者基因都在第二启动子的控制下被引入到所述微生物中，所述微生物被其转化。可选地，测量另外可以是合理的，其在上面根据本发明的微生物的另外的变体的上下文中被描述。
用于上述替换方法和/或改进的目的的基因或其核酸序列描述在NCBI数据库中，具有下面的编号Nos.：
HAP4： NP_012813
REG1： NP_010311
SAK1： NP_011055
MDH2： NP_014515
FRDS1：NP_010867
fumB：NC_004431
aceA：U00096AE000111-AE000510
上面的文件具有下面的参考文献资料：
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下面，参照实施方式更详细地解释本发明。
实施例1：具有四环素-调节的启动子系统的微生物的生产
为了实现在生物量生长的终止后柠檬酸循环的中断，根据本发明，这种代谢途径的三种基因被可以被调节的启动子控制。这些是基因IDH1，其编码NAD-依赖的异柠檬酸脱氢酶的第一亚基，以及基因SDH2，其编码琥珀酸脱氢酶的亚基，以及基因DIC1，其编码线粒体二羧酸转运体。这些酶活性的消除的结果是异柠檬酸，乙醛酸循环的底物，不再被通过柠檬酸循环转变为2-氧戊二酸，琥珀酸不被代谢为延胡索酸，乙醛酸循环的琥珀酸不再被转运入线粒体并由此不再被供应到位于线粒体内的柠檬酸循环。因此，柠檬酸循环被中断。被使用的启动子具有重要的性能，在生长期间是有活性的，以便允许柠檬酸循环的运转和通过加入阻遏物在生产期间尽可能强地被阻遏。这种调节通过四环素-调节的启动子系统的第二成分而成为可能，除了可被阻遏的tetO启动子。这是转录反式激活蛋白(tTA)，其代表操纵子结合结构域和活化结构域的融合蛋白。tTA结合到tetO启动子，其由此具有随后的基因的转录。来自四环素的组的抗生素诱导tTA的构象改变，这导致其从tetO启动子解离并由此导致随后的基因的转录被防止。为了确保tetO启动子的运转，由此用于tTA的基因也被整合入相应微生物的基因组。为此，例如LEU2基因座是可利用的。
异柠檬酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶和二羧酸转运体在生长期间在四环素可阻遏的tetO启动子的控制下被表达。在生产期间，酶活性以可控方式被消除。酿酒酵母被如此修饰以致三种靶基因的天然启动子例如通过在酵母基因组中的特异性整合被可阻遏的启动子交换。
由此获得的酵母菌株酿酒酵母(S.cerevisiae)的结构GRFura3 tTAtetOprom-SDH2和tetOprom-IDH1和tetOprom-DIC1产生自下面的表1。
表1.
实施例2：具有组成性活性琥珀酸合成的微生物
由于在琥珀酸生物合成路径上的乙醛酸循环和其他反应在酵母细胞中在葡萄糖存在时是天然转录上被强烈阻遏的，结果是这种生物合成途径不是活性的，这种代谢途径的酶的全部或选择的和丙酮酸羧化酶(所述酶负责添补反应(CO2固定))在用于琥珀酸从葡萄糖的生物合成的生产阶段期间被转录上优选地去调节。为了所述基因在酵母酿酒酵母中的被去调节的表达，组成性ADH1启动子被使用，其通过长期的天然序列的修饰导致独立于葡萄糖和乙醇的组成性表达(参见Lang C.，Looman A.C.，Appl Mi-crobiolBiotechnol.44(1-2)：147-156(1995))。在转录上去调节的是基因PYC1、ACS1、CIT1、ACO1、ICL1、MLS1、MDH3和CIT2。为此，一种表达系统被使用，其允许PYC1、ACS1、CIT1、ACO1、ICL1、MLS1、MDH3和CIT2的同时在转录上去调节的表达。各个基因(PYC1、ACS1、CIT1、ACO1、ICL1、MLS1、MDH3和CIT2)通过PCR从菌株酿酒酵母S288c的染色体酵母DNA被扩增并被提供有限制性连接物并随后在组成性ADH1启动子控制下被单独地整合在酵母染色体中。
由此获得的酵母菌株酿酒酵母的构成从表2产生。
表2.
实施例3：在酿酒酵母GRFura3中在基因座LEU2处在CMV启动子的控制下转录反式激活蛋白的表达
tTA-表达盒的编码核酸序列通过PCR标准方法被扩增，以便所得到的片段由下面的成分组成：loxP-kanMX-loxP-CMVprom.-tTA(YEAST20：1255-1262，2003)。作为引物，寡核苷酸序列被选择以便在5′和3′悬突处分别包含LEU2基因的5′或3′序列，在退火片断中包含loxP区的5′序列和tTA基因的3′序列。由此确保一方面包含KanR和tTA的完整片段被扩增，另一方面这个片段可以随后被转化入酵母中，通过同源重组，这个完整片段被整合在酵母的LEU2基因座中。
作为选择标记物用于针对G418的抗性。得到的菌株酿酒酵母GRFura3tTA包含在CMV启动子的控制下的基因tTA的拷贝。为了随后再次去除针对G418的抗性，产生的酵母菌株用cre重组酶载体pSH47转化(Guldener U，Heck S，Fielder T，Beinhauer J，HegemannJH.(1996)Anew efficient gene disruption cassette for repeated use in buddingyeast.Nucleic Acids Res.Jul 1；24(13)：2519-24)。通过这种载体，cre重组酶在酵母中被表达，结果是两个loxP序列内的序列区将被重组出去。结果是两个loxP序列中仅一个和CMVprom.-tTA盒仍然包含在原始LEU2基因座中。结果是酵母菌株再次失去G418抗性并由此适合在酵母菌株中通过这种cre-lox系统整合或去除另外的基因。载体pSH47可以随后通过在补充有尿嘧啶(20mg/L)和FOA(5-氟乳清酸)(1g/L)的YNB琼脂平板上反选择再次去除。为此，携带这种质粒的细胞必须首先在非选择性条件下被培养，随后在包含FOA的选择性平板上被选取(drawn)。在这些条件下，仅那些本身不能够合成尿嘧啶的细胞可以生长。在这个情况下，这些是不再包含质粒(pSH47)的细胞。
实施例4：酿酒酵母GRFura3中在四环素-调节的tetO7启动子的控制下SDH2的表达
用于tetO7启动子盒的编码核酸序列通过PCR和标准方法被扩增，以便所得到的片段由下面的成分构成：loxP-kanMX-loxP-ADH1term.-tetO7operator-CYC1prom.(YEAST13：837-848(1997)；Nucleic Acid Research 24(13)：1519-2524(1996))。作为引物，寡核苷酸序列被选择以便在5′和3′悬突分别包含SDH2基因的天然启动子的5′或3′序列，在退火片断中包含loxP区的5′序列和CYC 1prom的3′序列。由此确保一方面包含KanR和tetO7启动子的完整片段被扩增，另一方面这个片段可以随后被转化入酵母中，通过同源重组，这个完整片段被整合在所述酵母的SDH2基因座中，在基因SDH2的编码区前。
作为选择标记物用于针对G418的抗性。得到的菌株酿酒酵母GRFura3 repr.SDH2包含在四环素调节的tetO7启动子和天然SDH2终止子的控制下的基因SDH2的拷贝。为了随后再次去除针对G418的抗性，产生的酵母菌株用cre重组酶载体pSH47转化(Guldener U，Heck S，Fielder T，Beinhauer J，Hegemann JH.(1996)：A new efficientgenedisruption cassette for repeated use in budding yeast.Nucleic AcidsRes.Jul1；24(13)：2519-24)。通过这种载体，cre重组酶在所述酵母中被表达，结果是两个loxP序列内的序列区将重组出去。结果是两个loxP序列中仅一个和tetO7启动子盒仍然包含在基因SDH2的编码序列前。结果是酵母菌株再次失去G418抗性并由此适合在酵母菌株中通过这个cre-lox系统整合或去除另外的基因。载体pSH47可以随后通过在补充有尿嘧啶(20mg/L)和FOA(5-氟乳清酸)(1g/L)的YNB琼脂平板上反选择再次去除。为此，携带这种质粒的细胞必须首先在非选择性条件下被培养，随后在包含FOA的选择性平板上被选取。在这些条件下，仅那些本身不能够合成尿嘧啶的细胞可以生长。在这种情况下，这些是不再包含质粒(pSH47)的细胞。
实施例5：酿酒酵母GRFura3中在四环素-调节的tetO7启动子的控制下IDH1的表达
用于tetO7启动子盒的编码核酸序列通过PCR和标准方法被扩增，以便所得到的片段由下面的成分构成：loxP-kanMX-loxP-ADH1term.-tetO7operator-CYC1prom.(YEAST13：837-848(1997)；Nucleic Acid Research 24(13)：1519-2524(1996))。作为引物，寡核苷酸序列被选择以便在5′和3′悬突分别包含IDH1基因的天然启动子的5′或3′序列，在退火片断中包含loxP区的5’序列和CYC1prom的3’序列。由此确保一方面包含KanR和tetO7启动子的完整片段被扩增，另一方面这个片段可以随后被转化入酵母中，通过同源重组，这个完整片段被整合在所述酵母的IDH1基因座中，在基因IDH1的编码区前。
作为选择标记物用于针对G418的抗性。得到的菌株酿酒酵母GRFura3repr.IDH1包含在四环素调节的tetO7启动子和天然IDH1终止子的控制下的基因IDH 1的拷贝。为了随后再次去除针对G418的抗性，产生的酵母菌株用cre重组酶载体pSH47转化(Guldener U，HeckS，Fielder T，Beinhauer JHegemann JH.(1996)：A new efficient genedisruptioncassette for repeated use in budding yeast.Nucleic Acids Res.Jul1；24(13)：2519-24)。通过这种载体，cre重组酶在所述酵母中被表达，结果是两个loxP序列内的序列区将重组出去。结果是两个loxP序列中仅一个和tetO7启动子盒仍然包含在基因IDH1的编码序列前。结果是酵母菌株再次失去G418抗性并由此适合在酵母菌株中通过这种cre-lox系统整合或去除另外的基因。载体pSH47可以随后通过在补充有尿嘧啶(20mg/L)和FOA(5-氟乳清酸)(1g/L)的YNB琼脂平板上反选择再次去除。为此，携带这种质粒的细胞必须首先在非选择性条件下被培养，随后在包含FOA的选择性平板上被选取。在这些条件下，仅那些本身不能够合成尿嘧啶的细胞可以生长。在这种情况下，这些是不再包含质粒(pSH47)的细胞。
实施例6：酿酒酵母GRFura3中在四环素-调节的tetO7启动子的控制下DIC1的表达
用于tetO7启动子盒的编码核酸序列通过PCR和标准方法被扩增，以便所得到的片段由下面的成分构成：loxP-kanMX-loxP-ADH1term.-tetO7operator-CYC1prom.(YEAST13：837-848(1997)；Nucleic Acid Research 24(13)：1519-2524(1996))。作为引物，寡核苷酸序列被选择以便在5′和3′悬突分别包含DIC1基因的天然启动子的5′或3′序列，在退火片断中包含loxP区的5’序列和CYC1prom的3’序列。由此确保一方面包含KanR和tetO7启动子的完整片段被扩增，另一方面这个片段可以随后被转化入酵母中，通过同源重组，这个完整片段被整合在所述酵母的DIC1基因座中，在基因DIC1的编码区前。
作为选择标记物用于针对G418的抗性。得到的菌株酿酒酵母GRFura3repr.DIG1包含在四环素调节的tetO7启动子和天然DIC1终止子的控制下的基因DIC1的拷贝。为了随后再次去除针对G418的抗性，产生的酵母菌株用cre重组酶载体pSH47转化(Guldener U，HeckS，Fielder T，Beinhauer J，Hegemann JH.(1996)：A new efficient genedisruptioncassette for repeated use in budding yeast.Nucleic Acids Res.Jul1；24(13)：2519-24)。通过这种载体，cre重组酶在所述酵母中被表达，结果是两个loxP序列内的序列区将重组出去。结果是两个loxP序列中仅一个和tetO7启动子盒仍然包含在基因IDH1的编码序列前。结果是酵母菌株再次失去G418抗性并由此适合在酵母菌株中通过这个cre-lox系统整合或去除另外的基因。载体pSH47可以随后通过在补充有尿嘧啶(20mg/L)和FOA(5-氟乳清酸)(1g/L)的YNB琼脂平板上反选择再次去除。为此，携带这种质粒的细胞必须首先在非选择性条件下被培养，随后在包含FOA的选择性平板上被选取。在这些条件下，仅那些本身不能够合成尿嘧啶的细胞可以生长。在这个情况下，这些是不再包含质粒(pSH47)的细胞。
实施例7：酿酒酵母GRFura3tTArepr.SDH2repr.IDH1 repr.DIC1中在组成性ADH1启动子的控制下PYC1、ACS1、CIT1、ACO1、CIT2、ICL1、MLS1和MDH3的表达
下面的描述应用于对于所述提及的基因的在转录上去调节的基因的整合的连续执行，遵循下面的方案。
用于ADH1prom-PYC1(ACS1、CIT1、ACO1、CIT2、ICL1、MLS1、MDH3)-TRP1term的表达盒的编码核酸序列通过PCR和标准方法从载体pFlat-PYC1(ACS1、CIT1、ACO1、CIT2、ICL1、MLS1、MDH3)被扩增。得到的DNA片断在Klenow处理后在EcoRV界面被平端克隆入载体pUG6并导致载体pUG6-PYC1(ACS1、CIT1、ACO1、CIT2、ICL1、MLS1、MDH3)。在质粒分离后，载体pUG6-PYC1(ACS1、CIT1、ACO1、CIT2、ICL1、MLS1、MDH3)的延伸的片段通过PCR被扩增，以便得到的片段由下面的成分构成：loxP-kanMX-loxP-ADH1prom-PYC1(ACS1、CIT1、ACO1、CIT2、ICL1、MLS1、MDH3)色氨酸终止子。作为引物，寡核苷酸序列被选择以便在5′和3′悬突分别包含PYC1(ACS1、CIT1、ACO1、CIT2、ICL1、MLS1、MDH3)基因的5′或3′序列，在退火片断中包含loxP区的序列5′和色氨酸终止子的3′。由此确保一方面包含KanR和PYC1(ACS1、CIT1、ACO1、CIT2、ICL1、MLS1、MDH3)的完整片段被扩增，另一方面这个片段可以随后被转化入酵母中，通过同源重组，这个完整片段被整合在所述酵母的PYC1(ACS1、CIT1、ACO1、CIT2、ICL1、MLS1、MDH3)基因座中。
作为选择标记物用于针对G418的各自的抗性。得到的菌株酿酒酵母GRFura3tTArepr.SDH2repr.IDH1 repr.DIC1dereg.PYC1 ACS1 CIT1ACO1 ICL1 MLS1 MDH3 CIT2包含在tetO7启动子和天然终止子的控制下的基因SDH2、IDH1、DIC1的拷贝以及在组成性ADH1启动子和TRP1终止子的控制下的基因PYC1、CIT1、ACS1、ACO1、ICL1、MLS1、MDH3和CIT2的每种的一个拷贝。为了随后再次去除针对G418的抗性，分别产生的酵母菌株用cre重组酶载体pSH47转化(Guldener U，HeckS，Fielder T，Beinhauer J，Hegemann JH.(1996)：A newefficient genedisruption cassette for repeated use in budding yeast.NucleicAcids Res.Jul1；24(13)：2519-24)。通过这种载体，cre重组酶在所述酵母中被表达，结果是两个loxP序列内的序列区将重组出去。结果是两个loxP序列中仅一个和各自的表达盒盒仍然包含在最初的各自的基因座中。结果是酵母菌株再次失去G418抗性并由此适合在酵母菌株中通过这种cre-lox系统整合或去除另外的基因。载体pSH47可以随后通过在补充有尿嘧啶(20mg/L)和FOA(5-氟乳清酸)(1g/L)的YNB琼脂平板上反选择被再次去除。为此，携带这种质粒的细胞必须首先在非选择性条件下被培养，随后在包含FOA的选择性平板上被选取。在这些条件下，仅那些本身不能够合成尿嘧啶的细胞可以生长。在这种情况下，这些是不再包含质粒(pSH47)的细胞。
实施例8：与相应的对照菌株酿酒酵母GRFura3相比，根据如上所述的本发明的酵母菌株的酵母培养物中琥珀酸含量的测定。
根据如上所述的本发明的酵母菌株和酿酒酵母GRFura3各自在28℃和160rpm在WMVIII培养基(Lang and Lomann，1995)中以20ml培养物的量培养48小时。随后，500μl的这种预培养物被转移到50ml的相同培养基的主培养物，均在摇动烧瓶中在28℃和160rpm被培养2天。在得到无细胞培养物上清液后，琥珀酸、乙酸和乙醇的含量通过HPCL分析测定。结果是与对照菌株相比，根据本发明的酵母菌株存在强烈增加的琥珀酸浓度。
实施例9：具有组成性活性还原性柠檬酸循环，用于生产有机酸，尤其是琥珀酸的微生物。
还原性柠檬酸循环，即，从丙酮酸和草酰乙酸、苹果酸和延胡索酸起始到琥珀酸的柠檬酸循环的非环状返回部分(图3f.)是用于在葡萄糖上生产琥珀酸的最大摩尔产率的先决条件。仅还原性柠檬酸循环结合乙醛酸循环在琥珀酸的生产期间允许通过NADH到NAD+的再氧化和CO2固定达到每mol葡萄糖1.71mol的琥珀酸的最大产率。
基因PYC1的在转录上去调节的反应在实施例2和实施例7中解释。PYC1编码两种丙酮酸羧化酶之一，其催化丙酮酸到草酰乙酸的CO2固定反应，其是还原性柠檬酸循环的第一步。
细胞溶质苹果酸脱氢酶(Mdh2p)催化下面的步骤，即，草酰乙酸到苹果酸的反应，其受到由葡萄糖诱导的增加的蛋白水解降解。
这种蛋白水解降解通过苹果酸脱氢酶(Mdh2p)被表达为最初的12N-末端氨基酸缩短的Mdh2p蛋白而被防止。为此，来自菌株酿酒酵母S288c的染色体酵母DNA的在“开放阅读框”(MDH2t，t＝截短的，缩短的)的开始处相应缩短的MDH2基因通过PCR被扩增并提供有限制连接物，随后在组成性ADH1启动子的控制下被整合入酵母染色体中。为了这种缩短的基因在酵母酿酒酵母中的去调节的表达，组成性ADH1启动子被使用，其通过长时间的天然序列的修饰导致不依赖于葡萄糖和乙醇的组成性表达(Lang and Looman，1995)。
用于在柠檬酸循环的还原性部分上的琥珀酸生产的下面的步骤是苹果酸到延胡索酸的反应。这种反应由酶延胡索酸酶(Fum1p)催化。苹果酸到延胡索酸的反应是热力学上非常不利的，因为延胡索酸酶对延胡索酸具有的亲和力是对苹果酸的17倍。
因此，延胡索酸酶在酵母中被异源表达，其起源于生物体，其天然运行混合酸发酵，因为这样的生物体的延胡索酸酶的关于苹果酸到延胡索酸的反应的热力学比在酿酒酵母中有利的多。
为此，来自菌株大肠杆菌(E.coli)JM109的染色体细菌DNA的基因fumB通过PCR被扩增并提供有限制连接物，随后在组成性ADH1启动子的控制下被整合入酵母染色体中。为了这种基因在酵母酿酒酵母中的去调节的表达，组成性ADH1启动子被使用，其通过长时间的天然序列的修饰导致不依赖于葡萄糖和乙醇的组成性表达(Lang and Looman，1995)。
用于在还原性柠檬酸循环上的琥珀酸模生产的最后的步骤是延胡索酸到琥珀酸的反应。这种反应在细胞溶质中通过酶延胡索酸还原酶(Frds1p)被催化。这种酶的过度表达增加了还原性琥珀酸生产的效率。为此，来自菌株酿酒酵母S288c的染色体酵母DNA的FRDS1基因通过PCR被扩增并提供有限制连接物，随后在组成性ADH1启动子的控制下被整合入酵母染色体中。为了这种缩短的基因在酵母酿酒酵母中的去调节的表达，组成性ADH1启动子被使用，其通过长时间的天然序列的修饰导致不依赖于葡萄糖和乙醇的组成性表达(Lang and Looman，1995)
通过酵母自身的异柠檬酸裂合酶(乙醛酸循环的主要酶之一)的磷酸化的葡萄糖-诱导的蛋白水解降解或失活通过异源异柠檬酸裂合酶在酵母酿酒酵母中被表达而被避免。这种酶起源于天然包含乙醛酸循环并是“Crabtree”-阴性的微生物，因为来自这样的生物体的异柠檬酸裂合酶不受到葡萄糖-诱导的负性调节，或者不受到在蛋白水平上的蛋白水解降解。活性乙醛酸循环对于在主要碳源上的具有高产率的有机酸的有效生产是必要的。
为此，来自菌株大肠杆菌(E.coli)JM109的细菌DNA的基因aceA通过PCR被扩增并提供有限制连接物，随后在组成性ADH1启动子的控制下被整合入酵母染色体中。为了这种基因在酵母酿酒酵母中的去调节的表达，组成性ADH1启动子被使用，其通过长时间的天然序列的修饰导致不依赖于葡萄糖和乙醇的组成性表达(Lang and Looman，1995)。
实施例10：具有减少的或失活的代谢物或葡萄糖阻遏，用于呼吸中心代谢的有机酸生产的微生物的生产。
除了上面描述的实施例的措施，下面描述的措施可以是合理的，因为由此在所有的变体中获得更好的产率。
在存在葡萄糖时减少的葡萄糖阻遏通过特异性影响合适的负责葡萄糖阻遏的转录因子和激酶获得。这样，有机羧酸，尤其是酵母的呼吸中心代谢的二羧酸和羟基脂肪酸，如，例如琥珀酸、延胡索酸、苹果酸、草酰乙酸在主要碳源上，如例如葡萄糖和其他己糖和戊糖上的生产效率在生产时间和产率方面被提高。
在主要碳源上有机羧酸的生产效率的这种提高产生自下面的性质，具有减少的或中止的葡萄糖阻遏的菌株与野生型相比包括下面的性质：
·碳通量通过柠檬酸和乙醛酸循环增加
·所述菌株具有更高和更快的生长
·乙醇和甘油形式的副产品的较少产生
·乙醛酸循环被扩大
·负责中心代谢中的CO2固定的酶被表达到增加的程度
·呼吸系统，如线粒体转运系统、呼吸链、线粒体生源的所有基因和用于氧化还原当量的交换的所有基因是有活性的
·柠檬酸和乙醛酸循环的酶在蛋白质水平上从葡萄糖-诱导的负性调节被去除
为了在存在葡萄糖和其他主要碳源的时，实现葡萄糖阻遏的特异性减少，2种基因被在转录上去调节或过度表达，其在存在葡萄糖时被强烈阻遏。为了这些基因在酵母酿酒酵母中的去调节的表达，组成性ADH 1启动子被使用，其通过长时间天然序列的修饰导致不依赖于葡萄糖和乙醇的组成性表达(Lang and Looman，1995)。
基因HAP4和SAK1被在转录上去调节。Hap4p是转录活化蛋白复合体Hap2/3/4/5的部分，Sak1p是用于磷酸化和进而Snf1/Snf4复合体的活化的主要激酶。为此，表达系统被使用，其允许HAP4和SAK1的同时在转录上去调节表达。
两种基因(HAP4和SAK1)通过PCR从菌株酿酒酵母S288c的染色体酵母DNA被扩增并提供有限制连接剂，随后在组成性ADH1启动子的控制下被单独地整合入酵母染色体中。
为了在存在葡萄糖或其他主要碳源时获得葡萄糖阻遏的特异性减少，另外的葡萄糖阻遏级联的基因缺失或由被调节的启动子控制。这是基因REG1，其编码Glc7p/Reg1p I型蛋白磷酸酶的调节亚基。非活性的Glc7p/Reg1p磷酸酶导致Snf1/Snf4复合体被磷酸化并由此保持活性，其非常有助于葡萄糖阻遏的减少或中止。
由于无活性基因REG1在酵母酿酒酵母中导致生长缺陷，所以由四环素调节的tetO启动子被包括在这个基因前。在羧酸生产过程的生长阶段期间，所述基因REG1在四环素可阻遏的tetO启动子的控制下被表达。在生产阶段期间，通过添加培养添加剂，如，四环素，到培养基，所述基因表达和进而Reg1p的酶活性以被调节的方式被去除。酿酒酵母被修饰以致靶基因的天然启动子例如，通过酵母基因组中的靶向整合被可阻遏的启动子交换，所述酵母菌株包含，如实施例1所描述的，tetO启动子系统所需的转录反式激活蛋白(tTA)。
在tetO启动子下调节的基因REG1的实际实施可以完全按照实施例4到6实现，仅置换被tetO启动子控制的基因，基因REG1必须被使用。

Claims (28)

1.分离的遗传修饰的微生物，其中天然基因MDH2被基因MDH2的截短的变体置换，和天然基因FUM1被来自不同于所述微生物的生物体的基因FUM1置换，和其中基因FRDS1被过度表达，和基因PYC1和/或PYC2之一或二者被过度表达。
2.根据权利要求1所述的微生物，其中基因MDH2的截短的变体编码MDH2蛋白，其最初的12个N－末端氨基酸，以及，任选地，C－末端脯氨酸被缩短。
3.根据权利要求1或2所述的微生物，其中所述微生物为酵母，并且其中基因FUM1选自包括“大肠杆菌、产琥珀酸厌氧螺菌、琥珀酸放线杆菌、Mannheimia succiniciproducens、谷氨酸棒杆菌”的组的生物体。
4.根据权利要求3所述的微生物，其中所述酵母选自包括“酵母菌属、复膜孢子酵母属、类酵母属、裂殖酵母属、威克酵母属、德巴利氏酵母属、汉逊酵母属、有孢汉逊酵母属、毕赤氏酵母属、克勒克酵母属、假丝酵母属、接合酵母属、Ogataea、Kuraishia、Komagataella、Yarrowia、梅奇氏酵母属、拟威尔酵母属、Nakazawaea、克鲁维酵母属、隐球酵母属、孢圆酵母属、布勒掷孢酵母属、红酵母、Willopsis和掷孢酵母属”的组。
5.根据权利要求3所述的微生物，其中所述酵母是酿酒酵母。
6.根据权利要求1或2所述的微生物，其中来自包括“FRDS1、PYC1和PYC2”的组的基因的至少一种在第二外源、组成性活性启动子的控制下。
7.根据权利要求6所述的微生物，其中所述第二外源、组成性活性启动子是ADH1启动子。
8.根据权利要求1~7任一项所述的微生物在琥珀酸生产中的应用。
9.根据权利要求1~7任一项所述的微生物在用于琥珀酸生产的方法中的应用，其中所述方法包括下面的步骤：
a）任选地，在需氧条件下在生长培养基中培养并繁殖所述微生物，
b）随后，任选地在厌氧条件下培养所述微生物，以及
c)在步骤b)之后或步骤b)期间，从培养物上清液分离琥珀酸，并任选地进行纯化。
10.根据权利要求9所述的应用，其中步骤a）被实施直到至少100 g 干生物量/l的细胞密度。
11.根据权利要求9所述的应用，其中步骤a）被实施直到至少120 g干生物量/l的细胞密度。
12.根据权利要求9所述的应用，其中步骤a）被实施直到至少140 g干生物量/l的细胞密度。
13.根据权利要求9~12任一项所述的应用，其中步骤b）被实施直到至少0.4 mol/l的琥珀酸浓度。
14.根据权利要求9~12任何一项所述的应用，其中步骤b）被实施直到至少0.8 mol/l的琥珀酸浓度。
15.根据权利要求9~12任何一项所述的应用，其中步骤b）被实施直到至少1.0 mol/l的琥珀酸浓度。
16.根据权利要求9~12任一项所述的应用，其中步骤a）在20~35 ℃的温度下实施，时间为1~1,000 h。
17.根据权利要求9~12任一项所述的应用，其中步骤a）在20~35 ℃的温度下实施，时间为2~500 h。
18.根据权利要求9~12任一项所述的应用，其中步骤a）在20~35 ℃的温度下实施，时间为2~200 h。
19.根据权利要求9~12任一项所述的应用，其中步骤a）在28~30 ℃的温度下实施，时间为1~1,000 h。
20.根据权利要求9~12任一项所述的应用，其中步骤a）在28~30 ℃的温度下实施，时间为2~500 h。
21.根据权利要求9~12任一项所述的应用，其中步骤a）在28~30 ℃的温度下实施，时间为2~200 h。
22.根据权利要求9~12任一项所述的应用，其中步骤b）在15~40 ℃的温度下实施，时间为1 ~ 1,000 h。
23.根据权利要求9~12任一项所述的应用，其中步骤b）在15~40 ℃的温度下实施，时间为2 ~ 500h。
24.根据权利要求9~12任一项所述的应用，其中步骤b）在15~40 ℃的温度下实施，时间为2 ~ 200 h。
25.根据权利要求9~12任一项所述的应用，其中步骤b）在20~35 ℃的温度下实施，时间为1 ~ 1,000 h。
26.根据权利要求9~12任一项所述的应用，其中步骤b）在20~35 ℃的温度下实施，时间为2 ~ 500 h。
27.根据权利要求9~12任一项所述的应用，其中步骤b）在20~35℃的温度下实施，时间为2 ~ 200 h。
28.用于生产根据权利要求1~7任一项的微生物的方法，
其中在野生型微生物中或在相对于野生型被遗传修饰或突变的初始生物体中，野生型基因MDH2和FUM1被缺失或失活，
其中所述MDH2基因的截短的变体和来自不同于所述微生物的生物体的外源FUM1基因被引入到所述微生物中，并且所述微生物被其转化，和
其中至少基因FRDS1和PYC1二者，在第二启动子的控制下被引入到微生物中，并且所述微生物被其转化。
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