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Mit
der Etablierung nukleinsäureanalytischer Methoden in der
klinischen und molekularbiologischen Laboratoriumspraxis, insbesondere
der klinischen Analytik, haben Methoden zur Nukleinsäureaufreinigung
eine rasante technologische Entwicklung durchlaufen. Besonderes
Augenmerk gilt vor allem Nukleinsäureisolationsverfahren,
die geeignet sind auf automatischen „Liquid Handling"-Systemen appliziert
zu werden. Herausragend sind hier Festphasenextraktionskonzepte,
d. h. die aus dem zu untersuchenden Probenmaterial zu isolierenden
Nukleinsäuren werden an feste Oberflächen gebunden,
in der Probenmatrix enthaltene Verunreinigungen aus dem heterogenen
System heraus gewaschen und anschließend die gereinigten
Nukleinsäuren von der festen Phase wieder abgelöst.
Eine außerordentliche Stellung in diesen Systemen nehmen
die Adsorbentien in Form von superparamagnetischen Mikropartikeln
ein, da durch die mögliche Manipulation dieser Adsorbentien
mit magnetischen Feldern ein manuelles Eingreifen in den Extraktionsverlauf
umgangen und der Prozeß damit besonders vorteilhaft vollautomatisch
gestaltet werden kann.
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Eines
der ältesten Verfahren, die dieses grundsätzliche
Prinzip nutzen, ist die von Gillespie und Vogelstein vorgeschlagene
Anwendung von silikatischen Materialien, wie fein verteiltem Glas,
an welche Nukleinsäuren in Pufferlösungen fixiert
werden, die im wesentlichen chaotrope Salze als Pufferbestandteil
verwenden [
Proc Natl Acad Sci U. S. A. 76 (1979) 615–9].
Van Boom hat dieses Verfahren unter Nutzung ähnlicher silicatischer
Matrices und Puffersysteme auf komplexere biologische Materialien
erweitert [
Boom R. et al. J.Clin. Microbiol. 37 (1999) 615–9,
EP 389 063 und CA
2271603 ]. Nachteilig in
diesen Systemen ist vor allem, dass die Nukleinsäuren nur
unter den chaotrophen Bedingungen, die zu ihrer Bindung an die festen
Oberflächen geführt haben, auch an den Oberflächen
verbleiben. Die zur Bindung der Nukleinsäuren notwendigen chaotropen
Salze stören aber empfindlich die an die Nukleinsäuerisolierung
folgende eigentliche Analytik.
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Diese
störenden chaotropen Salze wurden bislang durch den Einsatz
von Waschlösungen die einen erheblichen Anteil von in Wasser
löslichen organischen Lösungsmitteln haben (meist
deutlich mehr als 50 vol% organisches Lösungsmittel) von
der festen Phase gewaschen, wobei die zu isolierenden Nukleinsäuren
an der festen Phase gebunden bleiben. Diese organischen Lösungsmittel
haben jedoch auch ein ebenfalls erhebliches Inhibitionspotential
für die vor allem auf enzymatischen Reaktionen beruhende Nukleinsäureanalytik
und müssen deshalb vor der eigentlichen Elution der Nukleinsäuren entfernt
werden, was den Prozess erheblich verlangsamt und technisch kompliziert
(Temperaturerhöhung um Verdampfen zu beschleunigen, lange
Wartezeiten).
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Ein
auf der Nutzung nichtchaotroper Salze beruhendes Verfahren begründen
Bendzko et al. [
DE 19856064 ,
US 2001041332 ]. In dem
sie sogenannte kosmotrope Salzlösungen zur Bindung von
Nukleinsäuren an silikatische Oberflächen nutzen,
ohne dabei jedoch die prinzipiellen Nachteile des Ursprungverfahrens
zu beseitigen.
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In
US 2003049671 wird vorgeschlagen,
mit negativ geladenen Gruppen modifizierte vornehmlich silikatischen
Oberflächen zur Isolation von Nukleinsäuren zu
verwenden. Es werden jedoch keine Bedingungen unter denen Nukleinsäuren
an diese Materialien binden beschrieben und es ist nahe liegend das
der prinzipielle methodische Ansatz den Verfahren mit chaotropen
oder kosmotrope Salzen entspricht.
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Dagegen
wird die Nutzung von negativ geladenen Karboxylgruppen tragenden
magnetischen Mikropartikeln zur Isolierung von DNA durch Hawkins ausführlich
beschrieben [
WO 9609379 ],
der DNA unter Verwendung von Puffersystemen mit hohem Anteil von
Polyethylenglycol und nicht chaotropen Salzen an karboxyliert Oberflächen
bindet. Auch hier ist der Einsatz von organischen Lösungsmitteln
in den Waschpuffern erforderlich, um die Komponenten der Bindungspuffer
aus dem System zu entfernen. Ein ähnlicher Ansatz wird
in
WO 02066993 verfolgt.
Anstelle der Karboxylgruppen tragenden magnetischen Mikropartikel
werden hier Zellulosederivate mit speziellen magnetischen Eigenschaften
zur Nukleinsäureisolation mit Hilfe von polyethylenglycolhaltigen Puffern
vorschlagen.
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Die
Verwendung von silikatischen Materialien in Kombination mit Puffersystemen,
die organische Lösungsmittel enthalten, wird in
EP 0512 767 eingeführt.
Hier spielen die Polaritätsverhältnisse der Komponenten
im verwendeten heterogenen System eine entscheidende Rolle. Ebenfalls
müssen die organischen Lösungsmittel durch Evaporation
vor der eigentlichen Elution der Nukleinsäuren aus dem
System entfernt werden, da sonst die sich der Isolation anschließende
Nukleinsäureanalytik gefährdet ist.
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Methodisch
grundsätzlich anders ist das Verfahren, welches den so
genannten Charge Switch Mechanismus verwendet [
WO 0248164 ]. Hier werden Nukleinsäuren
in einem wässrigen Puffersystem mit einem schwach sauren
pH-Wert unter Nutzung eines Ionenaustauschmechanismus an positiv
geladene Oberflächen gebunden. Bei Beibehaltung des schwach
sauren pH-Wertes, werden in rein wässrigem Medium unter
kontrollierter Ionenstärke die Verunreinigungen aus dem
System heraus gewaschen und anschließend durch Einsatz
schwach alkalischer Bedingungen die Nukleinsäuren vom Träger
eluiert. Dies gelingt aufgrund der in das System eingebrachten ionenaustauschaktiven
Gruppen (i. d. R. aliphatische oder heterocyclische Aminogruppen),
deren Ladung in Abhängigkeit vom pH-Wert des Mediums positiv
oder neutral ist. Die Bindung der Nukleinsäuren an die
Oberflächen erfolgt dabei direkt unter Wechselwirkung der
negativ geladenen Nukleinsäuren mit der positiv geladenen
Oberfläche der beschriebenen Partikel.
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Problematisch
ist in diesem System, dass erstens eine Anbindung aller in der Probenmatix
enthaltenen Makromoleküle mit einer negativen Nettoladung
wahrscheinlich ist und damit die Koisolation von Proteinen und negativ
geladenen Polysacchariden, wie z. B. Heparin, droht, was die Qualität
der isolierten DNA negativ beeinflusst. Auch sind Ionenaustauschwechselwirkungen
sehr empfindlich gegenüber höheren Ionenstärken
und der Anwesenheit von Detergenzien im Bindungsmedium. Beides erfordert ein
sehr genaues Einstellen der Bindungsbedingungen (neben dem pH-Wert
besonders die Salzkonzentration und den Gehalt von z. B. kationischer
Detergenzien), was problematische Kompromisse bei der Ausgestaltung
der Lysebedingungen zum Aufschluß des Probenmaterials erzwingt.
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Demgegenüber
sind die eingangs beschriebenen, auf polaren Wechselwirkungen beruhenden Mechanismen
wesentlich robuster, was erhebliche Konsequenz für die
eingesetzten Lysepuffersysteme hat.
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Völlig überraschend
konnte festgestellt werden, dass Nukleinsäuren unter Einwirkung
von Puffern mit einem im Vergleich zum formulierten Stand der Technik
geringen Anteil von weniger als 30 vol% an teilweise oder komplett
wasserlöslichen organischer Lösungsmitteln, ionischen
und/oder nichtionischer Detergenzien und chaotropen Salzen an polare
Oberflächen, vorzugsweise mit organischen Säuren
modifizierten Oberflächen fester Stoffe adsorbiert werden
können. Diese Oberflächen erfordern grundsätzlich
keine strukturellen Eigenschaften, wie sie für Kieselgele
oder ähnliche silikatische Adsorbentien (Gläser)
typisch sind, etwa Silanolgruppen, Silizium-Sauerstoff-Siliziumbindungen
oder partiell geladene Silanolgruppenderivate.
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Durch
Waschen der an die genannten Oberflächen gebundenen Nukleinsauren
mit wässrigen Lösungen von Mediatoren, die sowohl
Affinität zur eingesetzten Oberfläche, als auch Affinität
zu Nukleinsäuren haben, kann der der Adsorption von Nukleinsäuren
an die eingesetzte Oberfläche zugrunde liegende Mechanismus
von einer direkten Wechselwirkung der Nukleinsäuren mit
der Oberfläche, in eine durch den Mediator vermittelte,
indirekte umgewandelt werden. Das führt dazu, dass die
Oberflächen mit rein wässrigen Puffern, ohne Zusatz
bindungsvermittelnder Substanzen zu den Waschpuffern, wie die eingangs
beschriebenen chaotropen oder kosmotropen Salze oder organische
Lösungsmittel, gewaschen werden können. Erst das
Aufheben der Wechselwirkung des Mediators mit der gebundenen Nukleinsäure,
was vorteilhaft durch Erhöhung des pH Wertes, der Temperatur
oder beider Parameter erfolgen kann, führt zur Elution
der Nukleinsäure von der festen Oberfläche.
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In
einer besonderen Ausführungsform der Erfindung kann die
Analytik, die sich an die Nukleinsäureisolation anschließt,
auch ohne die Elution der Nukleinsäuren von der Oberfläche
erfolgen.
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Die
Bindung erfolgt vorteilhaft bei pH-Werten um den Neutralpunkt.
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Dabei
ist die Struktur der erfindungsgemäßen Oberfläche
polaren Charakters, besonders bevorzugt ist die Modifikation mit
organischen Säuren wie Phosphorsäureestern, Phosphonsäure-,
Sulfonsäure- oder Karbonsäurederivaten, besonders
bevorzug sind Karbonsäurederivate. Auch Kombinationen der
erwähnten Säuregruppierungen können erfolgreich
verwendet werden, ebenso wie die Kombination von polaren Säuregruppen
mit anderen polaren, aber auch unpolaren organischen Gruppen, wie Ether-,
Hydroxyl-, Alkyl- oder Alkylengruppen.
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Die
Möglichkeit der Bindung von Nukleinsäuren an die
mit organischen Säuren modifizierten Oberflächen
unter den beschriebenen Pufferbedingungen überraschte besonders,
da beide interagierenden Spezies bei pH Werten in der Nähe
des Neutralpunktes negativ geladen sind und sich elektrostatisch
abstoßen, was einer Adsorption entgegenwirkt. Trotz dieser
Tatsache lassen sich die Nukleinsäuren an die beschriebenen
Oberflächen mit der genannten Pufferkomposition binden.
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Besonders
effektiv funktioniert das Verfahren, wenn die organischen Säuren
in der Form ihrer polymeren Derivate als homo- und/oder copolymere Strukturen
auf die Oberfläche aufgebracht werden.
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Damit
ist ein überraschend einfaches Verfahren gefunden worden,
welches es erlaubt, aus einer Vielzahl von unterschiedlichen Nukleinsäuren
enthaltenden Lösungen, auf einfache, kostengünstige
und schnelle Weise Nukleinsäuren in hoher Reinheit zu isolieren.
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Dem
Fachmann ist die chemische Struktur der Nukleinsäuren im
Sinne dieser Erfindung bekannt. Es werden unter Nukleinsäuren
sowohl native Desoxyribonukleinsäuren (im Weiteren als
DNA bezeichnet), wie auch Ribonukleinsäuren (im Weiteren als
RNA bezeichnet) mit einer Kettenlänge von mehr als 20 Basenpaaren,
insbesondere mehr als 100 Basenpaaren verstanden.
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Dabei
ist der chemische bzw. biologische Ursprung der Nukleinsäuren
nicht für die Möglichkeit ihrer Isolierung nach
dem erfindungsgemäßen Verfahren von Belang.
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Es
können Nukleinsäuren aus biologischen Flüssigkeiten
wie beispielsweise Blut, Plasma, Serum oder Bakterienkulturen isoliert
werden. Die biologische Rolle der Nukleinsäuren ist dabei
unerheblich. Es können beispielsweise sowohl genomische
Nukleinsäuren aus Zellkernen, wie auch Nukleinsäuren aus
Organellen, etwa Mitochondrien, nach dem erfindungsgemäßen
Verfahren isoliert werden.
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Manchmal
ist es von Vorteil, insbesondere bei der Isolierung von Nukleinsäuren
aus biologischen Materialien, die ursprünglichen Probenmaterialien
mit Hilfe von enzymatischen Prozessen, mechanischen oder thermischen
Behandlungen oder Kombinationen dieser Verfahren, vor der eigentlichen Isolierung
aufzuschließen und die Nukleinsäuren leichter
der Isolierung zugänglich zu machen.
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Ebenso
ist neben der Isolierung von Nukleinsäuren aus biologischen
Materialien die Isolierung von Nukleinsäuren aus Mischungen
und Rezepturen zur in vitro Manipulation von Nukleinsäuren
möglich. Beispielhaft seien hier erwähnt Reaktionsgemische zur
DNA Sequenzierung, Reaktionsansätze der Polymerasekettenreaktion
(PCR), Reaktionsansätze zur Spaltung von Nukleinsäuren
mit Restriktionsendonukleasen.
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Unter
Oberflächen im Sinne dieser Erfindung werden insbesondere
Phasengrenzflächen zwischen flüssigen und festen
Phasen verstanden.
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Polare
Gruppen im Sinne der Erfindung sind vorzugsweise nichtionische polare
Gruppen, wie Hydroxyl- oder Thiolgruppen, oder negativ geladene Gruppen,
vorzugsweise organische Säuren, wie Phosphorsäuremono
und -diester, Phosphon-, Sulfon- oder Karbonsäuren. Es
können diese funktionellen Gruppen als funktionelle Spezies
allein oder im Gemisch der genannten Funktionalitäten auf
einer Oberfläche kovalent fixiert werden.
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Die
für das erfindungsgemäße Verfahren notwendigen
festen Phasen mit organischen Säureresten auf der Oberfläche
lassen sich durch direkte Synthese aus den Monomeren polymerisationsfähiger
organischer Säuren herstellen, wobei es vorteilhaft sein
kann, dem Polymerisationsansatz zusätzliche Komponenten,
wie Vernetzer oder Löslichkeit vermindernde Monomere zuzusetzen.
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Verfahren
zur Polymerisation sind aus dem Stand der Technik bekannt. Vorteilhafterweise
erfolgt die Polymerisation der Monomeren organischen Säuren
in Gegenwart einer vernetzenden Monomerkomponente, im organischen
Lösungsmittel, da hier die Produkte aus dem Reaktionsansatz
ausfallen und leicht abzutrennen sind.
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Weiterhin
sind dem Fachmann Verfahren zur Aufbringung funktioneller Gruppen
auf Trägermaterialien hinlänglich bekannt. Beispielhaft
seien hier angeführt die Aminofunktionalisierung von silikatischen Materialien
durch Reaktion mit 3-Aminopropyltriethoxysilan und dem anschließenden
Umsatz mit Bernsteinsäureanhydrit zur Fixierung von Karboxylgruppen
oder der Reaktion von Hydroxylgruppen einer Oberfläche
mit in Phosphorsäure gelösten Phosphor(V)oxid
zur Aufbringung von Phosphorsäureestergruppen. Weitere
Verfahren zur Oberflächenmodifikation sind in bei Weetall
[Methods in Enzymology (1976) 134) ausführlich
beschrieben.
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Besonders
vorteilhaft im Sinne dieser Erfindung ist die Verwendung von polymeren
organischen Säureresten, wie sie auch in
WO 2005066361 beschrieben sind.
Dabei kann es sich um Homopolymere der organischen Säuren
handeln, wie beispielsweise Polyacryl- oder Polymethacrylsäure.
Ebenso eignen sich Heteropolymere von organischen Säuren,
wie beispielsweise Mischpolymerisate von Styrensulfonsäure
und Maleinsäure. Auch Heteropolymere aus polymerisationsfähigen
organischen Säuren und Monomerkomponenten, die keine Säuregruppierung
haben, werden als polymere organische Säuren im Sinne dieser
Erfindung betrachtet.
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Die
Anbindung dieser polymeren organischen Säuren auf die Oberfläche
der festen Phasen erfolgt dabei nach ähnlichem chemischen
Prinzipien wie sie beim Modifizieren von Oberflächen mit
monomeren Säuregruppierungen zum Einsatz kommen. Beispielhaft
seien hier erwähnt die Reaktion mit an fester Phase gebundenen
Aminogruppen mit polymeren Sulfonsäurechloriden oder mit
Polyacrylsäuren in Gegenwart von Kondensationsreagenzien
wie Karbodiimiden.
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Werden
organischen Säuren als Modifikation auf feste Phasen aufgebracht,
können als feste Phasen organische Materialien, insbesondere
organische Polymere mit funktionellen Gruppen, beispielsweise Aminogruppen
oder Hydroxylgruppen auf deren Oberfläche verwendet werden.
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Auch
anorganische mineralische Oberflächen von z. B. Kieselgelen,
Kieselgelen mit superparamagnetischen Eigenschaften, als Glasplatten
ausgebildete Mikroreaktoren, Glaskapillaren sind als modifizierbare
Oberflächen zur Nukleinsäureisolation einsetzbar.
Die ursprünglich in den genannten Materialien vorhandenen
Oberflächensstrukturen werden dabei durch die Oberflächenmodifikation
in der Weise verändert, dass das modifizierte Material
kein dem Ausgangsmaterial entsprechende Adsorbtionseigenschaften
mehr besitzt, demzufolge nicht mehr als Adsorptionsmaterial mit
den für die Stoffklasse typischen Adsorptionseigenschaften
eingesetzt werden kann.
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Zur
Nukleinsäureisolation nach dem erfindungsgemäßen
Verfahren wird eine nukleinsäurehaltige Lösung,
vorzugsweise eine durch eine enzymatische Behandlung in einem Lysepuffer
oder durch einen mechanischen Aufschluß vorbehandelte biologische
Probe, wobei die biologische Probe eine Körperflüssigkeit
wie Blut oder dessen Bestandteile, Urin, Teil einer Pflanze, Materialien
aus der forensischen, wie klinischen Analytik, insbesondere Schleimhautabstriche
von Wangenschleimhäuten, getrocknete Blutspuren, Haare,
Epitelzellen sein kann, mit einem Bindungspuffer in Gegenwart einer festen
Phase, deren Oberfläche polare Gruppierungen, insbesondere
organische Säuren aufweist, gemischt.
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Das
entstehende Gemisch von Bindungspuffer und biologischer Probe enthält
neben dem Bestandteilen des Puffers der zum Lysieren der biologischen
Probe eingesetzt wurde, mindestens ein chaotropes Salz in einer
Konzentration von 1–2 Mol/l, vorzugsweise 1,5 Mol/l, ein
mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel in einer
Konzentration von 10– 50 vol% vorzugsweise 25–30
vol%, und ein ionisches und/oder nichtionisches Detergent mit einer Konzentration
von 1–20%, vorzugsweise 3–10%.
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Als
chaotropes Salz werden bevorzugt Guanidiniumsalze, insbesondere
Guanidiniumhydrochlorid zur Anwendung gebracht.
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Als
organische Lösungsmittel besonders geeignet sind Alkohole,
vorzugsweise mit einer unverzweigten aliphatischen Kohlenstoffkette
von mindestens 2 Kohlenstoffatomen, besonders bevorzugt sind drei
Kohlenstoffatome.
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Bevorzugte
nicht ionische Detergenzien sind die aus der Reihe der mit dem Trivialnamen
Tween vertriebenen, besonders bevorzugt Tween 20.
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Als
ionische Detergenzien besonders geeignet sind Derivate von Karbonsäuren,
insbesondere das Natriumsalz des N-Laurylsarcosins.
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Die
stoffliche Natur der festen Phase ist für das erfindungsgemäße
Verfahren nicht erheblich sondern die Eigenschaften der Oberfläche
der festen Phase.
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Als
feste Phase kommen vor allen oberflächenmodifizierte organische
Polymere oder mineralische Materialien, vorzugsweise mit inherenten
magnetischen Eigenschaften, besonders superparamagnetische Mikropartikel
mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 2–100 μm,
besonders 3–8 μm zum Einsatz.
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Der
pH-Wert der Bindungsmischung beträgt zwischen 4 und 7,
bevorzugt Werte zwischen 6 und 7, ganz besonders 6,5.
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Nach
Binden der Nukleinsäuren an die modifizierte Oberfläche
wird der Überstand abgenommen und die an die Oberfläche
gebundenen Nukleinsäuren mit einem Waschpuffer gewaschen,
der ein Mediatormolekül mit Affinität zur festen
Phase und zu Nukleinsäuren, vorzugsweise ein oligomeres
Polyamin, besonders bevorzugt sind Derivate des Polyethylenimins,
enthält.
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Der
pH-Wert des Waschpuffers beträgt zwischen 4 und 7, bevorzugt
Werte zwischen 6 und 7, ganz besonders 6,5.
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Als
oligomeres Polyamin können Verbindungen vom Typ kurzkettiger
Polyethylenimine, bevorzugt oligomere Polyamine des Types Spermin,
Spermidin oder Putrescin und verwandte Strukturen in einer Konzentration
von 0,1 bis 20 mM. Besonders geeignet sind Konzentrationen der oligomeren
von 0,5–3 mM Polyethylenimin.
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Letzte
Spuren von Verunreinigungen können in einem weiteren Waschschritt
mit reinem Wasser oder salzarmen, schwach gepufferten wässrigen
Lösungen entfernt werden.
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Die
Elution der Nukleinsäuren erfolgt dann unter Bedingungen,
die die Wechselwirkung zwischen der Nukleinsäure und dem
funktionalen Mediator und oder dem Mediator und der polaren Oberfläche
aufheben, vorzugsweise bei einem pH-Wert zwischen 8 und 10, insbesondere
bei 8,5 und Temperaturen von 20 bis 75°C, vorzugsweise
im Bereich 30–55°C.
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Die
isolierten Nukleinsäuren sind in der PCR und anderen molekularbiologischen
Analysenverfahren einsetzbar.
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In
einer besonderen Ausführungsform der Erfindung entfällt
die Elution der Nukleinsäuren von der modifizierten Oberfläche
und die an die Oberfläche gebundenen Nukleinsäuren
werden direkt und ohne eluiert zu werden in die molekularbiologische Analytik
eingebracht.
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Die
Erfindung soll nun anhand von einigen Beispielen erklärt
werden, ohne sie jedoch auf diese Beispiele zu beschränken.
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Beispiel 1:
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Herstellung vernetzter Karboxylgruppen
tragender magnetischer Mikropartikel
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2
ml Acryl saure, 2 ml Ethylenglycol-bis-methacrylat, 10 ml Methacrylsäureethylester,
2 g frisch gefälltes Eisen-(II,III)-oxid und 100 mg Dodecylsulfat Natriumsalz
werden in 130 ml Ethanol gelöst und 10 Minuten mit Argon
gespült.
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Dann
gibt man 200 mg Benzoylperoxid zur Mischung und erhitzt auf 75°C.
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Es
wird 17 Stunden bei dieser Temperatur gerührt, dann mit
Hilfe eines starken Permanentmagneten die magnetischen Bestandteile
aus der Mischung entfernt, 3 mal mit 200 ml Ethanol gewaschen, wobei
die magnetischen Bestandteile der Mischung immer mit Hilfe eines
starken Permanentmagneten separiert werden.
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Dann
saugt man ab und trocknet an der Luft.
Ausbeute: ca. 10 g irreguläre
Partikel
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Beispiel 2:
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Herstellung von aminopropyliertem Kieselgel
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10
g magnetisches Kieselgel (AGOWA GmbH) werden 24 Stunden in einer
1%igen Lösung von Aminopropyl-triethoxysilan in Ethanol
am Rückfluß gekocht.
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Dann
saugt man das modifizierte Kieselgel ab, wäscht zweimal
mit Ethanol, trocknet an der Luft und erhitzt anschließend
4 h auf 110°C im Trockenschrank.
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Beispiel 3:
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Bindung von Polyacrylsäure auf
aminopropyliertem magnetisches Kieselgel
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5
g des im Beispiel 2 hergestellten Kieselgels werden in 100 ml eine
1%igen Acrylsäurelösung (MW 4.000.000, Aldrich)
in 10 mM Imidazolpuffer, pH 7 suspendiert.
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Zu
dieser Mischung gibt man 50 mg EDC [N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethyl-carbodiimid-hydrochlorid]
und rührt 4 Stunden bei Raumtemperatur.
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Dann
saugt man das Kieselgel ab, wäscht es dreimal mit ca. 100
ml Wasser und trocknet es an der Luft.
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Beispiel 4
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Bindung von Polyacryl saure auf aminogruppentragenden
Polystyrenpartikel
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5
ml einer 10%igen Suspension von Polystyrenmikropartikeln (EM2, VWR
International) mit einem mittleren Teilchendurchmesser von 3 μm
werden zu 5 ml einer 2%igen Polyacrylsäurelösung
in 20 mM Imidazolpuffer, pH 7 gegeben. Man addiert 10 mg EDC [N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethyl-carbodiimid-hydrochlorid]
und rührt 4 h bei Raumtemperatur. Dann werden die magnetischen
Mikropartikel mit Hilfe eines starken Permanentmagneten abgetrennt und
mit zweimal 20 ml destilliertem Wasser gewaschen, wobei die Partikel
jedes mal mit einem Permanentmagneten separiert werden.
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Beispiel 5:
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Isolierung von DNA aus humanem EDTA Blut
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10 μl
Blut werden mit 90 μl Lysepuffer (1% SDS, 50 mM TrisHCl,
0,1 M NaCl, 20 mM EDTA, pH 8) und 5 μl Proteinase K Lösung
(40 μg/ml) gemischt und 10 Minuten bei 55°C inkubiert.
Das Lysat wird zu einer Mischung aus 15 μl einer Suspension
der im Beispiel 3 hergestellten Partikel (100 mg Partikel in 1 ml
Wasser) und 300 ml Bindungspuffer (2 M Guanidinhydrochlorid, 10%
Laurylsarcosin-Natriumsalz, 30 vol% Ethanol, 20 mM BisTris pH 6,5))
gegeben. Alle Komponenten werden sorgfältig gemischt und
2 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
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Dann
separiert man die Magnetpartikel mit der gebundenen DNA und wäscht
mit 500 μl 3 mM Spermidinhydrochloridlösung in
10 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 6,5 und anschließend mit
500 μl destilliertem Wasser.
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Die
an die Partikel gebundene DNA wird dann in 50 μl TE (10
mM TrisHCl pH 8, 1 mM EDTA) im Verlauf von 10 Minuten bei 55°C
eluiert.
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Beispiel 6:
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Isolation von DNA aus Pflanzenmaterialien
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Ca.
30 mg pflanzliche Keimblätter werden mit 250 μl
eines Lysepuffers (1% CTAB, 10 mM TrisHCl pH 8, 50 mM EDTA, 0,1
M Natriumchlorid) versetzt und in einer Kugelmühle gemahlen.
Anschließend inkubiert man das Mahlgut für 10
Minuten bei 55 Grad und zentrifugiert dann die festen Bestandteile
ab.
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200 μl
des von Feststoffen freien Lysates werden mit 30 μl der
Partikelsuspension und 500 μl des Bindungspuffers, die
im Beispiel 5 verwendet wurden, versetzt und alle Komponenten gut
durchmischt.
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Nach
Abtrennen der an die Magnetpartikel gebundenen DNA wird wiederum
mit 500 μl Waschpuffer (3 mM Spermidinhydrochloridlösung
in 10 mM Kaliumphosphatpuffer) und anschließend mit 500 μl Wasser
gewaschen.
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Die
an die Partikel gebundene DNA wird dann in 100 μl TE (10
mM TrisHCl pH 8, 1 mM EDTA) im Verlauf von 10 Minuten bei 55 Grad
eluiert.
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Beispiel 7:
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DNA Isolation aus einem Mundschleimhautabstrichen
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Ein
Wattetupfer, der zur Isolation von Schleimhautzellen aus dem Mund
benutzt wurde, wird in 150 μl Lysepuffer (1% SDS, 50 mM
TrisHCl, 0,1 M NaCl, 20 mM EDTA, pH 8), der 5 μl einer
Proteinase K Lösung (4 mg/ml Wasser) enthält gesteckt und
für 10 Minuten bei 55°C inkubiert.
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Das
Inkubationsgefäß wird mit einem kleinen Loch am
Boden versehen und in ein Auffanggefäß gesteckt.
Durch Zentrifugation trennt man die flüssigen Bestandteile
des Lysates ab.
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100 μl
des Lysates werden zu einer Mischung aus 15 μl einer Suspension
der im Beispiel 3 hergestellten Partikel (100 mg Partikel in 1 ml
Wasser) und 300 ml Bindungspuffer (2 M Guanidinhydrochlorid, 10%
Laurylsarcosin-Natriumsalz, 30 vol% Ethanol, 20 mM BisTris pH 6,5))
gegeben. Alle Komponenten werden sorgfältig gemischt und
2 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
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Dann
separiert man die Magnetpartikel mit der gebundenen DNA und wäscht
mit 500 μl 3 mM Spermidinhydrochloridlösung in
10 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 6,5 und anschließend mit
500 μl destilliertem Wasser.
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Die
an die Partikel gebundene DNA wird dann in 50 μl TE (10
mM TrisHCl pH 8, 1 mM EDTA) im Verlauf von 10 Minuten bei 55 Grad
eluiert.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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-
Zitierte Patentliteratur
-
- - EP 389063 [0002]
- - EP 2271603 [0002]
- - DE 19856064 [0004]
- - US 2001041332 [0004]
- - US 2003049671 [0005]
- - WO 9609379 [0006]
- - WO 02066993 [0006]
- - EP 0512767 [0007]
- - WO 0248164 [0008]
- - WO 2005066361 [0029]
-
Zitierte Nicht-Patentliteratur
-
- - Proc Natl
Acad Sci U. S. A. 76 (1979) 615–9 [0002]
- - Boom R. et al. J.Clin. Microbiol. 37 (1999) 615–9 [0002]
- - Methods in Enzymology (1976) 134 [0028]