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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Sekundärmetaboliten
aus Mikroalgen durch in vivo Extraktion. Vorzugsweise ermöglicht das
Verfahren die in vivo Extraktion von Astaxanthin aus Mikroalgen
der Gattung Haematoccocus pluvialis, ohne dass jedoch die grundsätzliche
Lösung
hierauf beschränkt
wäre.
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Aus
Biomassen, insbesondere aus Mikroalgen gewonnene Sekundärmetabolite,
wie Astaxanthin, Xantaxanthin, Alpha-, Beta- und Gamma-Carotin,
Lutein, Zeaxanthin, Violaxanthin und Kryptoxanthin, gewinnen seit
einiger Zeit zunehmende wirtschaftliche Bedeutung. Astaxanthin,
ein fettlösliches Pigment
der Gruppe der Carotinoide, ist beispielsweise von großer Bedeutung
in der Fischaufzucht. Hier wird es in Abwesenheit entsprechender
natürlicher
Quellen zugefüttert.
Eine besondere Bedeutung kommt dem Astaxanthin beispielsweise bei
der Aufzucht japanischer Zierkarpfen, den Kois, zu, deren Wert maßgeblich
durch die Art ihrer, durch die Zufütterung von Astaxanthin beeinflussbaren
Färbung
bestimmt wird. Zur Bereitstellung der nötigen Mengen Astaxanthins oder
auch anderer, insbesondere nährstoffreicher
Sekundärmetabolite,
werden Mikroalgen in großindustriellem
Maßstab
kultiviert und aus ihnen durch geeignete Extraktionsverfahren die
Sekundärmetabolite
extrahiert.
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Nach
den bisher im Wesentlichen eingesetzten Verfahren werden zunächst größere Mengen
von Mikroalgen in einer geeigneten Nährlösung kultiviert, danach die
Biomasse geerntet, das heißt
von der Nährlösung getrennt.
Eine entsprechendes Ernteverfahren ist beispielsweise aus der
DE 101 36 645 B4 bekannt.
Danach werden die Sekundärmetabolite aus
der geernteten Biomasse unter Einsatz von Lösungsmitteln extrahiert. Bei
den bislang angewandten Verfahren stirbt die jeweilige, als Lieferant
der Sekundärmetabolite
dienende Biomasse bei der Extraktion ab. Ein entsprechendes Extraktionsverfahren wird
beispielsweise durch die
US 4,680,314 beschrieben.
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Im
Allgemeinen ist jedoch die Kultivation entsprechender Mengen von
Mikroalgen vergleichsweise aufwändig
und zeitintensiv, da diese häufig
relativ geringe Wachstumsraten aufweisen. Auf der anderen Seite
handelt es sich bei den so genannten Sekundärmetaboliten, im Gegensatz
zu den Primärmetaboliten,
um Metabolite, denen keine essenzielle Rolle beim Zellwachstum und
Zellstoffwechsel zukommt, so dass es denkbar ist, sie in vivo aus
der Biomasse zu extrahieren sowie die Biomasse danach weiter zu kultivieren
und sie so für
eine erneute Extraktion von Sekundärmetaboliten zu nutzen.
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Ein
Verfahren zur in vivo Extraktion wird durch die
EP 1 361 280 A1 beschrieben.
Gemäß der
EP 1 361 280 A1 erfolgt
die Gewinnung der Sekundärmetabolite
durch ein so genanntes Melken der Zellen, insbesondere von Mikroalgen
in einem, aus einer wässrigen
Phase mit der Biomasse und einer biokompatiblen organischen Phase
bestehenden Kulturmedium sowie eine anschließende Trennung der mit den
Metaboliten beladenen organischen Phase von der wässrigen.
Dazu wird die in einem ersten Bioreaktor kultivierte Biomasse in
einen zweiten Bioreaktor überführt und
hier, nachdem sie zur Stimulation einer vermehrten Bildung von Sekundärmetaboliten,
wie insbesondere Carotinoide, unter Stress gesetzt wurde, mit einem
biokompatiblen, das heißt,
die Lebensfähigkeit
der Biomasse erhaltenden Lösungsmittel
versetzt. Zur Durchführung
der Extraktion werden die flüssige
Phase mit der Biomasse und das Lösungsmittel über eine
gewisse Zeit ständig
umgewälzt.
Dieser Umwälzvorgang
wird mit dem Abschluss der Extraktion gestoppt. Hierdurch bildet
sich in dem Bioreaktor ein Zwei-Phasen-System aus, bei dem sich
die mit den Sekundärmetaboliten
beladene organische Phase oberhalb der wässrigen Phase mit der weiterhin
lebensfähigen
Biomasse absetzt. Die aus dem Lösungsmittel
und den extrahierten Sekundärmetaboliten
bestehende organische Phase wird dann an der Oberfläche des
Zwei-Phasen-Systems abgezogen. Schließlich wird das Lösungsmittel
durch Verdampfen von den Metaboliten getrennt.
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Für das beschriebene
Verfahren ist die Ausbildung eines stabilen Zwei-Phasen-Systems nach der
Beendigung des Umwälzvorganges
und der mit ihm verbundenen Extraktion von großer Bedeutung. Nur ein stabiles
Zwei-Phasen-System
gestattet es, die organische, mit den Metaboliten beladene Phase von
der flüssigen
Phase abzuziehen. Um die Ausbildung eines entsprechend stabilen
Zwei-Phasen-Systems zu gewährleisten,
werden daher gemäß dem beschriebenen
Verfahren, höhere
Alkane, wie Oktanol, als Lösungsmittel
verwendet. Diese haben allerdings verhältnismäßig hohe Siedepunkte, wodurch sich
in nachteiliger Weise der Aufwand für die spätere Trennung des Lösungsmittels
von den Sekundärmetaboliten
erhöht.
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Aus
der
DE 103 01 669
A1 ist es bekannt, Biomaterial in ein keramisches Kompositmaterial
einzubinden und es dabei unter Verwendung eines nanopartikulären Verfestigungsmaterials
in einem Sol-Gel-Prozess zu immobilisieren.
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Aufgabe
der Erfindung ist es, ein alternatives Verfahren zur in vivo Extraktion
von Sekundärmetaboliten
aus Mikroalgen bereitzustellen, welches die Nachteile des Standes
der Technik vermeidet. Insbesondere soll das dazu zu schaffende
Verfahren eine in vivo Extraktion der Sekundärmetabolite ermöglichen
und so gestaltet sein, dass für
die Extraktion Lösungsmittel
verwendet werden können,
welche mit geringem Aufwand von den Sekundärmetaboliten zu trennen sind.
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Die
Aufgabe wird durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Hauptanspruchs
gelöst.
Vorteilhafte Aus- beziehungsweise Weiterbildungen der Erfindung
sind durch die Unteransprüche
gegeben.
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Nach
dem vorgeschlagenen Verfahren zur Gewinnung von Sekundärmetaboliten
aus Mikroalgen durch in vivo Extraktion erfolgt die Extraktion der Sekundärmetabolite,
wie beispielsweise aus der
EP 1
361 280 A1 bereits bekannt, unter Verwendung eines die
Lebensfähigkeit
der Mikroalgen erhaltenden Lösungsmittels.
Jedoch werden die Mikroalgen dazu, wie wiederum von anderen, die
Extraktion nicht in vivo durchführenden
Verfahren bekannt, zunächst aus
einer wässrigen,
ihrer Kultivation dienenden Nährlösung geerntet.
Dabei kann die Ernte der Algenbiomasse unter Erhalt der Vitalität der Mikroalgen beispielsweise
gemäß dem in
der
DE 101 366 45
B4 beschriebenen Verfahren oder durch einfaches Aufkonzentrieren
erfolgen.
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Erfindungsgemäß wird die
geerntete Algenbiomasse zur Extraktion der Sekundärmetabolite
an einem Festkörpersubstrat
immobilisiert und das Festkörpersubstrat
mit der daran immobilisierten Algenbiomasse mit dem der Extraktion
dienenden Lösungsmittel
in Berührung
gebracht. Die Immobilisierung der Algenbiomasse erfolgt erfindungsgemäß dadurch, dass
diese in eine auf das Festkörpersubstrat
aufgetragene poröse
Schicht eingebettet wird.
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Dazu
weist das erfindungsgemäße Verfahren
vorzugsweise den im Folgenden im Detail dargestellten Ablauf auf.
- 1. Die geerntete Algenbiomasse wird in einer wässrigen
oder wässrigalkoholischen
Dispersion eines Sols oder Solgemisches suspendiert, wobei nachfolgend
vereinfachend im allgemeinen nur von einem Sol gesprochen werden
soll, hiervon aber im Kontext der Beschreibung und der Patentansprüche stets
auch die Möglichkeit
der Verwendung eines Solgemisches umfasst sein soll. Bei dem Sol
handelt es sich um eines (oder eben auch um ein Gemisch) der folgenden
Sole:
a.) Siliziumdioxid-Sol,
b.) Metalloxid-Sol eines
Metalls der 2. bis 5. Haupt- oder Nebengruppe,
c.) organisch
modifiziertes Sol eines der unter b) genannten Metalloxide, erhalten
durch Hydrolyse des entsprechenden Metallalkoxids unter gleichzeitiger
Zugabe eines Alkyl-trialkoxysilans oder eines Dialkoxydsilans.
- 2. Mit dem Sol und der darin suspendierten Algenbiomasse wird
ein Festkörpersubstrat
beschichtet.
- 3. Das in einem Sol-Gel-Prozess auf dem Festkörpersubstrat
kondensierende und schließlich gelierende
Sol mit der darin suspendierten Algenbiomasse wird getrocknet. Dabei
wird die Algenbiomasse homogen in die Matrix des sich bildenden Gels
eingebettet und auf dem Festkörpersubstrat bildet
sich eine poröse,
biologisch aktive Schicht.
- 4. Das mit der biologisch aktiven Schicht versehene Festkörpersubstrat
wird zur Extraktion der Sekundärmetabolite
mit einem Lösungsmittel
in Berührung
gebracht. Dabei dringt das Lösungsmittel durch
die Poren der biologisch aktiven Schicht zu der Algenbiomasse vor
und durchdringt deren Zellwände,
wobei die Sekundärmetabolite
durch Diffusion aus der Algenbiomasse herausgelöst werden.
- 5. Das mit den extrahierten Sekundärmetaboliten beladene Lösungsmittel
wird schließlich
abseits des Festkörpersubstrats
und dessen biologisch aktiver Schicht verdampft. Nach dem Abdampfen des
Lösungsmittels
verbleiben die Sekundärmetabolite
in dem dazu beispielsweise verwendeten Vakuum-Rotationsverdampfer.
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In
den Solen sind das Siliziumdioxid beziehungsweise das oder die Metalloxide
als Nanopartikel enthalten. Das Verfahren macht es sich zunutze, das
diese Nanopartikel das natürliche
Bestreben zur dreidimensionalen Vernetzung und einem damit einhergehenden
Partikelwachstum (als Sol-Gel-Prozess bezeichnet) haben, wobei das
entsprechende Sol in ein Gel übergeht.
Die Vernetzung beziehungsweise Gelierung des Sols auf dem mit ihm
beschichteten Festkörpersubstrat
beginnt bei geeigneten Umgebungsbedingungen, sobald das Substrat
aus dem Sol, mit der darin erfindungsgemäß suspendierten Algenbiomasse
entfernt wird und setzt sich im Zuge der im Punkt 3 angesprochenen
Trocknung fort, wobei das Trocknen schließlich zur Ausbildung einer
porösen
Schicht auf dem Festkörpersubstrat
führt,
in welche die Algenbiomasse homogen eingebettet ist.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
ist vorzugsweise so weitergebildet, dass die auf dem Festkörpersubstrat
in die biologisch aktive Schicht eingebettete Algenbiomasse nach
der Extraktion der Sekundärmetabolite
erneut kultiviert wird und nach der hierdurch gegebenen Erholungsphase
sowie einer sich daran, zur Stimulation einer vermehrten Bildung von
Sekundärmetaboliten
anschließenden
Stressphase für
eine erneute, in gleicher Weise erfolgende Extraktion zur Verfügung steht.
Dieser gesamte Vorgang, also das erneute Kultivieren der weiterhin
lebensfähigen
Algenbiomasse sowie die erneute Extraktion der Sekundärmetabolite,
kann aufgrund der vorteilhaften Verfahrensgestaltung und der damit
verbundenen schonenden Extraktion gegebenenfalls mehrfach wiederholt
werden. Gegenüber
dem aus der
EP 1 361
280 A1 bekannten Verfahren ist es dabei von Vorteil, dass
für die
Extraktion niedrig siedende Lösungsmittel,
nämlich
Lösungsmittel
mit einer Siedetemperatur von 100°C
und darunter, verwendet werden können.
Hierdurch lässt
sich das Lösungsmittel
mit deutlich geringerem Aufwand von den mittels ihm herausgelösten Sekundärmetaboliten
trennen. Vor der erneuten Kultivation der Algenbiomasse wird das
Substrat mit der biologisch aktiven Schicht nach der Beendigung
des Extraktionsvorgangs vorzugsweise durch Waschen mittels Leitungswasser vollständig entfernt.
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Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform der
Erfindung wird die biologisch aktive Schicht vor der erstmaligen
Extraktion der Sekundärmetabolite noch
mit einer oder mehreren Schutzschichten versehen. Dabei werden die
Schutzschichten durch wiederholtes Aufbringen und Trocknen eines
der auch zur Erzeugung der biologisch aktiven Schicht geeigneten
Sole erzeugt, wobei dieses zur Erzeugung der Schutzschicht oder
-schichten jedoch keine suspendierte Algenbiomasse enthält. Das
erfindungsgemäße Verfahren
ist vorteilhafterweise dadurch weitergebildet, dass das zur Erzeugung
der biologisch aktiven Schicht sowie der gegebenenfalls vorhandenen Schutzschichten
verwendete Sol zur Steuerung der Porosität der jeweiligen Schicht und/oder
zur Verbesserung der Vitalität
der darin eingebetteten Algenbiomasse mit einem oder mehreren Additiven
versetzt wird, auf deren Art später
noch eingegangen werden soll.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
eignet sich vorzugsweise zur in vivo Extraktion von Carotinoiden
aus Mikroalgen. Besonders bevorzugt ist seine Anwendung für die in
vivo Extraktion von Astaxanthin aus Mikroalgen der Spezies Haematoccocus
pluvialis. Im letztgenannten Falle kommen als Additive, welche dem
Sol zur Steuerung der Porosität
der späteren
Schicht beigefügt
werden, Mono- oder Disaccharide, vorzugsweise Sorbit oder/und Glucose oder/und
Fructose in Betracht. Zumindest in Bezug auf Haematoccocus pluvialis
haben dabei die letztgenannten Additive den Vorteil, dass durch
ihre Zugabe nicht nur die Porosität der Schicht oder Schichten,
im Hinblick auf ein sicheres Eindringen der zur Extraktion verwendeten
Lösungsmittel,
steuerbar ist. Vielmehr ist dieser Vorzug bei einem Einsatz des
Verfahrens zur wiederholten Kultivation und Extraktion von Haematoccocus
pluvialis mit einer Verbesserung der Vitalität der Algenbiomasse durch die
Verwendung der Additive gepaart.
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Als
Träger
beziehungsweise Substrat für
die biologisch aktive Schicht dienen vorzugsweise Keramik oder Glas.
Die Beschichtung des Substrats erfolgt vorzugsweise durch ein Dip-Coating-Verfahren beziehungsweise
ein Tauchverfahren. Auch die Extraktion der Metabolite erfolgt vorzugsweise
dadurch, dass das mit der biologisch aktiven Schicht versehene Substrat
in das entsprechende, zur Extraktion verwendete Lösungsmittel
eingetaucht wird. In Versuchen haben sich Ethylacetat, Tetrahydrofuran, tert-Buthylmethylether
und Iso-Octan als besonders geeignete Lösungsmittel für eine die
Lebensfähigkeit der
Mikroalgen erhaltende Extraktion erwiesen. Das beschichtete Substrat
wird zur Extraktion der Sekundärmetabolite
in eines der genannten Lösungsmittel getaucht
oder mit ihm umspült.
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Wie
bereits ausgeführt,
lässt sich
das Verfahren besonders vorteilhaft zur Gewinnung beziehungsweise
in vivo Extraktion von Astaxanthin aus Haematoccocus pluvialis einsetzen,
ohne jedoch hierauf beschränkt
zu sein. Vielmehr kann das Verfahren auch für die Gewinnung von Antioxidanzien wie
Beta-Carotin, Tocopherole und Superoxidismutase, aber auch zur Gewinnung
von Proteinen mit einem hohen Anteil essentieller Aminosäuren oder
von Fetten mit einem hohen Anteil mehrfach ungesättigter Fettsäuren, wie
Arachidonsäure,
Eicosapentaensäure
und Docosahexaensäure,
eingesetzt werden. Weiterhin ist die Gewinnung von Polysacchariden
mit immunmodulatorischen Wirkungen sowie von Vitaminen, wie der
B-Vitamine Thiamin, Riboflavin oder des Vitamins B12, aber auch
des Vitamins E oder des Provitamin A möglich. Ferner kommt der Einsatz
des Verfahrens zur Gewinnung von Photosynthesefarbstoffen, wie Chlorophyllen
oder anderen Carotinoiden (Carotine, Xantrophylle), in Betracht.
Auch zur Gewinnung wachstumsregulierender Wirkstoffe, wie Auxine,
Gibberelline, Cytokinine, oder zur Gewinnung von restistenzinduzierenden
Wirkstoffen beziehungsweise Stressbotenstoffen, wie Brassinosteroiden, Peptidhormonen,
Octadecanoiden und Jasmonaten, kann das Verfahren vorteilhaft eingesetzt
werden.
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Die
Erfindung soll nachfolgend anhand eines Ausführungsbeispiels nochmals erläutert werden. Das
Ausführungsbeispiel
bezieht sich auf die Gewinnung von Astaxanthin aus Mikroalgen der
Spezies Haematoccocus pluvialis, welche zuvor in bekannter Weise
in einer Nährlösung kultiviert
wurden. Zur Gewinnung der Sekundärmetabolite
wird zunächst
Algenbiomasse aus der zur Kultivation der Mikroalgen dienenden Nährlösung, beispielsweise
gemäß der
DE 101 36 645 B4 oder
durch Aufkonzentrieren geerntet.
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Danach
wird die geerntete Algenbiomasse in einem geeigneten Sol beziehungsweise
Solgemisch aus der eingangs genannten Gruppe von Solen suspendiert.
Hierbei handelt es sich um Nanosole, wasserklare stabile Dispersionen
in welchen Oxidpartikel nanodimensionaler Form (mit einem Durchmesser < 10nm) dispergiert
sind. Die Dispersionen weisen vorzugsweise einen Feststoffgehalt
bis zu 20 Gew.-% Oxid auf. Derartigen Nanosolen ist das Bestreben
immanent, ihr sehr großes
Oberflächen/Volumenverhältnis durch
Partikelwachstum beziehungsweise dreidimensionale Vernetzung (Gelierung)
zu reduzieren. Im Zuge dieses Sol-Gel-Prozesses wird die in dem
Nanosol suspendierte Algenbiomasse in das Vernetzungsgitter homogen
eingebettet. Wie bereits ausgeführt,
kommen für
die Durchführung
des Verfahrens, das heißt
insbesondere für
die Bildung der auf das Substrat aufzubringenden Schicht mit der
darin eingebetteten Biomasse unterschiedliche Sole in Betracht.
Soweit es sich dabei um Sole von Metalloxiden handelt, kann der
Hydrolyseprozess der Metallalkoxide zur Modifizierung der Sol-Gel-Schichteigenschaften
in Gegenwart zugemischter Alkyl-trialkoxysilane R-Si(OR')3 und/oder Dialkoxysilane R2-Si(OR')2 durchgeführt werden.
Im Zuge des Sol-Gel-Prozesses werden dabei modifizierte Metalloxidgele
gebildet, die bezogen auf 1 Gewichtsanteil Metalloxidgel 0 bis 2
Gewichtsanteile R-SiO3/2 und/oder R2=SiO enthalten. R ist ein organischer
Alkyl- oder Arylrest, der Amino-, Hydroxy-, Epoxy- oder Alkoxygruppen
enthalten kann oder durch Halogene substituiert ist. R' ist ein Alkylrest,
vorrangig mit 1-4 Kohlenstoffatomen.
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Ein
geeignetes Nanosol A wird beispielsweise wie folgt hergestellt.
90 ml Tetraethoxysilan, 300 ml 0,01 N Salzsäure, 600 ml H2O,
10 ml 3-Glycidyloxypropyl-triethoxysilan werden für 20h bei
Raumtemperatur gerührt.
Es entsteht ein saures Nanosol mit ca. 3,6% modifiziertem SiO2. Zu 1000 ml des so erhaltenden Nanosols
werden 100 μl
Addid 200 (Netzmittel) zugegeben und für 1 h bei Raumtemperatur gerührt. Man
erhält
ein bei Lagerung unter 5°C
mehrere Wochen stabiles wässriges
SiO2-Nanosol A.
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Mittels
dieses Nanosols A wird auf einem Substrat ein Algen-Biocerfilm beziehungsweise
eine biologisch aktive, poröse
Schicht beispielsweise wie folgt ausgebildet. Wässrige Suspensionen von Haematococcus
pluvialis, werden in unterschiedlichen Konzentrationen und unterschiedlichen
morphologischen Phasen mit dem Nanosol A unter mechanischen Rühren gemischt
und nach Neutralisation mit 0,1 N Natronlauge durch Dip-Coating
(Ziehgeschwindigkeit 30cm/min) Beschichtungen vorzugsweise auf Glas
oder anderen Trägern
hergestellt. Die beschichteten Träger werden für 1 h bei
Raumtemperatur getrocknet. Man erhält ein Algen-Biocerfilm beziehungsweise
eine biologisch aktive, poröse
Schicht auf dem Substrat.
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Auf
diese Schicht können
gegebenenfalls eine oder mehrere Schutzschichten wie folgt aufgebracht
werden. Zu 1000 ml des wässrigen
SiO2-Nanosol A werden 18g Sorbit zugesetzt.
Das Nanosol wird für
1 h bei Raumtemperatur gerührt.
Man erhält ein
SiO2-Nanosol B. Der beziehungsweise die
bereits mit dem Algen-Biocerfilm
beschichteten Träger
werden mit dem SiO2-Nanosol B durch Dip-Coating (Ziehgeschwindigkeit
30cm/min) beschichtet. Die beschichteten Träger werden für 1 h bei
Raumtemperatur getrocknet. Man erhält ein Algen-Biocerfilm mit
einer Schutzschicht. Das Aufbringen weiterer Schutzschichten verläuft analog.
Auf diese Weise können bis
zu 10 Schutzschichten auf den Algen-Biocerfilm aufgetragen werden.
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Zur
Extraktion des Astaxanthin aus in der vorbeschriebenen Weise in
eine poröse
Schicht eingebetteter Biomasse von Haematococcus pluvialis wird
beispielsweise Ethylacetat als Lösungsmittel
an das entsprechende Schichtsystem gebracht. Geeignet ist sowohl
das Eintauchen der beschichteten Substrate in das Ethylacetat als
auch ein Umströmen mit
dem Lösungsmittel
in einer dafür
ausgebildeten Apparatur. Das Lösungsmittel
wird auf diese Weise für
eine Minute mit den beschichteten Substraten in Kontakt gebracht.
Nach einer Minute wird das astaxanthinhaltige Lösungsmittel entfernt und weiterverarbeitet
zur Astaxanthingewinnung. Die beschichteten Substrate beziehungsweise
Träger
(Biocere) werden mit Leitungswasser gewaschen, indem Wasser in die
Apparatur gegeben wird, um letzte Reste an Lösungsmittel zu entfernen. Anschließend wird dieses
Wasser aus der Apparatur entfernt. Die so behandelten Biocere werden nun
in eine Kultivationsphase überführt. Dazu
wird in die Extraktions-/Kultivationsapparatur mit den darin enthaltenen
Bioceren Algennährmedium
gefüllt,
die Apparatur so positioniert, dass ein Lichteintrag auf die beschichteten Substrate
von 60–80 μE/m2·s
gewährleistet
ist. Zur besseren Durchmischung der Nährlösung sowie eines geringen CO2-Eintrages in die Apparatur wird Luft in
das System eingebracht. Diese Art der Kultivation wird für 5–7 Tage
durchgeführt
und dient als Erholungsphase für
die auf den Substraten eingebettete Algenbiomasse nach der Extraktion.
Dabei ist bei der Haematoccocus pluvialis – Biomasse ein teilweiser Farbwechsel
von rot nach grün
festzustellen. Danach wird das Algennährmedium aus der Apparatur entfernt
und diese mit Leitungswasser befüllt.
Die somit eingeleitete Stressphase wird durch die Exposition der
Biocere mit einem erhöhten
Lichteintrag von 150–170 μE/m2·s
unterstützt.
Die Kultivation in der Stressphase wird für 10–20 Tage eingehalten, danach
kann ein weiterer Extraktionsvorgang erfolgen.