DE102005061487A1

DE102005061487A1 - Verfahren zum Nachweis eines Analyten in Form von Fragmenten einer Nukleinsäure und Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens

Info

Publication number: DE102005061487A1
Application number: DE200510061487
Authority: DE
Inventors: Holger MÜHLBERGER; Werner Dr. Hoffmann
Original assignee: Forschungszentrum Karlsruhe GmbH
Current assignee: Forschungszentrum Karlsruhe GmbH
Priority date: 2005-12-22
Filing date: 2005-12-22
Publication date: 2007-06-28
Also published as: WO2007079887A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis eines Analyten, der in Form von Fragmenten einer Nukleinsäure in einem wässrigen Medium vorliegt, und eine Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine einfache und zugleich empfindliche Nachweismöglichkeit für diese Fragmente ohne vorhergehendes Labeln der Nukleinsäuren bereitzustellen.
Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren gelöst, das die folgenden Schritte umfasst:
a) Einbringen des Analyten in ein Messvolumen 2,
b) Beaufschlagen des Messvolumens 2 mit Hochfrequenz über mindestens ein Elektrodenpaar 3, 3', das außerhalb des Messvolumens 2 angeordnet ist, und
c) Aufnehmen der Impedanz.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis eines Analyten, der in Form von Fragmenten von Nukleinsäuren in einem wässrigen Medium vorliegt, und eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens.
Bisher werden Fragmente von Analyten wie DNA (Desoxyribonukleinsäure), RNA (Ribonukleinsäure) oder m-RNA (Botenribonukleinsäure), die sich z.B. in einer Kapillare in einem wässrigen Medium befinden, überwiegend optisch detektiert.

Zur optischen Detektion von DNA mittels laserinduzierten Fluoreszenz muss wie z. B. in der US 2004/0096866 A1 zunächst die Probe gelabelt werden. Neben dem zusätzlichen Aufwand sind hierzu oft toxische oder karzinogene Substanzen erforderlich. Die Auswahl der verwendeten Werkstoffe ist zudem auf optisch transparente Materialien beschränkt.

Zur elektrischen Leitfähigkeit von DNA sind unterschiedliche Angaben bekannt, die von isolierend und halbleitend bis metallisch reichen, wobei DNA vorwiegend nicht in Lösung betrachtet wird. Unter Gleichspannung wird DNA, wie aus P. J. de Pablo, F. Moreno-Herrero, J. Colchero, J. G. Herrero, P. Herrero, A. M. Baró, P. Ordejónm J. M. Soler und E. Artacho, Absence of dc-Conductivity in λ-DNA, Phys. Rev. Lett. 85, S. 4992-4995, 2000, hervorgeht, als Isolator eingestuft.

Die US 2005/136466 A1 offenbart ein Verfahren zur Durchführung von Impedanz-Messungen an DNA, wobei eine ionisch gelabelte Probe in einem elektrischen Feld an einem komplementären DNA-Segment anhaftet und anschließend ein Enzym das ionische Label ablöst. Hierdurch wird in der Lösung eine elektrische Leitfähigkeit erzeugt, die mittels einer Impedanz-Messung zwischen einem Elektrodenpaar nachgewiesen wird.

Die WO 97/32039 A1 offenbart ein Verfahren und eine Vorrichtung zur quantitativen Bestimmung von Nukleinsäuren in Lösung, wobei die Messung der elektrischen Leitfähigkeit im direkten Kontakt mit dem Elektrolyten erfolgt. Hierfür wird eine Messzelle mit einem Volumen von mindestens 10 μl eingesetzt. Dieses Verfahren zeigt jedoch offensichtlich Probleme mit der Empfindlichkeit und der Reproduzierbarkeit des Nachweises.

Die DE 20 2005 009 960 U1 beschreibt ein Messgerät zur Kapillarelektrophorese, das aus einer kreuzförmigen Kapillaranordnung aus einer Trennkapillaren mit einem Elektrolyten und einer Injektionskapillaren für die Injektion und Separation eines Analyten, einer Hochspannungsquelle zur Erzeugung einer Potentialdifferenz für die Injektion und Separation und einer elektrischen Leitfähigkeitsdetektion mittels Aufnahme der Impedanz zum Nachweis von gelösten Bestandteilen im Analyten besteht und sich besonders gut für kleine Kationen und Anionen eignet.

Demnach ist es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Nachweis eines Analyten, der in Form von Fragmenten einer Nukleinsäure in einem wässrigen Medium vorliegt, und eine Vorrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens vorzuschlagen, die die genannten Nachteile und Einschränkungen nicht aufweisen. Insbesondere sollen ein derartiges Verfahren und eine hierfür geeignete Vorrichtung den einfachen und zugleich empfindlichen Nachweis der Fragmente ohne vorhergehendes Labeln der Nukleinsäuren ermöglichen.

Diese Aufgabe wird im Hinblick auf das Verfahren durch die Schritte des Anspruchs 1 und im Hinblick auf die Vorrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens durch die Merkmale des Anspruchs 10 gelöst. Die Unteransprüche beschreiben jeweils vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung.

Das erfindungsgemäße Verfahren zum Nachweis eines Analyten in Form von Fragmenten von Nukleinsäuren in einem wässrigen Medium umfasst die nachfolgend im Einzelnen erläuterten Schritte a) bis c).

Gemäß Schritt a) wird zunächst eine Fraktion, die in einem wässrigen Medium die nachzuweisenden Fragmente enthält, in ein Messvolumen vorzugsweise in einer Kapillare eingebracht, die einen Querschnitt von 1 μm bis 1000 μm, bevorzugt von 10 μm bis 200 μm, insbesondere von 20 μm bis 50 μm aufweist.

Das vorliegende Verfahren eignet sich insbesondere zum Nachweis eines Analyten, der in Form von Desoxyribonukleinsäure (DNA), Ribonukleinsäuren (RNA) wie Transfer-Ribonukleinsäure (t-RNA), Messenger-Ribonukleinsäure (m-RNA), ribosomaler Ribonukleinsäure (r-RNA), small nuclear Ribonukleinsäure (sn-RNA), natürlichen oder synthetischen Derivaten davon oder einer Mischung hiervon, die sich als gesamte Moleküle oder als Fragmente in einem wässrigen Medium befinden, vorliegt.

Hieran anschließend wird der Analyt zumindest innerhalb des Messvolumens, das vorzugsweise einen Wert von 10 fl bis 1 μl, besonders bevorzugt von 1 pl bis 50 nl, insbesondere von 10 pl bis 1 nl annimmt, gemäß Schritt b) mit Hochfrequenz, die eine Frequenz vorzugsweise von 1 kHz bis 10 GHz, besonders bevorzugt von 1 kHz bis 10 MHz, insbesondere von 10 kHz bis 5 MHz aufweist, beaufschlagt. Das Einbringen der Hochfrequenz in das Messvolumen erfolgt über ein oder mehrere Elektrodenpaare, die außerhalb des Messvolumens entweder unmittelbar an dieses angrenzend oder über eine Trennschicht, deren Dicke vorzugsweise einen Wert von 0,1 μm bis 1 mm, besonders bevorzugt von 10 μm bis 250 μm aufweist, hiervon getrennt angebracht sind.

Schließlich wird gemäß Schritt c) die Impedanz entweder über ein Frequenzspektrum mit festen oder variablen Grenzen oder in einer alternativen Ausgestaltung vorzugsweise bei ein, zwei, drei, vier, fünf oder mehr festen Werten als Antwort des Systems aus Analyt und wässriger Lösung auf dessen Beaufschlagung mit Hochfrequenz aufgenommen und ausgewertet.

In einer bevorzugten Ausgestaltung befinden sich die Fragmente der Nukleinsäuren in einer elektrolythaltigen Gelmatrix, die auch der Separation der Fragmente dient. In diesem Falle wird die Frequenz der eingebrachten Hochfrequenz vorzugsweise so gewählt, dass der Unterschied der Impedanz mit und ohne Analyt bei der gewählten Frequenz möglichst groß ist. Zusätzlich wird die Zusammensetzung der Gelmatrix so gewählt, dass sich die Impedanzspektren mit und ohne Analyt möglichst deutlich unterscheiden.

Dieses Vorgehen steht im Gegensatz zum Stand der Technik, bei dem die Frequenz in der Regel möglichst hoch gewählt wird, um die kapazitive Einkopplung des Messsignals zu optimieren.

Eine erfindungsgemäße Vorrichtung zum Nachweis eines Analyten, der in Form von Fragmenten von Nukleinsäuren, die sich in einem wässrigen Medium befinden, vorliegt, enthält mindestens die folgenden Bestandteile:

– mindestens ein Messvolumen zum Einbringen des Analyten, der in Form von Fragmenten von Nukleinsäuren in einem wässrigen Medium vorliegt,
– ein oder mehrere Elektrodenpaare, die außerhalb des Messvolumens, ggf. von diesem getrennt durch eine Trennschicht angeordnet sind, und
– ein Mittel zum Anlegen einer Hochfrequenz an das mindestens eine Elektrodenpaar sowie zur Aufnahme der Impedanz.

Hierbei liegt an den Elektrodenpaaren eine Messspannung vorzugsweise von 0,1 V bis 1000 V, besonders bevorzugt von 10 V bis 1000 V und insbesondere von 100 V bis 250 V an. Bei einem Abstand der Elektrodenpaare vorzugsweise von 5 μm bis 10 mm, besonders bevorzugt von 50 μm bis 1 mm, insbesondere von 100 μm bis 250 μm wird hierdurch eine Feldstärke des elektrischen Feldes im Messvolumen vorzugsweise von 1 V/mm bis 200 kV/mm, besonders bevorzugt von 100 V/mm bis 10 kV/mm, insbesondere von 200 V/mm bis 1 kV/mm erzeugt.

In einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung sind

– eine Vielzahl von Messvolumina zum Einbringen des Analyten, der in Form von Fragmenten von Nukleinsäuren in einem wässrigen Medium vorliegt,
– eine Vielzahl von Elektrodenpaaren, von denen jeweils mindestens eines außerhalb eines zugehörigen Messvolumens angeordnet ist, und
– ein Mittel vorgesehen, das wechselnd oder gleichzeitig eine Hochfrequenz an die Vielzahl der Elektrodenpaare anlegen und abwechselnd die Aufnahme der Impedanz vornehmen kann (so genanntes Multiplexen).

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren und der Vorrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens lassen sich Fragmente von Nukleinsäuren elektrisch detektieren, nachdem sie durch ein geeignetes Verfahren wie z. B. Elektrophorese ihrer Größe nach aufgetrennt wurden. Das erfindungsgemäße Verfahren ist hochempfindlich, so dass bereits mit kleinen Mengen an Analyt innerhalb des Messvolumens gearbeitet werden kann. Insbesondere kann auf ein Labeln des Analyten verzichtet werden.

Die Detektion erfolgt in Echtzeit, da der Detektor kurze Ansprechzeiten aufweist. Zur Vermeidung von elektrochemischen Wechselwirkungen mit dem Analyten erfolgt die Messung kontaktlos, da sich die Elektrodenpaare außerhalb der Kapillare be finden. Da das Analysesystem auch in einen nichttransparenten Werkstoff wie z.B. das Polymer PEEK eingebracht wird, ist es vorteilhaft, dass die Messung unabhängig von den optischen Eigenschaften des Werkstoffs erfolgt. Der Sensor ist kostengünstig, insbesondere dann, wenn die Vorrichtung so ausgestaltet ist, dass mittels Multiplexen der Nachweis des Analyten in mehreren Messvolumina nahezu gleichzeitig erfolgt.

Die Erfindung wird im Folgenden anhand von Ausführungsbeispielen und den Figuren näher erläutert. Hierbei zeigen:
1 Schematische Darstellung des Aufbaus einer Vorrichtung zum Nachweis eines Analyten, der in Form von Fragmenten einer Nukleinsäure vorliegt.
2 Impedanzspektrum von DNA in unterschiedlicher Verdünnung in Wasser: a) Betrag, b) Phase, c) Realteil und d) Imaginärteil der Impedanzspektren.
3 Impedanzspektrum von DNA in unterschiedlicher Verdünnung in einem Elektrolyten (BGE).
4 Impedanzspektrum einer 1:20.000 in Wasser verdünnten DNA im Vergleich zu Wasser.
5 Impedanzspektren von DNA in unterschiedlichen elektrolythaltigen Gelmatrix-Systemen.
1 zeigt schematisch den Aufbau einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zum Nachweis von Fragmenten von Nukleinsäuren wie z. B. DNA. In die Kapillare 1 werden die nachzuweisenden Fragmente, die sich in einem wässrigen Medium befinden, eingebracht. Zumindest innerhalb des Messvolumens 2 werden die Fragmente mit Hochfrequenz beaufschlagt, die, von geeigneten Mitteln 4 wie z.B. einem Hochfrequenzgenerator mit integrierter hochauflösender Impedanzanalyse bereitgestellt, an ein Elektrodenpaar 3, 3', das außerhalb der Kapillare 1 angeordnet ist, angelegt wird. Durch die Mittel 4 erfolgt ebenso die Aufnahme der Impedanz. Das Elektrodenpaar 3, 3' ist hier durch eine Trennschicht 5 von der Kapillare 1 getrennt.
Überraschenderweise wurde festgestellt, dass in Abhängigkeit von der angelegten Frequenz Unterschiede in der Leitfähigkeit zwischen verschiedenen konzentrierten wässrigen Lösungen von Fragmenten von DNA auftreten. 2 zeigt die Ergebnisse von Untersuchungen zur Impedanz (d.h. Kehrwert der Leitfähigkeit) von Fragmenten aus DNA in unterschiedlich starken Verdünnungen mit Wasser bei Beaufschlagung mit Hochfrequenz im Bereich von 10 kHz bis 1 MHz. Im Einzelnen sind der Betrag (2a), die Phase (2b), der Realteil (2c) und der Imaginärteil (2d) der komplexen Impedanz als Funktion der Frequenz dargestellt.
In 3 ist das Impedanzspektrum von Fragmenten von DNA dargestellt, die unterschiedlich stark in einem Elektrolyten (hier kurz als BGE bezeichnet) verdünnt ist. Der jeweilige Verlauf der Impedanz über den dargestellten Frequenzbereich lässt sich dadurch erklären, dass sich die Impedanzen des Elektrolyten und der DNA in wässriger Lösung unterschiedlich zusammensetzen. Diese unterschiedlichen Verläufe der Impedanz lassen sich gezielt einsetzen: Die Frequenz wird jeweils so gewählt, dass der Unterschied der Impedanz mit und ohne Analyt möglichst groß gewählt wird. Durch diese Wahl der Frequenz lassen sich bereits kleinste Konzentrationen an Nukleinsäuren detektieren.
Das Impedanzspektrum in 4 zeigt bei 1:20.000 in Wasser verdünnten Fragmenten aus DNA bei Frequenzen unterhalb von ca. 100 kHz, insbesondere bei Frequenzen unterhalb von 10 kHz, große Impedanzunterschiede zum Elektrolyt Wasser, die deutlich über der Messungenauigkeit liegen. Selbst bei 1:200.000 in Wasser verdünnten Fragmenten aus DNA (Diese Werte sind hier nicht dargestellt.) betrug der Impedanzunterschied immer noch 8,5 % bei 10 kHz.
Ein weiterer Schritt zur Erhöhung der Empfindlichkeit ergibt sich aus den Impedanzspektren verschiedener elektrolythaltiger Gelmatrix-Systeme. Überraschenderweise wurde festgestellt, dass die Impedanzspektren der in 5a und 5b dargestellten Gelmatrix-Systeme spiegelbildlich verlaufen. Es zeigte sich ein negativ gekrümmter Kurvenverlauf für die erste Gelmatrix aus 5a und ein positiv gekrümmter Kurvenverlauf für die zweite Gelmatrix aus 5b.
Bei der Analyse eines Analyten wird man daher eine elektrolythaltige Gelmatrix wählen, die über einen möglichst großen Bereich des Impedanzspektrums einen möglichst großen Impedanzunterschied zwischen einer Messung mit und ohne Analyt in wässriger Lösung aufweist. Besonders vorteilhaft ist es, die Zusammensetzung der elektrolythaltigen Gelmatrix so zu wählen, dass im Impedanzspektrum mit Analyt eine Krümmung beobachtet wird, die gegensätzlich zur Krümmung des Impedanzspektrums ohne Analyt ist.

Claims

Verfahren zum Nachweis eines Analyten in Form von Fragmenten einer Nukleinsäure in einem wässrigen Medium, mit den Schritten a) Einbringen des Analyten in ein Messvolumen (2), b) Beaufschlagen des Messvolumens (2) mit Hochfrequenz über mindestens ein Elektrodenpaar (3, 3'), das außerhalb des Messvolumens (2) angeordnet ist, und c) Aufnehmen der Impedanz.
Verfahren nach Anspruch 1 mit einem Analyten, der in Form von Fragmenten von Desoxyribonukleinsäure (DNA), einer Ribonukleinsäure (RNA) oder einem ihrer Derivate in einem. wässrigen Medium vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 mit einem Messvolumen (2) von 10 fl bis 1 μl.
Verfahren nach Anspruch 3 mit einem Messvolumen (2) von 10 pl bis 1 nl.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4 mit einer Frequenz von 1 kHz bis 10 GHz für die Hochfrequenz.
Verfahren nach Anspruch 5 mit einer Frequenz von 10 kHz bis 5 MHz für die Hochfrequenz.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Aufnahme der Impedanz bei mindestens einer festen Frequenz erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei sich der Analyt in einer elektrolythaltigen Gelmatrix befindet.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Frequenz so gewählt wird, dass der Unterschied der Impedanz mit und ohne Analyt bei der gewählten Frequenz möglichst groß ist.
Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, wobei die Zusammensetzung der Gelmatrix so gewählt wird, dass der Unterschied der Impedanz mit und ohne Gelmatrix möglichst groß ist.
Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 10, enthaltend – mindestens ein Messvolumen (2) für den Analyten, der in Form von Fragmenten von Nukleinsäuren in einem wässrigen Medium vorliegt, – mindestens ein Elektrodenpaar (3, 3'), das außerhalb des Messvolumens (2) angeordnet ist, und – ein Mittel (4) zum Anlegen einer Hochfrequenz an das mindestens eine Elektrodenpaar (3, 3') sowie zur Aufnahme der Impedanz.
Vorrichtung nach Anspruch 11 mit einem Messvolumen (2), das Teil einer Kapillare (1) mit einem Querschnitt von 1 μm bis 1000 μm ist.
Vorrichtung nach Anspruch 12, wobei die Kapillare (1) einen Querschnitt von 20 μm bis 50 μm aufweist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11 bis 13, wobei die Elektroden des mindestens einen Elektrodenpaars (3, 3') im Abstand von 5 μm bis 10 mm zueinander angeordnet sind und hieran eine Spannung von 0,1 V bis 1000 V anliegt.
Vorrichtung nach Anspruch 14, wobei die Elektroden des mindestens einen Elektrodenpaars (3, 3') im Abstand von 100 μm bis 250 μm zueinander angeordnet sind und hieran eine Spannung von 100 V bis 250 V anliegt.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11 bis 15, wobei zwischen dem Messvolumen (2) und dem mindesten einen Elektrodenpaar (3, 3') eine Trennschicht (5) vorgesehen ist.
Vorrichtung nach Anspruch 16, wobei die Trennschicht (5) eine Dicke von 0,1 μm bis 1 mm aufweist.
Vorrichtung nach Anspruch 17, wobei die Trennschicht (5) eine Dicke von 10 μm bis 250 μm aufweist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11 bis 18, enthaltend – eine Vielzahl von Messvolumina für den Analyten, – eine Vielzahl von Elektrodenpaaren, die Jeweils außerhalb eines der Messvolumina angeordnet sind, und – ein Mittel (4) zum Anlegen einer Hochfrequenz an die Vielzahl der Elektrodenpaare sowie zur abwechselnden Aufnahme der Impedanz über die Vielzahl der Elektrodenpaare.