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Die
Erfindung ist anwendbar zur Herstellung methylierter Malonsäuren, die
in der chemischen Industrie beispielsweise in Polyestern, in organischer Verbindungen
mit ionischen Eigenschaften und als Ausgangsstoff für chemische
Synthesen eingesetzt werden können.
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Die
Dimethylmalonsäure,
eine aliphatische Dicarbonsäure,
wird wegen ihrer bifunktionellen Struktur als reaktives Monomer
in Polykondensationsreaktionen eingesetzt. So wird sie als universell einsetzbare
vernetzende Komponente bei der Herstellung von linearen Polyestern
und Polyesteramiden sowie Copolyestern aufgeführt (
GB818157 ,
GB959671 ,
US3043808 ,
GB1101325 ,
GB1130558 ,
JP4303848 ,
EP385225 ). Sie wird als Bestandteil
in linearen Block-Polyestern
(
GB 993122 und
GB991784 ), in oxydationstabilen
(
GB1044550 ) und thermoplastischen
Polyestern (
US4108834 ),
als Bestandteil polymerer Weichmacher (
US3194776 ), als Monomer in Polyurethan-Polymeren
(
GB1115767 ), als Bestandteil
von vernetzten Silanolen mit lubrifizierenden Eigenschaften (
GB1455936 ), bei der Modifizierung
von Kunstharzen (
JP2000290267 ),
bei der Vernetzung von synthetischen Fasern (
US4304569 ), in Reaktionen mit Aminogruppen
(
JP2002088046 ), als
Porenregulator in Polyolefinschäumen (
US4163085 ) sowie als anionische
Komponente in ionischen Flüssigkeiten
(
JP2163922 ) vorgeschlagen.
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Darüber hinaus
bewirkt Dimethylmalonsäure wegen
ihres quarternären
Kohlenstoffs, eines Kohlenstoffatoms, an das vier andere Kohlenstoffatome gebunden
sind, eine versteifte lineare Struktur der Polymerketten, die zu
einer hohen thermischen Stabilität
der Polymere führt
(
US 3043806 ).
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Auch
wurde gefunden, dass eine Diät,
welche Dimethylmalonsäure
enthält,
bei Mäusen
und Ratten einen erniedrigten Serum Cholesterolgehalt und Triglyceridgehalt
verursachte (Izydore RA, Hall ICH; 1991. Hypolipidemic activity
of aliphatic dicarboxylic acids in rodents. Acta Pharm Nord. 3 141–6).
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Methylmalonsäure wird
vor allem als Ausgangsstoff bei chemischen Synthesen eingesetzt.
Da im Vergleich zur Dimethylmalonsäure bei ihr eine der Carboxylgruppen
leicht decarboxyliert und diese Eigenschaft auch in der chemisch
gebundenen Methylmalonyl-Gruppe vorhanden ist, kann auf einfachen Weg
eine Kettenverkürzung
erreicht werden. Diese Eigenschaft wird bei der Herstellung von
enantiomeren Decarboxylierungsprodukten ausgenutzt.
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Dimethylmalonsäure kann
auf unterschiedlichen Wegen chemisch synthetisiert werden. So wird sie
durch Oxidation von Ausgangsverbindungen, in denen der quarternäre Kohlenstoff
bereits vorhanden ist, wie Kaliumpermanganat unter alkalischen Bedingungen
hergestellt (Norman B et al.; 1941. Studies in peroxidase reaction.
J. Amer. Chem. Soc. 63, 497).
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Auch
durch Oxidation von 2,2 Dimethyl-1,3-propandiol mit Salpetersäure (Evans
AR, Mertin R, Taylor GA, Yap CHM; 1987. J. Chem Soc, Perkin Trans
I. 1635–1640)
kann die Dimethylmalonsäure
hergestellt werden. In
SU859351 wird
2,2-Dimethylbuten-3-al mit Ozon in Anwesenheit von Ferrocen zu Dimethylmalonsäure oxidiert.
Weitere Literaturangaben zu weiteren oxydativen Methoden der Herstellung
von Dimethylmalonsäure
sind in
SU859351 zu finden.
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Um
neuartige Plastifikatoren herzustellen, werden Stickstoffoxide als
selektive Katalysatoren bei der Oxidation von Hydroxypivalinaldehyd
mit Sauerstoff unter stark sauren Bedingungen zu Hydroxypivalinsäure und
Dimethylmalonsäure
eingesetzt (Selective oxidation of hydroxypivalic aldehyde with oxygen
catalysed by nitrogen oxides. Chornaja S, Zhizhkun S. Trusov S.
Riga, Technical University, Faculty of Material Science and Applied
Chemistry, URL: www.ul.ie/~cer/ec5/Books of Abstracts/Sym15-CP-a.doc;
Seite 12).
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Bei
der Oxidation von Fenchone(trimethyl-(2,7,7)bicyclo-(I,2,2)heptanone-3),
das im Fenchelöl
vorkommt, mit Kaliumpermanganat wird neben Essig- und Oxalsäure auch
Dimethylmalonsäure
gebildet. (Marsh JE; 1899. Jour. Chem. Soc., 75, 1058).
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Seit
langem ist bekannt, dass Methylmalonyl-CoA als Zwischenprodukt im
Stoffwechsel der meisten Organismen beim Abbau von L-Valin auftritt. Bekannt
ist auch, dass nach Lafferty (1963) in vitro die Bildung von Dimethylmalonyl-CoA
durch eine Carboxylase aus einem Mikroorganismus der Art Mycobacterium
sp. Strain IBS-M aus Isobutyryl-CoA und ATP, Mn++ und
CO2 katalysiert wird (Lafferty RM; 1963.
Die an der Verwertung verzweigter Fettsäuren geknüpfte CO2-Fixierung
(Lafferty RM. The CO2 fixation connected
with the use of branched fatty acids. Zentralbl Bakteriol [Orig].
191, 191-3).
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Es
wurden auch Mikroorganismen gefunden, welche Dimethylmalonsäure abbauen
(Kniemeyer O, Propian C, Rosello-Mora, Harder J; 1999. Anaerobic mineralization
of quarternary carbon atoms. Isolation of denitrofying bacteria
on dimethylmalonate. Appl. Environ. Microbiol. 65, 3319-324). Dieser
Befund deutet auf natürliche
Vorkommen von Dimethylmalonsäure
in der Natur hin. Die Methylmalonsäure tritt bei Mangel an Vitamin
B12 im Serum und Urin des Menschen auf und es wurde in vitro gezeigt,
dass eine Propionylcarboxylase aus den Mitochondrien der Rinderleber
die Bildung von Dimethylmalonyl-CoA in geringem Ausmaß katalysiert
(Lane MD, Halenz DR, Kosow DP, Hegre CS; 1960. Further studies on
mitochondrial propionyl carboxylase. J Biol Chem. 235, 3082-6).
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Es
ist weiterhin bekannt, das die Dimethylmalonylgruppe in den Polyketid-Antibiotika
des Typs der Cervimycine als Ester gebunden vorkommen.
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(Herold
K, Gollmick FA, Groth I, Roth M, Menzel KD, Möllmann U, Gräfe U, Hertweck
C; 2005. Chemistry. 11, 1-9 und Herold K, Xu Z, Gollmick FA, Gräfe U, Hertweck
C; 2004. Biosynthesis of cervimycin C, an aromatic polyketide antibiotic
bearing an unusual dimethylmalonyl moiety. Org Biomol Chem. 2, 2411-14).
Außerdem
wird der Dimethylmalonyl-Rest in den Polyketid-Antibiotika Epothilon, Resistomycin
und Benastin gefunden, zitiert bei Herold et al, 2005.
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Entsprechend
des Standes der Technik bzw. der Literatur ist ersichtlich, dass
die Biosynthese der freien Dicarbonsäuren Dimethylmalonsäure und
Methylmalonsäure
in vivo durch Mikroorganismen bisher nicht beschrieben wurde und
auch dafür
auch keine fermentativen Herstellungsverfahren bekannt sind.
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Es
ist das Ziel der Erfindung, methylierte Malonsäuren auf einem umweltschonenden
Weg biotechnisch herzustellen.
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Überraschend
wurde gefunden, dass bei Kultivierung in einem Submersmedium in
Schüttelkulturen
der Mikroorganismus der Gattung Streptomyces, der Art Streptomyces
tendae (ST 19024, HKI 179, DSM 13059) freie Dimethylmalonsäure in Konzentrationen
größer als
0,1 g/l und gleichzeitig Methylmalonsäure in Konzentrationen größer als
0,01 mg/l in die Kulturlösung
ausscheidet. Weitere Versuche zeigten, dass auch in Kulturen mit
Mikroorganismen der Art Streptomyces californicus, Streptomyces clavuligerus
und Streptomyces coelicolor) Dimethylmalonsäure gebildet wird. Bei der
Kultivierung von Streptomyces tendae entsteht neben der Dimethylmalonsäure in geringeren
Maße auch
Methylmalonsäure.
Dieser Stamm ist unter der Bezeichnung Streptomyces tendae DSM 13059
bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM) in Braunschweig
(Germany) hinterlegt.
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Die
methylierten Malonsäuren
stellen ein Beispiel für
neuaufgefundene Metaboliten dar, deren Bildung als freie Säuren der
mikrobiologisch orientierten Fachwelt nicht bekannt war. Es kann
davon ausgegangen werden, dass die relativ einfach strukturierten
methylierten Malonsäuren
auf Grund ihrer strukturellen Nähe
zu den Primärmetaboliten
dem Primärmetabolismus
bzw. dem grundlegenden Stoffwechsel der Mikroorganismen entstammen,
der mit dem Wachstum verbunden ist. Dafür spricht, das sie bei der
Fermentation nur während
der Wachstumsphase gebildet werden. Wenn das Wachstum beendet ist,
werden auch keine methylierten Malonsäuren mehr gebildet, sondern
im Gegenteil sogar wieder von den Mikroorganismen aufgenommen.
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Es
ist naheliegend, dass diese neuen Metaboliten nicht nur durch Mikroorganismen
der Gattung Streptomyces gebildet werden, sondern das ihre Biosynthese
eine allgemeine bzw. weitverbreitete Leistung von Mikroorganismen
darstellt. Deshalb umfasst die vorliegende Erfindung generell Mikroorganismen unterschiedlichster
Gattungen, darunter die aufgeführten
Gattung Streptomyces und die aufgeführten Arten der Gattung Streptomyces
sowie alle mikrobiellen Arten, Stämme bzw. Selektanten oder Mutanten, welche
die Eigenschaft besitzen, methylierte Malonsäuren zu bilden und diese in
das Kulturmedium abzugeben.
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Vorteilhaft
an der Erfindung ist, dass jetzt die Möglichkeit besteht, wertvolle
Grundchemikalien auf umweltverträgliche
Weise ohne Freisetzung von schädlichen
oder aufwendig zu entsorgenden Abprodukten zu gewinnen.
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In
der Erfindung wird als Beispiel vorgeschlagen, die methylierten
Malonsäuren
mit Hilfe von Mikroorganismen, insbesondere von Mikroorganismen der
Gattung Streptomyces auf fermentativem Wege herzustellen. Die fermentativen
Verfahren, bei denen nur bioabbaubare Nebenprodukte gebildet werden, zeichnen
sich per se durch ihre allgemein anerkannte Umweltverträglichkeit
aus.
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Die
Erfindung wird an Hand dieser Beschreibung sowie eines Beispiels
näher erläutert, ohne dass
sie dadurch jedoch eingeschränkt
wird. Die Kultivierung der Mikroorganismen erfolgt bevorzugt als Submerskultur
in gerührten
und belüfteten
Fermentoren unter Verwendung von Kulturmedien, die Kohlenhydrate,
Stickstoff- und Phosphatquellen sowie weitere anorganische Salze
und Spurenelemente enthalten. Bei Fermentationsende werden in der
Regel die Mikroorganismen vom Kulturfiltrat getrennt und aus dem
Filtrat werden die methylierten Säuren gewonnen. So wird in einer
Ausführung
der Erfindung bei einer Submersfermentation von Streptomyces tendae
nach Fermentationsende die Dimethylmalonsäure aus dem Kulturfiltrat mit
Hilfe eines Anionenaustauschers isoliert. Die Methylmalonsäure trat
bei dieser Fermentation nur in Spuren auf.
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a) Vorkultur:
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Die
Stammhaltung von Mikroorganismen der Gattung Streptomyces erfolgte
als Schrägagarkultur.
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Das
1. wässrige
Vorkulturmedium enthält
pro Liter 1 g Glucose, 15 g Dextrin, 1 g Sojapepton (Organotechnie
19585), Hefeextrakt (Organotechnie 19512), 2 g Ammoniumsulfat, 5
g Kochsalz, 1 g Calciumcarbonat und 1 ml Spurensalzlösung. Der pH-Wert
beträgt
6,8 vor dem Sterilisieren.
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Das
Sterilisieren erfolgt im Autoklaven bei 121°C für 40 Minuten. Anschließend erfolgte
die Zugabe von steriler Kaliumhydrogenphoshat-Lösung (120 mg/ml), so dass die
Konzentration des Phosphats im 1. Vorkulturmedium 1 g/l beträgt. Die
1. Vorkultur wird mit einer kleinen Menge des biologischen Materials
aus den Schrägagarkulturen
beeimpft und bei 28°C
10 h unter Schütteln
mit 160 rpm kultiviert.
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Die
zugesetzte Spurenelement-Lösung,
die auch der 2. Vorkultur und der Hauptkultur zugesetzt wurde, weist
folgende Zusammensetzung pro Liter auf: 40 mg Zinkchlorid, 200 mg
Eisen(III)chlorid mit 6 Wasser, 10 mg Kupferchlorid mit 6 Mole Wasser,
10 mg Manganchlorid mit 4 Mole Wasser, 10 mg Borax und 10 mg Ammoniummolybdat
mit 6 Mole Wasser.
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b) 2. Vorkultur:
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Das
Medium der 2. Vorkultur enthält
im Liter 20 g Dextrin, Sojapepton (Organotechnie 19585), 2,5 g Hefeextrakt
(Organotechnie 19512), 2 g Ammoniumsulfat, 5 g Kochsalz, 1 g Calciumcarbonat,
1 ml Spurenelement-Lösung.
Das Medium wird bei pH 6,8 bei 121°C für 40 Minuten autoklaviert.
Dann werden 2,7 ml einer sterilen Kaliumhydrogenphosphat-Stammlösung (120
mg/ml) zu 400 ml Medium gegeben. Die Kultur wird mit 5% (v/v) der
1. Vorkultur beimpft und unter Schütteln bei 160 rpm für 24 h bei 28°C geschüttelt.
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c) Nachweis der methylierten
Malonsäuren:
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Der
analytische Nachweis der methylierten Malonsäuren erfolgt mit einer Niederdruckgradientenanlage
der Fa. Jasco (Jasco Inc. 8649 Commerce, MD 21601), die mit einem
RI-Detektor und einer Aminex HPX-87H, 300 × 7,8 mm-Säule (Fa.BIO-RAD, Katalog-Nr.
1250140) ausgestattet ist.
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Als
mobile Phase wird 0,002 M Schwefelsäure eingesetzt, die Flußrate beträgt 0,6 ml/min,
die Säulentemperatur
50°C und
das Injektionsvolumen 60 μl.
Die Kalibration erfolgte in den beiden Bereichen 10 bis 100 mg/l
und 0,1 bis 1,0 g/l. Als Standard wurde käufliche Methylmalonsäure (FLUKA
67750) und Dimethylmalonsäure
(Fluka 40760) eingesetzt.
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Schüttelkolben-Kulturen
für ein
Screening nach Produzentenstämmen:
Die Kultivierung erfolgt in geschüttelten Flaschen (160 rpm)
mit einem Gesamtvolumen von 500 ml, das insgesamt 100 ml des Hauptkultur-Mediums
enthält.
Das Medium der Hauptkultur enthält
pro Liter Lösung
40 g Dextrin, 5 g Glucose, 3 g Sojaextraktionsschrot, 4 g Ammoniumsulfat,
1,2 g Kochsalz, 2 g Kaliumsulfat, 0,02 g Mangansulfat, 5 g Calciumcarbonat
und 2 g Magnesiumsulfat, 0,033 g Kaliumhydrogenphosphat, 0,8 g Hefeextrakt
sowie 0,5 ml der Spurenelement-Lösung
mit der folgenden Zusammensetzung: Die Sterilisation erfolgt bei
121°C für eine Zeitdauer
von 35 Minuten.
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Das
Ammoniumsulfat und die Glucose (25 g in 100 ml destilliertem Wasser)
werden getrennt voneinander separat bei 121°C über eine Zeitdauer von 35 Minuten
autoklaviert. Die Flaschen werden mit der ersten Vorkultur der verschiedenen
Stämme
beimpft.
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Als
Kultivierungszeit werden 96 Stunden gewählt. Die Temperatur beträgt 28°C. Der pH-Wert
der Kultur liegt während
der Kultivierung wegen der Pufferung durch den Calciumcarbonatgehalt
des Mediums zwischen 6,8 und 7,3.
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Streptomyces
tendae bildet unter diesen Bedingungen zwischen 0,2 g/l und 0,5
g/l Dimethylmalonsäure
und etwa 0,03 g/l bis 0,6 g/l Methylmalonsäure. Die Arten Streptomyces
californicus, Streptomyces clavuligerus und Streptomyces coelicolor
bilden zwischen 0,015 g/l und 0,150 g/l Dimethylmalonsäure.
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d) Fermentorkultur:
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Für die fermentative
Herstellung wird ein gerührter
und belüfteter
Edelstahl-Fermentor mit einem Bruttovolumen von 30 l (Typ C 20-2K,
Baujahr 1995, B. Braun Biotech International) eingesetzt, der mit
einer Mess-, Steuer- und Regeleinheit (micro DCU 300) kombiniert
ist. Der Fermentor wird mit 20 l eines Medium gefüllt, das
pro Liter 40 g Dextrin, 7 g Sojaextraktionsschrot, 2 g Kaliumsulfat,
0,03 g Mangansulfat, 5 g Calciumcarbonat, 88 mg Kaliumhydrogenphosphat,
1 g Hefeextrakt, 1,2 g Kochsalz, 7 g Glucose, 8 g Ammoniumsulfat
und 0,5 ml Spurenelement-Lösung enthält. Der
pH-Wert beträgt
vor der Sterilisation 6,5. Das Medium wird bei 121°C für eine Dauer
von 30 Minuten in situ sterilisiert.
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Der
Fermentor wird mit 5% (v/v) der 2. Vorkultur des Stammes Streptomyces
tendae ST 19024 beimpft. Die Fermentation wird bei 28°C mit einer
Belüftungsrate
von 10 l/min, einem Überdruck
von 200 mbar und einer Rüherdrehzahl
zwischen 300 und 600 rpm durchgeführt. Um die Bildung von Schaum zu
vermeiden, werden geringe Mengen eines Entschäumers zugesetzt. Der pH-Wert wird mit NaOH-Lösung auf
pH 6,8 geregelt. Der Dimethylmalonsäure-Gehalt des Kulturfiltrates
liegt nach 96 Stunden bei 0,63 g/l Dimethylmalonsäure.
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e) Isolation aus der Kulturlösung
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1
l Kulturlösung
die 0,63 g Dimethylmalonsäure
enthält,
wird nach Beendigung der Fermentation durch Zentrifugation von den
Mikroorganismen befreit und anschließend einer stufenweisen Ultrafiltration
unterworfen. In der ersten Stufe wird ein Ultrafilter mit einem
cut off (Ausschlußgrenze)
von 10 kDa eingesetzt, um Proteine und höhermolekulare Stärkeprodukte
zu entfernen. Das Penetrat der ersten Ultrafiltrationstufe wird
gesammelt und in einem zweiten Ultrafiltrationsschritt über einen
Ultrafilter mit einem cut off von 1 kDa gegeben. In dem erhaltenen Penetrat
wird zuerst der pH-Wert mit 0.1 M NaOH auf pH 8,5 eingestellt und
anschließend
das Penetrat mit destilliertem Wasser bis zu einer Leitfähigkeit
von 2 mS verdünnt.
Danach wird die Dimethylmalonsäure an
eine entsprechend equlibrierte Q-Sepharose gebunden und nach einer
Wäsche
mit dem Adsorptionspuffer mit 0,1 M Phosphatpuffer pH 7,0 von der Säule eluiert.
Das Eluat wird im Rotatationsverdampfer eingetrocknet und die Dimethylmalonsäure in 96 %igen
Ethanol aufgenommen. Die unlöslichen
Salze werden abfiltriert und die klare ethanolische Lösung im
Rotationsverdampfer eingedampft. Es wurden 0,45 g Dimethylmalonsäure erhalten.
Die Identität wurde
mit HPLC bestimmt.