DE102004032888B4

DE102004032888B4 - Rekombinante ScV-Partikel, ihre kodierenden Nukleinsäuren und ihre Verwendungen

Info

Publication number: DE102004032888B4
Application number: DE102004032888A
Authority: DE
Inventors: Manfred J. Schmitt; Frank Powilleit
Original assignee: Universitaet des Saarlandes
Current assignee: Universitaet des Saarlandes
Priority date: 2004-07-07
Filing date: 2004-07-07
Publication date: 2006-12-28
Anticipated expiration: 2024-07-08
Also published as: DE102004032888A1

Abstract

Isolierte Nukleinsäure kodierend für ein Fusionsprotein, das Virus-ähnliche Partikel bilden kann, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure
a) mindestens eine von einem Mycovirus stammende Nukleinsäuresequenz und
b) mindestens eine nicht von einem Mycovirus stammende Nukleinsäuresequenz aufweist,
wobei die Nukleinsäuresequenzen aus (a) und (b) funktionell miteinander verbunden sind und ganz oder teilweise für das Fusionsprotein kodieren.

Description

Die Erfindung betrifft die Konstruktion eines auf dem HefeVirus ScV basierenden Expressionssystem zur Herstellung rekombinanter Virus-ähnlicher Partikel und deren Verwendung zur Expression von Fremdproteinen z.B. im Rahmen der Impfstoffentwicklung.

Zur Herstellung rekombinanter Proteine steht eine Vielzahl von Expressionssytemen zur Verfügung. Die Auswahl eines Wirt/Vektor-Systems richtet sich nach den spezifischen physikochemischen Eigenschaften, der natürlichen Lokalisierung, der Stabilität und den für die biologische Funktion erforderlichen Modifikationen des Proteins sowie nach der gewünschten Aufreinigungsstrategie. Ein wesentliches Kriterium für die Auswahl eines geeigneten Expressionssystems stellt die beabsichtigte Verwendung des auf die entsprechende Weise rekombinant exprimierten Proteins dar. Insbesondere bei der Arzneimittelentwicklung ist die Verwendung rekombinant hergestellter Proteine vorteilhaft, da sich die dem Arzneimittel zugrunde liegenden Proteine somit in ausreichender Menge produzieren lassen und frei von toxischen Substanzen sind, die bei einer Isolierung des gewünschten Proteins aus seiner natürlichen Umgebung möglicherweise mitisoliert werden.

Beispielsweise wurden im Rahmen der Impfstoff-Entwicklung bis vor 20 Jahren bevorzugt attenuierte Pathogene oder inaktivierte Präparationen des vollständigen Erregers bzw. seiner krankheitsauslösenden Komponenten herangezogen. Jedoch bergen attenuierte Lebendimpfstoffe neben ihrer hohen Immunogenität das Risiko einer Reversion des Erregers zu seiner ursprünglichen Pathogenität. Bei der Herstellung von Totimpfstoffen besteht zudem die Gefahr einer unvollständigen physikochemischen Inaktivierung, so dass intakte Erreger funktionsfähig verbleiben können. Der Einsatz beider Vakzinen-Arten kann demzufolge zu beträchtlichen Nebenwirkungen führen. Aus diesem Grund erlangen rekombinante Partikel-Impfstoffe auf der Basis so genannter Virus-ähnlicher Partikel („Virus-like particles", VLP) im Zuge des Vakzinen-Designs zunehmend an Bedeutung. Sie sind replikationsunfähig und somit sicher, da sie sich aus Substrukturen oder Untereinheiten eines Pathogens zusammensetzen. Als gute Immunogene (Antigene, Immunantwort auslösende Moleküle) gelten hierbei Polymere, die antigene Determinanten (Epitope) eines Erregers in mehrfacher Ausführung enthalten und zu hochmolekularen Trägerkomplexen assemblieren. Aus dem Stand der Technik sind einige Beispiele zur Verwendung von VLP's bei der Entwicklung von Impfstoffen bekannt. Zum Beispiel offenbart das US-Patent 6,458,362 die Entwicklung eines rekombinanten VLPs auf der Basis des Schweineparvo Virus zur Vakzinierung von Schweinen. Des Weiteren offenbart die WO 2004/003143 die Verwendung von rekombinantem IPNV („infectious pancreatic necrosis Virus") oder TSV („Taura syndrome Virus"), deren Capsidproteine mit HIV-1- oder HBV-Antigendeterminanten fusioniert sind zur rekombinanten Herstellung einer Vakzine in Fischen oder Krabben.

Eine weitere, dem Fachmann geläufige Anwendung der heterologen Expression von Proteinen stellt die Identifizierung von Protein/Protein-Interaktionspartnern, z. B. im Rahmen der Erforschung von Signaltransduktionsprozessen, dar. Das allgemeine Prinzip der aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren wie „ribosomal display" oder „two hybrid system" beruht auf der Anwesenheit eines der Wechselwirkungspartner (des sogenannten Köders, entweder auf einer Oberfläche immobilisiert und/oder in einer Fusion mit einem Reporterprotein vorliegend), so dass Proteine aus der Expression einer cDNA-Bank mit dem Köder in vitro bzw. in in vivo interagieren können. Die kodierende Sequenz korrekter Bindungspartner (Beute) kann nach der Selektion mittels verschiedener Verfahren isoliert und kloniert werden. Nukleinsäurehaltige, chimäre „Virus-like particles" (VLP) könnten zu den bisherigen Techniken eine wirkungsvolle Alternative darstellen. Capside, die Fusionen aus einer assemblierenden und einer ssRNA-bindenden Proteindomäne enthalten, könnten ihre eigene Plasmid-kodierte Konstrukt-mRNA verpacken, in denen die Transkripte effektiv vor einem Abbau durch RNasen geschützt sind. Werden zusätzlich noch auf der äußeren VLP-Oberfläche heterologe Peptide exprimiert, sollten im Rahmen eines Screenings auch Ligandenbindungsstudien möglich sein, wobei positiv selektierte VLP die genetische Information des Peptids bereitstellen und somit eine direkte cDNA-Klonierung ermöglichen.

WO 03/068163 beschreibt chimäre Virus-ähnliche Partikel auf der Basis von menschlichen Papillomaviren. Ferner werden Virus-ähnliche Partikel umfassend Capsidproteine von anderen Viren wie Rotaviren, Caliciviren, Hepatitis E-Viren, Grippeviren, Hepatitis C-Viren und Retroviren einschließlich HIV vorgeschlagen. Nachteil dieser chimären Virus-ähnlichen Partikel ist jedoch, dass sie Sequenzen enthalten, die von humanpathogenen Viren abgeleitet sind.

Huang et al. beschreiben Capsid-Proteine eines Totivirus, die zu Virus-ähnlichen Partikeln assemblieren (Huang S., Soldevila A., et al. (1997) Expression, Assembly, and Proteolytic Processing of Helminhosporium victoriae 190S Totivirus Capsid Protein in Insect Cells, Virology, Bd. 234 (1), S. 134-137). Das Dokument beschreibt, dass die zwei eng verwandten Proteine p78 und p88, die beide aus einem Mycovirus stammen, zu Virus-ähnlichen Partikeln assemblieren können. Eine Herstellung chimärer Virus-ähnlicher Partikel wird in dem Dokument jedoch nicht beschrieben.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, eine Nukleinsäure bereit zu stellen, die eine Expression von Fremdproteinen ermöglicht und verbessert und für verschiedene Verwendungen, bei denen eine heterologe Expression von Proteinen wünschenswert ist, wie Vakzine-Entwicklung, Produktion von Proteinen, insbesondere Enzyme, Untersuchungen von Protein-/Proteinwechselwirkungen, Entwicklung von Transfektionssystemen, effizient eingesetzt werden kann.

Gelöst wir diese Aufgabe durch den Gegenstand der vorliegenden Erfindung:
Isolierte Nukleinsäure kodierend für ein Fusionsprotein, das Virus-ähnliche Partikel bilden kann, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure

a) mindestens eine von einem Mycovirus, insbesondere Totivirus, stammende Nukleinsäuresequenz und
b) mindestens eine nicht von einem Mycovirus stammende Nukleinsäuresequenz aufweist,

wobei die Nukleinsäuresequenzen aus (a) und (b) funktionell miteinander verbunden sind und ganz oder teilweise für das Fusionsprotein kodieren.

Der Ausdruck „isolierte" Nukleinsäure bedeutet innerhalb der vorliegenden Erfindung, dass die Nukleinsäure von anderen Nukleinsäuren, die in der natürlichen Umgebung der erfindungsgemäßen Nukleinsäure vorhanden sind, getrennt ist. Vorzugsweise ist eine „isolierte" Nukleinsäure frei von Sequenzen, welche die erfindungsgemäße Nukleinsäure natürlicherweise innerhalb der genomischen DNA des betreffenden Organismus flankieren, d.h. Sequenzen, die sich am 5'- oder am 3'-Ende der Nukleinsäure befinden. Jedoch können gewisse flankierende Sequenzen vorhanden sein, z.B. bis zu etwa 5kb, 4kb, 3kb, 2kb, 1kb oder weniger, insbesondere benachbarte oder innerhalb des selben Gens liegende, aber durch Introns getrennte, Peptid-kodierende Sequenzen. Darüber hinaus bedeutet „isoliert", dass die Nukleinsäure, z.B. ein Transkript/cDNA-Molekül, im Wesentlichen frei von zellulärem Material oder Kulturmedium (bei rekombinanter Herstellung) oder chemischen Vorstufen oder anderen chemischen Substanzen (bei chemischer Synthese) sein kann. Jedoch kann die erfindungsgemäße Nukleinsäure mit anderen kodierenden oder regulatorischen Sequenzen fusioniert sein und gilt dann immer noch als „isoliert". Beispielhaft kommen für isolierte Nukleinsäuren rekombinante DNA-Moleküle innerhalb eines Vektors, innerhalb heterologer Wirtszellen oder (teilweise) gereinigte DNA-Moleküle in Lösung oder chemisch hergestellte Moleküle in Frage. Isolierte RNA-Moleküle umfassen in vivo oder in vitro RNA-Transkripte der erfindungsgemäßen, isolierten DNA-Moleküle.

Unter einem „Fusionsprotein" versteht der Fachmann üblicherweise ein Protein, welches aus mindestens zwei verschiedenen Proteinkomponenten zusammengesetzt ist.

Üblicherweise wird ein Fusionsprotein hergestellt, indem die für die jeweiligen Komponenten kodierenden Nukleinsäuren mittels molekularbiologischer Methoden, die dem Fachmann bekannt sind, im Leseraster („in frame") aneinander ligiert werden, so dass bei der sich anschließenden Transkription/Translation das gewünschte, zusammengesetzte Protein entsteht. In der vorliegenden Erfindung besteht das Fusionsprotein Idealerweise aus einem viralen Hüll-/Capsidprotein oder Teil davon, das mit dem zu exprimierenden Fremdprotein fusioniert ist und die Bildung Virus-ähnlicher Partikel ermöglicht (siehe unten). Fusionsanteile können aber auch Peptide oder Proteine sein, die einen Nachweis des interessierenden Proteins ermöglichen, so genannte Reporterproteine (z.B. GFP) oder Enzyme (z.B. Alkalische Phosphatase, Luziferase). Des Weiteren kann es sich bei dem Fusionsanteil um so genannte „tags" handeln, die einen immunologischen Nachweis des interessierenden Proteins erlauben (z.B. c-myc, Biotin, FLAG-tag), oder um Peptide/Proteine, die eine Aufreinigung des interessierenden Proteins ermöglichen (z.B. His-tag, Glutathion-S-Transferase).

Der Ausdruck „Virus-ähnliche Partikel" bezeichnet einen Komplex, der spontan aus Untereinheiten viraler Proteine oder Peptide (z.B. virale Hüll-/Capsidproteine) gebildet wird, wenn sie in vivo oder in vitro in räumliche Nähe zueinander gebracht werden. Zum Beispiel kann ein solcher Komplex mit der vollständigen Ergänzung der Hüllproteine eines bestimmten Virus oder mittels Teilmengen homologer oder heterologer viraler Hüllproteine gebildet werden, so lange sie Komplexe bilden, die größer sind als die einzelnen Hüllproteine selbst. Jeder spontan gebildete Komplex aus multimeren Untereinheiten kann unter dieser Definition umfasst sein.

Unter einem „Mycovirus" wird ein Virus verstanden, das Pilze und Hefen infiziert. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Mycovirus um ein doppelsträngiges RNA-Virus, das spezifisch in Saccharomyces cerevisiae Virus-ähnliche Partikel bildet (ScV). Umfasst sind hierbei insbesondere die natürlicherweise in dieser Hefe persistierenden, apathogenen und nicht-infektiösen dsRNA-Viren ScV-L-A, ScV-L-BC und ScV-M (ScV für S.cerevisisae Virus).

Der Ausdruck „funktionell miteinander verbunden" bedeutet im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die Nukleinsäuresequenzen gemäß (a) und (b) üblicherweise, wie vorher beschrieben, mittels molekularbiologischer Techniken, z.B. Ligation, nacheinander geschaltet sind, so dass nach Transkription und Translation das gewünschte Fusionsprotein entsteht. Es ist dabei unerheblich, ob die Nukleinsäuresequenzen gemäß (a) und (b) jeweils ein- oder mehrmals vorliegen. Wie weiter unten beschrieben, kann „funktionell miteinander verbunden" auch bedeuten, dass die Nukleinsäuresequenz eine regulatorische Sequenz darstellt, deren Anwesenheit die Transkription und/oder Translation der Nukleinsäuresequenz gemäß (b) beeinflusst.

In einer weiteren Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Nukleinsäure dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuresequenz gemäß (a) ganz oder teilweise für mindestens ein Capsidprotein, bevorzugt Gag oder Gag-Pol (siehe SEQ ID NO: 24), oder eine funktionelle Variante davon, kodiert.

Das „Capsid" bezeichnet üblicherweise die Proteinhülle eines Virus. Dementsprechend ist ein Capsidprotein ein so genanntes Strukturprotein, das zur Bildung der viralen Hülle erforderlich und Bestandteil der Proteinhülle ist. „Gag" steht dabei für „group-specific antigen", und „Pol" für „Polymerase", eine in praktisch allen Retroviren vorkommende Region. Gag-Vorläuferproteine werden durch virale Proteasen in die verschiedenen Strukturproteine gespalten, die man in freigesetzten infektiösen Viruspartikeln findet. Die sequenzielle Anordnung der Gag-Proteine im Vorläuferprotein stimmt bei allen Retroviren überein. Die viralen Enzyme Protease, Reverse Transkriptase und die Integrase der Retroviren sind ebenfalls im Gag/Pol-Bereich der Pro-Virus-DNA kodiert.

Unter einer „funktionellen Variante" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung allgemein ein Fragment oder Derivat der ursprünglichen Nukleinsäuresequenz oder der davon kodierten Aminosäuresequenz verstanden, dessen Funktionsweise im Vergleich zur ursprünglichen Nukleinsäure oder des davon kodierten Proteins im Wesentlichen unverändert ist. „Fragment oder Derivat" bedeutet, dass sich die Nukleinsäure- und/oder Aminosäuresequenz von der ursprünglichen Nukleinsäure- und/oder Aminosäuresequenz an einer oder mehreren Positionen unterscheidet und einen hohen Grad an Homologie zu dieser Sequenz aufweist. Homologie bedeutet dabei eine Sequenzidentität über die gesamte Länge von mindestens 70%, vorzugsweise über 80%, besonders bevorzugt über 90% und insbesondere von mindestens 95%. Die Abweichungen zu der ursprünglichen Sequenz können dabei durch Deletion, Addition, Substitution oder Insertion von Nukleotiden und/oder Aminosäuren entstanden sein. Ein „Fragment" eines Proteins umfasst üblicherweise mindestens 8, 10, 12, 14, 16 oder mehr benachbarte Aminosäurereste der ursprünglichen Aminosäuresequenz. Derartige Fragmente können aufgrund ihrer biologischen Aktivität oder aufgrund einer anderen Funktion, z.B. Bindung an ein bestimmtes Substrat oder Wirkung als Immunogen, ausgewählt werden. Besonders bedeutende Fragmente sind biologisch aktive Fragmente, Peptide, die etwa 8 oder mehr Aminosäuren lang sind. Ein „Fragment" der Nukleinsäure bedeutet ferner eine zusammenhängende Nukleinsäuresquenz mit mindestens 12 Nukleotiden. Weiterhin kann das Fragment 30, 40, 50, 100, 250 oder 500 oder mehr Nukleotide lang sein. Die Länge des Fragments richtet sich unter anderem nach seiner beabsichtigten Verwendung. Beispielsweise kann das Fragment für Epitop-Regionen kodieren oder als DNA-Sonde oder Primer verwendet werden.

Die Erfinder haben erkannt, dass es für eine Modifizierung der äußeren Oberfläche des VLP günstig sein kann, ein Fremdprotein an bestimmten Stellen innerhalb des viralen Capsidproteins zu inserieren.

Daher ist die erfindungsgemäße Nukleinsäure in einer weiteren Ausführungsform dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuresequenz gemäß (b) ein- oder mehrmals an mindestens einer geeigneten Insertionsstelle innerhalb der für Gag kodierenden Nukleinsäuresequenz eingefügt ist.

Der Ausdruck „Insertionsstelle" bedeutet im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Stelle innerhalb der für Gag kodierenden Nukleinsäuresequenz, in welche die für ein anderes als das Gag-Protein kodierende Nukleinsäuresequenz mittels molekularbiologischer Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, hinein kloniert ist. In Frage kommen im allgemeinen alle Regionen innerhalb der für Gag kodierenden Nukleinsäuresequenz, vorausgesetzt, die Partikelbildung und die Expression des interessierenden Fremdproteins werden durch die Wahl der Insertionsstelle nicht wesentlich beeinträchtigt.

Vorzugsweise ist die mindestens eine geeignete Insertionsstelle 5'-terminal von der für Serin an Position 182 der SEQ ID NO:24 und/oder für Asparaginsäure an Position 262 der SEQ ID NO:24 kodierende Nukleinsäuresequenz lokalisiert.

Oft ist es wünschenswert, dass das heterolog exprimierte Fremdprotein nach Expression von seinem Fusionspartner getrennt wird, um das Protein in reiner Form ohne Fremdanteile vorliegen zu haben. Daher ist es günstig, wenn die für das Fusionsprotein kodierende Nukleinsäure noch eine für eine Proteaseschnittstelle kodierende Region enthält, so dass der interessierende Teil nach Expression von dem nicht interessierenden Teil abgeschnitten werden kann.

Die erfindungsgemäße Nukleinsäure ist demnach in einer weiteren Ausführungsform dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens eine für eine Proteaseschnittstelle kodierende Nukleinsäuresquenz aufweist. Der Begriff „Protease" schließt alle gebräuchlichen Endo- und Exoproteinasen, wobei Endoproteinasen (Proteasen, die ein Protein innerhalb der Aminosäuresequenz schneiden) bevorzugt sind.

In der vorliegenden Erfindung sind alle Schnittstellen für Proteasen, die der Fachmann üblicherweise für solche Zwecke, d.h. das Abtrennen von Fusionsanteilen bei der Expression rekombinanter Fusionsproteine, einsetzt, umfasst. Dazu zählen alle sauren, neutralen und alkalischen Proteasen, welche zu den Gruppen der Serin-, Cystein-, Aspartat- oder Metallproteasen gehören. Eine umfangreiche Liste von Proteasen (auch bekannt als Peptidase), die sich für die erfindungsgemäße Verwendung eignen, ist auf der ExPASy-Internetseite (Expert Protein Analysis System) unter http://ca.expasy.org/cgibin/enzyme-search_ful?peptidase zu finden. Die für diese Verwendung gebräuchlichste Protease ist die natürlicherweise in humanem Blut vorkommende Faktor-Xa-Protease, die für die Aktivierung von Prothrombin zu Thrombin verantwortlich ist. Diese Protease spaltet im Anschluss an die Aminosäureerkennungssequenz Ile-Glu-Gly-Arg.

Daher handelt es sich bei der Proteaseschnittstelle bevorzugt um die Schnittstelle für die Faktor-Xa-Protease.

Wie eingangs erwähnt, eignet sich die erfindungsgemäße Nukleinsäure unter anderem zur Herstellung eines Impfstoffes (Vakzine). Zu diesem Zweck ist es günstig, wenn die erfindungsgemäße Nukleinsäure für ein Protein oder ein Peptid kodiert, welches eine Immunantwort, d.h. unter anderem die Aktivierung von zytotoxischen oder Helfer-T-Lymphozyten oder die Bildung von Antikörpern, auslösen kann. Zytotoxische T-Lymphozyten zeichnen sich durch den Oberflächenmarker CD8, Helfer-T-Lymphozyten durch den Oberflächenmarker CD4 aus. Man spricht in diesem Zusammenhang von Epitopen.

Demgemäß ist die erfindungsgemäße Nukleinsäure in einer weiteren Ausführungsform dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuresequenz gemäß (b) ganz oder teilweise für ein immunogenes Epitop kodiert.

Unter einem (immunogenen) „Epitop" wird die Stelle eines Moleküls verstanden, die die Bindung mit einem spezifischen Antikörper eingeht. Unterschieden werden Sequenzepitope und Konformationsepitope. Man könnte daher ein Epitop auch als die Immunreaktion auslösende Oberflächenstruktur eines Antigens bezeichnen. Epitope können von unterschiedlicher Länge sein. Günstigerweise besitzt das Epitop im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Länge von mindestens 4, 6, 8, 12, 25, 50 Aminosäuren.

Bevorzugt umfasst das immunogene Epitop eine CD4- und/oder eine CD8-positive T-Lymphozyten aktivierende Region.

Üblicherweise richten sich Impfstoffe gegen Infektionen mit Mikroorganismen. Stammt demnach ein Epitop aus dem Protein eines Mikroorganismus, kann mit dem betreffenden Impfstoff gezielt eine Immunreaktion gegen den Mikroorganismus hervorgerufen werden.

Die erfindungsgemäße Nukleinsäure ist daher in einer weiteren Ausführungsform dadurch gekennzeichnet, dass das Epitop ein aus einem Mikroorganismus stammendes Polypeptid ist.

Der Ausdruck "Mikroorganismus" umfasst kleine einzellige Organismen in einer Größendimension jenseits der Sichtbarkeitsgrenze. Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung bezeichnet "Mikroorganismus" neben Viren Prokaryonten wie Bakterien, Cyanobakterien, Mollicutes sowie ein- und mehrzellige Eukaryonten wie z.B. Protozoa und bestimmte Gattungen von Pilzen, Algen und Parasiten (z.B. Sporozoa). Bevorzugt sind Mikroorganismen, die als pathogen gelten und demnach Auslöser für bestimmte Krankheiten sind.

Insbesondere sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung Mikroorganismen umfasst, die folgende (lediglich beispielhaft ausgewählte) Krankheiten auslösen: AIDS, Anthrax, Asthma, Borreliose/Lyme-Krankheit, Botulismus, Brucellose, Campylobacteriose, Chlamydiose, Cholera, Creutzfeldt-Jakob, Dengue-Fieber, Diphtherie, Ebola, Enterohämorrhagische E. coli (EHEC) syn. (VTEC), Erythema chronicum migrans, Frühsommer-Meningoenzephalitis (FSME), Gelbfieber, Gonorrhö, Grippe, Haemophilus influenzae, Hämolytisch-urämisches Syndrom (HUS), Hepatitis (Allgemein), Hepatitis A, Hepatitis B, Hepatitis C, HIV, Influenza, Kinderlähmung/Poliomyelitis, Keuchhusten/Pertussis, Lassa-Fieber, Legionellose, Listeriose, Lyme-Krankheit/Borreliose, Malaria, Masern, Meningitis, Meningokokkenerkrankungen, Milzbrand, Mumps, Norwalk-like-Viren, Otitis-Media, Paratyphus, Pertussis/Keuchhusten, Pneumokokken-Erkrankungen, Pneumonie, Pocken, Poliomyelitis/Kinderlähmung, Röteln, Salmonellose, SARS: Schweres Akutes Respiratorisches Syndrom, Shigellose, Starrkrampf/Tetanus, Tollwut, Tripper, Tuberkulose, Typhus, Verotoxin-produzierende E.coli (VTEC)syn.(EHEC), Virales hämorrhagisches Fieber (VHF), Vogelgrippe, West-Nil-Virus, Zeckenenzephalitis, Zytomegalie.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Mikroorganismus ein Virus, bevorzugt humanes CMV (ZytomegalieVirus). In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Epitop um das ganze oder einen Teil des immundominanten Proteins pp65 des humanen ZytomegalieVirus (hCMV) (siehe SEQ ID NOs:1,3,5 für die Nukleinsäure und 2, 4, 6 für das davon kodierte Protein).

Die erfindungsgemäße Nukleinsäure kann insbesondere zur heterologen Expression von Fremdproteinen verwendet werden. Dies ist insbesondere dann von Vorteil, wenn ein Bedarf an einer größeren Menge des herzustellenden Proteins besteht. Der Nachweis einer erfolgreichen Expression kann darin bestehen, dass das Fremdprotein beispielsweise eine enzymatische Aktivität aufweist, die durch Umsetzung des entsprechenden Substrats nachgewiesen werden kann.

Demgemäß ist die erfindungsgemäße Nukleinsäure in einer weiteren Ausführungsform dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuresequenz gemäß (b) ganz oder teilweise für ein Reporterprotein und/oder ein Enzym, oder eine funktionelle Variante davon, kodiert.

Der Ausdruck „funktionelle Variante" folgt der weiter oben gegebenen Definition. Darüber hinaus können funktionelle Varianten auch Derivate umfassen, bei denen eine oder mehrere Aminosäuren der Aminosäuresequenz chemisch modifiziert oder markiert sind. Die chemischen Modifizierungen können beispielsweise bewirken, dass das zu exprimierende Fremdprotein stabilisiert wird oder andere, wünschenswerte, physikalische und biochemische Eigenschaften aufweist. Dem Fachmann geläufige Modifizierungen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Acetylierung, Acylierung, ADP-Ribosylierung, Amidierung, kovalentes Anfügen von Flavin, kovalentes Anfügen von Nukleotiden oder Nukleotidderivaten, kovalentes Anfügen eines Lipids oder Lipidderivats, kovalentes Anfügen von Phosphotidylinositol, Kreuzvernetzung, Zyklisierung, Disulfidbrückenbildung, Demethylierung, Pyroglutamatbildung, Formylierung, gamma-Carboxylierung, Glykosylierung, GPI-Ankerbildung, Hydroxylierung, Iodinierung, Methylierung, Myristoylierung, Oxidierung, proteolytische Prozessierung, Phosphorylierung, Prenylierung, Razemisierung, Selenoylierung, Sulfatierung, tRNA-vermitteltes Anfügen von Aminosäuren (z.B. Arginylierung oder Ubiquitinierung). Derartige Modifizierungen sind dem Fachmann bekannt und detailliert in der einschlägigen Literatur beschrieben (z.B. Creighton et al., „Proteins – Structure and Molecular Properties", 2nd Ed., 1993, W.H. Freemann & Company, New York)

In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Enzym um eine Esterase, bevorzugt um eine bakterielle Esterase EstC.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst die erfindungsgemäße Nukleinsäure eine Nukleinsäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 und 15.

Die Erfinder haben außerdem erkannt, dass es für eine stabile, selektionsfreie Expression von Fremdproteinen in Wirtszellen, bevorzugt in Hefezellen, günstig sein kann, wenn die für das Fremdprotein kodierende Nukleinsäuresequenz von regulatorischen und cis-prozessiven, viralen Nukleinsäuresequenzen flankiert ist, so dass die nach einer Transkription entstandene rekombinante RNA durch die hefeeigenen ScV-L_A-Funktionen encapsidiert, repliziert und exprimiert wird.

Demnach betrifft die vorliegende Erfindung in einer weiteren Ausführungsform eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, bei der die Nukleinsäuresequenz gemäß (a) eine die Replikation, Transkription und/oder Encapsidierung regulierende Nukleinsäuresequenz umfasst.

Zu einer „die Replikation, Transkription, Encapsidierung regulierenden Sequenz" zählen beispielsweise Promotor- und/oder Terminatorsequenzen und/oder Sequenzen, die die Initiation der Transkription positiv beeinflussen. Darüber hinaus sind Sequenzen umfasst, die das interessierende Transkript gegebenenfalls prozessieren. Bevorzugt umfasst die die Replikation, Transkription und/oder Encapsidierung regulierende Nukleinsäuresequenz einen terminalen Replikationsenhancer („terminal replication enhancer", TRE) und/oder eine virale Bindungsstelle („viral binding site", VBS). Die genannten Sequenzen stammen bevorzugt aus den Hefeviren ScV-L_A, ScV-M1 oder ScV-M28.

In einer weiteren Ausführungsform umfasst die erfindungsgemäße Nukleinsäure eine für ein Ribozym kodierende Nukleinsäuresequenz.

Unter einem „Ribozym" wird üblicherweise ein katalytisches RNA-Fragment verstanden, d.h. selbstspaltende RNA-Moleküle (Phosphodiesterasen). Wird eine Ribozymsequenz in eine gewünschte mRNA insertiert, so kann es bei entsprechendem Design diese mRNA in der Regel spalten und prozessieren. In der vorliegenden Erfindung kann das erfindungsgemäße Ribozym die interessierende mRNA am 3'-Ende derart prozessieren, so dass die für die Verpackung (Encapsidierung) und Replikation essentiellen Sekundärstrukturen freigesetzt werden.

Die erfindungsgemäße Nukleinsäure eignet sich weiterhin für die Herstellung eines Transfektionssystems. Die Erfinder haben erkannt, dass rekombinante Virus-ähnliche Partikel auf ihrer äußeren Oberfläche eine negativ geladene Peptidschleife exprimieren können, die als Adapter für Proteine dient, welche einerseits elektrostatisch über einen polykationischen Abschnitt an die VLP-assoziierte Peptidschleife binden und andererseits eine zelltypspezifische Aufnahme fördern.

Die erfindungsgemäße Nukleinsäure ist demnach in einer weiteren Ausführungsform dadurch gekennzeichnet, dass sie eine für ein anionisches Adapterpeptid kodierende Nukleinsäuresequenz umfasst.

Unter einem „anionischen Adapterpeptid" wird ein im Wesentlichen negativ geladenes Peptid verstanden, das als Adapter für Proteine dienen kann.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Nukleinsäure dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Nukleinsäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den SEQ ID NOs: 17, 18, 19, 20, 21 und 22 umfasst.

Zum Einbringen der erfindungsgemäßen Nukleinsäure in eine Wirtszelle und zur Expression des interessierenden Proteins in einer Wirtszelle, bzw. wie in der vorliegenden Erfindung zur Bildung Virus-ähnlicher Partikel, die das interessierende Protein umfassen, ist es zweckmäßig, wenn die erfindungsgemäße Nukleinsäure in einen Vektor inseriert ist, der Steuerungselemente enthält, die eine heterologe Expression bewirken und/oder fördern.

Daher betrifft die vorliegende Erfindung auch einen Vektor, der eine erfindungsgemäße Nukleinsäure enthält.

Der Ausdruck „Vektor" bezeichnet ein Vehikel, bevorzugt eine Nukleinsäure, welches Nukleinsäuren transportieren kann. Üblicherweise ist die zu transportierende Nukleinsäure mit dem Vektor kovalent verbunden. Die vorliegende Erfindung umfasst Plasmide, einzel- oder doppelsträngige Phagen, einzel- oder doppelsträngige, virale DNA- oder RNA-Vektoren, oder artifizielle Chromosomen (AC) wie BAC (bakteriell), PAC (P1-Phage), YAC (Hefe; „yeast"), HAC (human) oder MAC (Säugetier; „mammalian"). Ein Vektor kann innerhalb der Wirtszelle als extrachromosomales Element repliziert und vervielfältigt werden oder in das Wirtschromosom integrieren und zusammen mit der Wirtszelle vervielfältigt werden.

Die vorliegende Erfindung umfasst Vektoren zur Vermehrung (Klonierungsvektoren) oder zur Expression (Expressionsvektoren) der erfindungsgemäßen Nukleinsäure. In Expressionsvektoren ist die Nukleinsäure daher vorzugsweise in Sinn-Orientierung funktionell mit regulatorischen Sequenzen verknüpft, die die Transkription in prokaryontischen und eukaryontischen Zellen oder in vitro in zellfreien Systemen ermöglichen. Zu den hier gemeinten regulatorischen Sequenzen zählen unter anderem transkriptionssteuernde Promotoren (z.B. linker lambda-Phage, lac, TRP, TAC, SV40, CMV, AdenoVirus, RetroVirus-LTR, SP6, T3, T7 und ähnliche), vorzugsweise PGK (Phosphoglyceratkinase-Promotor), Repressorbindungsstellen, Enhancer (z.B. aus SV40, CMV, AdenoVirus), Transkriptionsterminationsstellen, Ribosomenbindungsstellen, Start- und Stoppkodons oder Polyadenylierungssignale. Die regulatorischen Sequenzen bewirken entweder eine konstitutive Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäure in der Wirtszelle oder eine Expression, die mittels Temperaturänderung, Nährstoffzusatz- oder -entzug oder Zusatz/Entzug anderer Substanzen (z.B. Tetracyclin) induziert wird.

Die erfindungsgemäße Nukleinsäure kann nach bekannten Standardverfahren in den Vektor inseriert werden. Im Allgemeinen wird die interessierende DNA-Sequenz mit einem Vektor verbunden, indem die DNA-Sequenz und der Vektor mit einem oder mehreren Restriktionsenzymen geschnitten und anschließend miteinander ligiert werden.

Es kann wünschenswert sein, die erfindungsgemäße Nukleinsäure als Fusionsprotein zu exprimieren. Die vorliegende Erfindung umfasst daher auch Vektoren, die bereits für Fusionsanteile kodierende Sequenzen enthalten. Derartige Fusionsanteile können die Expression oder Löslichkeit eines rekombinanten Proteins steigern oder eine Aufreinigung erlauben, z.B. pGEX (GST-Fusion), pMAL (Maltose-E-Bindungsprotein) oder rRIT5 (Protein-A-Fusion).

Idealerweise wird der erfindungsgemäße Vektor oder die erfindungsgemäße Nukleinsäure zur Vermehrung oder Expression in eine Wirtszelle eingebracht. Zum Einbringen der erfindungsgemäßen Nukleinsäure in eine Wirtszelle (Transduktion, Transfektion bzw. Transformation) stehen dem Fachmann zahlreiche Verfahren – abhängig von der gewählten Wirtszelle – zur Verfügung. Die einfachste Methode für den Gentransfer ist die Injektion „nackter" Nukleinsäuren in ein Zielgewebe/Zielzellen. Eine effizientere Methode besteht in der Manipulation einer einzelnen Zelle durch die sogenannte Mikroinjektion der Nukleinsäure in den Zellkern. Besonders günstig ist der Einsatz von Reagenzien und Methoden, die Kalziumchlorid, Rubidiumchlorid, Litiumchlorid, Kalziumphosphat, DEAE-Dextran, kationische Lipide, Liposomen, biolistische Partikelbombardierung („gene gun"-Methode), Hitzeschocktransformation und Elektroporation, sowie beliebige Kombinationen davon umfassen. Phagen- oder virale Vektoren werden im Allgemeinen als verpackte oder verkapselte Viren in die Wirtszelle eingebracht.

Zum Selektieren einer Subpopulation von Wirtszellen, welche den erfindungsgemäßen Vektor enthalten, ist es zweckmäßig, wenn der Vektor zusätzlich mit einem so genannten Selektionsmarker versehen ist. Geeignete Selektionsmarker umfassen Gene für Tetracyclin- oder Ampicillinresistenz (Gen für beta-Lactamase) für Bakterien und Gene für Dihydrofolatreduktase- oder Neomycinresistenz für eukaryontische Wirtszellen. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält der erfindungsgemäße Vektor Selektionsmarker zur Expression in Hefezellen, vorzugsweise URA3 (Gen für Uracil-Synthese) oder LEU2 (Gen für Leucin-Synthese).

In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Vektor um einen Expressionsvektor, bevorzugt pPGK oder pL* (siehe Beispiele und Material und Methoden).

Die Erfindung betrifft weiterhin eine Wirtszelle, die eine erfindungsgemäße Nukleinsäure oder einen erfindungsgemäßen Vektor enthält. Die „Wirtszelle" bezeichnet innerhalb der vorliegenden Erfindung eine Zelle des Organismus, in welchem sich das Virus oder das Konstrukt vervielfältigt. Geeignete Wirtszellen umfassen prokaryontische Zellen (Bakterien), niedere eukaryontische Zellen (z.B. Hefezellen) oder höhere eukaryontische Zellen, z.B. Insektenzellen oder Säugetierzellen. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Wirtszelle um eine Hefezelle, bevorzugt der Gattung Saccharomyces.

In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein isoliertes Fusionsprotein, das von einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure kodiert ist.

Der Ausdruck „isoliert" oder „gereinigt" bedeutet innerhalb der vorliegenden Erfindung, dass das Fusionsprotein im Wesentlichen frei von zellulärem Material oder frei von chemischen Vorstufen oder anderen chemischen Substanzen ist. Das erfindungsgemäße Fusionsprotein kann bis zur vollständigen Homogenität oder niedrigeren Reinheitsgraden aufgereinigt sein. Der Reinheitsgrad richtet sich unter anderem nach der beabsichtigten Verwendung. Als kritische Voraussetzung wird vom Fachmann gesehen, dass die Präparation die gewünschte Funktion des Fusionsproteins erlaubt, selbst wenn beträchtliche Mengen anderer Komponenten in der Präparation vorhanden sind. „Im Wesentlichen frei von zellulärem Material" schließt Fusionsproteinpräparationen ein, welche weniger als 30% (gemessen nach Trockengewicht) andere Proteine (d.h. kontaminierende Proteine), vorzugsweise weniger als 20%, besonders bevorzugt weniger als 10% und insbesondere weniger als 5% andere Proteine aufweisen. Wenn das Fusionsprotein rekombinant hergestellt wird, kann es auch im Wesentlichen frei von Kulturmedium sein, d.h. das Kulturmedium beträgt weniger als 20% des Volumens der Fusionsproteinpräparation. „Im Wesentlichen frei von chemischen Vorstufen oder anderen chemischen Substanzen" umfasst Fusionsproteinpräparationen, bei denen das erfindungsgemäße Fusionsprotein von chemischen Vorstufen oder anderen chemischen Substanzen, die beispielsweise an der Synthese des erfindungsgemäßen Fusionsproteins beteiligt sind, abgetrennt ist. Eingeschlossen sind daher Fusionsproteinpräparationen, welche weniger als 30% (gemessen nach Trockengewicht) chemische Vorstufen oder andere chemische Substanzen, vorzugsweise weniger als 20%, besonders bevorzugt weniger als 10% und insbesondere weniger als 5% chemische Vorstufen oder andere chemische Substanzen aufweisen.

Das isolierte Fusionsprotein kann aus Zellen, welche zur rekombinanten Produktion des Fusionsproteins befähigt sind, aufgereinigt werden. Beispielsweise kann eine Nukleinsäure, die für das Fusionsprotein kodiert, in einen Expressionsvektor inseriert werden, der Expressionsvektor wird in eine Wirtszelle eingebracht und das Fusionsprotein wird in der Wirtszelle exprimiert. Das Fusionsprotein kann anschließend mittels Standardverfahren, die weiter unten genauer beschrieben sind, aus den Zellen isoliert werden.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Fusionsprotein dadurch gekennzeichnet, dass es eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, und 16 umfasst.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Herstellen rekombinanter, Virus-ähnlicher Partikel, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

(a) Einbringen einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure in Wirtszellen und
(b) Kultivieren der Wirtszellen unter Bedingungen, die eine Bildung der rekombinanten, Virus-ähnlichen Partikel erlauben und/oder fördern.

Das Einbringen der Nukleinsäure in die Wirtszelle kann nach einer der oben beschriebenen oder nach anderen, dem Fachmann bekannten Methoden erfolgen. Das Kultivieren erfolgt üblicherweise unter selektiven Bedingungen, d.h. beispielsweise in Leucin-freiem Mangelmedium, um erfolgreich transformierte Wirtszellen, insbesondere Hefezellen, anzureichern. Das Kultivieren der Hefezellen findet bei einer Temperatur von etwa 25-35°, vorzugsweise etwa um 30°C statt.

Bevorzugt umfasst das Verfahren zusätzlich das Aufreinigen der rekombinanten, Virus-ähnlichen Partikel.

Das Aufreinigen der Virus-ähnlichen Partikel aus den Wirtszellen erfordert ein Aufschließen der Wirtszellen, das nach allen dem Fachmann bekannten Methoden erfolgen kann. Handelt es sich bei den Wirtszellen um Hefezellen, wie in einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, kann der Aufschluss beispielsweise mittels enzymatischer Lyse (z.B. Zymolyase) und gegebenenfalls unter Zuhilfenahme mechanischer Aufschlussverfahren mittels Glaskügelchen (Vortex oder „Bead beater") erfolgen. Die anschließende Reinigung kann Zentrifugationsschritte, z.B. Ultrazentrifugation über ein Saccharosekissen und anschließende Fraktionierung über einen Saccharosedichtegradienten (siehe Beispiele) umfassen.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft außerdem rekombinante, Virus-ähnliche Partikel, die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens herstellbar sind: Wie vorstehend bereits erwähnt wurde, eignet sich die erfindungsgemäße Nukleinsäure zur Herstellung von Vakzinen.

Die vorliegende Erfindung betrifft demnach weiterhin eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, und/oder ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein, und/oder erfindungsgemäße Virus-ähnliche Partikel zur Verwendung als Arzneimittel, bevorzugt als Impfstoff, optional in Kombination mit einem geeigneten Trägerstoff.

Dabei ist es unerheblich, ob die erfindungsgemäße Nukleinsäure, und/oder das erfindungsgemäße Fusionsprotein, und/oder die erfindungsgemäßen Virus-ähnlichen Partikel alleine oder in Kombination mit anderen aktiven Substanzen verabreicht werden. Die Verabreichung der aktiven Substanzen kann gleichzeitig oder nacheinander erfolgen. Die Dosis und/oder Einwirkzeit des Arzneimittels, bevorzugt Impfstoffs, ist variabel und hängt vom physiologischen Zustand der zu behandelnden Person ab. Dabei können Alter, Gewicht und Geschlecht des Patienten eine Rolle spielen. Außerdem kann es von Bedeutung sein, ob die Krankheit akut, chronisch oder prophylaktisch behandelt werden muss. Die Herstellung solcher Arzneimittel ist dem Fachmann bekannt. Für die Stabilität und Wirksamkeit des Arzneimittels ist gegebenenfalls die Anwesenheit von Stabilisatoren und Trägersubstanzen wie Stärke, Laktose, Stearinsäure, Fette, Wachse, Alkohole oder physiologische Kochsalzlösungen oder andere Additiva wie Konservierungsstoffe, Farbstoffe, Geschmacksstoffe erforderlich. Arzneimittel in flüssiger Form lassen sich, falls erforderlich, lyophilisieren.

Die vorliegende Erfindung betrifft demnach auch ein Arzneimittel, bevorzugt einen Impfstoff, das/der, optional in Kombination mit weiteren pharmazeutisch verträglichen Substanzen und Trägerstoffen, eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, und/oder ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein, und/oder erfindungsgemäße Virus-ähnliche Partikel enthält, und das zur Behandlung von Infektionskrankheiten geeignet ist.

Die Verabreichung des Arzneimittels, insbesondere Impfstoffs, kann oral erfolgen, z.B. in Form von beschichteten oder unbeschichteten Tabletten, Granulaten, harten oder weichen Gelatinekapseln. Das Arzneimittel kann auch parenteral – unter Umgehung des Verdauungsapparates – z.B. subkutan, intramuskulär oder intravenös in Form von Lösungen für Infusionen oder Injektionen verabreicht werden. Andere Darreichungsformen betreffen direkte Applizierungen (z.B. auf die Haut) in Form von Salben, Tinkturen, Sprays oder transdermalen therapeutischen Mitteln, oder zu inhalierende Mittel in Form von Nasensprays, Aerosolen, oder in Form von Mikrokapseln, Implantaten oder Stäbchen. Die geeignete Darreichungsform hängt von der Art und der Schwere der Krankheit ab.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft die Verwendung einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure, und/oder eines erfindungsgemäßen Fusionsproteins, und/oder erfindungsgemäßer Virus-ähnlicher Partikel zur Behandlung von Infektionskrankheiten.

Das Arzneimittel/der Impfstoff oder die erfindungsgemäße Verwendung kann zur Vorbeugung und/oder Behandlung der folgenden, lediglich beispielhaft aufgezählten, Erkrankungen verwendet werden: AIDS, Anthrax, Asthma, Borreliose/Lyme-Krankheit, Botulismus, Brucellose, Campylobacteriose, Chlamydiose, Cholera, Creutzfeldt-Jakob, Dengue-Fieber, Diphtherie, Ebola, Enterohämorrhagische E. coli (EHEC) syn. (VTEC), Erythema chronicum migrans, Frühsommer-Meningoenzephalitis (FSME), Gelbfieber, Gonorrhö, Grippe, Haemophilus influenzae, Hämolytisch-urämisches Syndrom (HUS), Hepatitis (Allgemein), Hepatitis A, Hepatitis B, Hepatitis C, Influenza, Kinderlähmung/Poliomyelitis, Keuchhusten/Pertussis, Lassa-Fieber, Legionellose, Listeriose, Lyme-Krankheit/Borreliose, Malaria, Masern, Meningitis, Meningokokkenerkrankungen, Milzbrand, Mumps, Norwalk-like-Viren, Otitis-Media, Paratyphus, Pertussis/Keuchhusten, Pneumokokken-Erkrankungen, Pneumonie, Pocken, Poliomyelitis/Kinderlähmung, Röteln, Salmonellose, SARS: Schweres Akutes Respiratorisches Syndrom, Shigellose, Starrkrampf/Tetanus, Tollwut, Tripper, Tuberkulose, Typhus, Verotoxin-produzierende E.coli (VTEC)syn.(EHEC), Virale hämorrhagische Fieber (VHF), Vogelgrippe, West-Nil-Virus, Zeckenenzephalitis, Zytomegalie.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure, und/oder eines erfindungsgemäßen Fusionsproteins, und/oder erfindungsgemäßer Virus-ähnlicher Partikel zur heterologen Expression von Proteinen in Hefezellen, bevorzugt der Gattung Saccharomyces.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure, und/oder eines erfindungsgemäßen Fusionsproteins, und/oder erfindungsgemäßer Virus-ähnlicher Partikel zum Untersuchen von Protein-/Proteinwechselwirkungen.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure, und/oder eines erfindungsgemäßen Fusionsproteins, und/oder erfindungsgemäßer Virus-ähnlicher Partikel zum Herstellen eines Transfektionsmittels.

BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG:

1: Schematische Darstellung der gag-CMV pp65 Fusionsgene a) GCe und b) GCeSCe sowie entsprechender Partikel nach der Expression und Assemblierung in Hefe. GCe-VLP exponieren das CMV-pp65-Epitop (Ce) ausschließlich auf der inneren Capsidoberfläche (intraviral), GCeSCe-Partikel zusätzlich auf der äußeren Oberfläche.

2: Western-Analyse der VLP-Gradienten-Fraktionen 1-17 und des Gradienten-Pellets (Gr.P.) mit den Hefetransformanten a) S86c x pL*GCe und b) S86c x pL*GCeSCe. Der immunologische Nachweis der im Hefestamm S86c konstitutiv exprimierten Fusionsproteine erfolgte mit einem primären monoklonalen anti-pp65-Antikörper sowie einem anti-Maus/Alkalische Phosphatase-Konjugat als sekundären Antikörper.

3: Elektronenmikroskopische Aufnahme rekombinanter GCe-VLP, die aus der Hefetransformante S86c x pL*GCe präpariert und mittels Uranylacetat negativ kontrastiert wurden.

4: Antigenspezifische Antworten CD4-positiver HTL und CD8-positiver CTL im Rahmen eines ex vivo Assays mit dem Vollblut einer CMV-seropositiven Spenderin. Die im Blut durch verschiedene Antigene und costimulatorische Antikörper induzierte Aktivierung der Immunzellen wurde nach einer Dreifachfärbung mit den fluoreszenzmarkierten Antikörpern anti-CD69, anti-IFN-γ sowie anti-CD4 bzw. anti-CD8 mit Hilfe einer FACS-Analyse bestimmt. Eine Aktivierung von mehr als 0,05% der untersuchten T-Zellpopulation wurde als signifikant eingestuft (gestrichelte Linie).

5: a) Schematische Darstellung des Hefe-Expressionsvektors pL*G. Das gag-Gen unterliegt der Transkriptionskontrolle des konstitutiven PGK-Promotors und enthält zur in vivo Selektion das LEU2-Gen der Hefe. b) Schematischer Aufbau der an den Aminosäurepositionen D262 und S 182 modifizierten gag-Fusionen sowie c) der oberflächenmodifizierten VLP.

6: Western-Analyse der Gradienten-Fraktionen 1-17 und des Gradienten-Pellets a) nach der pL*G-getriebenen gag-Expression in dem Virusfreien Hefestamm S86c und b) nach der Isolierung natürlicher L_A-VLP aus dem Hefestamm MS 300b. Die aus der Hefe extrahierten Partikel wurden auf einen linearen 20-70%-igen Saccharose-Gradienten aufgetragen und 12 h bei 100.000 × g und 4°C zentrifugiert. Eine Fraktionierung erfolgte von unten nach oben (auf den Blots von links nach rechts aufgetragen) und lieferte 20 2 ml-Fraktionen. Das Gradienten-Pellet (GP) wurde in 2 ml PBSE resuspendiert. Der immunologische Nachweis des Gag-Proteins erfolgte mit einem polyklonalen anti-Gag-Antikörper. Aufgrund des natürlichen Verhältnisses von Gag zu Gag/Pol von 60 zu 1 lag das Gag/Pol-Fusionsprotein unterhalb der Nachweisgrenze des eingesetzten anti-Gag-Antikörpers. M: Rainbow-Marker (Amersham); m: Broad Range Marker (BioRad).

7: Cryoelektronenmikroskopische Aufnahme selbstassemblierter VLP nach der pL*G-getriebenen Expression von Gag in dem Virusfreien Hefestamm S86c. Die VLP wurden aus Gag-haltigen Gradientenfraktionen durch 12 h Zentrifugation bei 100.000 × g und 4°C reisoliert und in PBSE resuspendiert. Die VLP-Lösung mit einem Proteingehalt von 0,5 mg/ml wurde zur Vorbereitung der Cryo-Proben verwendet (Skalierungsstrich, 100 nm).

8: Western-Analyse der Gradienten-Fraktionen 1-20 und des Gradienten-Pellets (GP) der VLP-Präparationen aus den Hefetransformanten A) S86c x pL*G, B) S86c x pL*GS und C) S86c x pL*GD. Vor der Dichtegradienten-Zentrifugation wurden die Kissen-Pellets zur Oberflächendekoration rekombinanter VLP mit jeweils 4 μg monoklonalem anti-c-myc-Antikörper behandelt, der auch zum immunologichen Nachweis c-myc-markierter Fusionsproteine verwendet wurde (1 : 2.000 verdünnt). Als Sekundärantikörper diente ein anti-Maus/Alkalische Phosphatase-Konjugat, das die zur Dekoration und zur Blot-Entwicklung eingesetzten anti-c-myc-Antikörper erkennt. M: „Full range" Rainbow-Marker (Fa. Amersham).

Bemerkung: Die Gag-Signale in Blot A) resultieren aus der Kreuzspezifität des anti-c-myc-Immunglobulins.

9: Elektronenmikroskopische Aufnahme Antikörper behandelter GD-VLP, die aus der Hefetransformante S86c x pL*GD präpariert wurden.

A) GD-VLP + anti-Gfp (murin) + anti-Maus/5 nm Gold (Kontrolle);
B) GD-VLP + anti-c-myc (murin) + anti-Maus/5 nm Gold.

Die Partikel-Lösung wurde zur Negativkontrastierung mit Uranylacetat-Lösung behandelt und anschließend auf Polylysin-beschichtete Träger pipettiert. Mikroskopische Vergrößerung: A) 120.000 bzw. B) 150.000 (TECNAI G² 12, Fa. FEI).

10: Western-Analyse der Gradienten-Fraktionen 1-17 und des Gradienten-Pellets (GP) der VLP-Präparationen aus den Hefetransformanten A) S86c x pL*G8S, B) S86c x pL*G8D, C) S86c x pL*G16S und D) S86c x pL*G16D. Vor der Dichtegradienten-Zentrifugation wurden die Kissen-Pellets zur Oberflächendekoration rekombinanter VLP mit jeweils 4 μg monoklonalem anti-c-myc-Antikörper behandelt, der auch zum immunologichen Nachweis c-myc-markierter Fusionsproteine verwendet wurde (1 : 2.000 verdünnt). Als Sekundärantikörper diente ein anti-Maus/Alkalische Phosphatase-Konjugat, das die zur Dekoration und zur Blot-Entwicklung eingesetzten anti-c-myc-Antikörper erkennt. M: „Full range" Rainbow-Marker (Fa. Amersham).

11: Schematische Darstellung der Gag/Gfp-Fusionen GGS, GXGXS, G8G8S und G8XGX8S. X: Faktor Xa-Schnittstelle; 8x myc: 8x c-myc-Epitop.

12: Western-Analyse der Gradienten-Fraktionen 1-17 und des Gradienten-Pellets (GP) der VLP-Präparationen aus den Hefetransformanten A) S86c x pL*GGS, B) S86c x pL*GXGXS, C) S86c x pL*G8G8S und D) S86c x pL*G8XGX8S (G8XGX8S-VLP mit anti-Gfp dekoriert). Zum immunologichen Nachweis der Gfp-markierten Fusionsproteine wurde monoklonaler anti-Gfp-Antikörper verwendet (1 : 2.000 verdünnt). Als Sekundärantikörper diente ein anti-Maus/Alkalische Phosphatase-Konjugat, das die zur Dekoration und zur Blot-Entwicklung eingesetzten anti-Gfp-Antikörper erkennt. M: „Full range" Rainbow-Marker (Fa. Amersham).

13: Western-Analyse des Faktor X_a-Verdaus Detergenz-behandelter (Spur 1) und intakter GXGXS-VLP (Spur 2). Nach der Prozessierung verbleiben die vier Aminosäuren der Protease-Schnittstelle am C-terminalen Ende des freigesetzten Gfp (Gfp-X). Der immunologische Nachweis der Fusionsproteine erfolgte mit monoklonalem anti-Gfp (1 : 2.000 verdünnt). Die schwachen Signale oberhalb der Gfp-Bande repräsentieren die kleine und große Untereinheit der Xa Protease (kl. bzw. gr. UE), die von anti-Gfp unspezifisch gebunden wurden. M: „Full range" Rainbow-Marker (Fa. Amersham).

14: Schematischer Aufbau des GTXG-Fusionsproteins und die Bedeutung seiner einzelnen Domänen. AC = Affinitätschromatographie.

15: Western-Analyse der VLP-Gradienten-Fraktionen 1-17 und des Gradienten-Pellets (GP) der Hefetransformante S86c x pL*GTXG. Der immunologische Nachweis des im Hefestamm S86c konstitutiv exprimierten Fusionsproteins erfolgte mit einem monoklonalen anti-T7-Antikörper.

16: Western-Analyse zum Nachweis des GTXG-Proteins nach der affinitätschromatographischen Aufreinigung. Zum immunologischen Nachweis des Fusionsproteins wurde ein monoklonaler anti-T7-Antikörper verwendet. UZF: Ultrazentrifugation.

17: Western-Analyse des proteolytisch prozessierten GTXG-Fusionsproteins (10 μg) nach Behandlung mit verschiedenen Konzentrationen an Faktor X_a. Positivkontrolle: rGfp (rekombinantes Gfp).

18: Schematischer Aufbau des GTXEs-Fusionsproteins und die Bedeutung seiner einzelnen Domänen. AC = Affinitätschromatographie.

19: Elektronenmikroskopische Aufnahme von rekombinanten GTXEs-Partikeln nach in vivo Assemblierung in Hefe und Isolierung im Saccharose-Dichtegradienten. Die Negativkontrastierung der VLP erfolgte mit Uranylacetat-Lösung.

20: A) Mikrotiter-Assay zum Nachweis der katalytischen Aktivität rekombinanter GTXEs-Partikel (70 ng und 280 ng) über den Zeitraum von 1 h. Als Negativkontrolle dienten unmodifizierte Gag-VLP (560 ng). Die Esterase-bedingte Freisetzung von 4-Nitrophenol aus 280 μM 4-Nitrophenylacetat wurde über eine Absorptionsmessung bei einer Wellenlänge von 405 nm bestimmt. B) Reaktionskinetik der Hydrolyse von 2 mM 4-Nitrophenylacetat zu 4-Nitrophenol und Acetat durch die aus E. coli affinitätsgereinigte Esterase (TXEs) und die aus Hefe präparierten Gag/Esterase-Partikel (GTXEs-VLP). Die Umsetzungen erfolgten jeweils bei 25°C in einem Reaktionsvolumen von 0,1 ml unter neutralen Bedingungen in PBS₅₀-Puffer pH 7,0.

21: A) Coomassie-gefärbtes SDS-Gel und B) Western-Analyse zum Nachweis rekombinanter GTXEs-VLP. Jeweils 20 μl Probe wurden untersucht: „RI" repräsentiert das Reisolat (3 μg), das zur Reaktion verwendet wurde, „RZ" die nach der Esterhydrolyse rezyklisierten Partikel und „Ü" den Reaktionsüberstand nach Ultrazentrifugation. Als Kontrolle dienten 1 μg und 3 μg BSA (64kDa). Der immunologische Nachweis der 113 kDa großen GTXEs-Fusion erfolgte durch monoklonales anti-T7. M: „Full range" Rainbow-Marker (Fa. Amersham).

22: Reaktionskinetik der Hydrolyse von 4 mM 4-Nitrophenylacetat zu 4-Nitrophenol und Acetat durch rekombinante GTXEs-Partikel vor (Reisolat) sowie nach der Umsetzung und Rezyklisierung (Rezyklisat). Die Umsetzung erfolgte bei 25°C in einem Mikrotiter-Assay (Reaktionsvolumen: 0,1 ml) unter neutralen Bedingungen in PBS₅₀-Puffer pH 7,0.

23: Schematische Darstellung der Expressionskassette zur Etablierung rekombinanter Satellitenviren in einer L_A-haltigen Hefe sowie Fließdiagramm der einzelnen Ereignisse innerhalb der Hefezelle.

24: Schematische Darstellung der hybridisierenden Bereiche des konstruierten Hairpin-Ribozyms (H : Helix-Regionen).

25: Darstellung der Assemblierung rekombinanter Satellitenviren in L_A-haltigen Hefen. Das entscheidende Ereignis ist die Ribozym (Rz)-getriebene Freisetzung des VBS/TRE-Bereichs durch die in vivo erfolgende Abspaltung des RNA-Pol II-generierten Poly(A)-Traktes der heterologen mRNA.

26: Schematische Darstellung des Verpackungs- und Replikationszyklus der Ribozym-prozessierten Plasmid-mRNA. Letztere parasitiert die Capsid-Proteine Gag und Gag/Pol des wirtszelleigenen L_A-Virus und persistiert analog den M-Genomen als Satelliten-Virus.

27: Northern-Analyse zur Überprüfung der Funktionalität des Hairpin-Ribozyms nach einer in vitro „run off" Transkription. Der Nachweis der RNA-Fragmente erfolgte über eine Digoxigenin-markierte Sonde und Chemilumineszenz.

28: Northern-Analyse von Gesamtzell-RNA zur Überprüfung der Funktionalität des Hairpin-Ribozyms in einer L_A-Virus-haltigen Hefe, die das Hairpin-Ribozym Plasmidkodiert (Vektoren pMGXHP und pMLXHP) transkribiert. Als Negativkontrolle wurde die Gesamtzell-RNA aus dem untransformierten Hefestamm mitgeführt. Der Nachweis der RNA-Fragmente erfolgte über eine Digoxigenin-markierte Sonde und Chemilumineszenz.

29: Northern-Analyse zum Nachweis VLP-assoziierter RNA aus einer Hefetranformante, die mit dem VBS/Hairpin-Vektor pMGXHP und dem L_A-Proteinen kodierenden Plasmid pL*AT kotransformiert wurde. Die rekombinanten Partikel wurden aus der Hefe präpariert und einer RNA-Extraktion unterzogen. Als Negativkontrolle wurde VLP-assoziierte RNA aus einer Hefetransformante mitgeführt, die nur mit pL*AT transformiert wurde. Der Nachweis der RNA-Fragmente erfolgte über eine Digoxigeninmarkierte Sonde und Chemilumineszenz.

30: Struktureller Aufbau des konstruierten Fusionsproteins (a), aus dem in vivo assemblierte VLP hervorgehen (b), bei denen Geno- und Phänotyp über nichtkovalente Bindung eng miteinander gekoppelt sind.

31: Struktureller Aufbau eines Fusionsproteins (a), aus dem in vivo VLP hervorgehen (b), die nach Assoziation eines Aufnahme-vermittelnden Proteins als Gentransfer-Vehikel für eukaryontische Zellsysteme dienen.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher erläutert, ohne darauf beschränkt zu sein:
Die Konzentrationensangaben „mM" beziehen sich auf mMol/l.
Beispiel 1: Herstellung einer Vakzine in Form rekombinanter Partikel
Zur Herstellung einer potentiellen Vakzine in Form rekombinanter Partikel wurde zunächst ein verkürztes Fragment "Ce" des immundominanten Proteins pp65 des humanen CytomegalieVirus (hCMV) "in frame" an den C-Terminus des L_A-viralen Capsidproteins Gag fusioniert (GCe-Fusion). Auf dieser GCe-Fusion basierend wurde ein zweites Konstrukt hergestellt, das den Ce-Bereich zusätzlich innerhalb des Gag-Proteins vor der Aminosäure-Position 5182 enthält (GCeSCe-Fusion), die eine Exposition heterologer Peptide auf der äußeren Capsidoberfläche erlaubt. 1 zeigt den schematischen Aufbau beider Fusionsproteine und der resultierenden hybriden VLP.
Analog der Pol-Domäne des natürlichen Gag/Pol-Proteins ragt der heterologe Ce-Bereich in das Capsidinnere, wo er vor dem Abbau durch wirtseigene Proteasen geschützt ist. Das Ce-Protein umfaßt die beschriebenen Helfer-T-Lymphocyten (HTL)-Epitope p10-I und p6-II (Khattab et al., 1997) sowie die Cytotoxische T-Lymphocyten (CTL)-Epitope AE42, AE44 und AE45 (Solache et al., 1999). Das Fusionsgen befindet sich unter der transkriptiven Kontrolle des konstitutiven Phosphoglyceratkinase-Promotors in dem E. coli/Hefe "shuttle"-Vektor pL*, der zum selektiven Wachstum neben der Ampicillin-Resistenz das hefeeigene LEU2-Gen beinhaltet. Die resultierenden Vektoren pL*GCe bzw. pL*GCeSCe wurden in den Virusfreien Leucin-auxotrophen Hefestamm S. cerevisiae S86c (eigene Hefe-Stammsammlung) eingeschleust. Transformanten wurden in Leucinfreiem SC-Medium bis zu einer Zellzahl von 4-6 × 10⁷ Zellen/ml kultiviert und mittels Zymolyase 20T und Glasperlen aufgeschlossen. Die hybriden VLP wurden aus dem Extraktüberstand via Ultrazentrifugation über ein 45%-iges Saccharosekissen und anschließend über einen 20-70%-igen Saccharosegradienten gereinigt. Die darauf folgende Fraktionierung lieferte 20 Fraktionen (je 2 ml), wovon die ersten 17 und das in 2 ml PBSE resuspendierte Gradienten-Pellet in einer Western-Analyse überprüft wurden. Die GCe- und GCeSCe-Fusionsproteine wurden mit Hilfe eines monoklonalen anti-pp65-Antikörpers immunologisch nachgewiesen. Die Fusionsproteine GCe und GCeSCe zeigen auf den Blots (2) ein ähnliches Verteilungsmuster wie das Gag-Protein (6), so dass eine in vivo Assemblierung beider Proteine zu chimären VLP zugrundegelegt wird. Im Falle des GCe-Fusionsproteins konnte die Assemblierung in Hefe zu viralen Partikeln anhand elektronenmikroskopischer Aufnahmen bestätigt werden (3).
Fusionsprotein-haltige Fraktionen wurden vereint, die hybriden Partikel durch eine erneute Ultrazentrifugation reisoliert und in PBSE-Puffer resuspendiert. Die Antigenität der Partikel wurde in einem ex vivo Assay mit Vollblut einer CMV-seropositiven Spenderin überprüft. Hierbei wurden dem Vollblut Antigen sowie kostimulatorische Antikörper zugesetzt und eine dadurch vermittelte Aktivierung CD4-positiver HTL sowie CD8-positiver CTL über eine FACS-Analyse untersucht (Breinig et al., 2003), wobei eine verstärkte Expression von γ-Interferon (IFN-γ) und CD69 als Aktivierungsmarker dienten. Eine Aktivierung von mehr als 0,05% der untersuchten T-Zellpopulation wurde als signifikant eingestuft. Neben den Partikel-Proben GCe und GCeSCe wurden folgende Kontrollen mitgeführt: kostimulatorische Antikörper anti-CD28/anti-CD49d ohne Antigen; PBSE-Puffer; Lysat nicht- und CMV-infizierter Fibroblasten sowie Gag-VLP.
In 4 sind die antigenspezifischen Antworten der CD4- und CD8-positiven Lymphocyten dargestellt. Die Zellen wurden durch das als Positivkontrolle eingesetzte Lysat CMV-infizierter Fibroblasten, durch GCe-Partikel (5 und 11 μg) sowie durch 0,1 μg GCeSCe-VLP signifikant aktiviert. Unmodifizierte Gag-VLP (5 μg) und der zur Partikel-Präparation verwendete PBSE-Puffer bewirkten ebenso wie das Lysat nichtinfizierter Fibroblasten keine signifikante Antwort. Im Kontext einer Antwort CD8-positiver CTL wirkten GCe-Partikel dosisabhängig aktivierend, wohingegen GCeSCe- und Gag-VLP einen nichtsignifikanten Effekt zeigten.
Zusammenfassend kann den GCe-VLP in den eingesetzten Konzentrationen eine immunaktivierende Wirkung hinsichtlich CD8-positiver CTL zugeordnet werden. Vorherige Antigenitätsstudien mit GCe-Partikeln aus dem Pellet nach der Kissen-Zentrifugation bestätigen diese Beobachtung (Daten nicht gezeigt). Zudem bewirken sie eine Aktivierung CD4-positiver HTL, wobei 5 μg GCe-VLP stärker aktivierend waren als 11 μg Partikel. GCeSCe-VLP riefen in deutlich geringeren Konzentrationen (0,1 μg) eine nahezu gleichstarke CD4-Antwort hervor wie 5 μg GCe-Partikel. Jedoch induzierten sie keine signifikante Aktivierung CD8-positiver Zellen, wobei in diesem Kontext jedoch neben der unterschiedlichen Capsidzusammensetzung auch ein Effekt der Mengendifferenz im Vergleich zu den GCe-Partikeln nicht ausgeschlossen werden kann. Der Vollblut-Assay zeigt darüberhinaus, dass das Gag-Protein als nicht bzw. nur schwach immunaktivierender Antigen-Träger fungiert und somit ausschließlich das künstlich eingefügte Ce-Epitop für die gewünschte, signifikante Antigenität verantwortlich ist.
Beispiel 2: Präsentation oberflächenexponierter Epitope mittels rekombinanter L-A-Partikel
Die Bildung von L_A-Virionen in der Hefe S. cerevisiae setzt eine korrekte Assemblierung der Capsidproteme Gag und Gag/Pol voraus. Fujimura et al. (1992) konnten zeigen, dass Gag allein dafür verantwortlich ist, da bereits die Plasmidgetriebene Expression von gag in der Bäckerhefe zur Bildung nukleinsäurefreier VLP führt. Im Vergleich mit den natürlichen L_A-Partikeln lassen sich jene Gag-VLP elektronenmikroskopisch nicht unterscheiden und weisen ein ähnliches Sedimentationsverhalten im Dichtegradienten auf.
Die unten dargestellten Ergebnisse basieren auf einem gag-Konstrukt, das sich im C-terminalen Bereich durch das Einführen einer Sac I-Schnittstelle von dem Wildtyp-Capsidprotein geringfügig unterscheidet. Das gag-Gen befindet sich unter der transkriptiven Kontrolle des konstitutiven Phosphoglyceratkinase-Promotors in dem E. coli/Hefe "shuttle"-Vektor pL*, der zum selektiven Wachstum der Wirtsorganismen neben der Ampicillin-Resistenz das hefeeigene LEU2-Gen beinhaltet. Der resultierende Vektor pL*G (5a) wurde in den Virusfreien, Leucin-auxotrophen Hefestamm S. cerevisiae S86c (eigene Hefe-Stammsammlung) eingeschleust. Transformanten wurden in Leucinfreiem SC-Medium bis zu einer Zellzahl von 4-6 × 10⁷ Zellen/ml kultiviert und mittels Zymolyase 20T und Glasperlen aufgeschlossen. Die hybriden VLP wurden aus dem Extraktüberstand via Ultrazentrifugation über ein 45%-iges Saccharosekissen und anschließend über einen linearen 20-70%-igen Saccharosegradienten gereinigt. Die darauf folgende Fraktionierung lieferte 20 Fraktionen (je 2 ml), wovon die ersten 17 und das in 2 ml PBSE resuspendierte Gradienten-Pellet in einer Western-Analyse überprüft wurden. Zum Vergleich wurden natürliche L_A-Virionen mitgeführt, die aus dem Hefestamm S. cerevisiae MS300b isoliert wurden. 6 belegt, dass die rekombinanten Gag-VLP aus der pL*G-getriebenen Expression im Dichtegradienten das gleiche Sedimentationsverhalten wie die natürlichen dsRNA-haltigen L_A-Partikel zeigen (6, Fraktionen 8-14). Zudem weisen sie in kryoelektronenmikroskopischen Aufnahmen eine identische icosaedrische Capsidstuktur auf (7).
Zur Modifikation der äußeren Capsidoberfläche wurden innerhalb des Gag-Proteins zwei Positionen (Aspartat D262 und Serin S 182) ausgewählt, um das 10 Aminosäuren große c-myc-Epitop als 1-, 8- bzw. 16-fache Kopie zu inserieren (5b). Die entsprechenden Konstrukte werden mit pL*GS(D), pL*G8S(D) bzw. pL*16S(D) bezeichnet. Als Expressionswirt wurde der Virusfreie Hefestamm S86c eingesetzt. Das nach der Ultrazentrifugation des Extraktes Konstrukt-exprimierender Hefen erhaltene Kissen-Pellet wurde resuspendiert und mit 2-4 μg eines monoklonalen murinen anti-c-myc-Antikörpers versetzt, der an potentiell capsidoberflächenexponierten c-myc-Epitopen bindet. Die Suspensionen aus Partikeln mit Antikörper wurden auf ein Saccharose-Gradienten aufgetragen. Die aus der Dichtegradienten-Zentrifugation erhaltenen Fraktionen sowie das Gradienten-Pellet (GP) wurden einer SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen und einer Western-Analyse unterzogen, wobei der anti-c-myc-Antikörper und ein anti-Maus/Alkalische Phosphatase-Konjugat zum immunologischen Nachweis der Fusionsproteine verwendet wurden. Als Negativkontrolle wurde die Hefetransformante S86c × pL*G eingesetzt, die unmodifizierte Gag-Partikel liefert. Werden letztere mit anti-c-myc behandelt und nach einer Dichtegradienten-Zentrifugation fraktioniert, so zeigt sich, dass unter den gewählten Bindungsbedingungen keine Antikörper an die aus unmodifizierten Gag-Proteinen assemblierten Partikel binden (8A): Die Gagspezifischen Signale (76 kDa), die aus der Kreuzreaktivität der zum immunologischen Nachweis eingesetzten Antikörper resultieren, befinden sich in den Fraktionen 10-13, wohingegen die anti-c-myc-spezifischen Signale (leichte Kette: 27 kDa; schwere Kette: 54 kDa) erst ab Fraktion 17 auftreten.
Werden c-myc-markierte gag-Fusionen in vivo exprimiert, Partikel-Aufreinigungen und Antikörper-Behandlungen der Kissen-Pellets durchgeführt, liefern die resultierenden Gradienten-Fraktionen im Rahmen einer Western-Analyse die in 8B und 8C dargestellten Ergebnisse. Anhand der charakteristischen Signalverteilung auf den Western-Blots wird angenommen, dass aus den Ansätzen S86c × pL*GS und S86c × pL*GD chimäre VLP hervorgehen, die die Fähigkeit zur Selbst-Assemblierung beibehalten haben. Die Signale im Gradienten-Pellet werden vermutlich durch Fusionsprotein-Aggregate undefinierter Symmetrie verursacht, die den Dichtegradienten vollständig passieren.
Im Gegensatz zu dem Gag-VLP-Ansatz (8A) komigrieren die anti-c-myc-Antikörper mit den Epitop-markierten GS- und GD-VLP (8B und C) in den Saccharose-Gradienten, so dass von exponierten Positionen der eingeführten c-myc-Epitope an den Integrationsstellen D262 und S182 auf der äußeren Capsidoberfläche ausgegangen wird, die für Antikörper zugänglich sind. Letzteres konnte mit Hilfe einer Immunogold-Elektronenmikroskopie bestätigt werden (9). Hierbei wurden präparierte GD-VLP mit murinem anti-Gfp (Kontrolle) bzw. anti-c-myc und anschließend mit anti-Maus/5 nm Gold versetzt. Die elektronenmikroskopische Aufnahme in 9A zeigt GD-Partikel, die ein identisches Aussehen aufweisen wie natürliche L_A-Virionen, die von Oliver et al. (1977) nach Kontrastierung mit Uranylacetat beschrieben wurden: Isometrische Viruspartikel, die sich durch einen dunklen Kern sowie einen hellen Randbereich auszeichnen. Die schwarzen Punkte zwischen den VLP stammen von Gold-Konjugaten, welche statistisch verteilt vorliegen. Werden GD-Partikel mit anti-c-myc dekoriert und anschließend mit Immunogold behandelt, so erscheint die VLP-Oberfläche durch die Assoziation mit dem Primärantikörper diffus. Zudem befinden sich im Vergleich zur Kontrolle verstärkt Gold-Konjugate an der Capsidoberfläche, was auf deren Bindung an anti-c-myc zurückzuführen ist. Die Ergebnisse der Immunogold-Elektronenmikroskopie sowie jene der Western-Analysen (8) belegen die Exposition der an Gag-S182 und Gag-D262 eingeführten c-myc-Epitope auf der äußeren Capsidoberfläche in Hefe assemblierter GS- und GD-Partikel.
Nach der erfolgreichen Präsentation des zehn Aminosäuren großen c-myc-Epitops auf der äußeren Capsidoberfläche rekombinanter Partikel wurde eine Vergrößerung des Fremdpeptids vorgenommen, um die Insertionskapazität an den Gag-Aminosäurepositionen S182 und D262 zu bestimmen. Hierzu wurde das c-myc-Peptid innerhalb der gag-Konstrukte vervielfältigt, resultierende Fusionen in dem Virusfreien Hefestamm S86c exprimiert und auf die Assemblierungsfähigkeit der Fusionsproteine in vivo zu rekombinanten VLP getestet. Hierbei konnten das 8x und 16x c-myc-Epitop (11,3 bzw. 22,2 kDa) in das Capsidprotein integriert werden (G8S[D]- und G16S[D]-Fusionen), die nach Expression in vivo rekombinante Partikel liefern (10). In nachfolgenden Studien wurde das Grün fluoreszierende Protein (Gfp, 26,8 kDa) anstelle des poly-c-myc-Epitops vor Gag-S182 integriert (11) und die Auswirkung der Integration auf das Assemblierungsvermögen resultierender Partikel nach Expression in der per se Virusfreien Hefe S86c untersucht. Wird Gfp allein inseriert (GGS-Fusion), so verläuft die Assemblierung zu rekombinanten VLP in vivo ineffizient, da die fraktionsspezifischen Signale im Gegensatz zu jenem des Gradienten-Pellets sehr schwach sind (12 A). Letzteres wird vermutlich durch in der Hefezelle gebildete Fusionsproteine hervorgerufen, die sich zu Aggregaten unspezifischer Struktur zusammenlagern und im Zentrifugalfeld aufgrund ihrer hohen molekularen Masse den Saccharose-Dichtegradienten vollständig passieren. Jedoch ist es durch den Einbau von zusätzlichen Gfp-flankierenden Peptidsequenzen gelungen, die Assemblierungseffizienz entsprechender Fusionsproteine zu intakten VLP wieder zu erhöhen (12B/C/D). Die in diesem Kontext verwendeten flexiblen Linker sind die Faktor X_a-Schnittstelle mit der Aminosäure-Sequenz IEGR („X") und das 8x c-myc-Epitop („8"). Hinsichtlich der G8XGX8S-Fusion beträgt die Integrationskapazität an Gag-S182 53 kDa, wobei der Fremdanteil Gfp im Rahmen einer VLP-Dekoration für anti-Gfp zugänglich ist. Darüber hinaus sind die Protease-Schnittstellen auf der äußeren Capsidoberfläche intakter GXGXS-Partikel für den Faktor Xa zugänglich, mit dessen Hilfe Gfp freigesetzt werden kann (13). Zusammenfassend erlauben die hier beschriebenen chimären Gag-Partikel unter Verwendung flexibler Linker die Oberflächen-Präsentation von Proteinen mit einer molekularen Masse von knapp 27 kDa.
Beispiel 3: Expression und Aufreinigung von Fremdproteinen mittels rekombinanter ScV-L-A-Partikel
Hybride Virus-Partikel, deren Capsidproteine mit einem Fremdprotein fusioniert sind, stellen eine interessante Alternative zu den konventionellen Expressionssytemen dar, weil sie aufgrund ihrer hohen molaren Masse durch Ultrazentrifugation aus einem Zellextrakt einfach isoliert werden können. In diesem Zusammenhang verwendeten Burns et al. (1990) das p1-Protein des Ty-Retrotransposons aus der Hefe Saccharomyces cerevisiae zur Produktion und Aufreinigung des SIV-p27-Proteins. Fusionsproteine aus p1 und C-terminal angefügtem Fremdprotein assemblieren in der Bäckerhefe über den p1-Anteil zu hybriden Ty-Partikeln, die das heterologe Polypeptid auf ihrer äußeren Oberfläche exponieren. Eine dem Fremdprotein N-terminal eingefügte Protease-Schnittstelle ermöglicht seine Freisetzung vom Träger-Capsid sowie finale Aufreinigungsschritte.
Zur Expression und Aufreinigung von Fremdproteinen werden die in den Beispielen 1 und 2 beschriebenen Integrationsstellen des L_A-viralen Hauptcapsidproteins Gag ausgenutzt. Zur Herstellung hybrider VLP wurde zunächst das Grün fluoreszierende Protein (Gfp) C-terminal an Gag fusioniert, wobei ein T7-Epitop und eine Faktor X_a-Proteaseschnittstelle N-terminal der GFP-Sequenz eingefügt wurden (14). Die GTXG-Fusion wurde in den Expressionsvektor pL* (5) einkloniert, so dass das resultierende Plasmid pL*GTXG eine konstitutive Expression des Fusionsproteins in der Virusfreien Hefe S. cerevisiae S86c (eigene Hefe-Stammsammlung) erlaubt. Im Rahmen einer Partikel-Isolierung aus GTXG-Fusionsprotein-produzierenden Hefezellen und einer nachfolgenden Western-Analyse der Gradienten-Fraktionen 1-17 und des Gradienten-Pellets (GP) wurde eine VLP-typische Signalverteilung auf den Blot-Membranen festgestellt, die auf eine in vivo Assemblierung der Fusionsproteine zu hybriden Partikeln hinweist (15). Nach einer Reisolierung aus dem Saccharose-Gradienten wurden die chimären VLP mit Hilfe eines Detergenz-haltigen Puffers zerborsten und einer affinitätschromatographischen Aufreinigung über eine anti-T7-Matrix unterzogen (16). Die Eluate wurden anschließend mit Faktor X_a verdaut, wobei verschiedene Protease/Fusionsprotein- Verhältnisse gewählt wurden. Die Western-Analyse in 17 zeigt einerseits die Protease-getriebene Abspaltung des Gfp-Abschnitts von dem GTXG-Fusionsprotein und andererseits die Abhängigkeit der Gfp-Freisetzung von der eingesetzten Enzym-Menge.
Alternativ zur GTXG-Fusion wurde eine Gag-Variante konstruiert, in der das von Faktor X_a-Schnittstellen flankierte Gfp-Protein vor der Aminosäure 5182 integriert vorliegt (Beispiel 2, 11). Die Expression dieser 105 kDa großen GXGXS-Fusion in Hefe liefert rekombinante Partikel, die ein für VLP charakteristisches Wanderungsverhalten im Dichtegradienten zeigen (Beispiel 2, 12B). Nach einer Reisolierung aus dem Saccharose-Gradienten wurden intakte VLP sowie durch Detergenz-Behandlung der Partikel erhaltene GXGXS-Monomere mit Faktor X_a verdaut. In beiden Fällen konnte neben dem Volllängen-Fusionsprotein und einer einfach prozessierten Variante freigesetztes Gfp immunologisch nachgewiesen werden (Beispiel 2, 13). Dieses Ergebnis belegt die Zugänglichkeit der Gfp-flankierenden Protease-Schnittstellen für Faktor X_a.
Desweiteren umfasst die Erfindung Enzym-Fusionen des ScV-L_A-Capsidproteins und daraus hervorgehende rekombinante Partikel als rezyklisierbare Biokatalysatoren. Unter diesem Aspekt wurde die GFP-Sequenz der oben beschriebenen GTXG-Fusion gegen jene der Esterase EstC aus dem Bakterium Burkholderia gladioli (Reiter et al., 2000) ausgetauscht (18). Wird das entsprechende GTXEs-Konstrukt in Hefe exprimiert, assemblieren die Fusionsproteine zu intakten VLP (19). Letztere zeigen im Mikrotiter-Assay Ester-spaltende Aktivität, wobei unmodifizierte Gag-Partikel als Negativkontrolle dienten (20A). Zum Vergleich spezifischer Aktivitäten wurde als Kontrolle eine Esterase-Fusion (TXEs) in E. coli synthetisiert, der im Gegensatz zum GTXEs-Konstrukt die Gag-Domäne fehlt. Nach Aufschluss induzierter Bakterienzellen wurde das lösliche TXEs-Enzym affinitätschromatographisch über eine anti-T7-Matrix gereinigt und neben GTXEs-VLP aus S. cerevisiae zur Bestimmung der katalytischen Aktivität in einem Mikrotiter-Assay eingesetzt (20B). Unter Verwendung von 2 mM 4-Nitrophenylacetat als Substrat erzielten rekombinante GTXEs-Partikel aus Hefe spezifische Enzymaktivitäten von bis zu 12,8 Units pro mg Fusionsprotein, wobei 1 Unit als die Enzymmenge definiert wird, die unter Testbedingungen 1 μmol Alkohol/min freisetzt. Das entspricht einer Aktivität von 38,9 Units pro mg Protein für den 37,2 kDa großen TXEs-Anteil von 32,9% innerhalb der GTXEs-Fusion (113 kDa), wohingegen die bakteriell exprimierte TXEs-Esterase mit 72,6 Units pro mg Protein bei gleichen Substratkonzentrationen eine 1,9-fach höhere Aktivität aufweist. Dieser Unterschied basiert auf der Lokalisation der Esterase-Domäne im Capsidinneren der GTXEs-VLP, wobei die Virushülle aus assembliertem Gag-Protein eine Diffusionsbarriere darstellt. Hierdurch wird die Zugänglichkeit des aktiven Zentrums für die Substrate reduziert und ein rasches Hinausdiffundieren der Produkte aus den Capsiden unterbunden, was im Vergleich zum „nackten" TXEs-Enzym in einer geringeren spezifischen Aktivität mündet.
Im Rahmen einer Enzym-Rezyklisierung wurden rekombinante Gag/Esterase-Partikel aus einem Reaktionsansatz mittels Ultrazentrifugation reisoliert und hinsichtlich ihrer Quantität und katalytischen Qualität überprüft. Das in 21A dargestellte Coomassiegefärbte SDS-Gel zeigt, dass circa ein Drittel der ursprünglich eingesetzten Esterase-Partikel durch Ultrazentrifugation des Reaktionsansatzes wiedergewonnen werden können. Der Rest muss im Reaktionsüberstand enthalten sein, der jedoch weder in der Coomassienoch in der Western-Analyse (21B) aufgrund der hohen Verdünnung GTXEs-spezifische Signale liefert. Unter Verwendung von 4 mM 4-Nitrophenylacetat hydrolysieren die rezyklisierten Partikel nachwievor das Ester-Substrat (22) und weisen vergleichbare spezifische Aktivitäten von 20,2 Units pro mg Fusionsprotein auf wie VLP, die für die erste Ester-Spaltung eingesetzt wurden (20,8 Units pro mg Fusionsprotein).
Beispiel 4: Selektionsfreie Expression von Fremdproteinen in vivo mittels rekombinanter Viruspartikel in der Bäckerhefe
Die Expression eines Fremdgens in der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae erfolgt nach deren Transformation mit einem DNA-Konstrukt (YEp, YRp, YCp, YIp, YAC), das neben der Expressionskassette noch Gene für die Replikation bzw. Selektion des Vektors enthält. Daher müssen Hefe-Transformanten zur Aufrechterhaltung derartiger Konstrukte in definierten und kostspieligen Mangelmedien kultiviert werden, wobei ihr Wachstum im Vergleich zu jenem in Vollmedien vermindert ist und häufig zu geringeren Zelldichten sowie suboptimalen Proteinausbeuten führt.
Zudem zeigen Vektor-Systeme für die Hefe unterschiedliche genetische Stabilität. So werden beispielsweise YRp-Plasmide nicht vollständig auf Tochterzellen segregiert, so dass letztlich nur 5-10% der unter Selektionsdruck gewachsenen Hefe-Transformanten das Plasmid enthalten, wobei eine verringerte Produktion des Fremdproteins einhergeht (Current Protocols of Molecular Biology, Einheit 13.4).
In der vorliegenden Erfindung wurde eine Expressionskassette konstruiert, die eine stabile Expression heterologer Gene in einem L_A-Virus-haltigem Hefestamm ermöglichen soll. Hierbei wird die Fremdgensequenz von regulatorischen und cis-prozessiven Elementen flankiert, so dass die nach einer Transkription entstandene rekombinante RNA durch die hefeeigenen L_A-Funktionen encapsidiert, repliziert und exprimiert wird (23). Die Bereiche pPGK und tPGK stellen Promotor- respektive Terminator-Sequenzen aus einem Hefe/E. coli "shuttle"-Plasmid dar, in dem die Expressionskassette einkloniert ist, um in vivo eine konstitutive Transkription zu ermöglichen. Als Reportergene dienen das homologe LEU2- und das heterologe yEGFP3-Gen, die einen einfachen phänotypischen Nachweis der in vivo Expression erlauben: Wachstum auf Leucin-d/o-Medium bzw. Nachweis von Gfp durch Fluoreszenz-Mikroskopie. Dem jeweiligen Reportergen wurden die ersten 12 Basen des 5'-Endes der M28-(+)RNA vorgeschaltet, da sie als 5'TRE die Initiation der Transkription positiv beeinflussen (Schmitt und Breinig, 2002). Das von der hefeeigenen RNA-Polymerase II gebildete Transkript erhält eine 5'-Kappe sowie einen Poly(A)-Trakt am 3'-terminalen Ende. Die am 3'-Ende eingefügte Ribozym (Rz)-Sequenz (24) soll das Transkript in cis derart prozessieren, dass die Reportergen-kodierende Sequenz samt 3'VBS/TRE-Bereich verbleibt. Der VBS/TRE-Trakt ("viral binding site/terminal replication enhancer") enthält virale 3'-Sequenzen (alternativ aus L_A, M1 und M28), die zur cytoplasmatischen Replikation und Transkription der prozessierten RNA sowie zu deren Verpackung in VLP ("Virus-like particles") notwendig sind. Replikation, Transkription als auch Encapsidierung sollen über das Gag/Pol-Fusionsprotein des natürlich vorkommenden L_A-Virus der Wirtshefe erfolgen, wobei nach einer Assemblierung über L_A-Gag-Proteine VLP resultieren, die die prozessierte heterologe mRNA enthalten. In viro soll die Pol-Aktivität den Einzelstrang zu einem Doppelstrang komplettieren und letzteren als Matrize zur Transkription akzeptieren. Partikel mit heterologer dsRNA sollen in der Zelle mit natürlichen L_A-VLP koexistieren und wie solche cytoplasmatisch auf Tochterzellen vererbt werden, um eine stabile Expression des Fremdgens in Vollmedien (unter nicht-selektiven Bedingungen) zu gewährleisten. Letzteres würde gerade im Rahmen von industriellen Kultivierungen rekombinanter Hefen eine deutliche Vergünstigung der eingesetzten Nährmedien ermöglichen.
Die 25 und 26 illustrieren schematisch die Vorgänge innerhalb einer L_A-haltigen Hefezelle, die mit einer wie oben dargestellten Expressionskassette transformiert wurde.
Die Etablierung eines heterologen RNA-Satelliten beginnt mit der Transkription der DNA-Kassette im Hefe-Zellkern, die zur Bildung von positiv orientierter Einzelstrang-RNA ((+)ssRNA) führt. Nach dem Export ins Cytoplasma der Zelle wird die (+)ssRNA translatiert, wobei das Reporterprotein hergestellt wird, beispielsweise Gfp, das durch Fluoreszenz-Mikroskopie nachweisbar ist (25). Ein Teil der heterologen RNA wird durch die Aktivität des Ribozyms am 3'-Ende prozessiert, so dass die für Verpackung und Replikation essentiellen Sekundärstrukturen freigesetzt werden. Nach der Encapsidierung der prozessierten (+)ssRNA in L_A-Partikel der Wirtshefe erfolgt im Rahmen der Replikation eine in viro (–)-Strangsynthese (26). Die resultierende dsRNA wird durch die Pol-Aktivität transkribiert, wodurch wieder heterologe (+)ssRNA entsteht, die als virale RNA im Unterschied zum Transkript der nukleären RNA-Polymerase weder eine 5'-Kappe noch einen Poly(A)-Trakt am 3'-terminalen Ende aufweist und somit für einen neuen Verpackungs- und Replikationszyklus zur Verfügung steht.
Die 27 und 28 dokumentieren die in vitro und in vivo Aktivität des verwendeten Hairpin-Ribozyms. Im Rahmen der Encapsidierung Plasmidgetriebener mRNA in L_A-VLP wurde der Virusfreie Hefestamm S86c mit den Vektoren pL*AT und pMGXHP kotransformiert: pL*AT kodiert für die L_A-Proteine Gag und Gag/Pol, pMGXHP für ein GFP-VBS/TRE-Hairpin-Konstrukt, dessen mRNA über die VBS-Struktur durch Gag/Pol erkannt und in Partikel verpackt werden soll. Das Hairpin-Ribozym dient zur Prozessierung des Transkriptes, um in vivo ein authentisches Replikationssignal zu generieren. Die Northern-Analyse in 29 belegt die Encapsidierung der pMGXHP-getriebenen Einzelstrang-RNA in L_A-Partikel.
Beispiel 5: Untersuchung von Protein/Protein-Wechselwirkungen auf der Basis oberflächenmodifizierter, RNA-encapsidierender LA-Viruspartikel
Ein häufiges Ziel molekularbiologischer Forschung ist die Identifikation von Protein/Protein-Interaktionspartnern, z. B. im Rahmen der Signaltransduktion. Das allgemeine Prinzip gängiger Methoden wie „ribosomal display" oder „two hybrid system" beruht auf der Anwesenheit eines der Wechselwirkungspartner (des sogenannten Köders, entweder auf einer Oberfläche immobilisiert und/oder in einer Fusion mit einem Reporterprotein vorliegend), so dass Proteine aus der Expression einer cDNA-Bank mit dem Köder in vitro bzw. in in vivo interagieren können. Die kodierende Sequenz korrekter Bindungspartner (Beute) kann nach der Selektion mittels verschiedener Verfahren isoliert und kloniert werden (Fields and Song, 1989; Hanes and Pluckthun, 2000).
Nukleinsäurehaltige, chimäre „Virus-like particles" (VLP) könnten zu den bisherigen Techniken eine Alternative darstellen. Capside, die Fusionen aus einer assemblierenden und einer ssRNA-bindenden Proteindomäne enthalten, könnten ihre eigene Plasmidkodierte Konstrukt-mRNA verpacken, in denen die Transkripte effektiv vor einem Abbau durch RNasen geschützt sind. Werden zusätzlich noch auf der äußeren VLP-Oberfläche heterologe Peptide exprimiert, sollten im Rahmen eines Screenings auch Ligandenbindungsstudien möglich sein, wobei positiv selektierte VLP die genetische Information des Peptids bereitstellen und somit eine direkte Klonierung ermöglichen.
Fujimura et al. (1990) konnten bereits in der Hefe Saccharomyces cerevisiae die Encapsidierung Plasmidkodierter RNA in L_A-Virionen nachweisen. Das hierbei eingesetzte 725 Basen große Transkript enthielt die „viral binding site" (VBS)-Struktur der X-RNA, einer natürlichen Deletionsmutante von L_A. Trotz der Anwesenheit der RNA-Polymerase II-assoziierten Modifikationen (5'-Kappe und 3'-Poly(A)-Trakt) wurde das Transkript über die VBS-Struktur vom Gag/Pol-Fusionsprotein des natürlichen L_A-Systems der Wirtshefe erkannt und in Viruspartikel verpackt. Anhand dieser Daten und der in Beispiel 2 dargestellten Optionen zur Oberflächenmodifikation von L_A-Capsiden sollte die Herstellung rekombinanter Partikel möglich sein, die (i) heterologe Peptidsequenzen auf der äußeren Oberfläche exponieren, welche für Wechselwirkungspartner zugänglich sind, und die (ii) ihre vektorkodierte mRNA encapsidieren (30).
Beispiel 6: Transfektionssystem auf der Basis oberflächenmodifizierter, RNA-encapsidierender LA-Viruspartikel
Die Mehrzahl der Vektorsysteme, die gegenwärtig zur Gentherapie eingesetzt werden, sind Derivate von Retro-, Adeno- und Adeno-assoziierten Viren. Ihre Capside, in denen die zu transformierende Nukleinsäure verpackt wird, besitzen per se keinen Zelltyp-Tropismus (Robbins et al., 1998). Um genetische Informationen selektiv in Gewebe eines bestimmten Zelltyps einzuschleusen, muß die äußere Oberfläche des Viruscapsids mit Peptid-Sequenzen modifiziert werden, die eine gerichtete Aufnahme in die jeweilige Zielzelle vermitteln.
Unter diesem Aspekt verwendeten Stubenrauch et al. (2001) eine Variante des polyomaviralen VP1-Capsidproteins, die in vitro in Anwesenheit von Calcium-Ionen spontan zu "Virus-like particles" (VLP) assemblieren. Die rekombinanten Partikel exponieren auf ihrer äußeren Oberfläche eine negativ geladene Peptid-Schleife, die als Adapter für Proteine dient, welche einerseits elektrostatisch über einen polykationischen Abschnitt an die VLP-assoziierte Peptid-Schleife binden und andererseits eine zelltypspezifische Aufnahme forcieren. Auf diese Art mit tumorspezifischen Antikörper-Fragmenten behaftete VLP zeigten im Vergleich zur Negativkontrolle für Zellen entsprechender Tumorzelllinien einen signifikanten Tropismus.
Anhand dieser Daten und der Ergebnisse von Fujimura et al. (1990) sowie jener über die Modifizierbarkeit von L_A-Capsiden in Beispiel 1 sollten rekombinante L_A-Partikel hergestellt werden können, die zur Bindung von Proteinen mit einem polykationischen Abschnitt einen polyanionischen Bereich auf ihrer äußeren Oberfläche exponieren und heterologe Einzel- oder Doppelstrang-RNA im Capsidinneren verpacken (31). Werden diese Partikel mit Proteinen "dekoriert", die eine zelltypspezifische Aufnahme vermitteln, so könnten letztere als alternative Gentransfer-Vehikel eingesetzt werden.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims

Isolierte Nukleinsäure kodierend für ein Fusionsprotein, das Virus-ähnliche Partikel bilden kann, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure a) mindestens eine von einem Mycovirus stammende Nukleinsäuresequenz und b) mindestens eine nicht von einem Mycovirus stammende Nukleinsäuresequenz aufweist, wobei die Nukleinsäuresequenzen aus (a) und (b) funktionell miteinander verbunden sind und ganz oder teilweise für das Fusionsprotein kodieren.
Nukleinsäure nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuresequenz aus (a) von einem Totivirus stammt.
Nukleinsäure nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Mycovirus ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus ScV-L-A, ScV-L-BC und ScV-M.
Nukleinsäure nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuresequenz gemäß (a) ganz oder teilweise für mindestens ein Capsidprotein, bevorzugt Gag oder Gab-Pol, oder eine funktionelle Variante davon, kodiert.
Nukleinsäure nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuresequenz gemäß (b) ein- oder mehrmals an mindestens einer geeigneten Insertionsstelle innerhalb der für Gag kodierenden Nukleinsäuresequenz eingefügt ist.
Nukleinsäure nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens eine geeignete Insertionsstelle 5'-termiral von der für Serin an Position 182 der SEQ ID NO:24 und/oder für Asparaginsäure an Position 262 der SEQ ID NO:24 kodierende Nukleinsäuresequenz lokalisiert ist.
Nukleinsäure nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens eine für eine Proteaseschnittstelle kodierende Nukleinsäuresquenz aufweist.
Nukleinsäure nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Proteaseschnittstelle Schnittstelle für die Faktor-Xa-Protease ist.
Nukleinsäure nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuresequenz gemäß (b) ganz oder teilweise für ein immunogenes Epitop kodiert.
Nukleinsäure nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das immunogene Epitop eine CD4- und/oder eine CD8-positive T-Lymphozyten aktivierende Region umfasst.
Nukleinsäure nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Epitop ein aus einem Mikroorganismus stammendes Polypeptid ist.
Nukleinsäure nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus ein Virus ist.
Nukleinsäure nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Virus CMV ist.
Nukleinsäure nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuresequenz gemäß (b) ganz oder teilweise für ein Reporterprotein und/oder ein Enzym, oder eine funktionelle Variante davon, kodiert.
Nukleinsäure nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym eine Esterase ist.
Nukleinsäure nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Nukleinsäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den SEQ ID NQs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 und 15 umfasst.
Nukleinsäure nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuresequenz gemäß (a) eine die Replikation, Transkription und/oder Encapsidierung regulierende Nukleinsäuresequenz umfasst.
Nukleinsäure nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die die Replikation, Transkription und/oder Encapsidierung regulierende Nukleinsäuresequenz einen terminalen Replikationsenhancer und/oder eine virale Bindungsstelle umfasst.
Nukleinsäure nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine für ein Ribozym kodierende Nukleinsäuresequenz umfasst.
Nukleinsäure nach mindestens einem der Ansprüche 17 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine für ein anionisches Adapterpeptid kodierende Nukleinsäuresequenz umfasst.
Nukleinsäure nach mindestens einem der Ansprüche 17 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Nukleinsäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den SEQ ID NOs: 17, 18, 19, 20, 21 und 22 umfasst.
Vektor, der eine Nukleinsäure gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 21 enthält.
Vektor nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Expressionsvektor ist.
Vektor nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass der Expressionsvektor pL* ist.
Wirtszelle, die einen Vektor gemäß mindestens einem der Ansprüche 22 bis 24 enthält.
Wirtszelle nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Hefezelle ist.
Wirtszelle nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Hefezelle der Gattung Saccharomyces ist.
Isoliertes Fusionsprotein, dadurch gekennzeichnet, dass es von einer Nukleinsäure gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 21 kodiert ist.
Fusionsprotein nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den SEQ ID NOs: 2, 4. 6, 8, 10, 12, 14, und 16 umfasst.
Verfahren zum Herstellen rekombinanter, Virus-ähnlicher Partikel, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Einbringen einer Nukleinsäure gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 21 in Wirtszellen und (b) Kultivieren der Wirtszelle unter Bedingungen, die eine Bildung der rekombinanten. Virus-ähnlichen Partikel erlauben und/oder fördern.
Verfahren nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren zusätzlich das Aufreinigen der rekombinanten, Virus-ähnlichen Partikel umfasst.
Rekombinante, Virus-ähnliche Partikel, dadurch gekennzeichnet, dass sie mittels eines Verfahrens gemäß Anspruch 30 oder 31 herstellbar sind.
Nukleinsäure gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 21 und/oder Fusionsprotein gemäß Anspruch 28 oder 29 und/oder Virus-ähnliche Partikel gemäß Anspruch 32 zur Verwendung als Arzneimittel.
Nukleinsäure gemäß Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, dass das Arzneimittel ein Impfstoff ist.
Verwendung einer Nukleinsäure gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 21 und/oder eines Fusionsproteins gemäß Anspruch 28 oder 29 und/oder Virus-ähnlicher Partikel gemäß Anspruch 32 zur Behandlung von Infektionskrankheiten.
Verwendung einer Nukleinsäure gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 21 und/oder eines Fusionsproteins gemäß Anspruch 28 oder 29 und/oder Virus-ähnlicher Partikel gemäß Anspruch 27 zur heterologen Expression von Proteinen in Hefezellen.
Verwendung gemäß Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, dass die Hefezelle der Gattung Saccharomyces angehört.
Verwendung einer Nukleinsäure gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 21 und/oder eines Fusionsproteins gemäß Anspruch 28 oder 29 und/oder Virus-ähnlicher Partikel gemäß Anspruch 32 zum Untersuchen von Protein-/Proteinwechselwirkungen.
Verwendung einer Nukleinsäure gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 21 und/oder eines Fusionsproteins gemäß Anspruch 28 oder 29 und/oder Virus-ähnlicher Partikel gemäß Anspruch 32 zum Herstellen eines Transfektionsmittels.