DE102004020644A1

DE102004020644A1 - Verfahren zur Bestimmung eines UVA- und UVB-Strahlung erfassenden integralen Sonnenschutzfaktors

Info

Publication number: DE102004020644A1
Application number: DE102004020644A
Authority: DE
Inventors: Louis Ferrero; Karin Golz-Berner; Leonhard Zastrow; Norbert Groth; Thomas Dr. Herrling
Original assignee: Privatinstitut fur Dermatologische Produktforschung Galenus GmbH; Coty BV
Current assignee: Privatinstitut fur Dermatologische Produktforschung Galenus GmbH; Coty BV
Priority date: 2004-04-22
Filing date: 2004-04-22
Publication date: 2005-11-17
Also published as: JP2007532896A; US7567080B2; AU2005236155A1; CN1997910B; ES2399339T3; CN1997910A; WO2005103659A2; JP4286309B2; EP1738190B1; WO2005103659A3; EP1738190A2; AU2005236155B2; US20080224059A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung eines integrierten Sonnenschutzfaktors DOLLAR I1 der sowohl UVA- als auch UVB-Strahlung erfasst und der für die Einordnung kosmetischer und dermatologischer Sonnenschutzmittel einsetzbar ist. Das Verfahren umfasst folgende Schritte: Aufbringen des Sonnenschutzmittels in einer definierten Menge auf eine definierte Fläche eines Hautsubstrats, das zuvor mit einer Radikalfalle ("spin trap") imprägniert wurde, Bestrahlung des Hautsubstrats mit einer definierten Strahlungsmenge mit UVA- und UVB-Anteil mittels eines Sonnensimulators, Durchführung einer Elektronenspinresonanz(ESR)-Messung des bestrahlten Hautsubstrats, Erfassung der Anzahl der gefangenen freien Radikale als reale Zahl multipliziert mit 10·12· freien Radikalen pro mg Hautprobe und Ermittlung des integrierten Sonnenschutzfaktors DOLLAR I2 nach den Beziehungen (1), (2) und (8) DOLLAR F3

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung eines integrierten Sonnenschutzfaktors (∫ SPF oder iSPF), der sowohl UVA- als auch UVB-Strahlung erfasst und der für die Einordnung kosmetischer und dermatologischer Sonnenschutzmittel einsetzbar ist.
Es ist bekannt, dass die Erzeugung freier Radikale in der Haut durch UV-Strahlung deutlich erhöht wird. Dabei werden reaktionsfähige Sauerstoffspezies, wie das Hydroxylradikal ^*OH^–, das Superoxidanion-Radikal O₂ ^– und Singulett-Sauerstoff ¹O₂ erzeugt, die wiederum zur Bildung von Lipidradikalen L^* führen. In kosmetischen und dermatologischen Sonnenschutzzubereitungen werden daher UV-Filtersubstanzen und darüber hinaus in geringeren Mengen Antioxidationsmittel eingesetzt.

Aus 22^nd IFSCC Congress Edinburgh 2002 Proceedings, Oral Papers, Vol. 2, Zastrow et al. und anderen Veröffentlichungen ist weiterhin bekannt, dass durch Elektronenspinresonanz (ESR)-Imaging ein unterschiedlich tiefes Eindringen von UVA- und UVB-Strahlen in die Haut bestätigt wurde. Während UVB-Strahlen des Wellenlängenbereichs 290–320 nm nur bis etwa 50 μm Tiefe eindringen, dringen UVA-Strahlen bis in die untere Dermisschicht bis etwa 3 mm Tiefe ein.

Freie Radikale, deren Auftreten im Zeitbereich von 0,3 ns (^*OH-Radikal) bis einige Sekunden (L^*-Radikal) durch Radikalfallen, sogenannte „spin traps", wie DMPO (5,5'-Dimethyl-1-pyrrolin-N-oxid) oder PBN (Phenyl-tert-butylnitron) und das ESR-Verfahren gemessen werden kann, werden in tieferen Hautschichten hauptsächlich durch den UVA-Bereich des solaren Spektrums erzeugt.

In üblichen Sonnenschutzmitteln werden traditionelle Sonnenschutzfaktoren (SPF) oder Lichtschutzfaktoren (LSF) angegeben, die im Bereich von 2 bis 100, vorzugs weise 4 bis 50, liegen. Die darin enthaltene Information für den Anwender basiert auf der Erkenntnis, dass eine Verlängerung des Aussetzens der Haut gegenüber Sonnenstrahlung möglich ist, und zwar auf die Zeit (in Minuten) bis zum Auftreten eines Erythems (Sonnenbrand) multipliziert mit dem entsprechenden Faktor. Das Auftreten einer Hautrötung, die im allgemeinen als Entzündung (Erythem) zu verstehen ist und als Ergebnis einer bestimmten UV-Strahlendosierung auftritt, korreliert nach eigenen Erkenntnissen nicht linear mit dem Auftreten freier Radikale. Darüber hinaus enthalten Sonnenschutzmittel unterschiedliche Anteile an UVA- und/oder UVB-Filtern und bieten daher in den meisten Fällen keinen ausreichenden, variierenden und quantifizierbaren Schutz gegen freie Radikale. Die SPF/LSF in der bisherigen Form, die sich nur auf die Wirkung von UVB beziehen, erscheinen nicht mehrgeeignet, die Schutzwirkung von Sonnenschutzmitteln richtig wiederzugeben.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Bestimmung eines integrierten Sonnenschutzfaktors bereitzustellen, der die Wirkung von UVA- und UVB-Strahlung auf und in der Tiefe der Haut vollständig erfasst und der als genauer Richtwert für den Anwender dienen kann.

Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Bestimmung eines UVA- und UVB- Strahlung erfassenden integrierten Sonnenschutzfaktors (∫ SPF) für kosmetische und dermatologische Sonnenschutzmittel bereitgestellt, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man

(a) das Sonnenschutzmittel in einer definierten Menge auf eine definierte Fläche eines Hautsubstrats aufbringt, das zuvor mit einer als Radikalfalle („spin trap") dienenden, bekannten Substanz imprägniert wurde,
(b) das Hautsubstrat mit einer definierten Strahlungsmenge mit UVA- und UVB-Anteil entsprechend den natürlichen Sonnenbestrahlungsverhältnissen aus einer Strahlungsquelle, wie z. B. einem Sonnensimulator, bestrahlt,
(c) innerhalb von 1–120 Minuten nach der Bestrahlung das bestrahlte Hautsubstrat einer Elektronenspinresonanz (ESR)-Messung unterwirft,
(d) den Freie-Radikale-Generierungswert RG nach Vergleich mit einer Standardprobe mit bekannter Anzahl freier Radikale normalisiert und die Anzahl der gefangenen freien Radikale als reale Zahl X multipliziert mit 10¹² pro 1 mg Probe, RG = X × 10¹² freie Radikale/mg Hautprobe, erfasst
(e) und den integrierten Sonnenschutzfaktor ∫ SPF nach der Beziehung (1) ermittelt
wobei E₀ die UV-Dosis in mJ/cm² bezeichnet, die der mit dem Sonnenschutzmittel versehenen Hautprobe zugeführt wurde und nach der Beziehung (7) berechnet wird E0 = I·t (7)

I

= Bestrahlungsstärke des Sonnensimulators (mW/cm²)

t

= Bestrahlungszeit in Sekunden

und E die effektive UV-Dosis in mJ/cm² bezogen auf die ermittelte Anzahl der in Schritt (b) generierten freien Radikale bezeichnet, und E gemäß der realen Zahl X des Freie-Radikale-Generierungswertes in Schritt (d) nach der Beziehung (2) berechnet wird log10 (E) = a·log10(X·1000) + b (2)wobei a und b experimentelle Parameter sind, die in einem Kalibrierungsschritt ermittelt werden, um mittels der Fehlerquadratmethode ein korrektes, lineares Verhältnis zwischen Logarithmusfunktionen zur Basis Zehn der UV-Dosis und der realen Zahl der Freie-Radikale-Generierung zu erreichen, und E nach der Beziehung (8) berechnet wird E=10log10(E) (8).

Eine definierte Menge eines Sonnenschutzmittels gemäß obigem Schritt (a) ist beispielsweise eine Menge von 1–4 mg/cm² Hautfläche, vorteilhaft 2 mg/cm². Die dafür eingesetzte Haut sind Probestücke z. B. aus Hautbiopsien, von Hautsubstraten (künstliche Haut) oder Hautstücken vom Schweineohr, vorzugsweise Hautstücke vom Schweineohr, die ex vivo behandelt werden. Diese Hautproben werden nachfolgend als „Hautsubstrat" oder „Substrat" bezeichnet.

Auf das Substrat wird zuerst eine Radikalfalle („spin trap"), insbesondere PBN, aufgebracht, beispielsweise durch Inkubieren der Probe, um ein stabiles, langzeitnachweisbares Addukt zu schaffen.

Das Radikalfallen-Verfahren wurde zur Untersuchung der in Hautbiopsien unter Lichteinwirkung generierten freien Radikale pro ROS (ROS = Reactive Oxygen Species = reaktionsfähige Sauerstoffspezies) eingesetzt. Dieses Verfahren beinhaltet üblicherweise die Addition eines reaktionsfähigen, kurzlebigen freien Radikals über die Doppelbindung einer diamagnetischen Radikalfalle („spin trap"), um ein wesentlich stabileres freies Radikal, ein "Radikaladdukt", zu bilden. Die Anwendung von Radikalfallen („spin traps") verlängert die Lebenszeit (10^–9 s bis 10^–3 s) selbst der reaktionsfähigsten freien Radikale pro ROS, wie z. B. Hydroxylradikale (^•OH), Superoxidanion-Radikale (O₂ ^–•) und Lipidradikale (L^•), durch die Bildung von Radikalfallenaddukten (Minuten bis Stunden), die mittels ESR-Verfahren gemessen werden können. Eine bevorzugte Radikalfalle („spin trap") ist PBN (Phenyl-tert-butylnitron), das über einen langen Zeitraum (etwa 60 min) ein sehr stabiles ESR-Signal liefern kann und daher zur Quantifizierung der in der Haut nach verschiedenen UV-Dosen generierten freien Radikale besonders geeignet ist. Dieses Reagens wurde von der Fa. Sigma, München, Deutschland, bezogen. Die Reaktion mit PBN verläuft wie folgt:

Das Substrat wird vor der UV-Bestrahlung z. B. 30 Minuten mit der Radikalfallenlösung imprägniert. Die Radikalfalle („spin trap") PBN wird z. B. in einer Wasser/Ethanol (50/50)-Lösung gelöst, wodurch sich eine Konzentration von 400 mM ergibt.

Nach anschließendem Spülen der Substratoberfläche, z. B. mit Wasser/Ethanol, und Trocknen des Substrats wird nach einer kurzen Ruhezeit das Sonnenschutzmittel in der vorgegebenen Menge von z. B. 2 mg/cm² aufgetragen.

Nach einer Ruhezeit von 5–60 Minuten, vorzugsweise 10–15 Minuten, erfolgt die Bestrahlung von vorteilhaft einem ausgestanzten Hautstückchen aus dem Substrat gemäß Schritt (b) mit einem Sonnensimulator mit 17,53 mW/cm² für den UVA-Bereich und 0,37 mW/cm² für den UVB-Bereich. Dies entspricht etwa den natürlichen Sonnenbestrahlungsverhältnissen.

Die Messung nach 1–120 Minuten erfolgt mittels ESR-Spektroskopie.

Ein wesentlicher Vorteil der ESR-Spektroskopie gegenüber optischen Verfahren wie dem Fluoreszenz- oder Chemilumineszenz-Verfahren ist die Eindringtiefe der eingesetzten elektromagnetischen Wellen in biologische Gewebe. Die Wellenlänge von ESR ist etwa 10⁵ Mal größer als die der bei den anderen Verfahren eingesetzten Strahlen, was eine Eindringtiefe von etwa 10 mm in menschliches Gewebe zur Folge hat. Es ist eine ungestörte Untersuchung der gesamten Haut bis in die untere Dermis möglich. Dieser Messbereich ist zur Ermittlung der Wirkung von UV-Strahlung selbst in den tiefsten Schichten der gesamten Haut von großem Interesse. Aufgrund dieser Eigenschaft ist die ESR-Spektroskopie zur Bewertung von Schutzfaktoren besonders geeignet. Eine Berechnung direkt auf der Grundlage der ESR-Signalintensität kann jedoch bei Nichtvorhandensein einer Radikalfalle („spin trap") zu einer Unterschätzung des Schutzfaktors führen.

Die Zeit zwischen Bestrahlung und Messung hängt von der begrenzten Lebenszeit des zwischen Radikalfalle und freiem Radikal gebildeten Addukts ab. Sie liegt vorteilhaft zwischen 1 und 90 Minuten.

Der Vorteil der Radikalfalle PBN ist die hohe Stabilität des Addukts, die eine quantitative Analyse gestattet, und die ausgeprägte Signalreaktion infolge fehlender Selektivität bezüglich verschiedener Arten gefangener Radikale wie z. B. Hydroxyl-Radikale oder Radikale mit Kohlenstoffzentren. Die Signalform ist für alle gefangenen freien Radikale gleich, wodurch eine höhere Peakintensität erreicht wird.

Die Quantifizierung der generierten freien Radikale erfolgte anhand der Signalamplitude des PBN-Addukts von Peak zu Peak (low field-Peak). Die Signalamplitude wurde anhand der Amplitude einer Kalibrierungsprobe (Standard) mit bekannter Anzahl freier Radikale normalisiert. Diese Standardisierung stellt die Grundlage für die Berechnung des RG-Wertes (Radikalgenerierungswert = Radical Generation Value = RGV) dar. Der RGV beschreibt die Anzahl der gefangenen freien Radikale und wird als reale Zahl X, multipliziert mit 10¹ ² und normalisiert auf 1 mg der untersuchten Probe (Haut), d. h. auf ein Volumenelement von 1 mm·1 mm·1 mm mit der Annahme einer Dichte 1 für menschliche Haut und einer Dicke von etwa 1 mm, ausgedrückt.

Verschiedene Konzentrationen von Sonnenschutzmitteln zur Bewertung und Kalibrierung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden durch den Einsatz abschwächender Standardfilter zwischen der Strahlungsquelle mit definierter Strahlungsmenge und dem Hautsubstrat simuliert.

Als abschwächende Filter werden bevorzugt Neutraldichtefilter mit Abschwächungsfaktoren von 1, 2, 5, 10 und 20 (Lot Oriel, Frankreich) eingesetzt. Die Neutraldichtefilter bestehen aus Quarzträgern, auf die eine dünne Metallschicht im Vakuum aufgedampft wurde. Die Beschichtungsdicke bestimmt die optische Dichte. Die Absorbanz ist im UV-Bereich (290–400 nm) nahezu unabhängig von der Wellenlänge sowie unabhängig von der kosmetischen Standards eigenen Art der Auftragung.

Das vorliegende Verfahren eignet sich für die Messung aller bekannten Sonnenschutzmittel (UV-Filter), z. B. 4-Aminobenzoesäure-Derivate, Ester der Zimtsäure, Benzylidencampher-Derivate, Benzophenon-Derivative, Methoxybenzoylmethan-Derivate etc. Physikalische Filter wie TiO₂, ZnO, ZrO₂ etc. können ebenfalls gemessen werden. Es wurden z. B. folgende UV-Filter (mit den zugehörigen Abkürzungen) mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gemessen:
ES = Ethylhexylsalicylate; OC = Octocrylene; IMC = Isoamyl p-Methoxycinnamate; BMDBM = Butyl Methoxydibenzoylmethane; MBBT = Methylene bis-Benzotriazolyl-Tetramethylbutylphenol (bereitgestellt als 50-%ige wässrige Dispersion). Die letztge nannte Substanz wird unter dem Handelsnamen „Tinosorb M" vertrieben. BEMT = Bis Ethylhexyloxyphenol Methoxyphenyl Triazine. Die letztgenannte Substanz wird unter dem Handelsnamen „Tinosorb S" vertrieben.

Die UV-Absorptionsspektren verschiedener Sonnenschutzmittel wurden mit einem Lichtdurchlässigkeitsanalysator vom Typ Labsphere UV 1000 S gemäß einem in Cosmetics and Toiletries, Band 118, Nr. 10, Oktober 2003, beschriebenen spektroskopischen Verfahren realisiert. Proben der Sonnenschutzmittel wurden in einer Menge von 1,2 mg/cm² auf eine transparente, aufgerauhte PMMA-Platte aufgebracht. Der/die in vivo-SPF(s) wurde(n) nach dem COLIPA-Verfahren zum Test von Sonnenschutzfaktoren (SPF-Testverfahren) ermittelt. Colipa-Ref.: 94/289 (1994). Die in vivo-UVA-Schutzfaktoren wurden nach dem Persistant Pigment Darkening-Verfahren (PPD) als Endpunkt (Photodermatol. Photoimmunol. Photomed. 16, 245–249 (2000)) ermittelt.

Das erfindungsgemäße Verfahren berücksichtigt als erstes Verfahren überhaupt, dass die Ursache jeglicher, durch die gesamte UV-Einwirkung bedingten Hautschädigung die Gesamtzahl der erzeugten freien Radikale ist. Diese Anzahl wird weniger durch die Intensität der UV-Strahlen als vielmehr durch die Gesamt-UV-Dosis beeinflusst. Für diese Gesamtanzahl erzeugter freier Radikale, die mittels ESR genau gemessen werden kann, kann ein integrierter SPF ermittelt werden, der dem Anwender eine exakte Information über den tatsächlichen Schutz gegenüber UV-Strahlung gibt.

Solch ein SPF ist in zweifacher Hinsicht integriert: Er erfasst das gesamte UV-Spektrum, und er erfasst die komplette Hauttiefe, in der Schädigung durch UV-Strahlung auftreten kann.

Ein weiterer Vorteil bei der Messung des iSPF (ISPF oder ∫ SPF) wird dadurch erreicht, dass nicht mehr wie bisher das Auftreten eines Erythems auf der Haut eines Probanden nach einer unter ethischen Gesichtspunkten bedenklichen Bestrahlungsbehandlung gemessen werden muss, sondern die Messung an 2 bis 4 Hautstücken von je 1 cm² aus der Humanchirurgie oder von Hautsubstraten (künstliche Haut) oder direkt an Schweinehaut mit gleicher oder besserer Zuverlässigkeit erfolgen kann. Damit entfallen Strahlenschädigungen der Haut bei den Probanden, weil die Not wendigkeit für Probanden an sich für das neue Messverfahren entfällt. Nach dem COLIPA-Standard werden 10–20 Freiwillige benötigt. Auch die Auswirkungen langer Wartezeiten bis zum Erhalt der Ergebnisse entfallen sowie die Festlegung bestimmter Standards, gegen die bei den bekannten Verfahren auszuwerten ist.

Sowohl gerätetechnisch als auch von der Methodik ist das neue Verfahren ein erheblich reduzierter Kostenfaktor, da eine RGV-Messung bereits jetzt hinsichtlich der Kosten bei etwa der Hälfte bis einem Drittel der Kosten traditioneller SPF-Bestimmungsverfahren liegt.

Darüber hinaus liegt die Genauigkeit der Messung und Berechnung des iSPF (ISPF oder ∫ SPF) bei etwa ± 10 %, während das traditionelle SPF-Messverfahren, d. h. COLIPA (UVB-Schutz), nur bei einer Genauigkeit von 20–25 % liegt, bei hohen, in verschiedenen Testinstituten gemessenen SPFs sogar nur bei Genauigkeiten von 30–50 %.

Bei dunklen Hauttypen ist das PPD-Verfahren bereits jetzt nur sehr schwierig und mit großen Ungenauigkeiten einsetzbar, so dass Verbesserungen in dieser Hinsicht auch das Verfahrensspektrum erweitern und die Ergebnisse sicherer machen. Das erfindungsgemäße Verfahren ist unabhängig vom Hauttyp und von der ethnisch bedingten Hautfärbung.

Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt in einer Vereinfachung der Gerätetechnik. Breitflächige Lampensysteme zur Bestrahlung größerer Hautflächen entfallen zugunsten kleinerer, leistungsstärkerer, punktförmiger Bestrahlungseinheiten.

Die Messung der während der UV-Bestrahlung der Hautbiopsien generierten freien Radikale erfolgte mittels Elektronenspinresonanz (ESR) unter Verwendung eines ausgerichteten X-Band-ESR-Spektrometers. Es wurde ein Spektrometer vom Typ ERS 300+ (ZWG, Deutschland, modifiziert durch Galenus, Deutschland) mit folgenden Spektrometereinstellungen verwendet: Mikrowellenfrequenz f₀ = 9,52 GHz, Mikrowellenleistung Pμ = 20 mW, Modulationsfrequenz fm = 100 kHz, Modulationsamplitude Bm = 0,2 mT, Magnetfeld-Scan ΔBs = 20 mT, Scanzeit ts = 60 s.

Folgende Spektrometereinstellungen sind ggf. ebenfalls möglich: Mikrowellenleistung Pμ = 10–100 mW, Modulationsamplitude Bm = 0,05–0,5 mT, Magnetfeld-Scan ΔBs = 5–20 mT, Scanzeit ts = 10–120 s.

Die zu messende kosmetische oder pharmazeutische Zubereitung kann auch alle nach dem Stand der Technik bekannten Antioxidationsmoleküle oder Radikalfängermoleküle enthalten. Zu diesen Substanzen zählen Vitamine wie Vitamin C und Derivate desselben, z. B. Ascorbylacetat, Ascorbylphosphat und Ascorbylpalmitat; Vitamin A und Derivative desselben; Folsäure und Derivate derselben; Vitamin E und Derivate desselben, z. B. Tocopherylacetat; Superoxiddismutase; Flavone oder Flavonoide; Aminosäuren, z. B. Histidin, Glycin, Tyrosin, Tryptophan, und Derivate derselben; Carotenoide und Carotine, z. B. α-Carotin, β-Carotin; Harnsäure und Derivate derselben; α-Hydroxysäuren, z. B. Citronensäure, Milchsäure, Äpfelsäure; Stilben und Derivate desselben etc.

Ein weiteres bevorzugtes Antioxidationsmittel für die UV-Filter-Zubereitung ist ein Wirkstoff mit hohem Radikalschutzfaktor, der umfasst: ein durch Extraktion der Rinde von Quebracho blanco und anschließende enzymatische Hydrolyse gewonnenes, an Mikrokapseln gebundenes Produkt, das mindestens 90 Gew.-% Proanthocyanidinoligomere und bis zu 10 Gew.-% Gallussäure enthält, weiterhin einen durch Extraktion gewonnenen Seidenraupenextrakt, der das Peptid Cecropin, Aminosäuren und ein Vitamingemisch enthält, weiterhin ein nichtionisches, kationisches oder anionisches Hydrogel oder Hydrogel-Gemisch, weiterhin ein oder mehrere Phospholipid(e) und Wasser. Die Komplexzubereitung kann ebenfalls ein mindestens 150 Einheiten Superoxiddismutase pro ml enthaltendes Ultraschallaufschlussprodukt einer Hefe und ein oder mehrere Cyclodextrin(e) enthalten. Die Komplexzubereitung kann ein Produkt nach WO 99/66881, Beispiel 1 oder 2, oder WO 01/26617, Beispiel 1 sein. Ein Wirkstoffkomplex aus Pflanzenextrakten in alkoholischer Lösung ist als Antioxidationsmittel ebenfalls bevorzugt. Der Komplex umfasst 0,1–2 Gew.-% eines Extrakts aus grünen Kaffeebohnen, 0,1–2 Gew.-% eines Extrakts aus den Blättern von Camellia sinensis, 0,1–2 Gew.-% eines Extrakts von Pongamia pinnata und 0,1–2 Gew.-% eines Extrakts aus der Wurzel von Angelica archangelica sowie einen einwertigen C₂-C₅-Alkohol bis zu 100 %.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen näher beschrieben. In den beigefügten Zeichnungen zeigen
1: eine schematische Darstellung der Schutzfaktorbewertung
2: RG-Daten (X × 10¹² aus Tabelle 1) bezogen auf die UV-Dosis
3: das lineare Verhältnis zwischen log (UV-Dosis) und log (Freie-Radikale-Generierung) gemäß Daten in 2
4: das UV-Spektrum der Sonnenschutzmittel E, N, G und H.
EXPERIMENTELLE ERGEBNISSE:
Verhältnis zwischen UV-Dosis und Freie-Radikale-Generierung (RG)
Die Zufuhr unterschiedlicher Strahlungsintensitäten zu den Hautbiopsien erfolgte mittels einer ungefilterten UV-Quelle (Abschwächungsfaktor 1) und einer mit Neutraldichtefiltern mit Abschwächungsfaktoren von 2, 5, 10 und 20 gefilterten UV-Quelle. Die Filter werden zwischen der UV-Quelle und der Hautbiopsie, unmittelbar an der Öffnung des Probenhalters angeordnet. Neutraldichtefilter schwächen alle Strahlen unabhängig von ihrer Wellenlänge im gleichen Maße ab. Es wurde mit fünf verschiedenen Bestrahlungszeiten gearbeitet: 30, 60, 150, 300 und 600 Sekunden. Im Fall der nicht abgeschwächten UV-Quelle entspricht dies einer natürlichen Sonnenbestrahlung von etwa 1,7, 3,5, 8,7, 17,4 und 34,8 Minuten. Des Weiteren entspricht dies 0,11, 0,21, 0,54, 1,07 und 2,14 MED (MED = Minimal Erythemal Dose = minimale erythemale Dosis).
Zunächst wurde die Einhaltung des Reziprozitätsgesetzes geprüft. Es wurde also nachgewiesen, dass die Anzahl der generierten freien Radikale ausschließlich von der Dosis und nicht von der Bestrahlungszeit abhängt. Dies ist eine weitere Voraussetzung für die Berechnung realistischer Schutzfaktoren.
Die Bestrahlungszeiten wurden so gewählt, dass eine an die Abschwächungsfaktoren der Neutraldichtefilter gebundene, stufenweise Steigerung der Dosis erreicht wurde. Zum Beispiel kann der Versuch mit dem Abschwächungsfaktor 2 mit einer doppelt so langen Bestrahlungszeit (t = 60 Sekunden) wie der Versuch mit dem Abschwächungsfaktor 1 (t = 30 Sekunden) erreicht werden. Somit konnte mit einer einheitlichen UV-Dosis und unterschiedlichen Bestrahlungszeiten gearbeitet werden.
Dies ist in Tabelle 1 gezeigt, in der die gemessene Anzahl der UV-bedingten freien Radikale (RG = X × 10¹ ² Radikale/mg) gemäß den unterschiedlichen Bestrahlungszeiten und den verschiedenen optischen Abschwächungsfaktoren ausgewiesen ist. Die (in Tabelle 1 nicht ausgewiesene) Berechnung der UV-Dosen (mJ/cm²) erfolgte nach der Gleichung (6):

I: = Bestrahlungsstärke des Sonnensimulators (mW/cm²)
t: = Bestrahlungszeit (s)
Att: = Abschwächungsfaktor des Neutraldichtefilters

Eine konstante UV-Dosis (537 mJ/cm²) konnte entlang der Diagonale (von oben links nach unten rechts) in Tabelle 1 gemäß den 5 Bestrahlungszeiten, 30, 60, 150, 300 und 600 Sekunden, und den 5 Abschwächungsfaktoren, 1, 2, 5, 10 und 20, erreicht werden. Bei Gültigkeit des Reziprozitätsgesetzes sollte eine gleiche Anzahl freier Radikale gemessen werden.
Bei einer praktisch konstanten Radikalgenerierung über diesen gesamten Zeitbereich kann Folgendes beobachtet werden: RG-Durchschnitt = 1,36·10¹² Radikale/mg Hautbiopsie mit einer niedrigen relativen Standardabweichung von nur 7,03 % für diese 5 Werte.
Andere konstante RG-Werte, die verschiedenen, wiederholten UV-Dosen entsprechen, sind auch in einigen kleinen Diagonalen in Tabelle 1 zu finden. Diese sind durch spezifische Schattierungen/Punkte gekennzeichnet.
Somit erbringt Tabelle 1 den Nachweis für die Einhaltung des Reziprozitätsgesetzes in einem großen Bereich von UV-Dosen. Tabelle 1: An Hautbiopsien gemessene RG-Werte (X·10¹² Rad/mg) gemäß den verschiedenen Filterabschwächungsfaktoren und unterschiedlichen Bestrahlungszeiten
Zweitens wurde das Verhältnis zwischen UV-Dosis und Radikalgenerierung (RG) untersucht.
Mit 4 Neutraldichtefiltern und der ungefilterten UV-Quelle, multipliziert mit den 5 verschiedenen Bestrahlungszeiten, konnten 25 verschiedene UV-Bestrahlungssituationen, entsprechend 13 verschiedenen UV-Dosen, realisiert werden (siehe Tabelle 1).
Die Kurve in 2 zeigt die Freie-Radikale-Generierung in der Haut gemäß der UV-Dosis. Trotz der verschiedenen Bestrahlungszeiten ist zu erkennen, dass alle einzelnen experimentell ermittelten Datenkurven relativ nah beieinander und im Umfeld einer einzigen Kurve liegen. Die Kurven können für alle Bestrahlungszeiten gemäß einem nichtlinearen Verhältnis verbunden werden. Dies ist offenbar die Folge der Gültigkeit des Reziprozitätsgesetzes. Die Darstellung der Freie-Radikale-Generierung bezogen auf die UV-Dosis zeigt eine Sättigung für die hohen UV-Dosen.
Wurde mit einer Doppellogarithmusskala gearbeitet, konnte jedoch eine einfache, lineare Funktion über die experimentell ermittelten Kurven gelegt werden, wodurch sich das Verfahren sehr leicht kalibrieren ließ. Eine solche Darstellung ist in 3 zu sehen, die die Kurve von log (UV-Dosis) bezogen auf log (RG) zeigt. Bei der vorliegenden Untersuchung wurde die reale Zahl X der RG-Daten mit dem Faktor 1000 multipliziert, um durch die Umformung der Logarithmusfunktion bedingte negative Daten zu vermeiden.
Mit der folgenden linearen Funktion erreicht man eine gute Übereinstimmung mit den experimentell ermittelten Daten gemäß einer einfachen numerischen Anpassung der Parameter a und b mittels der Methode der kleinsten Fehlerquadrate: log (UV-Dosis) = a·log(1000·X) + b (2b)
Mithilfe dieser Beziehung (umgekehrt zur ersten Beziehung in 3) kann eine UV-Dosis bezogen auf die für eine Hautbiopsie, auf die ein Sonnenschutzmittel aufgetragen wurde, ermittelte Anzahl freier Radikale (RG) berechnet werden.
Bestimmung von Schutzfaktoren
Ausgehend von den vorstehenden experimentellen Ergebnissen konnte ein Verfahren für die Bestimmung von Schutzfaktoren entwickelt werden. Die Berechnung derselben erfolgt als Verhältnis von UV-Dosen, wie allgemein üblich. Das Verfahren ist in 1 schematisch beschrieben, wobei:

– E₀ die dem aus Schutzschicht und Hautbiopsie gebildeten System zugeführte UV-Dosis ist,
– E die UV-Dosis ist, die mittels der kalibrierten Gleichung (2) ausgehend von der Anzahl X der durch ESR-Spektroskopie gemessenen freien Radikale berechnet wurde. Diese „effektive" UV-Dosis sollte ungeschützten Biopsien zugeführt wer den, um die gleiche Anzahl freier Radikale zu erreichen, die für die mit 2 mg Sonnenschutzmittel pro cm² geschützten Biopsien gemessen wurde.

Tabelle 2 enthält Schutzfaktoren, die mittels dieses Verfahrens unter Verwendung von Daten aus Tabelle 1 und von in 3 ausgewiesenen, nach der Gleichung (2) ermittelten Parameterwerten (Kalibrierung) ermittelt wurden. Diese wurden mit den als Bezugspunkt dienenden Neutraldichtefilter-Abschwächungswerten verglichen. Jeder berechnete Schutzfaktor ist der Mittelwert von fünf, den verschiedenen Bestrahlungszeiten entsprechenden Werten. Die Abschwächungsfaktoren der Neutralfilter und die berechneten Schutzfaktoren liegen sehr nah beieinander. Tabelle 2: Berechnung der Schutzfaktoren der Neutraldichtefilter ausgehend von den in Tabelle 1 ausgewiesenen RG-Daten
Der integrierte SPF:
Der vorstehend dokumentierte Zusammenhang zwischen UV-Dosis und RG-Wert ermöglicht die Berechnung von Schutzfaktoren auf ähnliche Weise wie bei in vivo-SPFs. Die Validierung dieser neuen Schutzfaktoren erfolgte mithilfe von Neutraldichtefiltern als Standardschutzschichten.
Daher wurde die gleiche Methodik wie bei der Bestimmung des in vivo-SPF verwendet, d. h.:
Definition:
für den Erythem-Endpunkt.
Wobei:

MED_p: = Geschützter Haut zugeführte minimale erythemverursachende UV-Dosis
MED_u: = Ungeschützter (blanker) Haut zugeführte minimale erythemverursachende UV-Dosis

Gemäß der schematischen Beschreibung (1) entsprechen MED_p und MED_u jetzt E₀ und E, wenn der Erythem-Endpunkt durch die Anzahl der mittels ESR-Spektroskopie nachgewiesenen freien Radikale ersetzt wird.
Die quantitative Messung freier Radikale mithilfe der X-Band-ESR-Spektroskopie ermöglicht die Bestimmung eines neuen Sonnenschutzfaktors. Die größere Eindringtiefe der ESR-Spektroskopie ermöglicht eine vollständige, den gesamten UVB- und UVA-Bereich sowie die Hautvertikale von der Oberfläche bis zur Subkutis erfassende Untersuchung der Haut. Angesichts dessen wird als Bezeichnung für diesen neuen Schutzindex der Begriff „Integrierter Sonnenschutzfaktor" (iSPF, ISPF oder ∫ SPF) vorgeschlagen.
Bestimmung des ∫ SPF:
Die prinzipielle Vorgehensweise ist in 1 dargestellt. Sie umfasst folgende Schritte:

1) Es wird das numerische Verhältnis zwischen UV-Dosis und Freie-Radikale-Generierung (RG) ermittelt (Bewertung der Parameter a und b der Beziehung (2)). Beide Parameter der Beziehung sollten von Zeit zu Zeit anhand von Messungen der Freie-Radikale-Generierung in ungeschützten, mit verschiedenen UV-Dosen bestrahlten Biopsien angepasst (kalibriert) werden.
2) Die geschützten Biopsien (Auftragung von 2 mg Sonnenschutzmittel pro cm² Epidermisoberfläche) werden bestrahlt. Für jede Bestrahlungszeit (t) wird mittels ESR-Spektroskopie die Freie-Radikale-Generierung bewertet. Der RG-Wert der geschützten Biopsie ist daher gleich X_t (gemessen).
3) Für jede Bestrahlungszeit wird die entsprechende, der geschützten Biopsie zugeführte UV-Dosis (E₀)_t berechnet nach: (E0)t = Bestrahlungsstärke·Zeit (3).
4) Die effektive, zur Generierung der gleichen Anzahl X_t freier Radikale erforderliche UV-Dosis (E)_t wird nach den Parametern a und b der Beziehung (2) berechnet: log(E)t = a·log(1000·Xt) + b (2a)
5) Der integrierte SPF des Sonnenschutzmittels wird als Verhältnis von UV-Dosen für ein und dieselbe Bestrahlungszeit berechnet:

Beispiel 1 und 2
Es wurden zwei verschiedene Sonnenschutzmittelproben getestet, die beide einen hohen UVB-Schutz und verschiedene UVA-Schutzniveaus erreichten: Sonnenschutzmittel A ist ein physikalisches TiO₂-Sonnenschutzmittel mit einem SPF von 26 und einem UVA-Schutzfaktor (PPD) von 5; Sonnenschutzmittel B ist ein Sonnenschutzmittel mit organischem UV-Filter mit einem SPF von 39 und einem UVA-Schutzfaktor (PPD) von 12.
Beide Produkte wurden in einer Konzentration von 2 mg/cm² auf die Hautoberfläche aufgetragen und gemäß drei Bestrahlungszeiten getestet. Parallel dazu wurden auch unabgedeckte Hautbiopsien getestet: Ein erstes Set wurde direkt mit einem Sonnensimulator bestrahlt, und ein zweites Set wurde durch einen Neutraldichtefilter mit einem Abschwächungsfaktor von 30 bestrahlt. Die in Tabelle 3 ausgewiesenen Freie-Radikale-Generierungsdaten sind jeweils Mittelwerte von 4 Biopsien. Tabelle 3: Freie-Radikale-Generierung gemäß verschiedenen Bestrahlungszeiten (RG = X·10¹ ² Rad./mg)
In einem ersten Schritt wurde nochmals der Zusammenhang zwischen Freie-Radikale-Generierung (X_t·1000) und UV-Dosis untersucht, um seine Reproduzierbarkeit zu testen. Es wurden unabgedeckte Hautbiopsien ohne und mit Neutraldichtefilter verwendet. Die von diesen Hautbiopsien aufgenommene UV-Dosis wurde nach der Gleichung (6) berechnet.
Werden die Kalibrierungsdaten in einer Kurve mit doppellogarithmischer XY-Achse dargestellt, erhält man nach der folgenden Gleichung (5) exakte Parameter für die Gleichung (2): log(UV-Dosis) = 2,0947·log(1000·X) – 3,7463 (5)
Es ist festzustellen, dass die Beziehung (5) dem in 3 dargestellten linearen Verhältnis sehr ähnlich ist.
Alle in Tabelle 3 ausgewiesenen Daten wurden mittels einer Logarithmusfunktion (Basis 10) umgewandelt, um ein lineares Verhältnis zu erhalten: Tabelle 3a
Dann wurden log (Radikale) und log (UV-Dosis) mittels der Gleichung (2) ins Verhältnis gesetzt: Tabelle 3b Anpassung der Parameter a und b
Anschließend wurden die Werte a und b bestimmt, um die Summe der Differenzquadrate Delta² zu minimieren. Somit ist die Gleichung (2) mit a = 2,0947 und b = 3,7463 gut an die experimentell ermittelten Werte angepasst. Nach der Anpas sung wird mittels der Gleichung (2) log E gemäß den verschiedenen X-Werten ermitelt.
Die Berechnung der UV-Dosen kann ausgehend von den Radikalgenerierungsdaten in Tabelle 3 erfolgen. Die berechneten Dosen sind in Tabelle 4 ausgewiesen. Das Berechnungsverfahren wurde zunächst durch den Vergleich der berechneten UV-Dosen mit den ohne Schutz und mit einem Neutraldichtefilter mit Abschwächungsfaktor 30 zugeführten UV-Dosen überprüft. Es wurden nur geringe Differenzen bis zu einer Maximalabweichung von 13 % festgestellt. Zweitens wurden die effektiven UV-Dosen für die Sonnenschutzmittel A und B berechnet. Diese UV-Dosen sollten ungeschützten Biopsien zugeführt werden, um die gleiche Anzahl freier Radikale zu erreichen, die für mit 2 mg Sonnenschutzmittel pro cm² geschützte Biopsien gemessen wurde. Tabelle 4: Berechnete UV-Dosen (mJ/cm²) aus Gleichung (5) gemäß den Radikalgenerierungsdaten in Tabelle 3
Gemäß den UV-Dosen in Tabelle 4 werden Schutzfaktoren (∫ SPF) berechnet, und zwar als Verhältnis der zugeführten und berechneten (effektiven) UV-Dosen für ein und dieselbe Bestrahlungszeit (Gleichung 1). Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 ausgewiesen. Die Korrektheit der Indizes wird mit Versuchen ohne Schutz und mit Neutraldichtefilter mit Abschwächungsfaktor 30 geprüft. Die neuen Schutzfaktoren der Sonnenschutzmittel sind in den Spalten 4 und 5 von Tabelle 5 ausgewiesen.
Die Unsicherheit (± 95 % Vertrauensintervall) wurde ebenfalls gemäß allen Messungen berechnet (4 Biopsien pro Bestrahlungszeit). Tabelle 5: Berechnete Sonnenschutzindizes ∫ SPF auf der Grundlage des in Tabelle 4 ausgewiesenen Verhältnisses der UV-Dosen ∫ SPF
Es kann zunächst konstatiert werden, dass der integrierte SPF mit der UV-Filterungsbandbreite steigt. Der höchste Wert wird für Sonnenschutzmittel B ermittelt, das den besten in vivo-UVA-Wert (PPD) hat. In beiden getesteten Proben liegt der integrierte SPF deutlich niedriger als der erythemale in vivo-SPF.
Beispiel 3–8
Zur Ermittlung der Selektivität integrierter SPFs für verschiedene UV-Filterungsbandbreiten wurden spezielle Sonnenschutzformulierungen mit verschiedenen UVB- und/oder Breitband-UVA/UVB-Filtern zubereitet.
Die sechs Sonnenschutzmittelproben wurden wie beschrieben mit 3 verschiedenen Bestrahlungszeiten getestet: 30, 60 und 150 s.
Die in Tabelle 6 ausgewiesenen Radikalgenerierungsdaten X sind jeweils Mittelwerte von 4 Biopsiemessungen.
Die ∫ SPFs (integrierte SPFs) werden als Verhältnis der zugeführten UV-Dosis und der effektiven UV-Dosis für ein und dieselbe Bestrahlungszeit berechnet (Gleichung 1). Jeder ausgewiesene ∫ SPF ist der Mittelwert von drei, den verschiedenen Bestrahlungszeiten entsprechenden Berechnungen. Die Unsicherheit (± 95 % Vertrauensintervall) wurde ebenfalls berechnet und in der Tabelle ausgewiesen. Tabelle 6: RG-Daten gemäß verschiedenen Bestrahlungszeiten (RG = X × 10¹² Rad./mg). Ausgehend von den drei unterschiedlichen Bestrahlungszeiten wird ein mittlerer ∫ SPF berechnet.
Diese Beispiele bestätigen, dass der ∫ SPF deutlich gemäß der Bandbreite und Intensität der UV-Filterung zunimmt. Bei unzureichend ausgewogenen UVB/UVA-Sonnenschutzmitteln nahm die Schutzwirkung nicht zu. Dies war deutlich für Sonnenschutzmittel mit geringer UVA-Filterung zu beobachten, wie z. B. D und E, die nur einen einzigen UVB-Filter enthielten. Der durch den ∫ SPF angezeigte, tatsächliche, biologisch relevante Schutz gegen UV-Strahlung dieser Produkte ist erheblich niedriger als die durch den erythemalen SPF ausgedrückte Annahme.
Beispiel 9
Im Gegensatz zum in vivo-PPD und in vivo-SPF berücksichtigt der ∫ SPF das gesamte UV-Spektrum des Sonnenlichts, d. h. UVB und UVA.
Diese Messwirkungen von ESR (tief in der Haut) können allerdings zu einer Fehlinterpretation der Werte für die Quantifizierung der durch UVB erzeugten freien Radikale führen. Wie gezeigt werden konnte, beträgt dieser Wert etwa 0,24 × 10¹ ² Radikale/mg. All diese ROS sind jedoch in einem Volumenelement von 1 mm × 1 mm × 0,05 mm enthalten, wobei für die durchschnittliche Epidermis eine Dicke von 50 Mikrometern anzusetzen ist. Daher ist die Anzahl der in der Epidermis erzeugten freien Radikale dreimal höher als die in den tieferen Hautschichten unter UVA-Einwirkung generierte Anzahl, d. h. sie beträgt etwa 1,58 × 10¹ ² freie Radikale/mg.
Diese allein von UVB erzeugte Anzahl von etwa 4,8 × 10¹ ² Radikalen im epidermalen Volumenelement könnte für das Auftreten biologischer Wirkungen wie Erytheme oder damit zusammenhängende DNA-Schäden sehr relevant sein. Es gibt erste Belege dafür, dass UVB-bedingte DNA-Schäden mit sehr hohen Gaben von Antioxidationsmitteln verhindert werden können. Lin et al. berichteten über an Schweinehaut gemessenen Schutz gegen die Bildung von Thymindimeren durch eine Kombination von Vitamin C und E.
Zur Vervollständigung der Experimente wurde der Probenpalette ein Sonnenschutzmittel hinzugefügt, das lediglich guten UVA-Schutz bot. Zu einer kosmetischen Basis wurden 5,0 % BMDBM zugegeben, wodurch eine starke Absorption von UVA und eine geringe Absorption von UVB erreicht wurde (Sonnenschutzmittel N, 4). Erwartungsgemäß wurde ein niedriger erythemaler in vivo-SPF von 4,7 (± 1,3) gemessen. Bezüglich des integrierten SPF stellte sich folgende Frage: Würde sich dieser nicht zu weit in Richtung eines durch eine mögliche unzureichende Empfindlichkeit unseres Hautmodells für UVB-Strahlung bedingten, unrealistisch hohen Wertes bewegen? Die Anwendung des neuen Verfahrens auf das Produkt N ergab einen dem in vivo-SPF vergleichbaren integrierten SPF (∫ SPF) von 5,1 (± 1,2). Eine Überbewertung des UV-Schutzes ist somit auch dann ausgeschlossen, wenn in ein und demselben Produkt ein niedriger UVB-Schutz und ein hoher UVA-Schutz realisiert werden, wie in 4 gezeigt.
Umgekehrt könnte jeder Zusammenhang mit dem in vivo-SPF aufgezeigt werden.
In Abhängigkeit von der UV-Filter-Formulierung liegen die Daten für den in vivo-SPF weit über dem integrierten SPF (bei Sonnenschutzmitteln mit hohem UVB-Schutz) oder entsprechen diesem in etwa. Natürlich berücksichtigt der erythemale SPF nicht die Bedeutung der UV-Filterungsbandbreite und kann so, insbesondere im Fall hoher SPF-Werte, bei den Verbrauchern ein falsches Sicherheitsgefühl bewirken. Unter diesem Blickwinkel liefert der neue ∫ SPF eine wertvolle Information.
Die Kurven in 4 fassen vier typische Beispiele zusammen und zeigen die Hauptunterschiede zwischen dem erythemalen SPF und dem integriertem SPF. Sonnenschutzmittel E mit UVB- und ohne UVA-Schutz, Sonnenschutzmittel N mit UVA-Schutz, jedoch geringem UVB-Schutz, Sonnenschutzmittel G mit etwa gleich hohem UVB- und UVA-Schutz und Sonnenschutzmttel H mit höherem UVB- als UVA-Schutz.
Die Spektren und Schutzindizes zeigen, dass der erythemale SPF sehr stark von der UVB-Filterung, jedoch kaum von der UVA-Filterung beeinflusst wird. Im Gegensatz dazu ist der erfindungsgemäße ∫ SPF sowohl von der UVB- als auch der UVA-Filterung abhängig.
Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren ist klar, dass nur Produkte mit UVB/UVA-Filterung über eine große Bandbreite hinweg einen hohen integrierten SPF erreichen können. Dies steht im Einklang damit, dass die Generierung freier Radikale in der Gesamtheit der Hautbiopsie (Epidermis + Dermis) sowohl auf UVA- als auch UVB-Strahlung zurückzuführen ist. Darüber hinaus berücksichtigen die neuen, durch ESR-Spektroskopie ermittelten Schutzfaktoren ausreichend das Auftreten von UVB-bedingten Erythemen, und, wie gezeigt werden konnte, besteht ein hinreichender Zusammenhang mit dem in vivo-UVA-PPD.
Der integrierte SPF kann in derselben Weise wie herkömmliche in vivo-UV-Indizes interpretiert werden:
Mit einem ∫ SPF von 10 geschützte Haut kann zehnmal länger der Sonne ausgesetzt werden als ungeschützte Haut, ohne dass Sonnenbrand auftritt, wobei gleichzeitig die für das Auftreten einer PPD-Reaktion notwendige Zeit wesentlich unterschritten wird. Dementsprechend verringt ein ∫ SPF von 10 die Hautschädigung durch freie Radikale infolge einstündiger, ununterbrochener Sonnenbestrahlung auf ein Maß, das bei direkter Sonneneinwirkung ohne Schutz bereits nach sechs Minuten erreicht wird.

Claims

Verfahren zur Bestimmung eines UVA- und UVB-Strahlung erfassenden integrierten Sonnenschutzfaktors (∫ SPF) für kosmetische und dermatologische Sonnenschutzmittel, dadurch gekennzeichnet, dass man (a) das Sonnenschutzmittel in einer definierten Menge auf eine definierte Fläche eines Hautsubstrats aufbringt, das zuvor mit einer als Radikalfalle („spin trap") dienenden, bekannten Substanz imprägniert wurde, (b) das Hautsubstrat mit einer definierten Strahlungsmenge mit UVA- und UVB-Anteil entsprechend den natürlichen Sonnenbestrahlungsverhältnissen aus einer Strahlungsquelle, wie z. B. einem Sonnensimulator, bestrahlt, (c) innerhalb von 1–120 Minuten nach der Bestrahlung das bestrahlte Hautsubstrat einer Elektronenspinresonanz (ESR)-Messung unterwirft, (d) den Freie-Radikale-Generierungswert RG nach Vergleich mit einer Standardprobe mit bekannter Anzahl freier Radikale normalisiert und die Anzahl der gefangenen freien Radikale als reale Zahl X multipliziert mit 10¹ ² pro 1 mg Probe, RG = X × 10¹² freie Radikale/mg Hautprobe, erfasst (e) und den integrierten Sonnenschutzfaktor ∫ SPF nach der Gleichung (1) ermittelt
wobei E₀ die UV-Dosis in mJ/cm² bezeichnet, die der mit dem Sonnenschutzmittel versehenen Hautprobe zugeführt wurde und nach der Gleichung (7) berechnet wird E0 = I·t (7)I = Bestrahlungsstärke des Sonnensimulators (mW/cm²) t = Bestrahlungszeit in Sekunden und E die effektive UV-Dosis in mJ/cm² bezogen auf die ermittelte Anzahl der in Schritt (b) generierten freien Radikale bezeichnet, und E gemäß der realen Zahl X des Freie-Radikale-Generierungswertes in Schritt (d) nach der Gleichung (2) berechnet wird log10(E) = a·log10(X·1000) + b (2)wobei a und b experimentelle Parameter sind, die in einen Kalibrierungsschritt ermittelt wurden, um mittels der Fehlerquadratmethode ein korrektes, lineares Verhältnis zwischen Logarithmusfunktionen zur Basis Zehn der UV-Dosis und der realen Zahl der Freie-Radikale-Generierung zu erreichen, und E nach der Gleichung (8) berechnet wird E=10log10(E) (8).
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die definierte Menge Sonnenschutzmittel im Bereich von 1–4 mg pro 1 cm² Hautfläche liegt bei einer gegebenen Konzentration des Sonnenschutzmittels.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Simulation anderer Konzentrationen des Sonnenschutzmittels und die Kalibrierung des Verfahrens durch den Einsatz abschwächender Standardfilter zwischen der Strahlungsquelle mit definierter Strahlungsmenge und dem Hautsubstrat erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass als abschwächende Filter Neutraldichtefilter mit Abschwächungsfaktoren von 1, 2, 5, 10 und 20 eingesetzt werden.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass mit Bestrahlungszeiten von 30, 60, 150, 300 und 600 Sekunden, zur Bewertung der Photostabilität des Sonnenschutzmittels auch länger, gearbeitet wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die ESR-Messung 1–120 Minuten, vorzugsweise 15–60 Minuten, nach der Bestrahlung erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die ESR-Messung mit folgenden Spektrometer-Parametern erfolgt: Mikrowellenfrequenz f₀ = 9,52 GHz, Mikrowellenleistung Pμ = 20 mW, Modulationsfrequenz fm = 100 kHz, Modulationsamplitude Bm = 0,2 mT, Magnetfeld-Scan ΔBs = 20 mT, Scanzeit ts = 60 s.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Radikalfalle („spin trap") eine Substanz eingesetzt wird, ausgewählt unter Phenyl-tert-butylnitron oder Dimethyl-1-pyrrolin-N-oxid.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die zu messende kosmetische oder pharmazeutische Zubereitung alle bekannten physikalischen (mineralischen) und organischen Filter enthält, insbesondere Substanzen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ethylhexylsalicylate, Octocrylene, Isoamyl p-Methoxycinnamate, Butyl Methoxydibenzoylmethane, Methylene bis-Benzotriazolyl Tetramethylbutylphenol, Bis Ethylhexyloxyphenol Methoxyphenyl Triazine.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die zu messende kosmetische oder pharmazeutische Zubereitung bekannte Antioxidationsmoleküle oder Radikalfängermoleküle enthält.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Hautsubstrat ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Hautbiopsien, künstlicher Haut und Stücken von Schweinehaut, vorzugsweise Haut vom Schweineohr.