JP2010008057A - 生体内抗酸化度の測定方法 - Google Patents

Abstract

【課題】個体差に応じた生体内抗酸化度の測定技術を確立することである。
【解決手段】被験者の体液により、前記被験者の生体内抗酸化度を測定する抗酸化度の測定方法は、取得した体液に所定量のスピントラップ剤を添加してサンプル液を調製する工程と、前記調製したサンプルをＥＳＲ装置にて少なくとも１つのラジカル種のピーク強度を測定する工程とを含み、従来、困難であると思われていた唾液などの体液である酸化−還元系が複雑な系でのラジカルのピーク強度の測定を可能とした。
【選択図】図３

Description

本発明は、生体内抗酸化度の測定方法に関する。より詳しく述べると、唾液等の体液から被験者の抗酸化度をＥＳＲ装置により測定する方法に関する。

近年、いわゆる生活習慣病をはじめとする種々の疾病の原因として酸化ストレスが問題視されている。例えば、疾病の原因の約９割が酸化ストレス、すなわち酸素に起因するラジカル種が原因であるとされている。

このような酸化ストレスを改善する方法として、薬剤、サプリメント、食品等により抗酸化機能を有する成分（例えば、アスコルビン酸及びその誘導体、ユビキノン、ＳＯＤ等）を経口的に又は非経口的に対象者等に直接投与する方法が知られている。すなわち、酸化ストレスに起因する疾病を有する患者、酸化ストレスに起因する疾病を予防するための健常者のみならず、例えば、家畜、家禽類、養殖魚にこのような抗酸化成分を経口投与または非経口的ルートで投与している。

これらの抗酸化機能を有する成分の投与に加えて、あるいは抗酸化機能を有する成分の投与の代わりに抗酸化ストレスの改善方法として、種々の外的要因を患者に与えて治療することが試みられている。
例えば、アロマテラピーに代表される嗅覚による抗酸化ストレスの抑制方法、噛むこと（ｂｉｔｉｎｇ、 ｃｈｅｗｉｎｇ）、音声（音楽、特定波長の音波）等の種々の方法がヒト、哺乳動物を中心に試みられている。

また、逆に、騒音、異臭等によりヒト、哺乳動物が酸化ストレスを受ける場合がある。例えば、飛行場、工場等に発する騒音や、混雑場所での携帯電話の着信音、ヘッドホンから音漏れする音楽等により酸化ストレスが発生する場合もある。
このような酸化ストレスの測定方法として、特許文献１には酸化ストレスのマーカーとして、グルタチオン付加ヘモグロビンを用いそのようなグルタチオン付加ヘモグロビンの測定が、血液中の赤血球からヘモグロビンを遊出せしめた後、かかるヘモグロビン中のグルタチオン付加ヘモグロビン量を測定することによって、酸化ストレスの測定方法を実施することが記載されている。また、特許文献２には表面に微細な溝のアレイを加工した基板に対して透明基板を圧着させることで形成したマイクロチャネルアレイに、ヒト又は動物の抗凝固処置した全血を流し、該マイクロチャネルアレイを通過中の全白血球からの発光量を該透明基板越しに測定し、測定された発光量を白血球の活性酸素産生量及び酸化ストレスの指標とすることを特徴とする白血球活性酸素産生量及び酸化ストレス測定方法が開示されている。更に特許文献３によると、マーカーとして生体中のモノ不飽和脂肪酸を用いることを特徴とする酸化ストレスの測定方法が開示されている。

特開２０００−０７４９２３号公報（要約書） 特開２００１−０５０９５３号公報（要約書、図１） 特開２００３−０８３９７７号公報（要約書）

しかしながら、従来技術では、人の個体差に応じた酸化ストレスを測定できる方法はなかった。

従って、本発明の課題は、個体差に応じた生体内抗酸化度の測定技術を確立することである。

上記課題は、下記項目によって解決される。
（１） 被験者の体液により、前記被験者の生体内抗酸化度を測定する抗酸化度の測定方法であって、
取得した体液に所定量のスピントラップ剤を添加してサンプル液を調製する工程と、
前記調製したサンプルをＥＳＲ装置にて少なくとも１つのラジカル種のピーク強度を測定する工程と、を含むことを特徴とする抗酸化度の測定方法。

（２） 前記サンプルは、（ａ）所定量のスピントラップ剤と所定量の所定のフリーラジカル種を添加したサンプル、（ｂ）所定量のスピントラップ剤と所定量の所定のフリーラジカル清掃種を添加したサンプル、（ｃ）所定のスピントラップ剤のみを添加したサンプルの少なくとも１つであることを特徴とする（１）に記載の測定方法。

（３） 前記所定量のフリーラジカル種またはフリーラジカル清掃種を添加したサンプルは添加量の異なる複数個のサンプルより構成されていることを特徴とする（２）に記載の方法。

（４） 前記所定量のフリーラジカル種またはフリーラジカル清掃種を添加したサンプルは、所定の時間間隔にてＥＳＲ装置によるラジカル種の強度測定を行うことを特徴とする（２）または（３）に記載の方法。

（５） 前記フリーラジカル種の添加量の変化に基づくフリーラジカルのピーク強度の変化に基づいて、被験者のフリーラジカル負荷に対する回復能力を測定することを特徴とする、（２）から（４）のいずれか１項に記載の方法。

本発明はまた、次の各項目に関する。
（６） 被験者の体液により、前記被験者の生体内抗酸化度を測定する抗酸化度の測定方法であって、取得した体液に所定量のスピンプローブ剤を添加してサンプル液を調製する工程と、前記調製したサンプルをＥＳＲ装置にてスピンプローブ剤の消失速度を測定する工程と、を含むことを特徴とする抗酸化度の測定方法。

（７） 前記サンプルは、（ａ）所定量のスピントラップ剤と所定量の所定のフリーラジカル種を添加したサンプル、（ｂ）所定量のスピントラップ剤と所定量の所定のフリーラジカル清掃種を添加したサンプル、（ｃ）所定のスピントラップ剤のみを添加したサンプルの少なくとも１つであることを特徴とする請求項６に記載の測定方法。

（８） 前記所定量のフリーラジカル種またはフリーラジカル清掃種を添加したサンプルは添加量の異なる複数個のサンプルより構成されていることを特徴とする（７）に記載の方法。

本発明によると、被験者個々の体液、好ましくは唾液に基づいて各種ラジカル種の消去能をＥＳＲ装置を用いて測定することが可能であるので、被験者個々のラジカル消去能を容易に測定可能である。

また、本発明によると、被験者個々の体液、好ましくは唾液に基づいて抗酸化度をＥＳＲ装置を用いて測定することが可能であるので、被験者個々の抗酸化度を容易に測定可能である。更に、被験者個々のラジカル消去能と抗酸化度を比較することによって、被験者の生体内の酸化−抗酸化バランスを測定することが可能である。

以下、本発明の実施形態を添付図面に基づいて説明する。図１は、生体内の酸化・抗酸化系を模式的に示す図面である。

ラジカル種による酸化ストレスは、例えば「ガン」、「潰瘍性大腸炎」、「肝炎」、「急性膵炎」、「虚血性心疾患」、「虚血性腸炎」、「血管透過性が亢進」、「高血圧」、「紫外線障害」、「自己免疫疾患」、「ショック」、「腎炎」、「心筋梗塞」、「ストレス性潰瘍」、「成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）」、「テンカン発作」、「糖尿病」、「動脈硬化」、「脳卒中」、「パーキンソン病」、「放射線障害」、「薬剤性肝障害」、「リウマチ」、「老化」等の種々の疾病の原因となるだけでなく、図１に示す通り、加齢障害に対する評価・予知に使用することが可能である。

すなわち、図１に示す通り、活性酸素・フリーラジカル（図１左側）と、生体内抗酸化酵素とのバランスがとれていることが重要であるが、加齢により（生活習慣病・老化等）、生体内の活性酸素種と、生体内抗酸化物質（酵素）とのバランスが若干ではあるがくずれてしまう。

本発明においては、このような生体内の活性酸素種に対する被験者の消去能を例えば図２に示すようなＥＳＲ装置を使用して評価する。

図２は、本発明に適用可能なＥＳＲ装置の概略を示す概略図である。
図中、１は試料管、２は空洞共振器、３は電磁石、４はマイクロ波発生装置、５は磁場変調／掃引装置、６は検出器、７は増幅器、８はノイズフィルタ、９は制御装置を示す。
試料は試料管１に納められ、空洞共振器２の中に配置されている。空洞共振器２内にはマイクロ波発生装置４で発生されたマイクロ波が導波管により導かれている。また、空洞共振器２の外側には電磁石３が配置されており、その磁場は磁場変調／掃引装置５によって変調され、且つ磁場強度が掃引される。そして、検出器６で検出された信号は、増幅器７、ノイズをカットするためのノイズフィルタ８を介して図示しないＡ／Ｄ変換器によってデジタル化されて制御装置９に取り込まれ、ハードディスク等の記憶装置（図示せず）に記憶される。その後、図示しないモニタやプロッタなどの出力手段に出力することによって、オペレータは測定されたスペクトルを観察することができることになる。なお、図２に示すＥＳＲ装置では増幅器７とノイズフィルタ８は別個なものとしているが、増幅器にノイズフィルタの機構を持たせた構成のＥＳＲ装置を用いることも可能である。

本発明において、このようなＥＳＲ装置（ＸバンドのＥＳＲ装置）を用いて、被験者の個々のラジカル消去能及び抗酸化度（すなわち、酸化還元のバランス）を評価することができる。以下にその詳細を説明する。

（第１の方法）
本発明の第１の方法は、サンプルである被験者の体液にスピントラップ剤を添加して、存在するラジカルの強度をＥＳＲ装置にて測定することによって抗酸化度を測定する方法である。なお、この際のラジカル種は、後述するように所定のラジカル種産生系を用いて発生したラジカル種を使用してもよくあるいは所定量のラジカル種を添加してもよい。

また、本発明の第１の方法で使用できるスピントラップ剤は、当該技術分野に周知のスピントラップ剤を適用することができる。第１の方法に用いることができるスピントラップ剤の代表例として、ラジカルリサーチ株式会社より提供されているＣＹＰＭＰＯ（登録商標名）が挙げられる。

ＣＹＰＭＰＯ（登録商標名）は、下記の化学式を有する２−（５，５−ジメチル−２−オキソ−２λ５−［１，３，２］ジオキサホスフィナン−２−イル）−２−メチルｌ−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピロール １−オキシドであり、Ｏ_２ ⁻・、ＯＨ・を同時にトラップできるという特徴を有している。

このようなスピントラップ剤を適量添加した体液に添加して体液中のラジカル発生状況をピーク強度として測定する。
なお、本発明の好ましい実施形態において、体液に所定量の種々のラジカル種や抗酸化剤を添加して、体液とラジカル種および／または抗酸化剤との反応より、生体内の抗酸化能力の度合いを測定することも可能である。

例えば、使用するスピントラップ剤に応じて、所定量のラジカル種を体液に添加した後、体液のラジカルの消去能をＥＳＲ装置を用いて測定することができる。更に、フリーラジカル種の添加量を傾斜的に増加させてフリーラジカル種の負荷に対する体液の回復能力やフリーラジカルの消去能力限界を測定することもできる。

また、所定のラジカル種を所定量添加した体液に対して、所定時間間隔でラジカル種の強度を測定してもよい。

図３（ａ）及び図３（ｂ）は、スーパーオキシド産生系における体液のスーパーオキシド消去能を示すＥＳＲチャートであり、図３（ａ）はコントロール、図３（ｂ）は唾液を用いた実験系におけるスーパーオキシドのピークを示すＥＳＲチャートである。

図３（ａ）及び図３（ｂ）に示すＥＳＲチャートは、スーパーオキシド産生系として二酸化チタンと過酸化水素と紫外線を用いてスーパーオキシドを発生させ、スピントラップ剤としてＣＹＰＭＰＯ（登録商標名）を用いたスーパーオキシドのピーク強度を示している。図３（ａ）及び図３（ｂ）において黒丸で示す部分がスーパーオキシドのスペクトルである。

図３（ａ）及び図３（ｂ）に示す通り、スーパーオキシドのピークは、唾液を用いた実験系では低くなり、劇的に下がっていることを示している。

同様にして、図３（ｃ）及び図３（ｄ）はヒドロキシラジカル産生系における体液のヒドロキシラジカル消去能を示すＥＳＲチャートであり、図３（ｃ）はコントロール、図３（ｄ）は唾液を用いた実験系におけるヒドロキシラジカルのピークを示すＥＳＲチャートである。

図３（ｃ）及び図３（ｄ）に示すＥＳＲチャートは、ヒドロキシラジカル産生系として二酸化チタンと紫外線を用いてヒドロキシラジカルを発生させ、スピントラップ剤としてＣＹＰＭＰＯ（登録商標名）を用いた際のヒドロキシラジカルのピーク強度を示している。図３（ｃ）及び図３（ｄ）において白丸で示す部分がスーパーオキシドのスペクトルである。

図３（ｃ）及び図３（ｄ）に示す通り、ヒドロキシラジカルのピークは、唾液を用いた実験系では低くなり、劇的に下がっていることを示している。
従来、唾液などの体液では酸化−還元系が複雑系でありＥＳＲ装置により各種ラジカルのピーク強度を測定することは困難であると思われていたが、このようにＥＳＲ装置により体液における各種ラジカル種のピーク強度を測定できることは驚くべきことである。

このようにして、コントロール系と体液による所定のラジカル種のピーク強度の強度比を用いることにより、当該所定のラジカルに対する体液の消去能を測定することが可能となる。

本発明によって、このような、フリーラジカル産生系を複数用いて、対照と検体である体液とを比較することにより、個体差別の抗酸化度、すなわちフリーラジカル消去能を容易に測定することが可能となる。

また、複数のラジカル種に対して、同一の体液をＥＳＲ装置を用いて同様の手法で測定することにより、ラジカル種別の抗酸化度を測定することも可能となる。

（第２の方法）
次に、本発明の第２の方法について説明する。
本発明の第２の方法は、被験者の体液により、前記被験者の生体内抗酸化度を測定する抗酸化度の測定方法であり、被験者の体液に所定量のスピンプローブ剤を添加してサンプル液を調製した後にサンプルをＥＳＲ装置にてスピンプローブ剤の消失速度を測定する方法である。
本発明の第２の方法において、図２に示すようなＥＳＲ装置を用いて、測定する体液に所定量の電子スピンプローブを添加して、電子スピンプローブの消失速度の傾きの絶対値を測定する。

この際に、第１の方法で示したとおり、測定する体液に所定量の所定のラジカル種を添加したＥＳＲ吸収スペクトルを予め求めておくことが好ましい。

すなわち、ＥＳＲ吸収スペクトルを測定することによって、体液中のフリーラジカル分解能を測定することによって、その測定成分がどのようなフリーラジカルに対してどのような作用を示すかを判定できる。本発明においてＥＳＲ吸収スペクトルの測定は必須ではなく、所望に応じて行うものである。

具体的には、単独あるいは複数種の既知濃度のフリーラジカル種を有する基準物質に対するＥＳＲ吸収スペクトルを測定する。複数種の既知濃度のフリーラジカルを有する基準物質あるいは、各種フリーラジカルのいずれか１種を含有する複数の基準物質のＥＳＲ吸収スペクトルを測定することによって、測定物質がどのフリーラジカル種に対して分解能があるのかどうかを生体外評価することができる（第１の方法参照）。

電子スピンプローブの消失速度は、例えば図４に示す通り、時間の経過とともに減少する一次関数として表され、勾配がシャープな程（すなわち、消失速度の傾きの絶対値が大きくなる程）、フリーラジカル分解能が弱いと考えられる。

図４に示す通り、測定成分である体液に傾斜的濃度を有するフリーラジカル種を添加し（あるいは産生系を作り）、フリーラジカル負荷を変化させて電子スピンプローブの消失速度の変化（傾き）を測定することによって、フリーラジカル負荷に対する電子スピンプローブの傾きの変化により、被験者の体液における抗酸化度を、添加したフリーラジカル種毎に測定することが可能となる。

生体内の酸化・抗酸化系を模式的に示す図面である。 本発明に適用可能なＥＳＲ装置の概略を示す概略図である。 図３（ａ）及び図３（ｂ）は、スーパーオキシド産生系における体液のスーパーオキシド消去能を示すＥＳＲチャートであり、図３（ａ）はコントロール、図３（ｂ）は唾液を用いた実験系におけるスーパーオキシドのピークを示すＥＳＲチャートであり、図３（ｃ）及び図３（ｄ）はヒドロキシラジカル産生系における体液のヒドロキシラジカル消去能を示すＥＳＲチャートであり、図３（ｃ）はコントロール、図３（ｄ）は唾液を用いた実験系におけるヒドロキシラジカルのピークを示すＥＳＲチャートである。

符号の説明

１ 高周波発振器
２ ステップアッテネータ
３ サーキュレータ
４ 高周波線路
５ ループギャップ共振器
６ 静磁場コイル
７ 勾配磁場コイル
８ 測定対象物
９ 試料台
１０ 移動式のカップラー
１１ 高周波検出器
１２ データ処理装置
１３ 方向性結合器
１４ 移相器
１５ 方向性結合器

Claims (8)

1. 被験者の体液により、前記被験者の生体内抗酸化度を測定する抗酸化度の測定方法であって、
   取得した体液に所定量のスピントラップ剤を添加してサンプル液を調製する工程と、
   前記調製したサンプルをＥＳＲ装置にて少なくとも１つのラジカル種のピーク強度を測定する工程と、
   を含むことを特徴とする抗酸化度の測定方法。
2. 前記サンプルは、（ａ）所定量のスピントラップ剤と所定量の所定のフリーラジカル種を添加したサンプル、（ｂ）所定量のスピントラップ剤と所定量の所定のフリーラジカル清掃種を添加したサンプル、（ｃ）所定のスピントラップ剤のみを添加したサンプルの少なくとも１つであることを特徴とする請求項１に記載の測定方法。
3. 前記所定量のフリーラジカル種またはフリーラジカル清掃種を添加したサンプルは添加量の異なる複数個のサンプルより構成されていることを特徴とする請求項２に記載の方法。
4. 前記所定量のフリーラジカル種またはフリーラジカル清掃種を添加したサンプルは、所定の時間間隔にてＥＳＲ装置によるラジカル種の強度測定を行うことを特徴とする請求項２または請求項３に記載の方法。
5. 前記フリーラジカル種の添加量の変化に基づくフリーラジカルのピーク強度の変化に基づいて、被験者のフリーラジカル負荷に対する回復能力を測定することを特徴とする、請求項２から請求項４のいずれか１項に記載の方法。
6. 被験者の体液により、前記被験者の生体内抗酸化度を測定する抗酸化度の測定方法であって、
   取得した体液に所定量のスピンプローブ剤を添加してサンプル液を調製する工程と、
   前記調製したサンプルをＥＳＲ装置にてスピンプローブ剤の消失速度を測定する工程と、
   を含むことを特徴とする抗酸化度の測定方法。
7. 前記サンプルは、（ａ）所定量のスピントラップ剤と所定量の所定のフリーラジカル種を添加したサンプル、（ｂ）所定量のスピントラップ剤と所定量の所定のフリーラジカル清掃種を添加したサンプル、（ｃ）所定のスピントラップ剤のみを添加したサンプルの少なくとも１つであることを特徴とする請求項６に記載の測定方法。
8. 前記所定量のフリーラジカル種またはフリーラジカル清掃種を添加したサンプルは添加量の異なる複数個のサンプルより構成されていることを特徴とする請求項７に記載の方法。

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