DE102006023364A1

DE102006023364A1 - Verfahren und Vorrichtung zur Bestimmung eines UV-Radikalsonnenschutzfaktors (RSF) von Stoffen oder Stoffzusammensetzungen

Info

Publication number: DE102006023364A1
Application number: DE102006023364A
Authority: DE
Inventors: Katinka Jung; Thomas Dr. Herrling
Original assignee: GEMATRIA TEST LAB GmbH
Current assignee: Gematria Test Lab De GmbH
Priority date: 2006-03-06
Filing date: 2006-05-15
Publication date: 2007-09-13
Anticipated expiration: 2026-05-16
Also published as: DE102006023364B4

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur automatischen Bestimmung eines UV-Radikalsonnenschutzfaktors (RSF) eines Stoffes oder einer Stoffzusammensetzung, insbesondere von kosmetischen und dermatologischen Zusammensetzungen, mittels Messung der Reduktion von mindestens einer Elektron-Spin-Resonanz (ESR) aktiven Indikatorsubstanz durch UV-Bestrahlung bei konstanter Bestrahlungsstärke E in mindestens einer Hauptprobe für eine Zeitdauer t mittels Elektron-Spin-Resonanz-Spektroskopie (ESR), wobei der Radikalsonnenschutzfaktor (RSF) als ein zeitabhängiges Maß zur Evaluierung der Schutzwirkung des Stoffes oder Stoffzusammensetzung gegenüber UV-Strahlung ein zweidimensionaler Quotient gemäß $F1 definiert ist. Des Weiteren betrifft die Erfindung eine Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1 und eine Vorrichtung nach Anspruch 14.
Bekannt sind zahlreiche in vivo und in vitro Verfahren zur Bestimmung des UV-Schutzes kosmetischen oder dermatologischen Stoffen oder Stoffzusammensetzungen, insbesondere von Sonnenschutzprodukten.
Dabei stützen sich die in vivo Verfahren auf die Bestimmung der Zeit, die notwendig ist um ein Hauterythem (MED) zu erzeugen bzw. die Bestimmung eines Faktors SPF (Sun Protection Faktor) bzw. LSF (Lichtschutzfaktor), um den diese Zeit bei Anwendung eines Sonnenschutzproduktes verlängert werden kann. Der SPF/LSF ist ein Parameter, der die Schutzwirkung des Produktes gegenüber der UV-Strahlung, insbesondere der UV-B Strahlung (280-320 nm) charakterisiert, wobei von der Annahme ausgegangen wird, dass hauptsächlich von der UV-B Strahlung das Erythem erzeugt wird. Diese Annahme wird insbesondere dadurch gestützt, dass die UV-B Strahlung nur bis in die oberste Hautschicht in die Epidermis (bis ca. 50 µm) vordringen kann.
Die Schutzwirkung gegenüber der längerwelligen UVA-Strahlung (320-400 nm) wird dabei nicht berücksichtigt, da sie nicht unmittelbar mit der Erythembildung zusammenhängt. Für die in vivo Bestimmung des UV-A Schutzes wird eine Methode verwendet, die von der Bildung einer permanenten Bräunung, der so genannten PPD (Permanent Pigment Darkening) der Haut ca. 2 h nach der UV-A Bestrahlung ausgeht.
Beide in vivo-Methoden weisen erhebliche Nachteile auf. Die Bestimmung der Erythem- bzw. PPD-Schwelle einschließlich der dafür notwendigen Bestrahlungszeit (Eigenschutzzeit) ist für jeden Probanden (Testperson) individuell verschieden und wird hauptsächlich durch den Hauttyp bestimmt. Sie muss für jede Testperson gesondert bestimmt werden. Diese Tatsache erhöht den Aufwand und verringert die Vergleichbarkeit der an unterschiedlichen Probanden erzielten Ergebnisse erheblich.
Die Generierung von Erythemen und des PPD an Probanden stellt zu dem einen wesentlichen Eingriff in die Hautgesundheit des Probanden dar, die durchaus als Körperverletzung bezeichnet werden kann.
Bei der Generierung des Erythems bzw. PPD wird von einer charakteristischen notwendigen UV-Dosis ausgegangen. Die UV Dosis ist das Produkt aus Bestrahlungsintensität (W/m²) und Bestrahlungszeit (min bzw.sec). Bei der bisher verwandten Methode wird von einer Gleichwertigkeit und damit Austauschbarkeit der beiden Faktoren ausgegangen. Bei der Testung eines Produktes mit einem SPF 50 wird beispielsweise nicht über einen Zeitraum von 50 mal der Eigenschutzzeit (für Eigenschutzzeit von 10 min -> 500 min UV-Bestrahlung der Testperson) gemessen. Um nicht zu lange Bestrahlungszeiten der Testperson zu benötigen wird beispielsweise die Bestrahlungsintensität um den Faktor 50 erhöht. Diese hohen Bestrahlungsintensitäten erhöhen die Gefahr für den Probanden dramatisch, da die Stabilitäten der verwendeten Sonnenschutzcremes entscheidend die Bildungszeit eines Erythems beeinflussen. Bei instabilen Sonnenschutzprodukten – und in der Mehrzahl der Fälle ist von solchen auszugehen – wird dann natürlich die berechnete Schutzzeit überschritten und es kommt zu drastischen Hautverbrennungen. Außerdem wird bei dieser Methode die UV-A Strahlung und der Schutz vor UV-A Strahlung völlig außer Acht gelassen, so dass dem Probanden eine unverantwortlich hohe Dosis an UVA Strahlung zugeführt wird. Diese UV-A Strahlung dringt in die tieferen Hautschichten ein und ist vor allem für die Bildung von Hautkrebs verantwortlich. Die bisher verwendeten in vivo Methoden der Erythem und PPD Bildung müssen deshalb neu überdacht werden.

Bekannt ist (Darr D., Fridovich I. Free radicals in cutaneous biology. J Invest Dermatol. May 1994; 102(5): 671-5. Review) dass sowohl UVA als auch UVB Strahlung freie Radikale (FR) bzw. Reactive Oxygen Spezies (ROS) in der Haut erzeugen und dass diese FR/ROS wiederum in daran anschließenden Reaktionen die sog. Folgeradikale oder Sekundärradikale wie z.B. Lipidradikale, Lipidperoxide und andere Kohlenstoffzentrierte Radikale entstehen lassen, die zur Zerstörung oder Schädigung von Zellen, Zellmembranen und DNA führen können. Diese Radikale führen auch zur Herunterregulierung des Immunstatus der Haut und damit längerfristig zu Entzündungen (Erythemen) und zu Melanomen und anderen Formen des Hautkrebses.

Die bisher als Alternative vorgeschlagenen in vitro Methoden basieren zumeist auf Transmissionsmessungen an auf Trägerplatte (Quarz, Kunststoff) aufgetragenen dünnen Schichten (2.0 mg/cm²) des Sonnenschutzproduktes. Die Transmissionsmessungen erfolgen sukzessive über den UVB (280-320 nm) und UVA Bereich (320-400 nm) und zeigen die Verringerung der Transmission als Funktion der Wellenlänge. Diese Messungen sind ausgesprochen physikalischer Natur und haben keinen Bezug zu einer biologischen Endpunkt-Reaktion bzw. der Schutzcharakter der Haut wird dabei nicht berücksichtigt. Weiterhin ist mit diesen Methoden meist keine Abstufung in der Charakterisierung eines Produktes möglich.

Der Australische Standard ist beispielsweise eine solche in vitro Methode basierend auf Transmissionsmessung, die als erfüllt gilt, wenn über 90% der Strahlung vom Sonnenschutzprodukt absorbiert wird. Eine quantitative Beschreibung eines Produktes ist demnach nicht möglich.

Der Erfindung liegt daher das Problem zu Grunde, ein Verfahren bereitzustellen, dass die aufgezeigten Nachteile der bekannten Messverfahren umgeht und die Schutzparameter im gesamten UV-Bereich, insbesondere im UV-A und UV-B-Bereich eines Stoffes oder einer Stoffzusammensetzung, die bevorzugt in Sonnenschutzprodukten verwendet werden, umfassend beschreibt.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1 gelöst.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung eines UV-Radikalschutzfaktors (RSF) eines Stoffes oder einer Stoffzusammensetzung, insbesondere von kosmetischen und dermatologischen Zusammensetzungen, erfolgt mittels Messung der Reduktion von mindestens einer Elektron-Spin-Resonanz (ESR) aktiven Indikatorsubstanz durch UV-Bestrahlung mit einer vorbestimmten Strahlungsintensität bei konstanter Bestrahlungsstärke E in mindestens einer Hautprobe für eine Zeitdauer t bei Verwendung der Elektron-Spin-Resonanz-Spektroskopie (ESR), wobei mindestens eine Messung mit einer unbehandelten Hautprobe und mindestens eine Messung mit einer mit dem Stoff oder der Stoffzusammensetzung behandelten Hautprobe durchgeführt werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass in einem ersten Schritt a) die unbehandelte Hautprobe mit der ESR aktiven Indikatorsubstanz imprägniert wird, in einem zweiten Schritt b) mindestens eine erste Messung der Signalintensität der Indikatorsubstanz in der in Schritt a) imprägnierten Hautprobe erfolgt, wobei die gemessene Signalintensität als Anfangssignal I₁₀ bei t = 0 gilt; und in einem dritten Schritt c) mindestens eine zweite Messung der zeitlichen Abhängigkeit einer Signalintensität I₁ der Indikatorsubstanz in der gemäß Schritt a) imprägnierten Hautprobe von der UV-Bestrahlungsstärke E an mindestens drei unterschiedlichen Zeitpunkten t_1n (n = 1, 2, 3, ...) durchgeführt wird, die als ein Maß für die Zahl der durch die UV-Bestrahlung induzierten freien Radikale der Indikatorsubstanz in der unbehandelten Hautprobe betrachtet wird.

In einem vierten Schritt d) wird mindestens ein erster Datensatz zur Bestimmung eines ersten dynamischen Parameters in Form der Reaktionszeitkonstanten k₁ aus den gemäß Schritt c) an zumindest drei unterschiedlichen Zeitpunkten t_1n (n = 1, 2, 3 ...) gemessenen Signalintensitäten I₁ automatisch erzeugt.

Dieser Ablauf wird mit der behandelten Hautprobe in den Schritten e) bis g) wiederholt.

Dabei wird zunächst in Schritt e) die mit einem Stoff oder einer Stoffzusammensetzung behandelten Hautprobe mit einer ESR aktiven Indikatorsubstanz imprägniert. Im nächsten Schritt f) erfolgt mindestens eine erste Messung der Signalintensität der Indikatorsubstanz in der gemäß Schritt e) imprägnierten Hautprobe, wobei die gemessene Signalintensität als Anfangssignal I_p0 bei t = 0 gilt. Im folgenden Schritt g) wird die zeitliche Abhängigkeit einer Signalintensität I_p der Indikatorsubstanz in der gemäß Schritt e) imprägnierten Hautprobe von der UV-Bestrahlungsstärke E an mindestens drei unterschiedlichen Zeitpunkten t_pn (n = 1, 2, 3, ...) ermittelt, die als ein Maß für die Zahl der durch die UV-Bestrahlung induzierten freien Radikale in der Indikatorsubstanz in der behandelten Hautprobe gilt. Anschließend wird in Schritt h) mindestens ein erster Datensatzes zur Bestimmung eines zweiten dynamischen Parameters in Form der Reaktionszeitkonstanten k_p aus den gemäß Schritt g) an zumindest drei unterschiedlichen Zeitpunkten t_pn (n = 1, 2, 3 ...) gemessenen Signalintensitäten I_p automatisch erzeugt.

Der nächste Schritt i) des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst die automatische Normierung der Werte des dynamischen Parameters k_p auf den Wert des dynamischen Parameters k₁.

Zur Bestimmung eines zweidimensionalen Parameters in Form des Radikalsonnenschutzfaktors (RSF) wird basierend auf den normierten k_p-Werten automatisch mindestens ein dritter Datensatz erzeugt. Der Parameter des Radikalsonnenschutzfaktors (RSF), ist als zeitabhängiges Maß zur Evaluierung der Schutzwirkung des Stoffes oder Stoffzusammensetzung gegenüber der verwendeten UV-Strahlung gemäß

beschrieben.

Mit dem Wert des Radikalsonnenschutzfaktors (RSF) wird ein Parameter definiert, der die Fähigkeit und Effektivität eines Stoffes oder einer Stoffzusammensetzung angibt, die Bildung der durch UV-Strahlung erzeugten freien Radikale (FR) und reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) zu reduzieren. Der RSF vergleicht die Anzahl der gebildeten freien Radikale pro Zeiteinheit in der unbehandelten Hautprobe mit der Anzahl der gebildeten freien Radikale in der mit dem Stoff oder Stoffzusammensetzung behandelten Hautprobe.

Die Schutzwirkung eines Stoffes oder einer Stoffzusammensetzung ist abhängig von der eingesetzten Menge und der Stabilität des Stoffes oder Stoffzusammensetzung gegenüber UV-Strahlung. Somit wird der Wert k_p neben der verwendeten UV-Dosis, die sich aus der Bestrahlungsstärke und Bestrahlungszeit t ergibt, auch von der verwendeten Stoffmenge und deren UV-Dosis-Stabilität beschrieben, womit dieser Zusammenhang ebenfalls im RSF-Wert gemäß
RSF = f(UV-Dosis, Stoffmenge, UV-Dosis-Stabilität eines Stoffes)
berücksichtigt ist.

Grundidee des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die quantitative Messung der in der Haut generierten freien Radikale (FR) und ROS. Die Menge an freien Radikalen – und nicht länger ein Hauterythem – wird als Indikator zur Bestimmung des Sonnenschutzfaktors von entsprechenden Produkten verwendet. Diese Methode ist eine ex-vivo Methode, die an Hautbiopsien angewendet wird und somit alle ethischen Probleme der in vivo Messungen umgeht. Die Dedektierung der Radikalmenge erfolgt direkt in den Hautbiopsien mit der Elektronen Spin Resonanz (ESR) Spektroskopie.

Die Lebensdauer der generierten Primärradikale wie der ROS (OH^–, O₂ ^–) mit einer Lebensdauer im nano- bis mikro-Sekunden-Bereich ist für eine direkte Messung in Real-Time zu kurz. Deshalb werden semistabile ESR aktive Substanzen als Indikator verwendet, die vor der Bestrahlung in die Hautbiopsien eingebracht werden und die über einen Elektronentransfer mit den Primärradikalen ROS und auch den sekundären Folgeradikalen ihren Radikalcharakter verlieren und somit eine Signalabnahme im ESR – Spektrum verfolgbar ist (ESR silent).

Der Einsatz von semistabilen ESR-aktiven Indikatorsubstanzen bietet die Möglichkeit einer genauen Quantifizierung und Normierung der durch UV generierten freien Radikale (FR) und ROS. Ausgehend von der Reduzierung des ESR Signals der Indikatorsubstanz sind Mengenbestimmungen und Normierung für jede Messung bzw. Messreihe leicht möglich. Jede Messung kann somit auf ihr untersuchtes Hautareal normiert werden und die Ergebnisse können direkt untereinander verglichen werden. Das Einbringen von ESR-aktiven semistabilen Indikatorsubstanzen, die in der Haut nicht durch enzymatische Aktivität reduziert werden, und die Bestimmung ihrer Anfangsintensität in der Haut ist unabdingbare Voraussetzung für eine exakte quantitative Bestimmung von der in der Haut generierten Menge an freien Radikalen (FR) und reaktiven Sauerstoff-Spezies (ROS).

Das Verfahren ermöglicht sowohl die Bestimmung der absoluten Menge an generierten Radikalen sowie deren zeitliche Entstehungsprozesse. Das Verfahren ist ein zweidimensionales Verfahren mit quantitativen und zeitrelevanten, kinetischen Aussagen. Im Ergebnis wird ein Faktor angegeben, der die Menge an freien Radikalen(FR) und ROS pro UV-Dosis (Bestrahlungszeit t·Bestrahlungsstärke E) und entsprechend der Menge des verwendeten Filters in der geschützten und ungeschützten Hautprobe vergleicht

Der erste dynamische Parameter in Form der Reaktionszeitkonstanten k₁ ergibt sich direkt aus der Verringerung der Signalintensität I_1n der Indikatorsubstanz in Form eines Nitroxylradikals als Funktion der Zeitdauer t_1n bei UV-Bestrahlung der unbehandelten Hautprobe gemäß der monoexponentiellen Funktion f(t) = I1n(t) = I10exp – (k1·t1n), (2)wobei k₁ durch mathematische Fittung der monoexponentiellen Abfallkurve der gemessenen Signalintensität I₁(t) ermittelt wird. Die Bestimmung von k₁ erfolgt unter Anwendung von Fit- und Analysenprogrammen wie z.B. dem Origin-Programm.

Der zweite dynamische Parameter k_p wird in Analogie zu k₁ bestimmt, wobei hier die Verringerung der Signalintensität I_pn in Abhängigkeit von der Zeitdauer t_pn bei UV- Bestrahlung der behandelten Hautprobe zu Grunde gelegt wird. Der Parameter k_p ergibt sich somit aus f(t) = Ipn(t) = Ip0 exp – (kp·tpn), (3)mathematische Fittung der monoexponentiellen Abfallkurve der gemessenen Signalintensität I_p(t) bestimmt.

Für die Messungen wird der zu testende Stoff bzw. das Stoffgemisch in einer bestimmten Menge, gewöhnlich nach COLIPA-Standard, auf die epidermale Seite, d.h. die Oberseite der Hautprobe aufgetragen. Dazu werden die Hautproben mit der dermalen Seite, d.h. der Innenseite, auf ein Filterpapier gelegt, welches mit einer wässrigen Lösung der Indikatorsubstanz getränkt ist, und für einen bestimmten Zeitraum (5-10 Minuten) in einer dunklen Kammer gelagert wird. Nach Ablauf dieser Einwirkzeit wird die Hautprobe in einer Gewebezelle gelagert und in einem ESR Spektrometer vermessen.

Die Intensität des ESR Signals entspricht der in der Haut befindlichen Menge der ESR – aktiven Indikatorsubstanz. Nach der Bestimmung der Ausgangsintensität mit dem ESR Spektrometer wird diese Größe als Bezugspunkt definiert und unitär gleich „1" gesetzt. Anschließend wird die Gewebezelle mit der Hautprobe aus dem ESR Spektrometer entnommen und mindestens drei UV-Bestrahlungen (mittels Sonnensimulators) mit unterschiedlichen Bestrahlungszeiten bzw. UV-Dosen ausgesetzt. Nach jeder UV-Bestrahlung erfolgt eine ESR-Messung im Spektrometer. Die gemessene Intensität des sich verringernden ESR-Signals wird als Funktion der Bestrahlungszeit bzw. UV-Dosis bestimmt. Da die Reduktion der Indikatorsubstanz als Funktion der Bestrahlungszeit bzw. UV Dosis im wesentlichen einer monoexponentiellen Funktion entspricht, können die gemessenen Punkte durch eine solche Funktion approximiert werden

Der zeitliche Verlauf des monoexponentiellen Intensitätsabfalls des Indikators gemäß I = I₀ e^–kx mit x = t bzw. x = E·t, wobei E die Strahlungsintensität ist, (auf 1 normiert) findet seinen Ausdruck in der Reaktionszeitkonstanten k = f(I,t). Diese Zeit- bzw- Dosis-bezogene Betrachtungsweise ist vor allem bei der Testung von UV-instabilen Produkten von außerordentlichem Vorteil, da diese ihre Filtercharakteristik in Abhängigkeit von der erhaltenen UV-Dosis verändern.

Die Bestimmung der Reaktionszeitkonstanten k₁ gemäß Gleichung (2) der unbehandelten bzw. ungeschützten Hautprobe ist Ausgangspunkt für die Bestimmung des RSF-Wertes von Stoffen oder Stoffgemischen, insbesondere von Sonnenschutzprodukten.

Zu diesem Zwecke wird einer zweiten Hautprobe auf der epidermalen Seite der zu untersuchende Stoff bzw. das zu untersuchende Stoffgemisch aufgetragen und diese Hautprobe auf einer mit der Indikatorsubstanz getränkten Unterlage im Dunkelraum für 5-10 min gelagert.

Anschließend erfolgt auch hier eine mindestens dreimalige UV-Bestrahlung der behandelten Hautprobe bei entsprechend vorgegebenen UV-Bestrahlungszeiten und UV-Dosen, wobei der mittels ESR gemessene Intensitätsabfall des Indikators monoexponentiell gefittet wird und in der Bestimmung einer für den Stoff bzw. Stoffgemisch typischen Reaktionszeitkonstanten k_p gemäß der Gleichung (3) mündet.

Das Verhältnis der beiden k-Faktoren bestimmt den RSF des Stoffes oder Stoffgemisches p gemäß Gleichung (1). Da normalerweise der Abfall der Signalintensität der unbehandelten, ungeschützten Hautprobe größer ist als der behandelten, geschützten Hautprobe und damit k₁ größer k_p ist, ergeben sich RSF_p Werte größer 1.

Der Parameter des UV-Radikalschutzfaktors (RSF) wird vorteilhafterweise gemäß der Gleichung

bestimmt.

Die Generierung von freien Radikalen (FR) und ROS in der Haut ist abhängig von der auftreffenden Bestrahlungsintensität, die wiederum eng verknüpft ist mit der Transmission T des UV-Lichtes durch die dünne Schicht des auf die Haut aufgetragenen Stoffes oder Stoffgemisches.

Stoffe und Stoffgemische stellen zum einen chemische UV-Filter dar, die in Bezug auf die Transmission T bzw Absorption A von UV-Licht eine typische Verteilungsfunktion aufweisen. Das bedeutet, dass ein Stoff oder ein Stoffgemisch in Abhängigkeit von der chemischen Struktur bei bestimmten Wellenlängen ein Absorptionsmaximum bzw. Transmissionsminimum aufweisen, wobei die Transmission T bzw Absorption A normalerweise nicht über den gesamten Wellenlängenbereich konstant ist.

Zum anderen stellen Stoffe und Stoffgemische physikalische Filter dar, die die auftreffende UV-Strahlung reflektieren.

Zu dem weist das Verhältnis gemäß Gleichung (1) bei geringen k_p-Werten und somit bei geringen Transmissionswerten ein nichtlineares Verhalten auf.

Um einen für alle zu testende Stoffe oder Stoffgemische vergleichbaren Wert zu ermitteln, müssen diese Probleme berücksichtigt werden. Dabei werden folgende Überlegungen angestellt.

Die Transmission eines Sonnenschutzproduktes im gesamten UV-AB-Bereich kann durch einen idealen Protektionsfaktor (PF) charakterisiert werden, der den Protektionsfaktoren von physikalischen Dichtefiltern entspricht. Der Protektionsfaktor ist dabei proportional zum gemäß Gleichung (1) definierten UV-Radikalschutzfaktor (RSF).

Optimale Lichtschutzfaktoren eines Produktes oder Stoffes sind dann gegeben, wenn deren Protektionsfaktor PF über den UVA und UVB Wellenlängenbereich konstant ist. Dabei entspricht der PF im UVB-Bereich dem bekannten SPF. Eine Erweiterung des PF auf den UVA-Bereich soll durch die Angabe des RSF-Wertes realisiert werden.

Die Tatsache eines konstanten Schutzes über den gesamten UV-Bereich (UVA + UVB) kann am zweckmäßigsten durch physikalische Dichtefilter realisiert werden, die mit dünnen Metallschichten versehene Quarzplatten darstellen.

Bei den herkömmlichen UV-Schutzprodukten, wie Sonnenschutzcremes, ist der PF-Wert eine wellenlängenabhängige Größe. Die Generierung bzw. Reduzierung von FR/ROS in Haut während UV-Bestrahlung wird also in erster Linie durch den PF eines Produktes bestimmt, der invers proportional der Transmission T und der Bestrahlungsintensität E der UV-Strahlung gemäß PF (Produkt) ~ 1/Transmission ~ 1/E ~ 1/FR ~ 1/kp/k1 ~ RSF (5)ist. Die Bestrahlungsintensität E und die Bestrahlungszeit t sind dementsprechend für die Generierung von FR und ROS in der Haut verantwortlich.

Mit den anhand einer kalibrierten Korrelationskurve auf der Basis idealer UV-AB-Dichtefilter ermittelten RSF-Werte ist eine Bestimmung der für ein Sonnenschutzprodukt relevanten RSF Werte möglich. Die Dichtefilter entsprechen einem idealen Schutzfaktor, der über den gesamten UV-Wellenlängenbereich konstant ist.

Als physikalische Dichtefilter werden typischerweise metallbeschichtete Quarzplatten verwendet, die die Transmission über den gesamten UV-Bereich einschließlich visuell bis in den IR Spektralbereiche (260-800 nm) verringern, wobei ein Dichtefilter mit einem hohen Protektionsfaktor eine geringe Transmission (siehe Tabelle 1) aufweist. Die verwendeten physikalischen Dichtefilter (Hersteller: LOT-Oriol) werden nach ihrer optischen Dichte (D) eingeteilt, die als Zehnerlogarithmus des Kehrwertes der durchgelassenen Strahlungsleistung (T) definiert ist.

Tabelle 1:

Eine Transmission mit dem Wert 1 entspricht dabei einer Durchlässigkeit von 100%.

Zur Herstellung des Zusammenhanges von PF und RSF werden die dynamischen Parameter k₁ für eine unbehandelte bzw. ungeschützte Hautprobe und ein dynamischer Parameter k_n für eine Hautprobe bei Anwendung eines breitbandigen Dichtefilters n mit einem spezifischen Protektionsfaktor PF_n ermittelt.

Auch hier ergibt sich ein umgekehrt proportionaler Zusammenhang zwischen der normierten UV-Transmission, wobei 1 einer Transmission bzw. Durchlässigkeit von 100% entspricht, dem Quotienten k_n/k₁ und dem theoretischen Schutzfaktor PF der Dichtefilter (siehe Tabelle 1).

Zur Bestimmung des RSF eines Stoffes oder einer Stoffzusammensetzung p, der im Idealfall dem PF eines breitbandigen Dichtefilters entspricht, ist somit die Lösung des funktionellen Zusammenhanges RSF = PF = f(kp(=kn)/k1) (5)notwendig.

Nach doppelt logarithmierter Darstellung ergibt sich nach linearem Fitten folgender funktioneller Zusammenhang: In (kn/k1) = 0.024 – 0.823·In (PF) (6)

Mit k_n = k_p ergibt sich für die Bestimmung des UV-Radikalschutzes eines Stoffs oder einer Stoffzusammensetzung p der Zusammenhang gemäß Gleichung 4 von:

Der Radikalsonnenschutzfaktor RSF eines Stoffes oder einer Stoffzusammensetzung p kann damit anhand der Reduktionskinetik des verwendeten Testradikals als Funktion der Bestrahlungszeit bzw. UV-Dosis und dem sich daraus ergebenden dynamischen Parametern in Form der jeweiligen Reaktionzeitkonstanten k₁ und k_p bestimmt werden.

Diese Verfahrensweise ist sowohl ex vivo mit einer Hautprobe als auch in vivo anwendbar. Sie unterscheidet sich durch die Einbringung des Nitroxylradikals, die vor dem Auftragen des Produktes auf die Hautoberfläche erfolgen muß. Erst nach dem Aufbringen unter einer 10-minütigen Okklusion kann das UV-Schutzprodukt aufgetragen werden.

Das Verfahren ermöglicht mit Vorteil die Messung der zeitlichen Abhängigkeiten der Signalintensitäten I₁ und I_p in Gegenwart von UV-Strahlung im UV-AB-Bereich und somit die Bestimmung des UV-Radikalsonnenschutzfaktors (RSF-AB) gemäß Gleichung (4) für den gesamten Wellenlängenbereich der UV-AB-Strahlung.

Mit Vorteil können auch die zeitlichen Abhängigkeiten der Signalintensitäten I₁ und I_p in Gegenwart von UV-A-Strahlung separat gemessen werden, womit ein UV-Radikalsonnenschutzfaktors (RSF-A) separat für UV-A-Strahlung bestimmt werden kann.

Das Verfahren kann somit individuell für beliebige separate spektrale Bereiche angewendet werden, und somit die Bestimmung der Menge an generierten freien Radikalen/ROS als Funktion der Wellenlänge λ und deren Eindringtiefe in die Haut δ erlaubt. Diese Separierung ist besonders interessant für den UVB-Bereich (280-320 nm; δ = 50 µm ~ Epidermis) und UVA-Bereich (320-400 nm; δ = 3 mm ~ Dermis). Während der UVB Schutz eines Produktes gegenwärtig durch den SPF charakterisiert wird, existiert zur Bestimmung des UVA Schutzes kein quantifizierbares Verfahren. Eine getrennte Bestimmung in einen UVB und UVA Radikalschutz ist sinnvoll, da ca. 90% der FR und ROS in der Haut bis hin zur Subdermis durch UVA erzeugt werden. Die restlichen 10% beschränken sich dabei auf die Epidermis, die mit einer Dicke von ~ 50 µm nur ca. 1.7% bei einer betrachteten gesamten Hautdicke (einschließlich Dermis) von 3000 µm beträgt.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden alle erzeugten Radikale als integrierter Wert über die gesamte Hautdicke und den gesamten spektralen Bereich eines verwendeten Sonnensimulators (Hönle SOL 2) gemessen. Eine räumliche Separierung der einzelnen Hautschichten wäre mit dem ESR-Imaging (Herrling T., Fuchs J., Rehberg J., Groth N. UV-induced free radicals in the skin detected by ESR spectroscopy and imaging using nitroxides. Free Radic Biol. Med. 2003 Jul 1;35(1):59-67) möglich.

Eine separate Bestimmung des UVB und UVA Radikalschutzes ist notwendig, da nur der UVB-Radikalschutz direkt mit bestehendem SPF eines Produktes verglichen werden kann. Beide Verfahren zur Bestimmung des UVB und UVA Radikalschutzes unterscheiden sich in den verwendeten UV-Anregungsspektren. Eine ausschließliche Bestrahlung der Haut mit UVB (280-320 nm) ist aus physikalisch-technischen Gründen schwierig.

Es ist deshalb vorteilhaft, in einem ersten Schritt wie bereits erwähnt die durch Strahlung mit dem gesamten UV-AB (280-400 nm) Spektrum in einer Hautprobe erzeugten Radikale FR/ROS für die Ermittlung des RSF-AB zu verwenden.

In einem zweiten Schritt wird unter Verwendung eines UV-B Filter (Oriel WG305) an einer weiteren Hautprobe der RSF-A des Produktes ermittelt, der ausschließlich die durch UVA (320-400 nm) generierten Radikale berücksichtigt.

Zur Bestimmung des RSF-B wird die Menge an gebildeten Radikalen herangezogen, die sich aus der Differenz der jeweils für das UVAB und UVA Spektrum ermittelten Menge an FR und ROS ergeben, so dass sich die Signalintensitäten für den UV-B-Bereich für die Ermittlung des RSF-B Wertes aus der Differenz I(B) = I(AB) – I(A) (7)ergeben.

So kann für jedes Produkt ein RSF-AB, RSF-A und RSF-B ermittelt werden. Da die integrale Radikalmenge, d.h. deren absoluter Wert, in der Haut bei normaler Sonnenstrahlung im UV-AB-Bereich zu ca. 90% durch UV-A-Strahlung und zu ca. 10% von UV-B-Strahlung erzeugt wird, wird der RSF-AB somit vorwiegend durch die UV-A-Strahlung beeinflusst, d.h. RSF-AB ≈ RSF-A.

Die experimentelle und mathematische Vorgehensweise für die Bestimmung des RSF-AB Wertes und RSF-A Wertes ist bis auf die unterschiedlichen Spektralbereiche identisch. Die Bestimmung des RSFB erfolgt an Hand der errechneten Radikal-bzw. Intensitätsdifferenzen aus UVAB und UVA Strahlung.

Daher überwiegt normalerweise der Einfluss eines chemischen UV-A-Filters gegenüber einem UV-B-Filter in einem getesteten Stoff oder Stoffgemisch, wobei der Einfluss des UV-B-Filters in der Regel nur unterproportional berücksichtigt wird. Nur durch die Bestimmung des RSF-B-Wertes kann auch eindeutig der UV-B-Radikalschutz eines Produktes ermittelt werden.

Der resultierende Mindestschutz RSF eines Produktes wird demzufolge vom minimalsten Wert des UV-A- und UV-B-Radikalschutzes bestimmt: (RSF = Minimum <RSFA; RSFB>). Diese Definition bezieht sich auf einen Mindestschutz sowohl für die Epidermis, der ausschließlich von der UV-B-Strahlung beeinflusst wird, als auch für die Dermis, der ausschließlich durch UV-A-Strahlung beeinflusst wird.

So kann beispielsweise ein 20-facher UVB-Schutz mit einem RSF-B Wert gleich 20 nur dann umfassend gelten, wenn der RSF-A Wert größer gleich 20 ist, um Schäden in der Dermis zu vermeiden. Umgekehrt gilt dasselbe.

Die zu testenden Stoffe oder Stoffzusammensetzung sind aus der Gruppe enthaltend Ethylhexylmethoxycinnamat, Butylmethoxydibenzoylmethan, Ethylhexyltriazon, Bisethylhexyloxyphenol-methoxyphenyltriazine (Tinosorb S), Methylen-bis-benzotriazoyltetramethylbutylphenol (Tinosorb M) und/oder Isoamyl-p-methoxycinnamat ausgewählt. Diese chemischen UV-Filtersubstanzen werden neben den physikalischen Filtersubstanzen Ti₂O und Zn₂O typischerweise in den bekannten Sonnenschutzprodukten als UV-A- und UV-B-Filter verwendet.

Als ESR-aktive Indikatorsubstanzen werden bevorzugt semistabile Nitroxyl-Radikale, insbesondere 3-Carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyroline-1-oxyl (PCA), verwendet. Weitere Indikatorsubstanzen sind z.B. 3-Carboamyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine-1-oxyl (PCM), 2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1-oxyl (TEMPO), (4-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1-oxyl (TEMPOL), (4-Oxo-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1-oxyl (TEMONE), 4-Trimethylammonium-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1-oxyl (CAT1).

Als bevorzugte Hautproben werden Hautbiopsien, insbesondere Hautbiopsien vom Schwein oder Menschen verwendet oder direkte Messungen am Menschen durchgeführt.

Die erfindungsgemäße Aufgabe wird auch durch eine Vorrichtung mit den Merkmalen des Anspruchs 14 gelöst.

Danach ist die Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens durch mindestens ein erstes Mittel für eine Messung der zeitlichen Abhängigkeit der Signalintensität I₁ der mindestens einen Elektron-Spin-Resonsnaz (ESR) aktiven Indikatorsubstanz bei UV-Bestrahlung in einer unbehandelten Hautprobe und mindestens ein zweites Mittel für eine Messung der zeitlichen Abhängigkeit einer Signalintensität I_p der mindestens einen Elektron-Spin-Resonsnaz (ESR) aktiven Indikatorsubstanz in einer mit dem Stoff oder der Stoffzusammensetzung behandelten Hautprobe gekennzeichnet.

Die Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die Figuren an mehreren Ausführungsbeispielen näher erläutert. Es zeigen:
1 Diagramm mit Darstellung der auf 1 normierten Signalintensitäten I der zeitabhängigen Reduktion der ESR-aktiven Indikatorsubstanz PCA unter Verwendung der optischen Dichtefilter PF10 und PF50 zur Bestimmung der Reaktionszeitkonstanten k (k₁ = ungeschützte Haut; k₁₀ = PF 10 geschützt; k₅₀ = PF 50 geschützt).
2 Diagramm mit Darstellung der Beziehung zwischen dem Quotienten der Reaktionszeitkonstanten k_n/k₁, der Transmission T und den Protektionsfaktoren PF der physikalischen Dichtefilter PF = 1; 2; 5; 10; 20; 50.
3 Diagramm mit doppelt logarithmierter Darstellung des funktionellen Zusammenhanges von In k_n/k₁ und In PF zur Bestimmung des RSF als Funktion des durch die Dichtefilter realisierten Schutzes gegenüber FR/ROS.
Ausführungsbeispiel
Das Ausführungsbeispiel zeigt die Ergebnisse von ex vivo Messungen an Schweineohrbiopsien und der Testung und Bestimmung des RSF von 6 UV-Filtern, die in unterschiedlicher Konzentration in eine kosmetische Grundlage eingearbeitet wurden. Bei den UV-Filtern (siehe Tabelle 2) handelt es sich um Substanzen, die eine UV-Transmissionsminderung im UVB, UVA und UVAB Bereich haben. Als radikaldetektierende Indikatorsubstant wurde das semistabile Nitroxylradikal PCA (2,2,5,5-tetramethylpyrrolidin-1-oxyl) verwendet. Es wurde eine 1 mM PCA Lösung in Wasser hergestellt und damit eine Gaze bzw. Filterpapier von 1 × 1 cm² Fläche getränkt. Ein ebenfalls 1 cm² großes Hautareal (Epidermis, Dermis und Subcutis) wird mit der dermalen Seite auf das getränkte Filterpapier bzw. die Gaze gelegt, um das PCA in die Haut einpenetrieren zu lassen. Eine Verweildauer der Haut auf der Gaze von 5 Minuten bei Dunkelheit ist ausreichend, um eine ESR relevante Konzentration von PCA in der Haut und eine annähernd homogene Verteilung des PCA in der Haut zu erreichen. Aus der Mitte der 1 cm² großer Hautbiopsie wird eine Biopsie von 5 mm Durchmesser ausgestanzt. Diese Hautbiopsie wird in eine spezielle Gewebezelle gelagert und in einem ESR Spektrometer der Firma Magnettech (MS 200) die PCA Intensität gemessen, die als Ausgangssignal (t = 0) betrachtet wird, auf die die nach UV-Einstrahlung verringerten Signale normiert werden (siehe auch 1).
Soll die UV Protektion einer Sonnenschutzcreme gemessen werden, so ist diese in einer dünnen Schicht (2 mg/cm²) auf die epidermale Seite des Hautareals aufzutragen, bevor diese mit der dermalen Seite auf die PCA-getränkte Gaze gelegt wird. Anschließend wird aus der Mitte des Hautareals eine Biopsie von 5 mm Durchmesser ausgestanzt, deren PCA-Intensität in einem ESR-Spektrometer vermessen wird und auf die Signalamplitude aller nach UV-Bestrahlung gemessener Signalamplituden normiert werden.
Die unbehandelte und die mit den sechs Sonnenschutzcremes und der puren Cremegrundlage behandelte Hautbiopsien werden jeweils in 5 Zeitintervallen (30 s, 60 s, 120 s, 180 s, 300 s) mittels eines Sonnensimulators (SOL2) bestrahlt, wobei nach jedem Zeitintervall die verbleibende PCA-Intensität gemessen wird.
Die sich für jedes Produkt ergebenden normierten Messwerte werden jeweils mit einer monoexponentiellen Funktion (siehe auch 1) abgeglichen und die k-Werte bzw. Reaktionszeitkonstanten ermittelt. Die sich für jedes Sonnenschutzprodukt p (p = 1...8) ergebenden k_p-Werte werden auf den k-Wert der unbehandelten Haut k₁ normiert, so dass sich die in Tabelle 2 verzeichneten Quotienten k_p/k₁ ergeben. Mit Hilfe von Gleichung (4) kann so für jedes Produkt der Radikal-Sonnenschutzfaktor RSF bestimmt werden, wie er in Tabelle 2 angegeben ist.
Tabelle 2
Die einzelnen Filter zeigen große Unterschiede in ihrer Effektivität, die Bildung von freien Radikalen zu unterbinden. Die Grundlage ohne Filter zeigt mit einem RSF-Wert von 1,11 eine sehr geringe Schutzwirkung, die auf die Absorption der Strahlung durch den Cremefilm zurückzuführen ist.
Da die einzelnen Filter mit unterschiedlichen Konzentrationen in die Grundlage eingebracht worden sind, wird die Radikalschutzwirkung auf den jeweiligen Filteranteil normiert. Werden diese RSF-Werte durch den Prozentanteil des jeweiligen Filters geteilt, ergibt sich ein theoretischer RSF Wert der Filter für eine 1%ige Konzentration (siehe Tabelle 2).
Die UVB-Filter zeigen wie erwartet geringe theoretische RSF-Werte. So ergibt sich für Ethylhexyltriazon ein Wert von 0,8, für Isoamyl-methoxycinnamat von 1,6 und Ethylhexyl-methoxycinnamate von 3,45.
Da die freien Radikale vor allem von UV-A Strahlung erzeugt werden, entsprechen diese Werte dem erwarteten Ergebnis. Die Unterschiede zwischen den zwei sehr ähnlichen Filtersystemen Isoamyl-methoxycinnamat und Ethylhexylmethoxycinnamate, die ein identisches Absorptionsspektrum zeigen, könnten in einer unterschiedlich homogenen Verteilung der Creme liegen.
Für den UVA-Filter Butyl-methoxydibenzoylmethan ergibt sich ein sehr hoher theoretischer RSF-Wert von 9,2. Schon geringe Konzentrationen dieses Filters können also einen effektiven UV-A Schutz gewährleisten.
Die Breitbandfilter Tinosorb S und Tinosorb M zeigen sehr unterschiedliche Ergebnisse. Tinosorb S zeigt einen sehr hohen theoretischen RSF-Wert von 8 und ist damit ein effektiver UV-A Filter. Für Tinosorb M würde auf Grund des Absorptionsspektrums ein ähnlich hoher Wert erwartet werden. Der gemessene Wert beträgt jedoch nur 3,7 prp Prozent eingearbeiteten Filter. Dieser geringe Wert könnte mit der geringeren spezifischen Extinktion des Tinosorb M von 600 gegenüber Tinosorb S mit einer spezifischen Extinktion von 819 erklärt werden. Weiterhin besteht Tinosorb M aus Nanopartikeln mit einem Durchmesser von 200 nm. bei geringen Konzentrationen kann es daher zu einer nicht homogenen Verteilung der Partikel kommen.
1 zeigt die graphische Darstellung der Reduktion der Signalintensitäten I (auf 1 normiert) eines ESR-Signales der Indikatorsubstanz als Funktion der Bestrahlungszeit t bei Verwednung der optischen Dichtefilter PF10 und PF50. Als ESR-aktive Indikatorsubstanz wurde das Nitroyl-Radikal PCA verwendet und der Einfluss der Verwendung von optischen Dichtefiltern auf die Abnahme der Signalintensität des PCA-Radikals bestimmt. Da die Reduktion des PCA-Radikals als Funktion der Zeit t im wesentlichen einer monoexponentiellen Funktion entspricht, können die gemessenen Punkte durch eine solche monoexponentielle Funktion gemäß e^–kx mit x = t oder x = E·t approximiert werden.
In 2 ist die Beziehung zwischen den Quotienten der Reaktionszeitkonstanten k_n bei Verwendung der Dichtefilter und k₁ der ungeschützten Haut, der Transmission T und dem Protektionsfaktor PF der physikalischen Dichtefilter dargestellt. Dabei entspricht der Wert 1 einem Transmissionswert von 100%. Die Reaktionszeitkonstanten k_n und k₁ wurden anhand der Reduktion der Indikatorsubstanz PCA ermittelt.
3 zeigt die doppelt logarithmierte Darstellung des Zusammenhangs des Quotienten In(k_n/k₁) und des Protektionsfaktors In(PF) aus 2 gemäß der in Gleichung (6) dargestellten Funktion.

Claims

Verfahren zur automatischen Bestimmung eines UV-Radikalenschutzfaktors (RSF) eines Stoffes oder einer Stoffzusammensetzung, insbesondere von kosmetischen und dermatologischen Zusammensetzungen, mittels Messung der Reduktion von mindestens einer Elektron-Spin-Resonsnaz (ESR) aktiven Indikatorsubstanz durch UV-Bestrahlung bei konstanter Bestrahlungsstärke E in mindestens einer Hautprobe für eine Zeitdauer t mittels Elektron-Spin-Resonanz-Spektroskopie (ESR), wobei mindestens eine Messung mit einer unbehandelten Hautprobe und mindestens eine Messung mit einer mit dem Stoff oder der Stoffzusammensetzung behandelten Hautprobe durchgeführt werden, gekennzeichnet durch a) Imprägnierung der unbehandelten Hautprobe mit der ESR aktiven Indikatorsubstanz, b) mindestens eine erste Messung der Signalintensität der Indikatorsubstanz in der in Schritt a) imprägnierten Hautprobe, wobei die gemessene Signalintensität als Anfangssignal I₁₀ bei t = 0 gilt, c) mindestens eine zweite Messung der zeitlichen Abhängigkeit einer Signalintensität I₁ der Indikatorsubstanz in der gemäß Schritt a) imprägnierten Hautprobe von der UV-Bestrahlungsstärke E an mindestens drei unterschiedlichen Zeitpunkten t_1n (n = 1, 2, 3, ...) als ein Maß für die Zahl der durch die UV-Bestrahlung induzierten freien Radikale in der Indikatorsubstanz in der unbehandelten Hautprobe, d) automatische Erzeugung mindestens eines ersten Datensatzes zur Bestimmung eines ersten dynamischen Parameters in Form der Reaktionszeitkonstanten k₁ aus den gemäß Schritt c) an zumindest drei unterschiedlichen Zeitpunkten t_1n (n = 1, 2, 3 ...) gemessenen Signalintensitäten I₁, e) Imprägnierung der mit einem Stoff oder einer Stoffzusammensetzung behandelten Hautprobe mit der ESR aktiven Indikatorsubstanz, f) mindestens eine erste Messung der Signalintensität der Indikatorsubstanz in der gemäß Schritt e) imprägnierten Hautprobe, wobei die gemessene Signalintensität als Anfangssignal I_p0 bei t = 0 gilt; g) mindestens eine zweite Messung der zeitlichen Abhängigkeit einer Signalintensität I_p der Indikatorsubstanz in der gemäß Schritt e) imprägnierten Hautprobe von der UV-Bestrahlungsstärke E an mindestens drei unterschiedlichen Zeitpunkten t_pn (n = 1, 2, 3, ...) als ein Maß für die Zahl der durch die UV-Bestrahlung induzierten freien Radikale in der Indikatorsubstanz in der behandelten Hautprobe, h) automatische Erzeugung mindestens eines zweiten Datensatzes zur Bestimmung eines zweiten dynamischen Parameters in Form der Reaktionszeitkonstanten k_p aus den gemäß Schritt g) an zumindest drei unterschiedlichen Zeitpunkten t_pn (n = 1, 2, 3 ...) gemessenen Signalintensitäten I_p, i) automatische Normierung der Werte des dynamischen Parameters k_p auf den Wert des dynamischen Parameters k₁, und j) automatische Erzeugung mindestens eines dritten Datensatzes basierend auf den normierten Werten von k_p zur Bestimmung eines Parameters in Form des Radikalenschutzfaktors (RSF), der ein zeitabhängiges Maß zur Evaluierung der Schutzwirkung des Stoffes oder Stoffzusammensetzung gegenüber UV-Strahlung ein zweidimensionaler Quotient gemäß
ist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der dynamische Parameter k₁ durch mathematische Fittung der monoexponentiellen Abfallkurve der gemessenen Signalintensität I₁ bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der dynamische Parameter k_p durch mathematische Fittung der monoexponentiellen Abfallkurve der gemessenen Signalintensität I_p bestimmt wird
Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Parameter des UV-Radikalsonnenschutzfaktors (RSF) gemäß der Gleichung
bestimmt wird.
Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die zeitlichen Abhängigkeiten der Signalintensitäten I₁ und I_p in Gegenwart von UV-AB-Strahlung gemessen werden.
Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der UV-Radikalsonnenschutzfaktor (RSF-AB) für UV-AB-Strahlung nach Gleichung (4) unter Verwendung der bei UV-AB-Strahlung gemessenen Signalintensitäten bestimmt wird.
Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die zeitlichen Abhängigkeiten der Signalintensitäten I₁ und I_p in Gegenwart von UV-A-Strahlung gemessen werden.
Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der UV-Radikalsonnenschutzfaktors (RSF-A) für UV-A-Strahlung nach Gleichung (4) unter Verwendung der bei UV-A-Strahlung gemessenen Signalintensitäten bestimmt wird.
Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Signalintensität für UV-B-Strahlung aus der Differenz der bei UV-AB- und UV-A-Strahlung gemessenen Signalintensitäten bestimmt wird.
Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass des UV-Radikalsonnenschutzfaktors (RSF-B) für UV(B)-Strahlung nach Gleichung (4) unter Verwendung der für die UV-B-Strahlung errechneten Signalintensitäten bestimmt wird.
Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Indikatorsubstanz 3-Carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyroline-1-oxyl (PCA), 3-Carboamyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine-1-oxyl (PCM), 2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1-oxyl (TEMPO), (4-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1-oxyl (TEMPOL), (4-Oxo-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1-oxyl (TEMONE) und/oder 4-Trimethylammonium-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1-oxyl (CAT1) verwendet wird.
Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Indikatorsubstanz in einer wässrigen Lösung mit einer Konzentration von 0,5 bis 5 mM, insbesondere 1 mM, verwendet wird.
Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Hautprobe Hautbiopsien vom Schwein oder Menschen und/oder die Innenseite eines Unterarms eines Menschen verwendet werden.
Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, mit mindestens einem ersten Mittel für eine Messung der zeitlichen Abhängigkeit der Signalintensität I₁ der mindestens einen Elektron-Spin-Resonsnaz (ESR) aktiven Indikatorsubstanz bei UV-Bestrahlung in einer unbehandelten Hautprobe und mindestens einem zweiten Mittel für eine Messung der zeitlichen Abhängigkeit einer Signalintensität I_p der mindestens einen Elektron-Spin-Resonsnaz (ESR) aktiven Indikatorsubstanz in einer mit dem Stoff oder der Stoffzusammensetzung behandelten Hautprobe.