DE10144664A1 - Vacciniavirus MVA-E3L-Knock-Out-Mutanten und Verwendung hiervon - Google Patents
Vacciniavirus MVA-E3L-Knock-Out-Mutanten und Verwendung hiervonInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft MVA-Vacciniaviren, die zur Erzeugung von rekombinanten MVA-Viren verwendet werden, ebenso wie Wirtszellen, die mit diesen mutierten MVA-Viren infiziert wurden. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin DNA-Vektorkonstrukte, und ein Verfahren zur Erzeugung von rekombinantem MVA durch Verwendung der mutierten MVA-Viren und der DNA-Vektorkonstrukte. Die mutierten MVA-Vacciniaviren der vorliegenden Erfindung sind dadurch gekennzeichnet, daß das MVA ORF 050L-Gen oder ein funktioneller Teil hiervon im Virus-Genom inaktiviert wurde.
Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft mutierte MVA-Vaccinia viren, die zur Erzeugung von rekombinanten MVA-Viren verwendet werden, ebenso wie Wirtszellen, die mit diesen mutierten MVA-Viren infiziert wurden. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin DNA-Vektor- Konstrukte und ein Verfahren zur Erzeugung von rekombinantem MVA unter Verwendung der mutierten MVA-Viren und der DNA-Vektor-Konstrukte.
- Das Vacciniavirus gehört zur Gattung Orthopoxvirus der Familie der Poxviren. Bestimmte Stämme der Vacciniaviren wurden viele Jahre lang als Lebendimpfstoffe zur Immunisierung gegen Pocken (Small Pox) verwendet, beispielsweise der Elstree-Stamm des Lister Instituts im Vereinigten Königreich. Wegen der Komplikationen, die sich aus der Vakzinierung bzw. Impfung ergeben können (Schär, Zeitschrift für Präventivmedizin 18, 41-44 [1973]) und seit der Erklärung der WHO von 1980, daß die Pocken ausgerottet sind, werden heutzutage nur nach Menschen mit hohem Risiko gegen Pocken geimpft.
- Vacciniaviren wurden ebenfalls als Vektoren zur Herstellung und Übertragung von Fremdantigenen verwendet (Smith et al., Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 2, 383-407 [1984]). Dies ist mit für Fremdantigene kodierenden DNA-Sequenzen (Genen) verbunden, die mit Hilfe der DNA-Rekombinationstechniken in das Genom der Vacciniaviren eingebracht werden. Wenn das Gen an einen Ort in die virale DNA eingebracht wird, der für den Lebenszyklus des Virus nicht essentiell ist, ist es für die neu produzierten rekombinanten Vacciniaviren möglich infektiös zu sein, das soll heißen, sie sind dazu in der Lage, Fremdzellen zu infizieren und so dass die integrierte DNA-Sequenz zu exprimiert wird (EP Patentanmeldung NR. 83 286 und Nr. 110 385). Die rekombinanten Vacciniaviren, die auf diese Weise hergestellt wurden, können einerseits als Lebendimpfstoffe bzw. -vakzine zur Pro - phylaxe von Infektionen und andererseits zur Herstellung von heterologen Proteinen in eukaryontischen Zellen verwendet werden.
- Das Vacciniavirus gehört zu den am meisten ausgewerteten lebenden Vektoren und hat spezielle Merkmale, die seine Verwendung als rekombinante Vaccine unterstützen: Es ist hoch stabil, billig herzustellen, leicht zu verabreichen und kann große Mengen von Fremd-DNA aufnehmen. Es hat den Vorteil, sowohl Antikörper- als auch cytotoxische Reaktionen zu induzieren und ermöglicht die Präsentation von Antigenen an das Immunsystem in einer natürlicheren Weise und es wurde in einer breiten Vielzahl von Tiermodellen erfolgreich als Vektor-Vakzine, die gegen Infektionskrankheiten schützen, verwendet. Zusätzlich sind Vaccinia- Vektoren extrem wertvolle Forschungswerkzeuge zur Untersuchung des Struktur- Funktionsverhältnisses rekombinanter Proteine, zur Bestimmung von Zielen bzw. Targets der humoralen und Zell-vermittelten Immunantworten und zur Untersuchung derjenigen Art von Immunantwort, die zum Schutz gegen eine spezielle Krankheit notwendig ist.
- Jedoch ist das Vacciniavirus für Menschen infektiös bzw. ansteckend und seine Verwendung als Expressionsvektor im Labor wurde durch Sicherheitsbedenken und Regulierungen beeinträchtigt. Darüber hinaus werden mögliche zukünftige Anwendungen des rekombinanten Vacciniavirus, beispielsweise zur Erzeugung von rekombinanten Proteinen oder rekombinanten Virusteilchen für neue therapeutische oder prophylaktische Ansätze, bei Menschen durch die produktive Replikation des rekombinanten Vaccinia-Vektors behindert. Die meisten der in der Literatur beschriebenen rekombinanten Vacciniaviren basieren auf dem Western Reserve (WR)-Stamm von Vacciniaviren. Es ist andererseits bekannt, daß dieser Stamm in hohem Maße neurovirulent ist und somit schlecht zur Verwendung bei Menschen und Tieren geeignet ist (Morita et al., Vaccine S. 65-70 [1987].
- Bedenken hinsichtlich der Sicherheit der Standardstämme von VV wurden durch die Entwicklung von Vaccinia-Vektoren aus hoch-attenuierten bzw. abgeschwächten Virusstämmen angegangen, die durch ihre eingeschränkte Replikationsfähigkeit in vitro und ihre Avirulenz in vivo charakterisiert sind. Virusstämme, die speziell zur Vermeidung unerwünschter Nebenwirkungen gezüchtet wurden, sind seit langer Zeit bekannt. So war es möglich, durch Langzeit-Serienpassagen des Ankara-Stammes des Vacciniavirus (CVA) auf Hühnerembryo- Fibroblasten einen modifizierten Vacciniavirus Ankara (MVA) zu züchten (bezüglich eines Überblicks siehe Mayr, A., Hochstein-Mintzel, V. und Stickl, H. (1975) Infection 3, 6-14; Schweizer Patent Nr. 568 392). Das MVA-Virus wurde in Übereinstimmung mit den Erfordernissen des Budapester Vertrages bei CNCM (Institut Pasteuer, Collectione Nationale de Cultures de Microorganisms, 25, nie de Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) am 15. Dezember 1987 unter der Hinterlegungsnummer I-721 hinterlegt.
- Das MVA-Virus wurde untersucht, um Veränderungen im Genom bezüglich des Wildtyp- CVA-Stammes zu bestimmen. Sechs Haupt-Deletionen (Deletion I, II, III, IV, V und VI) wurden bestimmt bzw. identifiziert (Meyer, H., Sutter, G. und Mayr A. (1991) J. Gen. Virol. 72, 1031-1038). Dieses modifizierte Vacciniavirus Ankara weist nur geringe Virulenz auf, d. h. es folgen ihm keine Nebenwirkungen, wenn es zur Vakzinierung verwendet wird. Es ist daher zur initialen Vakzinierung von Patienten mit geschwächter Immunabwehr besonders geeignet. Die ausgezeichneten Eigenschaften des MVA-Stammes wurden in einer Anzahl von klinischen Versuchen unter Beweis gestellt (Mayr et al., Zbl. Bakt. Hyg. I, Abt. Org. B 167, 375-390 [1987], Stickl et al., Dtsch. Med. Wschr. 99, 2386-2392 [1974]).
- Kürzlich wurde ein neuartiges Vaccinia-Vektorsystem auf der Basis des in seinem Wirtsspektrum eingeschränkten und in hohem Maße attenuierten MVA-Virus etabliert, bei dem Fremd-DNA-Sequenzen an einem Ort von Deletion III innerhalb des MVA-Genoms oder innerhalb des TK-Genes eingefügt werden (Sutter, G. und Moss, B. (1995) Dev. Biol. Stand. Basel, Karger 84, 195-200 und US-Patent 5 185 146). Beruhend auf Langzeit-Serienpassage in Hühnerembryo-Fibroblasten (chicken embryo fibroblasts = CEF) kann MVA in CEF sehr effizient vermehrt werden, es hat jedoch seine Fähigkeit, produktiv in menschlichen oder den meisten anderen Säugetier-Zellen zu wachsen, verloren (Meyer, H., Sutter, G. und Mayr A. (1991) J. Gen. Virol. 72, 1031-1038 und Sutter et al., J. Virol., Vol. 68, Nr. 7, 4109-4116 (1994)). Die virale Replikation in menschlichen Zellen wird spät in der Infektion blockiert, wodurch der Zusammenbau zu reifen infektiösen Virionen verhindert wird. Nichts desto weniger ist MVA zur Expression viraler und rekombinanter Gene auf einem hohen Niveau sogar in nicht permissiven Zellen in der Lage und kann als ein effizienter und außergewöhnlich sicherer Expressionsvektor dienen (Sutter, G. und Moss, B. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10 847-10 851).
- Es hat sich in Tiermodellen herausgestellt, daß Test-Vakzinen auf Grundlage von rekombinantem MVA gegen eine Vielzahl von infektiösen Mitteln, einschließlich Influenzavirus, Immundefizienzvirus und Plasmodium-Parasiten immunogen und/oder protektiv sind. Darüber hinaus wurde die potentielle Brauchbarkeit von rekombinantem MVA zur Krebstherapie in mehreren Tumormodellsystemen etabliert (Moss et al. 1996, Adv Exp Med Biol 397: 7; Drexler et al. 1999, Cancer Res 59: 4955). Interessanterweise induzierten rekombinante MVA- Vakzine gleiche oder bessere Immunreaktionen auf Ziel-Antigene und wurden durch eine vorexistierende Vacciniavirus-spezifische Immunität wesentlich weniger beeinträchtigt, wenn sie mit replikationsfähigen Vacciniavirus-Vektoren verglichen wurden (Ramirez et al. 2000, J. Virol 74: 7651). Gegenwärtig kann MVA als der Vacciniavirus-Stamm der Wahl zur Vektorentwicklung betrachtet werden. Mehrere rekombinante MVA-Vakzine sind bereits unter klinischer Erforschung in der Tumorimmuntherapie und in der Prophylaxe der Infektion mit dem humanen Immundefizienzvirus.
- Das MVA-Genom enthält mehrere offene Leseraster (open reading frames = ORFs), die für virale Regulatorfaktoren kodieren (Antoine et al. 1998, Virology 244: 365). Einer von diesen ist MVA ORF 050L (Antoine et al. 1998, Virology 244: 365), der ebenfalls als VV-Gen E3L (Goebel et al. 1990, Virology 179: 247) bekannt ist. Das virale Protein E3L ist einer der wichtigsten Interferon- (IFN) Resistenzfaktoren, der durch VV kodiert wird (Smith et al. 1998, Sem. Virol. 8: 409). Es wurde gezeigt, daß es dsRNA bindet und die Aktivierung sowohl von PKR als auch von 2'-5' Oligoadenylatsynthetase (2-5 A-S) hemmt (Chang et al. 1992, PNAS 89: 4825; Rivas et al. 1998; Virology 243: 406). Die E3L-Produktion wurde für die VV- Replikation in einer Reihe von Säugetierwirts-Zellen einschließlich menschlicher HeLa- Zellen als essentiell beschrieben, sie wurde jedoch als für die Virus-Vermehrung in CEF nicht essentiell befunden (Beattie et al. 1996, Virus Genes 12: 89; Chang et al. 1995, J. Virol. 69: 6605).
- Um die Verwendung von MVA weiter auszunutzen wurde ein neuer Weg zur Erzeugung von rekombinantem MVA durch Einführung von Fremdgenen durch DNA-Rekombination in den MVA-Stamm des Vacciniavirus gesucht. Zur Erzeugung von rekombinantem MVA basieren bisher etablierte Strategien auf der genomischen Co-Insertion von selektierbaren und nichtselektierbaren Markergenen, z. B. die E. coli gpt und lacZ, oder Vacciniavirus K1L- Gensequenzen (Sutter, G. und Moss, B. 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10 847-10 851; Staib, C. et al. 2000, Biotechniques, 28: 1137-1148). Die Einführung dieser heterologen Marker in das MVA-Genom verbessert die Isolierung von klonierten rekombinanten Viren signifikant. Jedoch existiert während des Klonier-Verfahrens ein Bedarf nach einer Ergänzung von selektiven oder chromogenen Mitteln, wie beispielsweise dem mutagenen Mittel Mycophenolsäure oder X-Gal/DMFA und/oder das Erfordernis nach selektiven Wirtszellen. Weiterhin ist die Aufrechterhaltung bzw. Beibehaltung von zusätzlichen Fremdgensequenzen für Vektor-Viren nicht erwünscht, die in klinischen Anwendungen verwendet werden sollen und weitere gentechnische Eingriffe in das Virus-Genom sind notwendig, um unerwünschte Marker zu entfernen (Drexler et al. 1999, Cancer Res 59: 4955; Staib, C. et al. 2000, Biotechniques, 28: 1137-1148).
- Es ist deswegen die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die oben erwähnten Nachteile zu vermeiden und ein verbessertes Verfahren zur Erzeugung von rekombinanten MVA bereitzustellen. Weil es nicht die Absicht war, das Genom des MVA-Virus zu verändern, war es notwendig, ein Verfahren zu verwenden, das dieses Erfordernis erfüllt.
- Dies wird durch die Merkmale der unabhängigen Ansprüche erreicht. Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind in den abhängigen Ansprüchen dargelegt.
- Erfindungsgemäß wird eine neue MVA-Knock-Out-Mutante bereitgestellt, die dadurch gekennzeichnet ist, daß das MVA ORF 050L-Gen oder funktionelle Teile hiervon im viralen Genom inaktiviert wurden.
- Funktionelle Teile des ORF 050L schließen beispielsweise die kodierenden Sequenzen der carboxyterminalen dsRNA-Bindungsdomäne des E3L-Proteins (Chang & Jacobs 1993, Virology 194: 537) oder die aminoterminale Domäne des E3L-Proteins ein, die Sequenzähnlichkeiten mit zellulären Interferon-Reaktions-Proteinen aufweisen, Z-DNA binden kann und für die E3L-Funktion in vivo erforderlich ist (Brandt & Jacobs 2001, J. Virol. 75: 850).
- Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wurde das MVA ORF 050L-Gen oder ein funktioneller Teil hiervon durch Deletion aus dem Virusgenom inaktiviert.
- Alternativ kann eine rekombinantes MVA, das eine fehlerhafte E3L-Funktion aufweist, durch Sequenz-Mutagenese, beispielsweise Insertionsmutagenese erzeugt werden, was zur Inaktivierung der Synthese des funktionellen E3L-Protein durch Rasterverschiebungs-Einführung (frame-shift-introduction) oder durch spezifische Hemmung der E3L-Gentranskription führen kann. Das rekombinante MVA kann in vorteilhafter Weise bei einem Verfahren zur Einführung von Fremdgenen und zur anschließenden Selektion transfizierter Stämme verwendet werden, d. h. in einem Verfahren zur Erzeugung von rekombinantem MVA.
- Unter Verwendung einer kürzlich etablierten Methodologie der vorübergehenden Wirtsspektrum-Selektion wurde durch aufeinanderfolgendes Klonieren von gentechnisch veränderten Viren in Kaninchen RK-13 und Hamster BHK-21 Zellen (Staib et al. 2000, Biotechniques 28: 1137) mutierte MVA erzeugt, bei denen die E3L-kodierenden Sequenzen aus dem viralen Genom deletiert wurden (MVA-ΔE3L). Eine Western-Blot-Analyse der viralen Proteine, die während der Infektion von BHK-21 Zellen durchgeführt wurde, zeigte, daß die Viren nicht dazu in der Lage waren, E3L-Protein zu erzeugen. Wenn sie bezüglich der Wachstumskapazität in BHK-21 Zellen verglichen wurden, replizierten sich MVA-ΔE3L genauso effizient wie ursprünglich nicht mutierte MVA F6 (Fig. 1).
- Wenn die Erfinder das Viruswachstum in CEF, dem bevorzugten Zellkultur-System zur MVA-Vermehrung, testeten, hat sich MVA-ΔE3L überraschender Weise als nicht dazu in der Lage herausgestellt, sich produktiv zu replizieren (Fig. 2). Diese Erkenntnis war insbesondere deswegen überraschend, weil früher beschrieben wurde, dass die Deletion von E3L aus VV-Genomen die Virus-Replikation in CEF nicht beeinflusst (Beattie et al. 1996, Virus Genes 12: 89; Chang et al. 1995, J. Virol. 69: 6605).
- Die genaue Reinsertion der E3L-kodierenden Sequenz in das Genom von MVA-ΔE3L stellte die Wachstumskapazität des Virus auf CEF wieder her, was revertante bzw. rückmutierte Viren MVA-ΔE3L-Rev (Fig. 1, 2) zur Folge hatte. Diese Daten bestätigten, daß die E3L- Funktion essentiell war, um die Bildung einer MVA-Nachkommenschaft in CEF zu ermöglichen. Darüber hinaus erzeugt das Klonieren der E3L-Gensequenzen in MVA- Plasmidvektoren und die Transfektion der letzteren in MVA-ΔE3L infizierte BHK-21 Zellen rekombinantes MVA, das direkt durch Wachstumsselektion auf CEF selektiert werden konnte.
- Ausgehend von dieser überraschenden Erkenntnis wurde ein Verfahren entwickelt, in dem das mutierte MVA-ΔE3L Virus als essentielles Werkzeug zur schnellen und effizienten Erzeugung von rekombinantem MVA zur Verwendung als Expressions-Vektor oder Vakzine dient.
- Besondere Vorteile bestehen darin, daß diese strenge Wachstumsselektion von rekombinantem MVA (i) auf CEF - einer wohl etablierten Gewebskultur, die zur Erzeugung von MVA- Vakzinen zur klinischen Verwendung geeignet ist, durchgeführt werden kann und (ii) auf einer einfachen Wiederherstellung des ursprünglich bereits gut charakterisierten MVA- Genotyps basiert.
- Das Grundprinzip, das der Erfindung zugrunde liegt ist, daß, so lange MVA auf CEF ohne Einführung der geeigneten DNA-Sequenzen (E3L kodierende Sequenzen und wahlweise weitere DNA-Sequenzen, die beispielsweise für heterologe Proteine kodieren) eine Replikation nicht eintritt. Deswegen ist das vorliegende Verfahren/ die vorliegende MVA-Knock-Out- Mutante zur Selektion von rekombinantem MVA geeignet und dient daher als ein Werkzeug zur effektiven Erzeugung von rekombinantem MVA.
- Wie hierin verwendet bedeutet der Begriff "rekombinantes MVA" solche MVA, die gentechnisch verändert wurden, beispielsweise durch DNA-Rekombinationstechniken und die zur Verwendung als eine Vakzine oder als Expressions-Vektor vorgesehen sind.
- Gemäß der vorliegenden Erfindung können die rekombinanten MVA-Vacciniaviren wie folgt hergestellt werden:
Ein DNA-Konstrukt, das eine DNA-Sequenz enthält, die für ein E3L-Protein oder ein E3Labgeleitetes Polypeptid kodiert und eine DNA-Sequenz enthält, die für ein fremdes Polypeptid kodiert, wobei beide durch DNA-Sequenzen flankiert sind, die einen nicht essentiellen Ort, beispielsweise eine natürlich vorkommende Deletion, beispielsweise Deletion III, innerhalb des MVA-Genoms flankieren, wird in Zellen, vorzugsweise eukaryontische Zellen eingeführt. Bevorzugte eukaryontische Zellen sind BHK-21 (ATCC CCL-10), BSC-1 (ATCC CCL-26), CV-1 (ECACC 87032605) oder MA104 (ECACC 85102918) Zellen, die produktiv mit MVA-ΔE3L infiziert wurden, um eine homologe Rekombination zu ermöglichen. Wenn das DNA-Konstrukt einmal in die eukaryontische Zelle eingebracht ist und die E3L kodierende DNA und Fremd-DNA mit der Virus-DNA rekombiniert wurde ist es möglich, das erwünschte rekombinante Vacciniavirus-MVA nach einer Passage in Zellen zu isolieren, die die E3L-Funktion zur Unterstützung des Viruswachstums erfordern, beispielsweise in CEF Zellen. Das Klonieren der rekombinanten Viren ist in einer als Plaque-Reinigung bekannten Weise möglich (vergleiche Nakano et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 1593-1596 [1982], Franke et al., Mol. Cell. Biol. 1918-1924 [1985], Chakrabarti et al., Mol. Cell. Biol. 3403-3409 [1985], Fathi et al., Virology 97-105 [1986]. - Das einzufügende DNA-Konstrukt kann linear oder ringförmig sein. Eine ringförmige DNA wird bevorzugt verwendet. Es wird besonders bevorzugt, ein Plasmid zu verwenden.
- Das DNA-Konstrukt kann Sequenzen enthalten, die die linke und die rechte Seite einer nicht essentiellen Stelle flankieren, beispielsweise die Seite der Deletion III innerhalb des MVA- Genoms (Sutter, G. und Moss, B. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10847-10851).
- Die Fremd-DNA-Sequenz kann zwischen den Sequenzen eingefügt werden, die die nicht essentielle Stelle flankieren, beispielsweise die natürlich vorkommende Deletion.
- Die fremde DNA-Sequenz kann ein Gen sein, das für ein therapeutisches Polypeptid, beispielsweise t-PA oder Interferon oder für ein pathogenes Mittel kodiert. Unter pathogenen Mitteln sind Viren, Bakterien und Parasiten zu verstehen, die eine Krankheit verursachen können, ebenso wie Tumorzellen, die sich unkontrolliert in einem Organismus vermehren und somit zu einem pathologischen Wachstum führen können. Beispiele derartiger pathogener Mittel sind in Davis, B. D. et al., (microbiology, 3. Ausgabe, Harper International Edition) beschrieben. Bevorzugte Gene von pathogenen Mitteln sind diejenigen von Influenza-Viren oder Masern und von Respiratoy-Syncytial-Viren, von Dengue-Viren, von humanen Immundefizienzviren, beispielsweise HIV I und HIV II, von humanen Hepatitis-Viren, beispielsweise HCV und HBV, von Herpes-Viren, von Papilloma-Viren, vom Malariaparasiten Plasmodium falciparum und von den Tuberkulose verursachenden Mycobakterien.
- Bevorzugte Gene, die Tumor-assoziierte Antigene kodieren, sind diejenigen von Melanomassoziierten Differenzierungs-Antigenen, beispielsweise Tyrosinase, Tyrosinase-verwandte Proteine 1 und 2, von Cancer-Testes-Antigenen bzw. Tumor-Hoden-Antigenen, beispielsweise MAGE-1, -2, -3 und BAGE, von nicht mutierten Shared Antigenen bzw. Antigenen, die von meheren Tumortypen geteilt werden, die auf Tumoren überexprimiert werden, beispielsweise Her-2/neu, MUC-1 und p53.
- Damit die Fremd-DNA-Sequenz oder das Gen exprimiert werden kann ist es notwendig, daß Regulatorsequenzen, die zur Transkription des Gens erforderlich sind, auf der DNA vorliegen. Derartige Regulatorsequenzen (als Promotoren bezeichnet) sind dem Fachmann bekannt, beispielsweise diejenigen des Vaccinia 11 kDa-Gens, wie sie in der EP-A-198 328 beschrieben sind und wie beispielsweise diejenigen des 7,5 kDa-Gens (EP-A-110 385).
- Das DNA-Konstrukt kann in die Zellen durch Transfektion, beispielsweise mittels einer Kalziumphosphat-Ausfällung (Graham et al., Virol. 52, 456-467 [1973]; Wigler et al., Cell 777-785 [1979] mittels Elektroporation (Neumann et al., EMBO J. 1, 841-845 [1982]), durch Mikroinjektion (Graessmann et al., Meth. Enzymology 101, 482-492 (1983)), mittels Liposomen (Straubinger et al., Methods in Enzymology 101, 512-527 (1983)), mittels Sphäroblasten (Schaffner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 2163-2167 (1980)) oder durch andere Verfahren eingebracht werden, die dem Fachmann bekannt sind. Die Transfektion mittels einer Kalziumphosphat-Ausfällung wird vorzugsweise angewendet.
- Um Vaccine herzustellen, werden die gemäß der vorliegenden Erfindung erzeugten MVA- Vacciniaviren in eine physiologisch akzeptable Form umgewandelt. Dies kann auf Grundlage der vieljährigen Erfahrung in der Zubereitung von Vakzinen, die zur Impfung gegen Pocken verwendet werden, durchgeführt werden (Kaplan, Br. Med. Bull. 25, 131-135 [1969]). Typischerweise werden ungefähr 106-107 Teilchen des rekombinanten MVA in 100 ml Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS) in Gegenwart von 2% Pepton und 1% menschlichen Albumin in einer Ampulle gefriergetrocknet, vorzugsweise in einer Glasampulle. Das Lyophilisat kann Füllmittel bzw. Verdünnungsmittel (wie beispielsweise Mannitol, Dextran, Zucker, Glycin, Laktose oder Polyvinylpyrrolidon) oder andere Hilfsmittel (beispielsweise Antioxidanzien, Stabilisatoren etc.) enthalten, die zur parenteralen Verabreichung geeignet sind. Die Glasampulle wird dann verschlossen bzw. versiegelt und kann vorzugsweise bei Temperaturen unterhalb -20°C für mehrere Monate aufbewahrt werden.
- Zur Vakzinierung kann das Lyophilisat in 0,1 bis 0,2 ml einer wäßrigen Lösung, vorzugsweise physiologischer Salzlösung, gelöst und parenteral verabreicht werden, beispielsweise durch intradermale Inokulation. Die erfindungsgemäße Vakzine wird vorzugsweise intrakutan injiziert. Ein leichtes Anschwellen und eine Rötung und manchmal auch ein Juckreiz kann an der Injektionsstelle auftreten (Stickl et al., siehe oben). Der Verabreichungsweg, die Dosis und die Anzahl der Verabreichungen kann vom Fachmann in einer bekannten Weise optimiert werden. Wo dies angebracht ist, ist es zweckdienlich, die Vakzine mehrere Male über eine verlängerte Zeitspanne hinweg zu verabreichen, um ein hohes Niveau von Immunreaktionen gegen das Fremdantigen zu erzielen.
- Als Zusammenfassung umfaßt das Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Herstellung von rekombinantem MVA die folgenden Schritte: Infizieren der Wirtszellen wie oben beschrieben mit dem rekombinanten MVA, Transfizieren der Wirtszellen mit einem DNA- Vektorkonstrukt der vorliegenden Erfindung und Selektieren von wieder hergestelltem MVA durch Züchtung auf CEF-Zellen oder vom Hühnerembryo abgeleiteten LSCC-H32-Zellen (Roth & Kaaden 1985 Appl Environ Microbiol 49: 634-636) oder Vogelzellen (beispielsweise Wachtel-Fibroblasten QT6 oder QT35-Zellen).
- Fig. 1 zeigt das Mehrschritt-Wachstum von MVA-ΔE3L im Vergleich zu MVA- ΔE3LRev und Wildtyp MVA in BHK-Zellen.
- Fig. 2 zeigt das Mehrschritt-Wachstum von MVA-ΔE3L im Vergleich zu MVA- ΔE3LRev und Wildtyp MVA in CEF-Zellen.
- Fig. 3 zeigt die Konstruktion des rekombinanten Virus MVA-PsH5-gfp.
- Die folgende ausführliche Beschreibung soll zu einem besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung beitragen. Es soll jedoch nicht der Eindruck erweckt werden, daß die Erfindung auf den Gegenstand des Beispiels beschränkt ist.
- Das MVA-Virus ist ein stark attenuiertes Vacciniavirus, das durch Reihen-Passagen des ursprünglichen CVA-Stammes auf Hühnerembryo-Fibroblasten (CEF)-Kulturen erzeugt wurde. Bezüglich eines allgemeinen Überblicks der Geschichte der Herstellung, der Eigenschaften und der Verwendung des MVA-Stammes von Vaccinia wird auf die von Mayr et al. in Infection 3, 6-14 [1975] veröffentlichte Zusammenfassung Bezug genommen. In Folge der Anpassung an CEF ist das Wachstum des MVA-Virus auf anderen Zellsystemen in hohem Maße eingeschränkt. Ausnahmsweise fördern Nierenzellen vom Babyhamster (BHK-21), eine wohl charakterisierte, einfach zu erhaltende Zelllinie, das MVA-Wachstum und weisen eine eben solche Expressionsfähigkeit von rekombinanten Genen wie das hoch effiziente CEF auf und wurden zur standardisierten MVA-Vermehrung während der Entwicklung von Expressions- Vektoren und rekombinanten Lebendimpfstoffen- bzw. Vakzinen empfohlen (Drexler et al., 1998, J. Gen. Virol., 79, 347-352).
- Das MVA-Virus wurde normalerweise auf CEF-Zellen gezüchtet, die Wirtszelle, an die es angepaßt wurde. Um die CEF-Zellen herzustellen wurden 11 Tage alte Embryonen aus inkubierten bzw. bebrüteten Hühnereiern isoliert, die Extremitäten wurden entfernt und die Embryos in kleine Stücke geschnitten und langsam in einer Lösung, die aus 25% Trypsin bei Raumtemperatur bestand, für 2 Stunden dissoziiert. Die sich ergebende Zellsuspension wurde mit einem Volumen von Medium I (MEM Eagle, beispielsweise erhältlich bei Gibco, Basel, Schweiz; Bestell-Nr. 072-1500), das 5% fötales Kalbsserum (fetal calf serum = FCS), Penicillin (100 Einheiten/ml), Streptomycin (100 mg/ml) und 2 mM Glutamin enthielt verdünnt und durch ein Zellsieb (beispielsweise erhältlich von der Technomara AG; Zürich, Schweiz, Bestell-Nr. Bellco 1985, 150 mesh) filtriert und die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 2000 UpM in einer Tischzentrifuge (Hermle KG, D-7209 Gosheim, BRD) bei Raumtemperatur 5 Minuten lang sedimentiert. Das Zellsediment wurde in einem Viertel des ursprünglichen Volumens von Medium I aufgenommen und die CEF-Zellen, die auf diese Weise gewonnen wurden, wurden auf Zellkulturschalen ausgebreitet. Man ließ sie in Medium I in einem CO2-Inkubator bei 37°C 1-2 Tage lang wachsen, abhängig von der erwünschten Zelldichte und sie wurden zur Infektion entweder direkt oder nach 1-2 weiteren Zellpassagen verwendet. Eine klare Beschreibung der Herstellung von Primärkulturen ist im Buch von R. I. Freshney, "Culture of animal cell", Alan R. Liss Verlag, New York [1983] Kapitel 11, Seite 99 ff. zu finden.
- Das MVA-Δ3L wird in Babyhamsternieren BHK-21-Zellen (American Type Culture Collection ATCC CCL-10) routinemäßig vermehrt, die im Minimalmedium (minimal essential medium = MEM), das mit 10% fötalem Kalbsserum (FCS) ergänzt war, gezüchtet wurden. BHK-21-Zellen wurden bei 37°C in einer Atmosphäre von angefeuchteter Luft-5% CO2 gehalten.
- Die Viren wurden zur Infektion wie folgt verwendet. Die Zellen wurden in 175 cm2 Zellkultur-Flaschen gezüchtet. Bei 80-90%-iger Konfluenz wurde das Medium entfernt und die Zelle für eine Stunde mit einer MVA-Virussuspension (0,01 infektiöse Partikel (= pbe) pro Zelle, 0,01 ml/cm2) in Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS/Dulbecco, beispielsweise Animed AG, Muttenz, Schweiz, Bestell-Nr. 23.100.10) inkubiert. Darauf wurde Medium zugesetzt (0,2 ml/cm2) und die Flaschen wurden bei 37°C 2-3 Tage lang inkubiert, bis ungefähr 80% der Zellen abgerundet waren. Die Viruslysate wurden mit den Zellen und Medium ohne Behandlung in den Zellkultur-Flaschen bei -30°C vor der weiteren Verarbeitung (Reinigung etc.) aufbewahrt.
- Die Reinigungsschritte, die zur Gewinnung einer Virus-Zubereitung unternommen wurden, die so rein wie möglich und frei von Bestandteilen ist, die für die Wirtszelle spezifisch sind, waren für die MVA- und WR-Viren identisch (Joklik, Virology 18, 9-18 [1962], Zwartouw et al., J. gen. Microbiol. 29, 523-529 [1962]. Die Zellkulturen, die infiziert und dann bei -30°C aufbewahrt wurden, wurden aufgetaut, die restlichen Zellen wurden abgeschüttelt oder vom Kunststoffsubstrat abgeschabt und die Zellen und Viren wurden aus dem Medium durch Zentrifugation entfernt (Sorvall centrigue, GSA rotor, 1 Stunde bei 5000 UpM und 10°C). Das Sediment, zusammengesetzt aus Virus- und Zell-Teilchen wurde einmal in PBS (10-20 mal das Volumen des Sedimentes) suspendiert und die Suspension wurde wie oben zentrifugiert. Das neue Sediment wurden in 10 mal dem Volumen von RSB-Puffer (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM KCl, 1 mM MgCl2) suspendiert und die Suspension wurde kurz mit Ultraschall behandelt (Labsonic 1510 ausgestattet mit einer Spitze von 4 mm Durchmesser, erhältlich von Bender und Hobein, Zürich, Schweiz; 2 mal 10 Sekunden bei 60 Watt und Raumtemperatur) um verbleibende noch intakte Zellen zu desintegrieren und um die Virusteilchen aus den Zellmembranen freizusetzen. Die Zellkerne und die größeren Zellbruchstücke wurden in der nachfolgenden kurzen Zentrifugation der Suspension entfernt (Sorvall GSA rotor erhältlich von DuPont Co., D-6353 Bad Nauheim, BRD; 3 Minuten bei 3000 UpM und 10°C). Das Sediment wurde noch einmal in RSB-Puffer suspendiert, mit Ultraschall behandelt und wie oben beschrieben zentrifugiert. Die gesammelten Überstände, die freie Virusteilchen enthielten, wurden vereinigt und über ein Kissen geschichtet, das aus 10 ml 35% Saccharose in 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 zusammengesetzt war und in einem Kontron TST 28.38/17 Rotor zentrifugiert (Kontron Instrumente, Zürich, Schweiz; entspricht einem Beckmann SW 27 Rotor) 90 Minuten lang mit 14 000 UpM bei 10°C). Der Überstand wurde dekantiert und das Sediment, das die Virusteilchen enthielt, wurde in 10 ml 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 aufgenommen, durch kurze Behandlung mit Ultraschall homogenisiert (2 mal 10 Sekunden bei Raumtemperatur, Gerät wie oben beschrieben) und auf einen abgestuften Gradienten zur weiteren Reinigung aufgebracht. Die Stufen des Gradienten waren jeweils auf 5 ml Saccharose in 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 (Saccharosekonzentrations-Stufen: 20%, 25%, 30%, 35% und 40%) zusammengesetzt. Der Gradient wurde in einem Kontron TST 28.38/17 Rotor bei 14 000 UpM 10°C für 35 Minuten zentrifugiert. Nach dieser Zentrifugation waren mehrere getrennte Zonen sichtbar, die Virusteilchen enthielten, und zwar in der Region des Gradienten zwischen 30% und 40% Saccharose. Dieser Bereich wurde vom Gradienten (10 ml) abgesaugt bzw. abgezogen, die Saccharoselösung wurde mit PBS (20 ml) verdünnt und die Virusteilchen wurden daraus durch Zentrifugation (Kontron TST 28.38/17 Rotor, 90 Minuten bei 14 000 UpM, 10°C) sedimentiert. Das Sediment, das nunmehr größtenteils aus reinen Virusteilchen bestand, wurde in PBS in einer derartigen Weise aufgenommen, daß die Viruskonzentrationen einem Durchschnitt von 1-5 × 109 PBE/ml entsprachen. Die gereinigte Virusstammlösung wurde entweder direkt verwendet oder mit PBS für nachfolgende Experimente verdünnt.
- Genomische MVA DNA-Sequenzen, die das E3L-Gen flankieren, wurden durch Polymerase- Kettenreaktion unter Verwendung von MVA DNA (kloniertes Isolat F6, 582ste Passage auf CEF) als einer Matrize amplifiziert. Die Primer der stromaufwärts liegenden flankierenden Region von E3L waren
5'-ATATGATTGGGCCCACTAGCGGCACCGAAAAAGAATTCC-3' (ApaI-Ort unterstrichen) und
5'-GTCAATAGCGGCCGCAGACATTTTTAGAGAGAACTAAC-3 (NotI-Ort unterstrichen). Die Primer für die stromabwärts liegende Region waren
5'-TACATGAAACGCGTTCTATTGATGATAGTGACTATTTC-3' (MluI-Ort unterstrichen)
und 5'-GTTACGTCGGATCCAGATTCTGATTCTAGTTATC-3' (BamHI-Ort unterstrichen). - Die Konstrukte wurden mit ApaI/NotI oder MluI/BamHI geschnitten und in die entsprechenden Stellen des Plasmids pΔK1L eingefügt (Staib et al. 2000, Biotechniques, 28: 1137-1148), um das E3L Deletionsplasmid pΔE3L-K1L zu erzeugen.
- Das mutierte Virus MVA-ΔE3L wurde unter Verwendung einer kürzlich beschriebenen Methodologie erzeugt (Staib et al. 2000, Biotechniques, 28: 1137-1148). Kurz gesagt wurden einlagige Schichten bzw. Monolayers von 1 × 106 konfluenten bzw. zusammenfließenden BHK-21 Zellen, die in Gewebskultur-Platten mit 6-Wells bzw. Vertiefungen gezüchtet wurden (Costar, Corning NY, USA) mit MVA bei einer Infektionsmultiplizität (Multiplicity of Infection = MOI) von 0,01 IE pro Zelle infiziert. 90 Minuten nach der Infektion der Zellen wurden diese mit 10 µg Plasmid pΔE3L-K1L DNA pro Well unter Verwendung von Kalziumphosphat transfiziert (CellPhect Transfection Kit, Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland), wie es vom Hersteller empfohlen wurde. 48 Stunden nach der Infektion wurden die Zellen geerntet, drei Mal gefriergetrocknet und in einem für einen cup geeignetes Ultraschallgerät (cup sonicator) (Sonopuls HC 200, Bandelin, Deutschland) homogenisiert. Zehnfache Reihenverdünnungen (10-1 bis 10-4) des geernteten Materials im Medium wurden dazu verwendet, subkonfluente Monolayers von RK-13 Zellen zu infizieren, die in Gewebskultur- Platten mit 6-Wells gezüchtet wurden. Nach 3 Tagen Inkubation bei 37°C wurden Sammelpunkte bzw. Foci von RK-13 Zellen, die mit mutierten MVA-ΔE3L infiziert wurden, durch Absaugen mit einer Luftverdrängungspipette in einem 20 µl Volumen aufgenommen, in Mikrozentrifugenröhrchen, die 500 µl Medium enthielten, übertragen und durch Gefriertrocknen und Ultrabeschallung für eine weitere Infektion von RK-13 Zell-Monolayers verarbeitet. Nach Elimination der gesamten Eltern-MVAs während eine Passage auf RK-13 Zellen, wurden zehnfache Reihenverdünnungen (10-1 bis 10-6) der rekombinanten Viren zur Infektion von subkonfluenten BHK-21 Zellen verwendet, die in Gewebskultur-Platten mit 6-Wells gezüchtet wurden (Costar, Corning NY, USA). Gut getrennte Foci von infizierten BHK-21 Zellen wurden zur Isolierung von K1L-negativen mutierten MVA-ΔE3L geerntet.
- Um die low-multiplicity-growth-Profile (Profile eines Wachstums mit geringer Multiplizität) zu bestimmen, wurde die Virusvermehrung nach dem Infizieren von CEF oder BHK-21 Zellen-Monolayers mit 0,05 infektiösen Einheiten (IE) MVA, MVA-ΔE3L oder MVA-ΔE3Lrev pro Zelle überwacht. Zusätzlich wurde ein Einschritt-Wachstum (one step growth) von MVA, MVA-ΔE3L und MVA-ΔE3LRev untersucht, indem Zellen bei einer Multiplicity of Infection von 5 IE untersucht wurden. Für alle Infektionsexperimente wurden konfluente Monolayers von einer Well aus Kulturplatten mit 6 Wells pro Zeitpunkt verwendet. Nach Virusadsorption für 60 Minuten bei 37°C für ein Wachstum mit geringer Multiplizität und für die Einschritt- Wachstumsexperimente wurde das Inoculum entfernt. Die infizierten Zellen wurden zwei Mal mit RPMI 1640 gewaschen und mit frischen RPMI 1640 Medium, das 10% FCS enthielt, bei 37°C in einer 5% CO2 Atmosphäre inkubiert. Zu mehrfachen Zeitpunkten nach der Infektion (p.i.) wurden infizierte Zellen geerntet und das Virus durch Gefriertrocknen und kurze Beschallung freigesetzt. Reihenverdünnungen der sich ergebenden Lysate wurden auf konfluenten BHK-21 Monolayers ausplattiert, die in 6-Well-Platten als Zweier-Wiederholungen gezüchtet wurden. Für ein Vacciniavirus-spezifisches Immunfärben von virusinfizierten Zellen wurden Medien 48 Stunden p.i. entfernt, die Zellen kurz in Aceton : Methanol fixiert (1 : 1, 1 ml/Well). Nach Waschen und Blockieren in PBS-2% FCS wurden die Zellen 60 Minuten lang mit polyklonalem Kaninchen-Anti-Vaccinia-Antikörper (IgG Fraktion, Biogenesis Ltd, Poole, England, Katalog-Nr. 9503-2057, verdünnt 1 : 10.000 in PBS-3% FCS) inkubiert. Nach Waschen der Zellen mit PBS wurde Peroxidase-konjugierter polyklonaler Ziegen-Anti- Kaninchen-Antikörper (beispielsweise zweiter Antikörper Meerrettichperoxidase-konjugiert (IgG (H+L)), Katalog-Nr. 111-035-114; Dianova, Hamburg, Germany, dilution 1 : 1000 in PBS-3% FCS) zugesetzt und für 45 Minuten inkubiert. Nach Waschen in PBS wurden Antikörper-markierte Zellen mit Dianisidin (Sigma Nr. 09143)-Substrat-Lösung entwickelt, Foci gefärbter Zellen wurden gezählt und die Virustiter (IE/ml) wurden wie bei Vacciniavirus- Plaque-Assays berechnet.
- Um die Erzeugung von rekombinantem MVA unter Verwendung einer auf E3L basierenden Selektion zu ermöglichen, wurden neue Vektor-Plasmide auf Grundlage von pIII-Plasmid- Vektoren konstruiert, die die flankierenden MVA-Sequenzen (flank III-1 und flankIII-2) enthielten, um die präzise und zielgerichtete Einfügung rekombinanter DNA in den Ort der natürlich vorkommenden Deletion III innerhalb des MVA-Genomes zu ermöglichen (Sutter & Moss 1992, Staib et al. 2000). Um den Plasmid-Vektor pIII-E3-PsH5 zu erzeugen, wurde ein 627 bp DNA-Fragment, das die vollständige kodierende Sequenz des MVA-E3L-Gens unter Transkriptionskontrolle seiner authentischen Promotorsequenz enthielt, durch PCR hergestellt, mit Klenow behandelt und zwischen den flank III-1 und flank III-2 DNA-Sequenzen in Plasmid plW9 über den Restriktionsort BamHI (Wyatt, L. et al. 1996, Vaccine 14: 1451-1458) eingefügt. Ein 723-bp DNA-Bruchstück, das das offene Leseraster gfp enthielt, wurde aus pEGFP-N1 (CLONETECH Labaratories GmbH, Heidelberg, Deutschland) ausgeschnitten, indem die Restriktionsendonukleasen BamHI und NotI verwendet wurden, mit Klenow- Polymerase behandelt und in den Restriktionsort SmaI von pIII-E3-PsH5 eingefügt, um pIII- E3-PsH5-gfp zu erhalten.
- 3.4 Bildung und Isolation von rekombinanten MVA-PsH5-gfp
- Monolayers von 1 × 106 konfluenten BHK-21 Zellen, die in 6-Well Gewebskultur-Platten gezüchtet wurden (Costar, Corning NY, USA) wurden mit MVA-ΔE3L bei einer Multiplicity of Infection (MOI) von 0,01 IE pro Zelle infiziert. 90 Minuten nach der Infektion wurden die Zellen mit 10 µg pIII-E3-PsH5-gfp DNA pro Well unter Verwendung von Kalziumphosphat transfiziert (CellPhect Transfection Kit, Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland), wie vom Hersteller empfohlen. 48 Stunden nach Infektion wurden die Zellen geerntet, drei mal gefriergetrocknet und in einem Cup Sonicator homogenisiert (Sonopuls HD 200, Bandelin, Deutschland). Zehnfache Reihenverdünnungen (10-1 bis 10-4) des geernteten Materials im Medium wurden zum Infizieren von subkonfluenten Monolayers von CEF Zellen verwendet, die in Gewebskultur-Platten mit 6-Wells gezüchtet wurden. Nach drei Tagen Inkubation bei 37°C wurden die Foci von CEF-Zellen, die mit rekombinantem MVA inJiziert waren, bezüglich der GFP-Synthese überwacht und durch Ansaugen mit einer Luftverdrängungspipette in einem 20 µl Volumen aufgenommen, auf Mikrozentrifugen-Röhrchen übertragen, die 500 µl Medium enthielten, und durch Gefriertrocknen und Ultrabeschallung für eine weitere Infektion von CEF-Zell-Monolayers verarbeitet. Nach drei aufeinander folgenden Runden der Plaque-Reinigung in CEF-Zellen wurden die rekombinanten MVA-PsH5- gfp-Viren durch Infektion von CEF-Monolayers amplifiziert und die DNA wurde durch PCR untersucht, um die genetische Homogenität des Virusstammes zu bestätigen. SEQUENZPROTOKOLL
Claims (18)
1. MVA-Knock-Out-Mutante,
dadurch gekennzeichnet,
daß das MVA ORF 050L-Gen oder ein funktioneller Teil hiervon im Virusgenom inaktiviert
wurde.
2. MVA-Knock-Out-Mutante nach Anspruch 1,
bei der das MVA ORF 050L-Gen oder ein funktioneller Teil hiervon durch Deletion aus dem
Virusgenom inaktiviert wurde.
3. Wirtszelle,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Zelle mit dem MVA nach Anspruch 1 oder 2 infiziert wurde.
4. Wirtszelle nach Anspruch 3, die eine eukaryontische Zelle ist.
5. Eukaryontische Zelle nach Anspruch 4,
die eine BHK-21-Zelle, eine BS-C-1-Zelle, eine MA104-Zelle oder eine CV-1-Zelle ist.
6. DNA-Vektorkonstrukt, das Sequenzen umfaßt, die das MVA ORF 050L-Gen kodieren
oder für ein funktionell äquivalentes, von MVA ORF 050L abgeleitetes, Polypeptid kodieren.
7. DNA-Vektorkonstrukt nach Anspruch 6,
wobei das Konstrukt weiterhin DNA-Sequenzen umfaßt, die für ein Fremdprotein kodieren.
8. DNA-Vektorkonstrukt nach Anspruch 7,
wobei das Fremdantigen ein heterologes Protein ist, das aus der Gruppe stammt, die aus
therapeutischen Polypeptiden und pathogenen Mitteln besteht.
9. DNA-Vektorkonstrukt nach Anspruch 8,
wobei das therapeutische Polypeptid aus t-PA oder Interferon besteht.
10. DNA-Vektorkonstrukt nach Anspruch 9,
wobei das pathogene Mittel aus Viren, Bakterien, Protozoen und Parasiten ebenso wie aus
Tumorzellen oder Tumorzell-assoziierten Antigenen oder funktionellen Teilen hiervon besteht.
11. DNA-Vektorkonstrukt nach Anspruch 9,
wobei die Viren aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Influenza-Viren, Masern- und
Respiratory-Syncytial-Viren, Dengue-Viren, humanen Immundefizienz-Viren, menschlichen
Hepatitis-Viren, Herpes-Viren oder Papilloma-Viren besteht.
12. DNA-Vektorkonstrukt nach Anspruch 9,
wobei das Protozoon Plasmodium falciparum ist.
13. DNA-Vektorkonstrukt nach Anspruch 9,
wobei die Bakterien Tuberkulose verursachende Mycobakterien sind.
14. DNA-Vektorkonstrukt nach Anspruch 8,
wobei das Tumor-assoziierte Antigen aus Melanom-assoziierten Differenzierungs-Antigenen,
beispielsweise Tyrosinase, den Tyrosinase verwandten Proteinen 1 und 2, Cancer-Testes-
Antigenen, beispielsweise MAGE-1, -2, -3 und BAGE oder aus nicht mutierten Shared
Antigenen, die auf Tumoren überexprimiert werden, beispielsweise Her-2/neu, MUC-1 und p53
ausgewählt ist.
15. DNA-Vektorkonstrukt nach einem der Ansprüche 6 bis 14,
wobei das MVA ORF 050L und die Fremdprotein kodierenden Bereiche jeweils von DNA-
Sequenzen flankiert werden, die innerhalb des MVA-Genoms einen nicht essentiellen Ort
flankieren.
16. DNA-Vektor nach Anspruch 15,
wobei der nicht essentielle Ort der Ort der Deletion III im MVA-Genom ist.
17. DNA-Vektorkonstrukt nach einem der Ansprüche 6 bis 16,
das ein Plasmid ist.
18. Verfahren zur Erzeugung von rekombinantem MVA, das die folgenden Schritte umfasst:
- Infizieren der Wirtszellen nach einem der Ansprüche 3 bis 5 mit den rekombinanten
MVA nach Anspruch 1 oder 2,
- Transfizieren der Wirtszellen mit einem DNA-Vektorkonstrukt nach einem der
Ansprüche 6-17; und
- Selektieren wieder hergestellter MVAs durch Züchten auf CEF-Zellen oder auf von
Hühnerembryo abgeleiteten LSCC-H32-Zellen oder Vogel-Zellen, beispielsweise Wachtel-
Fibroblasten QT6 oder QT35-Zellen.
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