JP4406561B2 - ワクシニアウイルスmvaのe3lノックアウト変異体およびその使用 - Google Patents

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Description

本発明は、組換えMVAウイルスの作製に用いる変異MVAワクシニアウイルス、ならびにこれらの変異MVAウイルスを感染させた宿主細胞に関する。本発明はさらに、DNAベクター構築物、ならびに変異MVAウイルスとDNAベクター構築物とを用いて組換えMVAを作製する方法に関する。
ワクシニアウイルスは、ポックスウイルス科のオルトポックスウイルス属に属している。ワクシニアウイルスのある種の株は、天然痘に対して免疫化するための生ワクチンとして長年にわたって用いられている。株の例としては、英国のリスター研究所(Lister Institute)のElstree株がある。ワクチン接種を原因とした合併症(非特許文献1)の可能性があるため、また1980年にWHOにより天然痘は根絶されたとの宣言が出されたため、今日ではリスクが高い人のみが天然痘に対するワクチン接種を受けている。
ワクシニアウイルスは、外来抗原の生産および送達用のベクターとしても使用されている(非特許文献2)。この場合、DNA組換え技術によりワクシニアウイルスのゲノムに導入しようとする外来抗原をコードするDNA(遺伝子)を必要とする。仮にその遺伝子が、ウイルスのライフサイクルに必須でないウイルスDNAの部位に組み込まれた場合、新しく生産される組換えワクシニアウイルスが感染性となる可能性がある。すなわち、外来細胞に感染することにより組み込まれたDNA配列を発現することが可能である(特許文献1および2)。このようにして調製した組換えワクシニアウイルスは、一方では感染の予防のための生ワクチンとして、他方では真核細胞における異種タンパク質の生産のために用いることが可能である。
ワクシニアウイルスは、最も広範に評価がなされている生ベクター(live vector)の1つであり、組換えワクチンとしてのその使用を支持する特別な特徴を備えている。すなわち、このウイルスは非常に安定であり、安価に製造され、投与が容易で、多量の外来DNAを組み込むことが可能である。このウイルスは抗体と細胞毒性反応の両方を誘発させる利点を持ち、比較的自然な方法で免疫系に抗原を提示することを可能にし、多様な動物モデルにおいて感染性疾患に対する防護ベクターワクチンとしての使用が成功している。さらに、ワクシニアベクターは、組換えタンパク質の構造−機能相関を解析するため、液性および細胞性免疫応答の標的を決定するため、ならびに特定の疾患に対する防護に必要な免疫防御の種類を検討するための、極めて貴重な研究ツールである。
しかしながら、ワクシニアウイルスはヒトに対して感染性であり、実験室における発現ベクターとしてのその使用は、安全上の懸念および規制による影響を受けてきた。さらに、例えばヒトにおける新規な治療法または予防法のための組換えタンパク質または組換えウイルス粒子を作製するために、組換えワクシニアウイルスを将来適用する可能性は、組換えワクシニアベクターが増殖的に複製することが原因で閉ざされている。文献に記載されている組換えワクシニアウイルスの大部分は、ワクシニアウイルスのWestern Reserve(WR)株が基となっているが、この株は神経毒性が高いためヒトおよび動物における使用には不適であることが知られている(非特許文献3)。
VVの標準株の安全性に関する懸念に対しては、in vitroでの限られた複製能力およびin vivoでの無毒性を特徴とする高度に弱毒化されたウイルス株からワクシニアベクターを開発することにより対処されている。望ましくない副作用を回避するた
めに特別に培養されたウイルス株が長年にわたって知られている。したがって、ニワトリ胚線維芽細胞でワクシニアウイルスのAnkara株(CVA)を長期間連続して継代培養することにより、改変ワクシニアウイルスAnkara(MVA)を育成することが可能となっている(総説については、非特許文献4および特許文献3を参照)。MVAウイルスは、ブダペスト条約の要件に従って、CNCM(フランス国75724 パリ セデックス15 リュ ド ドクトゥール ルー 25(25,rue de Docteur Roux,75724 Paris Cedex 15)に所在のパスツール研究所(Institut Pasteur)、Collectione Nationale
de Cultures de Microorganisms)に、1987年12月15日に寄託番号I−721として寄託された。
野生型CVA株と比較してゲノム内の変化を調べるためにMVAウイルスの分析が行われ、6つの主要な欠失(欠失I、II、III、IV、VおよびVI)が同定されている(非特許文献5)。この改変ワクシニアウイルスAnkaraは低い毒力を有しているにすぎない。すなわち、ワクチン接種に用いた場合、副作用がないことになる。したがって、このウイルスは免疫不全状態の対象者への最初のワクチン接種に特に適している。MVA株の優れた特性は多くの臨床試験で実証されている(非特許文献6および7)。
最近、MVAゲノム内またはTK遺伝子内の欠失IIIの部位に挿入された外来DNA配列を有し、宿主域が制限され、高度に弱毒化されたMVAウイルスを用いた、新規なワクシニアウイルス・ベクター系が樹立された(非特許文献8ならびに特許文献4)。ニワトリ胚線維芽細胞(CEF)における長期連続継代培養により得られたMVAはCEFにおいて非常に効率良く増殖可能であるが、ヒトおよび他のほとんどの哺乳動物の細胞内では増殖的に生育する能力を失っている(非特許文献5および非特許文献9)。ヒト細胞におけるウイルス複製は感染後期に阻害され、成熟感染性ビリオンへのアセンブリが妨げられる。それにもかかわらず、MVAは、非許容細胞中でさえもウイルス遺伝子および組換え遺伝子を高レベルで発現することが可能であり、効率的で、例外的に安全な発現ベクターとしての役割を果たしうる(非特許文献10)。
動物モデルでは、組換えMVAを基にした候補ワクチンは、インフルエンザウイルス、免疫不全ウイルスおよびプラスモディウム寄生体を含む種々の感染性因子に対して免疫原性かつ/または防御性であることが見いだされている。さらに、癌の治療における組換えMVAの潜在的有用性がいくつかの腫瘍モデル系において立証された(非特許文献11および12)。興味深いことに、組換えMVAは、複製能力のあるワクシニアウイルス・ベクターと比較して、標的抗原に対して同等またはより良好な免疫応答を誘導し、先在性のワクシニアウイルス特異的免疫によって影響されることが著しく少ない(非特許文献13)。現在のところ、MVAはベクター開発に最適のワクシニアウイルス株であると考えられる。いくつかの組換えMVAワクチンが、既に腫瘍の免疫療法およびヒト免疫不全ウイルス感染の予防における臨床研究に供されている。
MVAゲノムは、ウイルス調節因子をコードする数個の読み取り枠(ORF)を含んでいる(非特許文献14)。それらのうちの1つは、MVA ORF 050Lであり(非特許文献14)、VV遺伝子E3Lとしても知られている(非特許文献15)。ウイルスタンパク質E3Lは、VVによりコードされる重要なインターフェロン(IFN)耐性因子の1つである(非特許文献16)。このタンパク質は、dsRNAに結合して、PKRおよび2’−5’オリゴアデニル酸シンテターゼ(2−5A−S)のいずれの活性化も阻害することが示されている(非特許文献17および18)。E3Lの産生は、ヒトHeLa細胞を含む各種哺乳動物宿主細胞におけるVVの複製に必須であるとされているが、CEFにおけるウイルスの増殖には必須でないことが見いだされた(非特許文献19および20)。
MVAの用途をさらに開発するために、DNA組換えによりワクシニアウイルスのMVA株に外来遺伝子を導入することによって組換えMVAを得る新たな方法を探求した。組換えMVAを得るために予め確立した戦略は、選択および非選択マーカー遺伝子、例えば、大腸菌のgptおよびlacZまたはワクシニアウイルスのK1L遺伝子配列を、ゲノムへ同時挿入することに基づいている(非特許文献10および21)。MVAゲノムへのこれらの異種マーカーの導入により、クローン化組換えウイルスの単離が非常に容易になる。しかし、クローニング操作中に、突然変異誘発因子であるミコフェノール酸またはX−Gal/DMFAのような選択剤または色素原物質を補足する必要があり、および/または選択的宿主細胞を用いる必要がある。さらに、付加された外来遺伝子配列が維持されることは、臨床適用に用いられるベクターウイルスには望ましいことではなく、ウイルスゲノムにさらに遺伝子工学的処理を施して望ましくないマーカーを除去する必要がある(非特許文献12および21)。
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したがって、上記の不都合を回避し、組換えMVAを作製する改善された方法を提供することが本発明の目的である。MVAウイルスのゲノムを変化させない意図であったので、この要件に適合する方法を使用する必要があった。
これは、特許請求の範囲の独立請求項の特徴により達成される。本発明の好ましい実施形態は、従属請求項に示されている。
本発明によれば、MVA ORF 050L遺伝子またはその機能的部分(機能を有する部分)がウイルスゲノムにおいて不活性化されていることを特徴とする新規なMVAノックアウト変異体が提供される。
前記ORF 050Lの機能的部分としては、例えば、E3Lタンパク質のカルボキシ末端dsRNA結合ドメイン(チャンおよびヤコブス(Chang & Jacobs)、1993年、Virology、第194巻、537ページ)、または、細胞インターフェロン応答タンパク質との配列類似性を有し、Z−DNAに結合可能であり、in vivoでE3Lの機能に必要である、E3Lタンパク質のアミノ末端ドメイン(ブラントおよびヤコブス(Brandt & Jacobs)、2001年、J.Virol.第75巻、850ページ)などがある。したがって本明細書で用いる場合、ORF 050Lの機能的部分とは、E3Lタンパク質のフラグメントであって、MVAゲノム内で不活性化することによりCEF細胞において変異MVAが複製しなくなるようなフラグメントであると定義する。
好ましい実施形態によれば、MVA ORF 050L遺伝子またはその機能的部分は、ウイルスゲノムから欠失させることにより不活性化されている。
代替例として、E3L機能に欠陥のある組換えMVAを、配列突然変異誘発、例えば挿入突然変異誘発によりフレームシフトを導入して機能的E3Lタンパク質合成の不活性化をもたらすか、またはE3L遺伝子の転写を特異的に阻害することにより、作製してもよい。この組換えMVAは、外来遺伝子を導入してその後トランスフェクションされた株を選択する方法、すなわち組換えMVAを作製する方法において用いるのに好都合である。
人為操作したウイルスをウサギRK−13細胞およびハムスターBHK−21細胞において連続クローニングすることによる、一時的に宿主域を選択する最近確立された方法(スタイブら(Staib et al.)、2000年、Biotecniques、第
28巻、1137ページ)を用いて、ウイルスゲノムからE3Lコード配列が欠失した変異MVA(MVA−ΔE3L)を作製した。BHK−21細胞の感染時に実施したウイルスタンパク質のウエスタンブロット分析により、前記ウイルスがE3Lタンパク質を産生できないことが示された。BHK−21細胞中の増殖能力について比較したところ、MVA−ΔE3Lは元の非変異MVA F6と同程度の効率で複製した(図2D)。
驚くべきことに、発明者らがMVA増殖用の好ましい細胞培養系であるCEF中でウイルスの増殖を試験したとき、MVA−ΔE3Lは生産的に複製することが不可能であることが認められた(図2)。この所見は特に驚くべきことであった、というのも以前はVVゲノムからE3Lを欠失させてもCEFにおけるウイルスの複製には影響を及ぼさないとされていたからである(ベアッティーら(Beattie et al.)1996年、Virus Genes、第12巻、89ページ;チャンら(Chang et al.)1995年、J.Virol.第69巻、6605ページ)。
MVA−ΔE3LのゲノムにE3Lをコードする配列を正確に再挿入することにより、CEFにおけるウイルスの増殖能が回復し、復帰突然変異ウイルスMVA−ΔE3L−Revが生じた(図2C、2D)。このデータは、CEFにおけるMVAの子孫形成にE3Lの機能が必須であることを裏付けた。さらに、MVAプラスミドベクターへE3L遺伝子配列をクローニングし、該プラスミドベクターをMVA−ΔE3Lに感染させたBHK−21細胞へトランスフェクションすることにより、CEFでの増殖選択により直接単離可能な組換えMVAが生成された。
この驚くべき所見から出発し、発現ベクターまたはワクチンとして使用するための組換えMVAを迅速かつ効率よく生産するための必須ツールとして、変異ウイルスMVA−ΔE3Lが役割を果たすことを特徴とする方法を開発した。
とりわけ有利な点は、組換えMVAのこのような厳密な増殖選択を(i)臨床用MVAワクチンの生産に適した十分確立された組織培養であるCEFで実施可能なこと、および(ii)既に十分に特性解析されている本来のMVA遺伝子型を単純に復元することに基づいていることである。
本発明の基礎をなす原理は、MVAがCEF上に存在し、適切なDNA配列(E3Lコード配列および任意選択で(例えば異種タンパク質をコードする)さらなるDNA配列)が導入されない限りは、複製が起こらないということである。したがって、本方法/MVAノックアウト変異体は、組換えMVAの選択に適しており、したがって組換えMVAを効率よく作製するためのツールとしての機能を果たす。
本明細書で用いているように、「組換えMVA」という用語は、例えばDNA組換え技術により遺伝的に改変されており、ワクチンまたは発現ベクターとしての使用に供されるMVAを意味する。
本発明によれば、組換えMVAワクシニアウイルスは以下のように調製することが可能である。
E3Lタンパク質またはE3L由来ポリペプチドをコードするDNA配列と外来ポリペプチドをコードするDNA配列とを含み、いずれのDNA配列も、MVAゲノム内の非必須部位(例えば欠失IIIなどの天然に存在する欠失部位など)に隣接するDNA配列に隣接しているDNA構築物を、細胞、好ましくは真核細胞に導入する。好ましい真核細胞は、相同的組換えが可能なようにMVA−ΔE3Lを生産的に感染させた、BHK−21細胞(ATCC CCL−10)、BSC−1細胞(ATCC CCL−26)、CV−1細胞(ECACC 87032605)またはMA104細胞(ECACC 8510
2918)である。ひとたびDNA構築物が真核細胞に導入され、E3LをコードするDNAおよび外来DNAがウイルスDNAと組換えられれば、ウイルスの増殖を支持するためにE3Lの機能を必要とする細胞、例えばCEF細胞で継代することにより、所望の組換えワクシニアウイルスMVAを単離することが可能である。組換えウイルスのクローニングは、プラーク精製として知られている方法により可能である(例えばナカノら(Nakano et al.)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、第79巻、1593〜1596ページ(1982年)、フランケら(Franke et al.)、Mol.Cell.Biol.1918〜1924ページ(1985年)、チャクラバーチら(Chakrabarti et al.)、Mol.Cell.Biol.3403〜3409ページ(1985年)、ファシら(Fathi et al.)、Virology 97〜105ページ(1986年)を参照)。
挿入するDNA構築物は、線状でも環状でもよい。環状DNAを用いることが好ましい。プラスミドを用いることが特に好ましい。
DNA構築物は、MVAゲノム内の非必須部位(例えば欠失III部位)の左右に隣接する配列を含んでいてよい(サッター ジーおよびモス ビー(Sutter,G.and Moss,B.)(1992年)Proc.Natl.Acad.Sci.USA、第89巻、10847〜10851ページ。
外来DNA配列を、非必須部位、例えば天然に存在する欠失、の両側に隣接する配列の間に挿入することが可能である。
外来DNA配列は、例えばt−PAもしくはインターフェロンなどの治療用ポリペプチドをコードする遺伝子、または病原性因子由来の遺伝子であってよい。病原性因子とは、疾病を引き起こし得るウイルス、細菌および寄生体、ならびに生物体内で無制限に増殖することにより病的に増殖する腫瘍細胞であると理解されたい。そのような病原性因子の例は、デビス,ビー.ディー.ら(Davis,B.D.et al.)の著書(Mocrobiology、第3版、Harper International Edition)に記載されている。病原性因子の好ましい遺伝子は、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルスおよび呼吸器合胞体ウイルス、デング熱ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス(例えばHIV IやHIV II)、ヒト肝炎ウイルス(例えばHCVやHBV)、ヘルペスウイルス、パピローマウイルス、熱帯熱マラリア原虫、および結核を引き起こすマイコバクテリア、の遺伝子である。
腫瘍関連抗原をコードする好ましい遺伝子は、黒色腫関連分化抗原(例えばチロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質1および2)、癌・精巣抗原(例えばMAGE−1、−2、−3、およびBAGE)、腫瘍上で過剰発現される非変異型の共通抗原(例えば、Her−2/neu、MUC−1およびp53)、の遺伝子である。
外来のDNA配列または遺伝子が発現されることを可能にするためには、遺伝子の転写の要件とされる調節配列がDNA上に存在することが必要である。そのような調節配列(プロモーターと呼ばれている)は当業者に知られており、例えば、欧州特許出願公開第198,328号に記載のワクシニア11kDa遺伝子の調節配列および7.5kDa遺伝子の調節配列(欧州特許出願公開第110,385号)である。
DNA構築物は、例えば、リン酸カルシウム沈殿(グラハムら(Graham et al.)、Virol.第52巻、456〜467ページ(1973年)、ウィグラーら(Wigler et al.)、Cell 777〜785ページ(1979年))、エレクトロポレーション(ニューマンら(Neumann et al.)、EMBO J.第1巻、841〜845ページ(1982年))、マイクロインジェクション(グレスマンら(Graessmann et al.)、Meth.Enzymology、
第101巻、482〜492ページ(1983年))、リポソーム(ストラウビンガーら(Straubinger et al.)、Methods in Enzymology、第101号、512〜527ページ(1983年))、スフェロプラスト(シャフナー(Schaffner)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、第77巻、2163〜2167ページ(1980年))、または当業者に知られている他の方法を用いたトランスフェクションにより細胞内に導入することが可能である。リン酸カルシウム沈殿によるトランスフェクションを用いることが好ましい。
ワクチンを調製するために、本発明により作製したMVAワクシニアウイルスを生理学的に許容し得る形態に加工する。これは、天然痘のワクチン接種に用いるワクチン調製における長年の経験に基づいて行うことが可能である(カプラン(Kaplan)、Br.Med.Bull.第25巻、131〜135ページ(1969年))。一般的に、約10〜10個の組換えMVA粒子を、アンプル、好ましくはガラスアンプルに入れた2%ペプトンおよび1%ヒトアルブミンを含む100mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中で凍結乾燥する。凍結乾燥物には、非経口投与に適した増量剤(マンニトール、デキストラン、糖、グリシン、ラクトースまたはポリビニルピロリドンなど)または他の補助剤(抗酸化薬、安定剤等)を含まれていてよい。次いでガラスアンプルを密封し、好ましくは−20℃未満の温度で、数カ月間にわたり保存することが可能である。
ワクチン接種のために、凍結乾燥物を0.1〜0.2mlの水溶液、好ましくは生理食塩水に溶解し、非経口投与、例えば、皮内接種することが可能である。本発明によるワクチンは、皮内注射することが好ましい。軽度の腫脹および発赤、時にはかゆみも、注射部位に認められることがある(スティクルら(Stickl et al.)、前出)。投与法、用量および投与回数を、当業者が既知の方法により最適化することが可能である。外来抗原に対する高レベルの免疫応答を得るために、必要に応じてワクチンを長期にわたって数回投与することが好都合である。
まとめると、組換えMVAの作製のための本発明の方法は、次の工程からなる。すなわち、上述のような宿主細胞に組換えMVAを感染させる工程、宿主細胞に本発明のDNAベクター構築物をトランスフェクションする工程、ならびにCEF細胞またはニワトリ胚由来LSCC−H32細胞(ロスおよびカーデン(Roth & Kaaden)、1985年 Appl Environ Microbiol、第49巻、634〜636ページ)または鳥類の細胞(例えば、ウズラ線維芽細胞QT6細胞またはQT35細胞)で増殖させることにより復元されたMVAを選択する工程。
以下の詳細な実施例は、本発明をよりよく理解するのに寄与するためのものである。しかし、本発明を実施例の主題に限定するという印象を与えることを意図するものではない。
1.ウイルスの増殖および精製
1.1 MVAおよびMVA−ΔE3Lウイルスの増殖
MVAウイルスは、ニワトリ胚線維芽細胞(CEF)培養物で起源株CVAを連続継代することにより生産された、著しく弱毒化されたワクシニアウイルスである。ワクシニアMVA株の生産の歴史、特性および用途の一般的な総説については、メイルら(Mayr
et al.)によりInfection、第3巻、6〜14ページ(1975年)に発表された概説を参照することが可能である。CEFへの適応の結果として、他の細胞系でのMVAウイルスの増殖は著しく制限される。例外的に、よく特性解析され、維持が容易な細胞株であるベビー・ハムスター腎臓細胞(BHK−21)は、MVAを増殖させ、
効率の高いCEFと同程度に効率良く組換え遺伝子を発現させるので、発現ベクターおよび組換え生ワクチンの開発における標準化されたMVA増殖用に推奨されている(ドレクスラーら(Drexler et al.)、1998年、J.Gen.Virol.第79巻、347〜352ページ)。
MVAウイルスは、それが適応した宿主細胞であるCEF細胞で通常増殖させた。CEF細胞を調製するために、インキュベートした鶏卵から11日齢の胚を分離し、端部(extremities)を除去し、胚を小片に切断し、25%トリプシンからなる溶液中で室温で2時間にわたり徐々に分離した。得られた細胞懸濁液を、5%ウシ胎児血清(FCS)、ペニシリン(100ユニット/ml)、ストレプトマイシン(100mg/ml)および2mMグルタミンを含む1倍量の培地I(MEMイーグル、例えば、ギブコ(Gibco)[スイス バーゼル所在]から入手可能、注文番号072−1500)で希釈し、細胞用ふるい(例えば、テクノマラ アーゲー(Technomara AG)[スイス チューリッヒ所在]から入手可能、注文番号Bellco 1985、150メッシュ)を通してろ過し、この細胞を卓上遠心分離機(ヘルムレ カーゲー(Hermle
KG)[D−7209ドイツ連邦共和国ゴスハイム(Gosheim)所在]で室温、2000rpmで5分間遠心分離して沈降させた。細胞沈降物を最初の容積の4分の1容の培地Iに懸濁し、このようにして得られたCEF細胞を細胞培養皿に広げた。細胞を培地I中で37℃のCOインキュベーター内で所望の細胞密度に応じて1〜2日間増殖させ、直接感染させるかまたはさらに1〜2回細胞を継代してから感染させるために用いた。初代培養物の調製に関する明確な説明は、アール.アイ.フレシュニー(R.I.Freshney)の著書「Culuture of animal cell」、アラン アール.リス出版(Alan R.Liss Verlag)[ニューヨーク所在](1988年)第11章99ページ以降に記載されている。
MVA−ΔE3Lは、10%ウシ胎児血清(FCS)を添加した最少必須培地(MEM)中で増殖させたベビー・ハムスター腎臓細胞BHK−21(American Type Culture Collection ATCC CCL−10)中で常法により増殖させる。BHK−21細胞は、加湿空気−5%CO雰囲気中で37℃で維持した。
ウイルスを次のように感染に用いた。細胞を175cm細胞培養用ボトル中で培養した。80〜90%コンフルエントの状態で培地を除去し、細胞を、リン酸緩衝生理食塩水(PBS/ダルベッコ、例えば、アニメド アーゲー(Animed AG)[スイス ミュッテンツ(Muttenz)所在]、注文番号23.100.10)に含めたMVAウイルス懸濁液(細胞当たり0.01個の感染性粒子(=pfu)、0.01ml/cm)とともに1時間インキュベートした。次いで培地を加え(0.2ml/cm)、約80%の細胞が円形化するまで、ボトルを37℃で2〜3日インキュベートした。さらなる処理(精製等)の前に、ウイルス溶解物を細胞および培地とともに、処理せずに細胞培養ボトル中で−30℃で保存した。
1.2 ウイルスの精製
可能な限り純粋で、宿主細胞に特異的な成分を含まないウイルス調製物を得るために行った精製工程は、MVAおよびWRウイルスの場合と同じであった(ジョクリク(Joklik)、Virology、第18巻、9〜18ページ(1962年)、ツアルトウら(Zwartouw et al.)、J.gen.Microbiol.第29巻、523〜529ページ(1962年))。予め感染させてから−30℃で保存した細胞培養物を解凍し、残っている細胞をプラスチック基材から振り落とすか、またはかき落とし、遠心分離(Sorvall(登録商標)遠心分離機、GSAローター、5000rpm、10℃で1時間)により細胞とウイルスを培地から取り出した。ウイルスおよび細胞小片からなる沈降物をPBS(沈降物の容積の10〜20倍)に1回懸濁し、懸濁液を上記の
ように遠心分離した。新たな沈降物を10倍量のRSB緩衝液(10mM トリス−HCl pH8.0、10mM KCl、1mM MgCl)に懸濁し、残りの依然として無傷の細胞を崩壊させ、細胞膜からウイルス粒子を放出させるために超音波で短時間処理した(直径4mmのチップを装着したLabsonic 1510、ベンダーアンドホベイン(Bender and Hobein)[スイス チューリッヒ所在]から入手可能、60ワット、室温で2×10秒)。細胞核および比較的大きな細胞の破片は、続いて懸濁液を短時間遠心分離して除去した(Sorvall(登録商標)GSAローター、デュポン社(DuPont Co.)[D−6353ドイツ連邦共和国バド ナウハイム(Bad Nauheim)所在]から入手可能、3000rpm、10℃で3分間)。沈降物を、上記のように再度RSB緩衝液に懸濁し、超音波で処理し、遠心分離した。回収した、遊離ウイルス粒子を含む上清を合わせ、10mMトリス−HCl、pH8.0中35%ショ糖10mlのパッド上に重層し、Kontron TST28.38/17ローター(コントロンインストルメンテ(Kontron Instrumente)[スイス チューリッヒ所在];ベックマン(Beckman)SW 27ローターに相当)中で14000rpm、10℃で90分間遠心分離した。上清を傾瀉し、ウイルス粒子を含む沈降物を10mlの10mMトリス−HCl、pH8.0に溶解し、超音波で短時間処理し(室温で2×10秒、上記の装置)、さらに精製するため段階的勾配に供した。勾配の各段階はそれぞれ10mMトリス−HCl、pH8.0に溶解したショ糖5mlからなるものとした(ショ糖濃度段階:20%、25%、30%、35%および40%)。勾配試料をKontron TST28.38/17ローターで14000rpm、10℃で35分間遠心分離した。この遠心分離の後、ウイルス粒子を含むいくつかの分離帯が30%ショ糖と40%ショ糖の間の勾配の領域に見えた。この領域を勾配試料からサイフォン作用により排出させ(10ml)、このショ糖溶液をPBS(20ml)で希釈し、この溶液から遠心分離(Kontron TST28.38/17ローター、14000rpm、10℃で90分間)によりウイルス粒子を沈降させた。この時点でほとんど純粋なウイルス粒子のみからなる沈降物を、ウイルス濃度が平均1〜5×10pfu/mlになるようにPBSに溶解した。精製ウイルス保存溶液を、後続の実験のために直接またはPBSで希釈して使用した。
2.MVA−ΔE3Lウイルスの構築および特性解析
2.1 E3L欠失プラスミドの構築
E3L遺伝子の両側に隣接するMVAゲノムのDNA配列を、MVA(クローン化分離株F6、CEFで第582継代)のDNAを鋳型として用いたポリメラーゼ連鎖反応により増幅した。E3Lの上流隣接領域のプライマーは、5’−ATATGATTGGGCCCACTAGCGGCACCGAAAAAGAATTCC−3’(下線部はApaI部位)および5’−GTCAATAGCGGCCGCAGACATTTTTAGAGAGAACTAAC−3’(下線部はNotI部位)であった。下流領域のプライマーは、5’−TACATGAAACGCGTTCTATTGATGATAGTGACTATTTC−3’(下線部はMluI部位)および5’−GTTACGTCGGATCCAGATTCTGATTCTAGTTATC−3’(下線部はBamHI部位)とした。構築物をApaI/NotIまたはMluI/BamHIで切断し、プラスミドpΔK1L(スタイブら(Staib et al.)、2000年、Biotechniques、第28巻、1137〜1148ページ)の対応する部位に挿入して、E3L欠失プラスミドpΔE3L−K1Lを得た。
2.2 変異ウイルスMVA−ΔE3Lの形成および単離
変異ウイルスMVA−ΔE3Lを、以前に記載された方法(スタイブら(Staib et al.)、2000年、Biotechniques、第28巻、1137〜1148ページ)を用いて作製した。簡単に述べると、6ウェル組織培養プレート(コスター(Costar)[米国ニューヨーク州コーニング(Corning)所在]で増殖させ
た1×10個のコンフルエントなBHK−21細胞の単層に細胞当たり0.01IUの感染効率(MOI)でMVAを感染させた。感染90分後に、製造業者の推奨に従いリン酸カルシウムを用いてウェル当たり10μgのプラスミドpΔE3L−K1L DNAで細胞をトランスフェクションした(CellPhect(登録商標)トランスフェクションキット、アマシャム・ファルマシア・バイオテク(Amersham Pharmacia Biotech)[ドイツ国フライブルク(Freiburg)所在])。感染48時間後に細胞をハーベストし、凍結−解凍を3回行い、カップ超音波処理器(Sonopuls HD 200[ドイツ国バンデリン(Bandelin)所在])でホモジナイズした。ハーベストした材料を培地で10倍希釈系列とした物(10−1〜10−4)を用いて、6ウェル組織培養プレートで増殖させたRK−13細胞のサブコンフルエントな状態の単層に感染させた。37℃で3日間インキュベートした後、変異MVA−ΔE3Lに感染したRK−13細胞巣を、空気置換ピペットを用いて吸引により20μl容を採取し、500μlの培地を入れた微小遠心チューブに移し、RK−13細胞の単層を新たに感染させるために凍結−解凍と超音波により処理した。RK−13細胞での継代時にすべての親MVAを除去した後、組換えウイルスを10倍希釈系列とした物(10−1〜10−6)を用いて、6ウェル組織培養プレート(コスター(Costar)[米国ニューヨーク州コーニング(Corning)所在]で増殖させたサブコンフルエントな状態のBHK−21細胞に感染させた。良く分離された感染BHK−21細胞巣をハーベストし、K1L陰性の変異MVA−ΔE3Lを単離した。
クローン化したMVA単離株のウイルスDNAを先に記載したように(スタイブら(Staib et al.)2000年)、PCRを用いて常法により分析した。変異MVAのゲノム中のE3L遺伝子座をモニターするために、ORF E3Lに隣接する遺伝子配列由来のオリゴヌクレオチド、5’−ATA TGA TTG GGC CCA CTA GCG GCA CCG AAA AAG AAT TCC−3’および5’−TAC ATG AAA CGC GTT CTA TTG ATG ATA GTG ACT ATT TC−3’を用いた。
(サザンブロット分析) ウイルス感染BHK細胞から単離した全DNAをEcoRIで消化し、0.8%アガロース中でのゲル電気泳動により分離し、Hybond(登録商標)N+膜に移し、[α−32P]CTPで標識したE3L遺伝子の下流隣接領域に及ぶPCR断片からなるDNAプローブとハイブリダイズさせた。QuickHyb(登録商標)のプロトコール(ストラタジーン(Stratagene)GmbH[ドイツ国ハイデルベルク所在]に従ってプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを実施した。2×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウムpH7.0溶液(SSC)/0.1%SDSを用いて、膜を65℃で30分間2回洗浄し、室温で2回洗浄した。このブロットをKodak x−Omatフィルムに曝露した。
(ウエスタンブロット分析) 6ウェル組織培養プレートで増殖させたコンフルエントなBHK−21細胞の単層に細胞あたり10IUのウイルスを1時間接種した。感染細胞を培地で短時間洗浄し、シトシンアラビノシド(AraC、40μg/ml)を含むまたは含まない新鮮な培地とともにインキュベートした。24時間後、細胞溶解物を調製し、SDS−12%ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)により分離した。次いで、タンパク質を、25mMトリス、19.2mMグリシンおよび20%メタノールを含む緩衝液(pH8.3)中で2時間にわたりニトロセルロース膜(バイオラッド(BioRad))にエレクトロブロッティングした。2%(重量/容積)BSA、0.05%(容積/容積)Tween、50mMトリス、150mM NaClを含むブロッキング緩衝液(pH7.5)中で終夜ブロッキングした後、ブロットを、抗E3Lマウス・モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマTW2.3(ユウェンら(Yuwen et al.)、Virology、第195巻、732〜744ページ、1993年)の上清の10
倍希釈物を用いてブロッキング緩衝液中で1時間探索した。洗浄した後、ペルオキシダーゼとコンジュゲートしたポリクローナルヤギ抗マウス抗体(IgG(H+L)、カタログ番号111−035−114、ディアノバ(Dianova)[ドイツ国ハンブルク所在]、希釈率1:10000)をブロッキング緩衝液で5000倍希釈したものと共にブロットを1時間インキュベートし、再び洗浄し、Kodak x−Omatフィルムを用いて高感度化学発光法(ECL、製造業者)による可視化により現像した。
2.3.ウイルス増殖の分析
低率増殖プロファイルを測定するために、CEFまたはBHK−21単層に細胞当たり0.05感染単位(IU)のMVA、MVA−ΔE3LまたはMVA−E3revを感染させた後、ウイルスの増幅をモニターした。5IUの感染効率(MOI)で細胞を感染させて、MVA、MVA−ΔE3LまたはMVA−E3revの1段階の増殖を分析した。すべての感染実験に、6ウェル組織培養プレートで増殖させたコンフルエントな単層を用いた。37℃で60分間ウイルスを吸着させた後、接種物を除去した。感染細胞をRPMI 1640で2回洗浄し、10%FCSを含む新鮮RPMI 1640培地とともに5%CO雰囲気中37℃でインキュベートした。感染後(p.i.)複数の時点で感染細胞をハーベストし、凍結−解凍と短時間の超音波処理によりウイルスを放出させた。得られた溶解物の段階希釈物を6ウェル組織培養プレートで増殖させたコンフルエントなBHK−21単層上で2連で平板培養した。ウイルス感染細胞のワクシニアウイルス特異免疫染色のために、48時間p.i.の時点で培地を除去し、細胞をアセトン:メタノール(1:1、1ml/ウェル)で短時間固定した。洗浄し、PBS−2%FCS中でブロッキングした後、細胞をポリクローナルウサギ抗ワクシニア抗体(IgGフラクション、バイオジェネシス社(Biogenesis Ltd.)[英国プール(Poole)所在]、カタログ番号9503−2057、PBS−3%FCSで1:10000に希釈)とともに60分間インキュベートした。細胞をPBSで洗浄した後、ペルオキシダーゼとコンジュゲートしたポリクローナルヤギ抗ウサギ抗体(例えば、2次抗体の西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートした(IgG(H+L))、カタログ番号111−035−114、ディアノバ(Dianova)[ドイツ国ハンブルク所在]、PBS−3%FCSで1:1000に希釈)を加え、45分間インキュベートした。PBSで洗浄した後、抗体で標識された細胞をジアニシジン(シグマ(Sigma)No.09143)基質溶液で処理し、染色細胞巣を計数し、ワクシニアウイルス・プラーク・アッセイと同様にウイルス力価を計算した(IU/ml)。
(ウイルスDNAの分析) 感染細胞からウイルスゲノムDNAを既述(アール ピーおよびモス ビー(Earl P & Moss B)、Current Protocols in Molecular Biology)のように単離した。ウイルスDNAの複製を評価するために、スロット・ブロット装置を用いて全DNAをHybond(登録商標)N+膜にトランスファーし、32P標識MVA DNAプローブとハイブリダイズさせた。放射活性をホスホイメージャ分析装置(バイオラッド(BioRad)で定量した。
([35S]メチオニン標識ポリペプチドの分析) 12ウェルプレート中のBHKおよびCEF細胞単層に、20のMOIでMVA、MVA−ΔE3LもしくはMVA−E3revを感染させるか、または疑似感染させた。4℃で45分間吸着させた後、ウイルス接種物をあらかじめ加温した組織培養培地で置換して、5%CO雰囲気中37℃でインキュベートした。感染後、表示された時点で細胞をメチオニン非含有培地で37℃で10分間洗浄し、各ウェルに50μCiの[35S]メチオニンを加え、37℃で30分間インキュベートした。0.2mlの0.5%Nonidet(登録商標)P−40溶解緩衝液(20mMトリス−HCl、10mM NaCl(pH8.0))を加えて10分間、感染細胞単層の細胞質抽出物を調製した。細胞抽出物からのポリペプチドを10%ドデシ
ル硫酸ナトリウム(SDS)ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)により分離し、オートラジオグラフィーにより分析した。
(DNA断片化の分析) CEFに、20のMOIでMVA、MVA−ΔE3LもしくはMVA−E3revを感染させるか、または疑似感染させた。細胞を感染後16時間および24時間の時点でハーベストし、前述したように全DNAを抽出した。沈殿させたDNAを100μlのHOに再懸濁し、RNase(終濃度:1mg/ml)で37℃で15分間処理し、1%アガロースゲルで分離した。臭化エチジウムで染色してDNA断片を可視化した。
(ヘキスト染色) 直径12mmのカバーガラスを備えた12ウェルプレート中でコンフルエントな状態まで増殖させたCEF細胞に、5もしくは20のMOIでMVA、MVA−ΔE3LもしくはMVA−E3revを感染させるか、または非感染とした。感染後16時間および24時間の時点で細胞をヘキスト3343で室温で30分間染色し、蛍光顕微鏡下で写真撮影した。アポトーシス細胞と非アポトーシス細胞との比を計数により求め、平均値および平均値の標準誤差の3倍(平均値/3×SEM)として表した。
(カスパーゼ活性のアッセイ) 12ウェル組織培養プレートで増殖させた5×10個のコンフルエントなCEF単層に、20MOIでMVA、MVA−ΔE3LおよびMVA−E3revを感染させるか、または疑似感染させた。4℃での感染90分後に、細胞を10%ラクトアルブミンおよび5%BMSを含むMEMで2回洗浄し、37℃で16時間インキュベートした。細胞をハーベストし、遠心分離により集め、PBSで1回洗浄し、溶解緩衝液(1%Nonidet(登録商標)P−40、50mMトリス−HCl、150mM NaCl、pH8.0)中細胞2×10個/mlとして氷上で10分間インキュベートした後激しく渦流混合することにより溶解した。10000×g、4℃で5分間遠心分離して抽出物を清澄化し、新しいバイアルに移した。DEVD切断活性を測定するために、抽出物を、10mM HEPES−KOH、40mM β−グリセロリン酸塩、50mM NaCl、2mM MgCl、5mM EGTAおよび1mMジチオトレイトール[DTT]、(pH7.0)を含み、0.1%CHAPS{3’−[(3’−コールアミドプロピル)−ジメチルアンモニオ]−1−プロパンスルホナート}、100μgのウシ血清アルブミンおよびアセチル−DEVD−7−アミノ−4−メチルクマリブ(DEVD−AMC)(最終濃度:10μM)を添加した反応緩衝液(有糸分裂希釈緩衝液(ラゼブニク,ワイ.エー.、コール,エス.、クーク,シー.エー.、ネルソン,ダブリュ.ジー.およびアーンシャウ,ダブリュ.シー.(Lazebnik,Y.A.、Cole,S.、Cooke,C.A.、Nelson,W.G. and Earnshaw,W.C.(1993年)「細胞を含まないin vitro有糸分裂抽出物におけるアポトーシスの核事象:アポトーシスの活性相の分析用モデルシステム(Nuclear
events of apoptosis in vitro cell free mitotic extracts: a model system for analysis of the active phase of apoptosis)」、J.Cell.Biol.第123巻、7〜22ページ)で1:10に希釈した。反応は、平底の96ウェルプレートで37℃で1時間、3連で実施した。次いで、ミリポア(Millipore)のCytofluor(登録商標)96リーダーで390nm(励起)および460nm(発光)における蛍光を測定して、遊離AMCを測定した。バックグラウンドの蛍光(緩衝液と基質のみ)を差し引いた値を算出し、平均値および平均値の標準誤差の3倍(平均値/3×SEM)として表した。
(ELISAによるアポトーシスの測定) 細胞数1×10のコンフルエントなCEF単層に、それぞれ5、10および20のMOIでMVA、MVA−ΔE3LおよびMVA−E3revを感染させるか、または疑似感染させた。感染後16時間の時点で、Ce
ll Death Detection ELISAキット(ロシュ ダイアグノスティックス(Roche Diagnostics)[マンハイム所在]を用い、製造業者の指示に従ってアポトーシスの程度を分析した。概要を述べると、感染後16時間の時点で培地を除去し、細胞を溶解緩衝液中でインキュベートした。溶解後、無傷の核を遠心分離によりペレットとし、上清のアリコートをマイクロタイター・プレートのストレプトアビジンでコーティングしたウェルに移した。試料中に存在するアポトーシス性ヌクレオソームの量を、DNAおよびヒストンに対して作製したマウス・モノクローナル抗体ならびに分光光度分析を用いて測定した。
(ヨウ化プロピジウム染色) 核の断片化を測定するため、6ウェル組織培養プレートで増殖させた1×10のコンフルエントなCEF単層に5IUおよび20IUのMOIでMVA、MVA−ΔE3LおよびMVA−E3revを感染させた。4℃での感染90分後に、細胞を10%ラクトアルブミンおよび5%BMSを含むMEMで2回洗浄した。感染後の様々な時点で細胞をトリプシン処理し、回収し、70%エタノール中に4℃で保存した。翌日、細胞をPBSで2回洗浄し、終濃度50μg/mlのヨウ化プロピジウムを含むPBSに再懸濁した。試料を暗所に4℃で1時間保存し、ベクトン・ディッキンソン(Becton Dickinson)のFACScalibur(登録商標)装置で分析したが、これはすでに報告されているように実施した(ニコレッティ,アイ.、ミグレオラティ,ジー.、パグリアッシ,エム.シー.、グリグナニ,エフ.およびリカルディ,シー.(Nicoletti,I.、Migliorati,G.、Pagliacci,M.C.、Grignani,F.and Riccardi,C.)(1991年)、「プロピジウム染色およびフローサイトメトリーによる胸腺細胞のアポトーシスを測定する迅速かつ簡単な方法(A rapid and simple method for measuring thymocyte apoptosis by propidium staining and flow cytomretry)」、J.Immunol.Methods、第139巻、271〜279ページ)。
3.組換えMVAウイルスの作製
3.1 ベクタープラスミドの構築
E3Lを用いた選択による組換えMVAの作製を可能にするために、MVAゲノム内に天然に生じる欠失IIIの部位に正確に組換えDNAを挿入するためのMVA隣接配列(flankIII−1およびflankIII−2)を含むpIIIプラスミド・ベクター(サッターおよびモス(Sutter and Moss)1992年、スタイブら(Staib et al.)2000年)を基にして、新規のベクタープラスミドを構築した。プラスミド・ベクターpIII−E3−PsH5を作製するために、MVA E3L遺伝子の完全長コード配列をその本来のプロモーター配列の転写制御下にある状態で含む627bpのDNAフラグメントをPCRにより調製し、クレノウ(Klenow)で処理し、BamHI切断部位を介してプラスミドpLW9のflankIII−1およびflankIII−2のDNA配列の間に挿入した(ウイアット,エル.ら(Wyatt
L.et al.)、1996年、Vaccine、第14巻、1451〜1458ページ)。gfp読み取り枠を含む723bpのDNA断片を、制限エンドヌクレアーゼBamHIおよびNotIを用いてpEGFP−N1(クロンテックラボラトリーズ(CLONETECH Laboratories)GmbH[ドイツ国ハイデルベルク所在])から切り出し、Klenowポリメラーゼで処理し、pIII−E3−PsH5のSmaI切断部位に挿入して、pIII−E3−PsH5−gfpを得た。
3.2 組換えMVA−PsH5−gfpの形成および単離
6ウェル組織培養プレート(コスター(Costar)[米国ニューヨーク州コーニング(Corning)所在]で増殖させた1×10のコンフルエントなBHK−21細胞の単層に、細胞あたり0.01IUの感染効率(MOI)でMVA−ΔE3Lを感染さ
せた。感染90分後に、リン酸カルシウムを用いて製造業者の推奨に従いウェル当たり10μgのpIII−E3−PsH5−gfp DNAで細胞をトランスフェクションした(CellPhect(登録商標)トランスフェクションキット、アマシャム・ファルマシア・バイオテク(Amersham Pharmacia Biotech)[ドイツ国フライブルク(Freiburg)所在])。感染48時間後に、細胞をハーベストし、凍結−解凍を3回行い、カップ超音波処理器(Sonopuls HD 200[ドイツ国バンデリン(Bandelin)所在])でホモジナイズした。ハーベストした材料を培地で10倍希釈系列としたもの(10−1〜10−4)を用いて、6ウェル組織培養プレートで増殖させたCEF細胞のサブコンフルエントな単層に感染させた。37℃で3日間インキュベートした後、組換えMVAに感染したCEF細胞巣をGFP合成についてモニターし、空気置換ピペットを用いて20μlの容積を吸引により採取し、500μlの培地を入れた微小遠心チューブに移し、さらにCEF細胞単層に感染させるために凍結−解凍と超音波により処理した。CEF細胞におけるプラーク精製を3回連続して実施した後に、組換えMVA−PsH5−gfpウイルスをCEF単層に感染させて増幅し、DNAをPCRにより分析してウイルス・ストックの遺伝学的均一性を確認した。
(結果)
(変異MVA−ΔE3Lの作製)
MVAのライフサイクルにおける重要なインターフェロン耐性遺伝子E3Lの意義を評価するために、相同的組換えを用いて、MVAゲノム内のE3L読み取り枠の完全なプロモーター配列およびコード配列をワクシニアウイルスK1L遺伝子発現カセットで置換した(図1A)。このマーカーは、ウサギ腎臓RK−13細胞への感染時に変異ウイルスの厳密な選択的増殖を可能にし、第2段階では、非選択的増殖条件を用いて、隣接する反復DNA配列間のさらなる相同的組換えにより同マーカーが再び簡単に除去される(スタイブら(Staib et al.)2000年)。E3L遺伝子配列が欠失した組換えMVAを、RK−13およびBHK−21細胞単層での数回のプラーク精製中に単離した。プラークのクローニング中、予想されたゲノム変異をPCRによりモニターした(図1B)。一次ウイルス・ストックをBHK−21細胞上で増幅し、ウイルスDNAのサザンブロット分析により再評価し(図1C)、MVA−ΔE3Lと命名した。アラビノシドCの存在下または非存在下で調製した細胞溶解物のウエスタンブロット分析から、野生型MVAを感染させた細胞でのE3Lタンパク質の合成が確認されたが、MVA−ΔE3Lを感染させた後にはE3Lポリペプチドを検出することは不可能であった(図1D)。
(MVA−ΔE3Lの複製はCEFにおいて阻害される)
MVA−ΔE3Lの2次ウイルス・ストックを作製するために、コンフルエントなCEF単層に低い感染効率(MOI)で感染させたが、驚くべきことに、ウイルスは増殖しなかった。宿主域の表現型を想定して、BHK−21細胞およびCEF細胞の感染後のウイルス増殖を比較分析しようとした。増殖の欠如は、ウイルスの複製または伝播の欠陥に起因している可能性があった。最初に、細胞当たり0.1感染単位(IU)でMVAまたはMVA−ΔE3Lを細胞に感染させる多段階増殖実験においてウイルスの収率を測定した(図2A、2B)。この感染効率では、BHK−21細胞内でのMVAおよびMVA−ΔE3Lの複製と伝播はほぼ同じであり、感染後20時間〜48時間で達した感染力の力価のピークは非常に類似していた(図2A)。予想通り、MVAはCEF細胞中では効率よく複製された。これに対して、CEFにおけるMVA−ΔE3Lの力価は感染させた力価と比較して絶え間なく低下し、生産的ウイルス増殖が事実上ないことが示唆された(図2B)。さらに、10のMOIを用いて感染させて1段階のウイルス増殖を分析したが、再びBHK−21細胞中ではMVAとMVA−ΔE3Lの増殖能力が同等であることを見出した。多段階増殖分析からのデータを並べると、感染後8、22または48時間にCEF中で検出されたMVA−ΔE3Lの感染力の力価はウイルス吸着後に認められた感染力のレベルに決して到達しなかった(図2C、2D)。これらの実験からMVA−ΔE3Lは
CEFにおいて特異的な複製上の欠陥を有すると結論した。このような宿主域表現型がE3L遺伝子配列の欠失のみに起因することを検証するために、その本来のプロモーター配列の転写制御下にあるE3L遺伝子をMVA−ΔE3Lのゲノムに再挿入して復帰突然変異MVA−E3revを作製した。概要を述べると、MVA−ΔE3L感染BHK細胞をトランスフェクションするために、完全長のE3L遺伝子発現カセットならびにそのゲノム上の隣接配列からなるDNA断片を含むプラスミド・ベクターpE3Lrevを用いた。復帰突然変異ウイルスMVA−E3revは、CEF単層におけるプラーク精製により容易に単離可能であった。E3Lが安定に再挿入されたことがMVA−E3revゲノムDNAを用いたPCRにより確認され、細胞溶解物のウエスタンブロット分析により野生型MVAと同等のレベルでE3Lタンパク質が合成されることが明らかになった(データは示さず)。追加のスクリーニングまたは選択を実施する必要なしにMVA−E3revを単離可能であったという事実が既に、CEFにおけるMVA−ΔE3Lの増殖不全を首尾よく復帰変異させたことを示唆していた。それに対応して、BHK−21細胞およびCEF細胞の両方におけるMVA−E3revの多段階および1段階増殖分析において、ウイルス複製のレベルが野生型MVAと同様であることを見出した(図2A〜D)。以上のデータから、我々は、このウイルスが長期間継代されて生育してきた細胞培養系であるCEFにおいて、MVAの複製を維持するためにE3Lの機能が必要であると結論した。
(MVA−ΔE3Lを感染させたCEFにおけるウイルスのタンパク質およびDNA合成の低下)
CEFのMVA−ΔE3Lへの非許容感染をより十分に解析するために、感染性ウイルス子孫が生産されないことがウイルスのタンパク質合成の低下に起因するかどうかを測定しようとした。CEFおよびBHK細胞を、MVA、MVA−ΔE3LまたはMVA−E3revを感染させた後の様々な時点で[35S]メチオニンで代謝的に標識した。各標識期間の後に、溶解物を調製し、SDS−PAGEおよびオートラジオグラフィーにより分析した。MVAを感染させたBHK細胞では、後期ウイルスタンパク質合成が感染5時間後に起こり、感染10時間後には細胞のタンパク質合成を強力に遮断して顕著となった(図3A)。MVA−ΔE3LまたはMVA−E3revを感染させたBHK細胞ではウイルスタンパク質について同様のパターンが認められた(図3A)。MVAまたはMVA−E3revを感染させたCEFでは、豊富な後期ウイルスタンパク質合成が感染5時間後および10時間後に認められた(図3B)。これに対して、MVA−ΔE3Lを感染させたCEF細胞では、ウイルスのタンパク質産生に特異的なポリペプチドのバンドを検出することはほとんど不可能であった(図3B)。感染5時間後の時点で、一般的な後期ウイルスタンパク質と移動度が等しいいくつかの弱いポリペプチドのバンドが、宿主細胞のタンパク質合成の顕著な遮断を伴って見られるようになった。
ウイルス後期タンパク質が豊富に合成されるかどうかはウイルスDNAの複製に依存するので、MVA−ΔE3Lのライフサイクルにおけるこの段階を調べ、BHK−21細胞およびCEF細胞への感染について比較した。1段階感染における様々な時点で感染細胞から全DNAを単離し、このDNAを膜にトランスファーしてその膜を放射活性標識したMVA−DNAプローブとハイブリダイズさせることにより、ウイルスのDNA合成をモニターした(図3C、3D)。図3Cに示すように、MVA−ΔE3LまたはMVAを感染させたBHK−21細胞では、非常に類似した動態および量を伴うウイルスDNAの蓄積が起こった。CEF細胞においても、両ウイルスを感染させた後にウイルスDNAが次第に多く合成されることが見出された(図3D)。しかし、MVA−ΔE3LによるCEFへの非許容感染の場合、感染6時間後および12時間後の時点で検出されたDNAは許容条件に比べると少量であった。したがって、MVA−ΔE3L感染CEFで認められたタンパク質合成の著しい減少はウイルス特異的DNA複製の著しい阻害とは相関していなかったが、ウイルスDNAの生産は非許容感染において比較的遅い時点で停止したようである。
(MVA−ΔE3Lを感染させたCEFにおけるアポトーシスの誘導)
ウイルスタンパク質合成の顕著な停止とウイルスDNA複製の能力維持とを特徴とするこの感染表現型は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞へのワクシニアウイルスの非許容感染(スペーナーら(Spehner et al.)、1988年、ラムゼイ−エウイングおよびモス(Ramsey−Ewing and Moss)、1995年)を想起させるものであった。ワクシニアウイルスのCHOへの不稔感染にはアポトーシスの誘導を伴うが、これは牛痘ウイルス遺伝子CHOhrの同時発現により回避し得る(インクら(Ink et al.)、1995年、ラムゼイ−エウイングおよびモス(Ramsey−Ewing and Moss)、1998年)。さらに、またワクシニアのE3L遺伝子産物がワクシニアウイルスに感染したHeLa細胞においてアポトーシスの誘導を阻害するとの報告もある(リーおよびエステバン(Lee and Esteban)、1994年、キブラーら(Kibler et al.)、1997年)。MVA−ΔE3Lによる感染24時間以内に光学顕微鏡によりCEF培養物をモニターすると異常な細胞収縮が観察されたので、CEF細胞におけるMVA−ΔE3Lの増殖制限がアポトーシスに関連している可能性があるかどうかを探求することは重要であると思われる。アポトーシスに関する最初の標準的アッセイでは、ヌクレオソームの「DNAラダー」(ウイリーら(Wyllie et al.)、1980年)に相当する180bp多量体へのDNAの特徴的な切断についてモニターした。MVA−ΔE3L、MVAまたはMVA−E3revのいずれかを感染させたCEF培養から細胞の全DNAを単離し、アガロースゲル電気泳動により分離し、臭化エチジウム染色により可視化した。16時間および24時間MVA−ΔE3Lを感染させたCEF細胞の試料において、アポトーシスを示唆する細胞DNAの典型的な断片化が観察された。これに対して、MVAまたは復帰突然変異ウイルスMVA−E3revを感染させたCEF細胞の試料ではそのようなDNAのラダー形成は検出されなかった(図4A)。アポトーシスの他の特徴は、核外ヌクレオソームの出現である。したがって、CEFの培養物をヘキスト3343で染色し、個々の細胞におけるアポトーシス小体についてスクリーニングした。MVA−ΔE3Lの感染16時間後に、ヘキスト3343で広範に染色された細胞質の空胞を容易に検出可能であった(図4B)。さらに、このアッセイでは、300〜500個の細胞を含む無作為に選択した範囲において細胞外染色を有する細胞の割合を測定することによりアポトーシス細胞の数を定量することが可能であった(3連で実施、図4C)。MVA−ΔE3Lによる感染後には、細胞あたり5IUの感染効率を用いた場合で全細胞の約20%にアポトーシスの明らかな徴候が認められた。細胞あたり20IUの感染効率で行った実験では、アポトーシス細胞の割合は約30%に増加した。これに対して、野生型MVAまたは復帰突然変異ウイルスMVA−ΔE3revを感染させた細胞で最高4%、および疑似感染細胞のわずか1%が核外染色について陽性として計数された。このアポトーシス過程がDNAレベルのみで起こるのではないことを示すために、特異的ペプチド基質Asp−Glu−Val−Asp(DEVD)を用いてカスパーゼによる細胞内タンパク質分解を調べた(サルベセンおよびディキシト(Salvesen and Dixit)、1997年)。確立された蛍光アッセイを用いて、感染16時間後にCEFから調製した細胞抽出物におけるDEVD切断活性を測定した(リンシンガーら(Linsinger et al.)、1999年)。この場合も、MVA−ΔE3Lによる感染後には著しく増強されたDEVD切断活性が認められたが、MVAまたはMVA−E3rev感染細胞からの抽出物では検出可能な活性があるとしてもごくわずかしか含んでいなかった(図4D)。これらの結果は、CEFにおけるMVA−ΔE3Lの増殖不全はアポトーシスの誘導に関連していることを明確に示していた。
さらに、MVA−ΔE3L感染CEFにおけるアポトーシスの開始が、宿主域を制限された表現型に一層明らかに関連しうるどうか評価することを試みた。本発明者らの以前の実験は、すべての細胞の感染を保証するはずの細胞あたり20IUの感染効率で実施され
たが、約30%の細胞がヘキスト染色でアポトーシス細胞と評価されたにすぎなかった。したがって、最初に、アポトーシスの度合に関してMVA−ΔE3Lを一層注意深く力価測定することに関心が払われた。CEF細胞に1、5、10または20IUのMVA−ΔE3L、MVAまたはMVA−E3revを感染させ、感染16時間後にマウス・モノクローナル抗体によるアポトーシス性ヌクレオソームを特異的に検出するELISAを用いてアポトーシスを定量した(Cell Death Detection ELISAキット、ロシュ ダイアグノスティックス(Roche Diagnostics)[マンハイム所在])(図5A)。細胞あたりの最低用量1IUのMVA−ΔE3Lを接種したCEFに明らかなアポトーシスの徴候が見出された。感染に用いるMVA−ΔE3L量の増加に伴いアポトーシスのレベルが一貫して増大したのに対して、さらに高い用量でMVAまたはMVA−E3revを感染させてもバックグラウンドレベルをわずかに超える量の細胞死がもたらされたに過ぎなかった。ヘキスト染色によるアポトーシス細胞の計数の精度は、感染細胞単層の取り扱い時にアポトーシス細胞の一部が脱離して分析の対象から外れると思われるため、限られたものであった可能性がある。MOI20での感染後に存在する細胞死の割合を分析する別のプロトコールを用いるために、アポトーシス状態の核をヨウ化プロピジウムで染色し、様々な時点でフローサイトメトリーにより計数した(ニコレッティら(Nicoletti et al.)、1991年)。MVA−ΔE3Lを感染させてから6時間という早い時点で、MVAまたはMVA−E3revを感染させたCEFと比較してアポトーシス状態の核の数が多いことが検出された(図5B)。後続の時点ではMVA−ΔE3L感染CEFにおける死細胞の割合は連続的に増加し、感染24時間後に全細胞の約70%になった。このデータは、MVA−ΔE3L感染CEFで認められるアポトーシスの程度と動態とがタンパク質およびDNAの合成の低下を特徴とする増殖制限を示す表現型と相関することを示唆していた。
(MVA−ΔE3Lを感染させたCEFにおけるI型IFNの誘導)
E3Lが欠失したワクシニアウイルスWRによるHeLa細胞におけるアポトーシスの誘導は、IFNにより調節される主要な抗ウイルス酵素PKRおよびRNaseLの活性化を妨げる強力なdsRNA結合タンパク質としてのE3Lの機能に関連づけられている(リーおよびエステバン(Lee and Esteban)、1994年;キブラーら(Kibler et al.)、1997年)。このワクシニアウイルス変異体の他の特有な特徴は、IFN処理に対するその高い感受性である(ベアッティーら(Beattie et al.)、1991年;ベアッティーら(Beattie et al.)、1995年)。興味深いことに、ワクシニアウイルス・コペンハーゲン感染時においても、E3L機能の欠失はインターフェロン調節因子3(IRF−3)の活性化によるIFN−β合成の誘導をもたらす。したがって、MVA−ΔE3LによりCEFを感染させた後のIFNの存在についてモニターし比較することを試みた。我々は6ウェル組織培養プレートで増殖させたCEF単層に細胞あたり10IUのMVA−ΔE3L、MVA、MVA−E3rev、野生型ワクシニアウイルスCVA、またはWRを接種した。細胞を含まない上清を感染24時間後に収集し、確立されたアッセイを用いて組換え型ニワトリIFN(recIFN、250U/ml)と比較してニワトリI型IFNの活性について試験した(図6)。野生型ワクシニアウイルスCVAを感染させた細胞の上清は、検出可能なIFN活性を含んでいなかった(図6A)。同じ結果がワクシニアウイルスWRの感染後にも得られた(データは示さず)。これに対して、MVA感染CEFの培地にはIFN活性が明らかに存在していた(図6B)。驚くべきことに、最高レベルのIFNがMVA−ΔE3L感染後に認められ、対照として用いたrecIFNで得られた活性と同程度の活性に達した(図6C)。MVA−E3revの感染後にも、より低いレベルではあるが、変異型でないMVAの感染後と同等のIFN活性が検出された(図6D)。このデータは既に、MVAによるCEFの許容感染が生物学的に活性なI型IFNの蓄積を誘発し、一方、MVA−ΔE3Lの非許容感染はさらに多くのIFNを産生させることを示すものであった。
(CEFにおけるワクシニアウイルス感染に対するIFN処理の効果)
哺乳動物細胞へ感染させた場合、ワクシニアウイルスの複製はIFN活性に対して比較的抵抗性であることが認められている。興味深いことに、このことは、ニワトリのインターフェロンによる前処理がワクシニアウイルスの増殖を阻害し得るCEF培養物の場合には異なるようである。MVA感染に対するIFNの効果を測定するために、CEF単層を漸増量の組換え型ニワトリI型IFNで24時間前処理してから、該培養物を低いMOIでMVA、MVA−ΔE3LもしくはMVA−E3rev、または比較のためにワクシニアウイルスCVAもしくはWRに感染させた。感染48時間後に細胞単層を固定し、ウイルス感染細胞巣をワクシニアウイルス特異免疫染色により可視化した(図7)。ワクシニアウイルスCVAまたはWRの感染後には、疑似感染処理または低量のIFN(培地1mlあたり1または10U IFN)で処理した単層において形成されたような多数のウイルスプラークが示された。さらに、培地1mlあたり10UのIFNを存在させると、通常より小さいウイルスプラークが少なくなった。培地1mlあたり100UのIFNまたは培地1mlあたり1000のIFNとプレインキュベートした単層にはもはやプラーク形成は検出されなかった(データは示さず)。MVA感染CEFを免疫染色した結果、細胞単層から離れていない状態のウイルス陽性細胞巣が認められ、MVA感染による一般的な細胞変性が比較的低いことが実証された。このようなプラーク表現型の差があるにもかかわらず、IFN処理した際のMVA感染細胞巣の形成は、ワクシニアウイルスWRまたはCVAで認められるプラーク形成と非常に類似していた。培地1mlあたり最高10UまでのIFNで処理した単層にはMVA感染細胞が認められた。この後者の量は細胞巣の数と大きさに明らかに影響を及ぼし、一方、より高いIFN濃度では完全な増殖阻害がもたらされた。これと非常に対照的に、MVA−ΔE3Lを接種した単層にはIFN処理とは関係なく検出可能なウイルス感染細胞は存在せず、この変異体がCEFにおいて生産的に複製することは不可能であることが確認される。これに対して、MVA−E3rev感染では、野生型MVAで確立されたパターンと同じ細胞巣形成が再び認められた。このデータは、CEFにおけるワクシニアウイルス感染の相対的なIFN感受性を示唆した以前の試験を裏付けるものであり、また、CEF適応MVAのIFNによる阻害がワクシニアウイルス株WRおよびCVAの感染時に認められるIFN効果と非常に類似していることをさらに示していた。
(E3L機能の復元による組換えMVAの作製)
ワクシニアウイルス感染における単一遺伝子依存的な宿主域表現型を、変異ウイルスゲノムへの該宿主域遺伝子の再挿入による効率のよい組換えウイルスの選択に見事に用いることが可能である。CEFにおけるMVA−ΔE3Lの増殖制限がそのような宿主域選択を可能にするものであるかどうかを確認するために、MVAゲノム内の欠失IIIの部位へ、その本来のプロモーターの転写制御下にあるE3Lコード配列を再導入することを目的として、MVA挿入プラスミドを構築した。ワクシニアウイルス特異的プロモーターPmH5とともに発現させるモデル組換え遺伝子として機能するA.victoriae gfp遺伝子の発現カセットを付加することにより、MVAベクタープラスミドpIII−E3L−PH5−gfpが得られた(図7A)。このプラスミドをMVA−ΔE3Lに感染したBHK−21細胞へトランスフェクションした後、ウイルス特異的細胞変性効果を示す多くの細胞の間にgfp遺伝子を発現しているいくつかの細胞群が認められた。このことは、組換えMVAが形成されたことを示唆するものであった。CEFにおけるウイルス増殖の選択的復元について試験するために、トランスフェクション後に得られたウイルス材料の10倍希釈物を6ウェル組織培養プレートで増殖させたCEF単層に接種した。3日後、事実上すべてがGFP産生細胞を含むウイルスプラークの形成が認められた。CEFでさらに増幅させるために処理した10個の十分に分離したプラークから、さらに1継代後に組換えMVA−PH5−GFPの8種の単離株を回収した。ウイルスDNAのPCR分析により、すべてのウイルス単離株がそのゲノム内の欠失IIIの部位に安定な
挿入配列を有する本物の組換え体であることが立証された(図7B)。これらのウイルス単離株が容易に得られたことは、CEFにおけるMVAの増殖にはE3Lの機能が本質的に必要であることを反映しており、また、MVA−ΔE3LのE3L特異的な回復を、組換えMVAを作製するための効率的な宿主域選択プロトコールとして提案することが可能であることを示唆している。
Figure 0004406561
MVA−ΔE3Lの構築および特性解析を示す図。(A)MVAゲノムおよびE3L遺伝子配列を欠失させるためにデザインされたプラスミドpΔK1L−E3Lの模式的マップを示す。MVAゲノムのHindIII制限エンドヌクレアーゼ部位を最上部に示す。E3L遺伝子に隣接するMVA−DNA配列(flank−E3LIおよびflank−E3LII)をpΔK1Lにクローニングし、相同的組換えによるK1L選択マーカーの挿入を誘導して、MVAゲノムからE3Lのオープンリーディングフレーム(ORF)を欠失させた。K1L遺伝子の発現により、RK13細胞内において不安定な中間体ウイルスMVA−ΔE3L+K1Lを選択的に増殖させることが可能となる。付加的反復配列(LacZ)が関与する第2の相同的組換えの際にK1Lマーカー遺伝子が欠失した後、最終的な突然変異ウイルスMVA−ΔE3Lが生じる。(B)ウイルスDNAのPCR分析を示す。(C)ウイルスDNAのサザンブロット分析を示す。(D)AraCの存在下または非存在下でMVA−ΔE3LまたはMVAを感染させたCEFからの溶解物のウエスタンブロット分析を示す。E3L特異マウス・モノクローナル抗体TW9により検出されたE3Lタンパク質バンドを矢印で示す。 MVA−ΔE3L(●)、MVAwt(MVA−F6)(四角)およびMVA−E3rev(三角)を高用量(A,B)および低用量(C,D)で感染させた後のCEF細胞(A,C)およびBHK細胞(B,D)内のウイルス増殖の分析を示す図。Cは、CEF細胞においてMVA−E3revおよび野生型MVAと比較してMVA−ΔE3Lが多段階に増殖したことを示す。Dは、BHK細胞においてMVA−E3revおよび野生型MVAと比較してMVA−ΔE3Lが多段階に増殖したことを示す。 (A,B)ウイルスポリペプチドの合成を示す図。(A)BHK細胞および(B)CEF細胞をMVA−ΔE3L、MVAまたはMVA−E3revに感染させ(レーン9〜12)、表記の感染後時間(hpi)において[35S]メチオニンで30分間標識した。細胞溶解物を10%ポリアクリルアミドゲルでのゲル電気泳動により分析し、オートラジオグラフィーにより可視化した。タンパク質標準品(レーンM)については、左側にそれらの分子質量(キロダルトン単位)を示す。非感染細胞(U)を対照とした。(C,D)ウイルスDNAの合成を示す図。BHK‐21細胞(C)およびCEF細胞(D)をMVA−ΔE3LまたはMVAで感染させてから0時間、2時間、4時間、6時間および8時間後に分離したDNAをHybond(登録商標)N+膜上に固定し、32Pで標識したMVA−DNAプローブとのハイブリダイゼーションにより分析した。放射活性を、ホスホイメージ分析装置で定量した。 CEF細胞における、MVA−ΔE3Lによるアポトーシスの誘導を示す図。(A)DNA断片化を分析するために、セミコンフルエントな単層状態のCEF細胞に細胞あたり20PFUのMOIでMVA−ΔE3L(レーン1、2)、wtMVA(レーン3、4)もしくはMVA−E3rev(レーン5、6)を感染させるか、または非感染(レーン7)とした。感染16時間後(レーン1、3、5)および感染24時間後(レーン2、4、6)にウイルスDNA抽出物を得、1%アガロースでゲル電気泳動を行って分離し、臭化エチジウム染色により可視化した。陽性対照として、DNAラダー調製キット(ロシュ ダイアグノスティックス(Roche Diagnostics)から得た試料を適用した(レーン8)。(B)カバーガラス上で増殖させた疑似感染(mock)またはMVA感染CEF細胞を用いてヘキスト(Hoechst)3343による染色を実施した。16時間後に細胞をヘキスト3343で30分間染色した。細胞あたり5PFUのMOIでMVA−ΔE3L(ΔE3L)、非組換えMVA(MVA)もしくはMVA−E3rev(E3rev)を感染させるか、または疑似感染させた(mock)CEF細胞の顕微鏡写真を撮影した。(C)細胞あたり5および20PFUのMOIで、MVA−ΔE3L(□、1番目)、MVA(□、2番目)またはMVA−E3rev(□、3番目)を感染させたCEF細胞について、感染後16および24時間後にヘキスト3343で染色したアポトーシス細胞数を数えた。結果を、平均値/3×SEMとして示す。疑似感染させたCEFを、4番目に淡灰色で示す。(D)細胞あたり5および20PFUのMOIでMVA−ΔE3L(□)、MVA(□)もしくはMVA−E3rev(□)を感染させたCEF細胞または非感染CEF細胞において、DEVD切断の誘導を測定した。DEVD切断活性は、材料および方法の項目に記載したように各混合物から10μl試料を3連で測定した。結果を、平均値/3×SEMとして示す。 アポトーシスの用量依存性および時間依存性を示す図。(A)アポトーシスの感染用量依存性を、疑似感染させたCEF細胞(淡灰色、4番目)、またはMVA−ΔE3L(□、1番目)、MVA(□、2番目)およびMVA−E3rev(□、3番目)に感染させた細胞についてELISAにより測定した。細胞死検出ELISAを、感染16時間後に製造業者の指示に従って実施した(ロシュ ダイアグノスティックス(Roche Diagnostics)。405nm(対照:490nm)における吸光度を測定した。結果を、平均値/2×SEMとして示す。(B)アポトーシスの時間依存性を、細胞あたり20PFUのMOIでMVA−ΔE3L(□)、MVA(□)もしくはMVA−E3rev(□)を感染させるか、または疑似感染させたCEF細胞について分析した。細胞を表示した時点でハーベストし、終夜固定し、ヨウ化プロピジウムで染色し、フローサイトメトリーにより分析した。 CEFにMVA−ΔE3Lを感染させた後のニワトリI型IFNの合成を示す図。6ウェル組織培養プレートで増殖させたCEF単層に細胞あたり10IUのMVA−ΔE3L(C)、MVA(B)、MVA−E3rev(D)、野生型ワクシニアウイルスCVA(A)を接種した。細胞を含まない上清を感染後24時間目に採取し、ニワトリI型IFNの活性について、組換えニワトリIFN(recIFN、250U/ml)と比較して試験した。 CEFにおけるMVA感染に対するIFN処理の効果を示す図。CEF単層を漸増量の組換えニワトリI型IFNとともに24時間インキュベートした後、培養物に低MOIでMVA、MVA−ΔE3LもしくはMVA−E3revを、または比較のためにワクシニアウイルスCVAもしくはWRを感染させた。感染後48時間目に細胞単層を固定し、ウイルス感染細胞巣を、ワクシニアウイルス特異的免疫染色を用いて可視化した。 E3Lレスキューによる組換えMVAの生成およびCEF細胞における増殖選択を示す図。(A)MVAゲノムの模式的マップ(HindIII制限マップ)およびベクタープラスミドpIII−E3L−PmH5−gfpの模式的マップを示す。flank−1およびflank−2は、外来遺伝子ならびに選択マーカーE3LをMVAゲノム内の欠失IIIの部位へと導くDNA配列に相当する。外来遺伝子は、改変型のワクシニアウイルス初期/後期プロモーターPmH5により制御される。(B)ウイルスDNAのPCR分析。組換えMVA−PmH5−gfp(recMVA)の8種のクローン、または非組換えMVA(WT)から単離されたゲノムDNA、およびプラスミドpIII−E3L−PmH5−gfp DNAを鋳型DNAとして、固有のDNAフラグメントを増幅させた。1kb DNAラダーをDNAフラグメントの分子量のための標準として用いた。

Claims (19)

  1. MVA ORF 050L遺伝子またはその機能的部分がウイルスゲノムにおいて不活性化されていることを特徴とするMVAノックアウト変異体。
  2. MVA ORF 050L遺伝子またはその機能的部分がウイルスゲノムからの欠失により不活性化されていることを特徴とする、請求項1に記載のMVAノックアウト変異体。
  3. 請求項1または2に記載の前記MVAに感染していることを特徴とする宿主細胞。
  4. 真核細胞である請求項3に記載の宿主細胞。
  5. BHK−21細胞、BS−C−1細胞、MA104細胞またはCV−1細胞である請求項4に記載の真核細胞。
  6. 請求項3〜5のいずれか一項に記載の宿主細胞を請求項1または2の組換えMVAに感染させる工程と、
    該宿主細胞を、MVA ORF 050L遺伝子をコードするか、または機能的に同等のMVA ORF 050L由来ポリペプチドをコードする配列を含むDNAベクター構築物でトランスフェクションする工程と、
    CEF細胞、ニワトリ胚由来LSCC−H32細胞または鳥類の細胞で増殖させることにより、復元されたMVAを選択する工程と、
    からなる、組換えMVAを作製する方法。
  7. 前記構築物が外来タンパク質をコードするDNA配列をさらに含む、請求項6に記載の
    方法
  8. 前記外来タンパク質が治療用ポリペプチドおよび病原性因子からなる群に由来する異種ポリペプチドである、請求項7に記載の方法
  9. 前記治療用ポリペプチドがt−PAまたはインターフェロンからなる請求項8に記載の方法
  10. 前記異種ポリペプチドが、ウイルス、細菌、原虫および寄生体ならびに腫瘍細胞もしくは腫瘍関連抗原、またはそれらの機能的部分からなる、請求項8に記載の方法
  11. 前記ウイルスがインフルエンザウイルス、麻疹および呼吸器合胞体ウイルス、デング熱ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ヒト肝炎ウイルス、ヘルペスウイルスまたは乳頭腫ウイルスからなる群から選択される、請求項10に記載の方法
  12. 前記原虫が熱帯熱マラリア原虫である請求項10に記載の方法
  13. 前記細菌が結核を引き起こすマイコバクテリアである請求項10に記載の方法
  14. 前記腫瘍関連抗原が、黒色腫関連分化抗原癌・精巣抗原、および腫瘍上で過剰発現する非変異の共通抗から選択される、請求項10に記載の方法
  15. 前記MVA ORF 050Lおよび外来タンパク質コード領域がそれぞれ、MVAゲノム内の非必須部位に隣接するDNA配列に隣接している、請求項〜14のいずれか一項に記載の方法
  16. 前記非必須部位はMVAゲノム内の欠失IIIの部位である、請求項15に記載の方法
  17. プラスミドである、請求項〜16のいずれか一項に記載の方法
  18. 前記鳥類の細胞はウズラ線維芽細胞QT6またはQT35細胞である請求項6に記載の方法。
  19. 前記黒色腫関連分化抗原はチロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質1および2であり、前記癌・精巣抗原はMAGE−1、2、3、およびBAGEであり、前記腫瘍上で過剰発現する非変異の共通抗原はHer−2/neu、MUC−1およびp53である請求項14に記載の方法。
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