JP4406561B2 - ワクシニアウイルスmvaのe3lノックアウト変異体およびその使用 - Google Patents
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Description
めに特別に培養されたウイルス株が長年にわたって知られている。したがって、ニワトリ胚線維芽細胞でワクシニアウイルスのAnkara株(CVA)を長期間連続して継代培養することにより、改変ワクシニアウイルスAnkara(MVA)を育成することが可能となっている(総説については、非特許文献4および特許文献3を参照)。MVAウイルスは、ブダペスト条約の要件に従って、CNCM(フランス国75724 パリ セデックス15 リュ ド ドクトゥール ルー 25(25,rue de Docteur Roux,75724 Paris Cedex 15)に所在のパスツール研究所(Institut Pasteur)、Collectione Nationale
de Cultures de Microorganisms)に、1987年12月15日に寄託番号I−721として寄託された。
本発明によれば、MVA ORF 050L遺伝子またはその機能的部分(機能を有する部分)がウイルスゲノムにおいて不活性化されていることを特徴とする新規なMVAノックアウト変異体が提供される。
代替例として、E3L機能に欠陥のある組換えMVAを、配列突然変異誘発、例えば挿入突然変異誘発によりフレームシフトを導入して機能的E3Lタンパク質合成の不活性化をもたらすか、またはE3L遺伝子の転写を特異的に阻害することにより、作製してもよい。この組換えMVAは、外来遺伝子を導入してその後トランスフェクションされた株を選択する方法、すなわち組換えMVAを作製する方法において用いるのに好都合である。
28巻、1137ページ)を用いて、ウイルスゲノムからE3Lコード配列が欠失した変異MVA(MVA−ΔE3L)を作製した。BHK−21細胞の感染時に実施したウイルスタンパク質のウエスタンブロット分析により、前記ウイルスがE3Lタンパク質を産生できないことが示された。BHK−21細胞中の増殖能力について比較したところ、MVA−ΔE3Lは元の非変異MVA F6と同程度の効率で複製した(図2D)。
E3Lタンパク質またはE3L由来ポリペプチドをコードするDNA配列と外来ポリペプチドをコードするDNA配列とを含み、いずれのDNA配列も、MVAゲノム内の非必須部位(例えば欠失IIIなどの天然に存在する欠失部位など)に隣接するDNA配列に隣接しているDNA構築物を、細胞、好ましくは真核細胞に導入する。好ましい真核細胞は、相同的組換えが可能なようにMVA−ΔE3Lを生産的に感染させた、BHK−21細胞(ATCC CCL−10)、BSC−1細胞(ATCC CCL−26)、CV−1細胞(ECACC 87032605)またはMA104細胞(ECACC 8510
2918)である。ひとたびDNA構築物が真核細胞に導入され、E3LをコードするDNAおよび外来DNAがウイルスDNAと組換えられれば、ウイルスの増殖を支持するためにE3Lの機能を必要とする細胞、例えばCEF細胞で継代することにより、所望の組換えワクシニアウイルスMVAを単離することが可能である。組換えウイルスのクローニングは、プラーク精製として知られている方法により可能である(例えばナカノら(Nakano et al.)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、第79巻、1593〜1596ページ(1982年)、フランケら(Franke et al.)、Mol.Cell.Biol.1918〜1924ページ(1985年)、チャクラバーチら(Chakrabarti et al.)、Mol.Cell.Biol.3403〜3409ページ(1985年)、ファシら(Fathi et al.)、Virology 97〜105ページ(1986年)を参照)。
DNA構築物は、MVAゲノム内の非必須部位(例えば欠失III部位)の左右に隣接する配列を含んでいてよい(サッター ジーおよびモス ビー(Sutter,G.and Moss,B.)(1992年)Proc.Natl.Acad.Sci.USA、第89巻、10847〜10851ページ。
外来DNA配列は、例えばt−PAもしくはインターフェロンなどの治療用ポリペプチドをコードする遺伝子、または病原性因子由来の遺伝子であってよい。病原性因子とは、疾病を引き起こし得るウイルス、細菌および寄生体、ならびに生物体内で無制限に増殖することにより病的に増殖する腫瘍細胞であると理解されたい。そのような病原性因子の例は、デビス,ビー.ディー.ら(Davis,B.D.et al.)の著書(Mocrobiology、第3版、Harper International Edition)に記載されている。病原性因子の好ましい遺伝子は、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルスおよび呼吸器合胞体ウイルス、デング熱ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス(例えばHIV IやHIV II)、ヒト肝炎ウイルス(例えばHCVやHBV)、ヘルペスウイルス、パピローマウイルス、熱帯熱マラリア原虫、および結核を引き起こすマイコバクテリア、の遺伝子である。
第101巻、482〜492ページ(1983年))、リポソーム(ストラウビンガーら(Straubinger et al.)、Methods in Enzymology、第101号、512〜527ページ(1983年))、スフェロプラスト(シャフナー(Schaffner)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、第77巻、2163〜2167ページ(1980年))、または当業者に知られている他の方法を用いたトランスフェクションにより細胞内に導入することが可能である。リン酸カルシウム沈殿によるトランスフェクションを用いることが好ましい。
1.1 MVAおよびMVA−ΔE3Lウイルスの増殖
MVAウイルスは、ニワトリ胚線維芽細胞(CEF)培養物で起源株CVAを連続継代することにより生産された、著しく弱毒化されたワクシニアウイルスである。ワクシニアMVA株の生産の歴史、特性および用途の一般的な総説については、メイルら(Mayr
et al.)によりInfection、第3巻、6〜14ページ(1975年)に発表された概説を参照することが可能である。CEFへの適応の結果として、他の細胞系でのMVAウイルスの増殖は著しく制限される。例外的に、よく特性解析され、維持が容易な細胞株であるベビー・ハムスター腎臓細胞(BHK−21)は、MVAを増殖させ、
効率の高いCEFと同程度に効率良く組換え遺伝子を発現させるので、発現ベクターおよび組換え生ワクチンの開発における標準化されたMVA増殖用に推奨されている(ドレクスラーら(Drexler et al.)、1998年、J.Gen.Virol.第79巻、347〜352ページ)。
KG)[D−7209ドイツ連邦共和国ゴスハイム(Gosheim)所在]で室温、2000rpmで5分間遠心分離して沈降させた。細胞沈降物を最初の容積の4分の1容の培地Iに懸濁し、このようにして得られたCEF細胞を細胞培養皿に広げた。細胞を培地I中で37℃のCO2インキュベーター内で所望の細胞密度に応じて1〜2日間増殖させ、直接感染させるかまたはさらに1〜2回細胞を継代してから感染させるために用いた。初代培養物の調製に関する明確な説明は、アール.アイ.フレシュニー(R.I.Freshney)の著書「Culuture of animal cell」、アラン アール.リス出版(Alan R.Liss Verlag)[ニューヨーク所在](1988年)第11章99ページ以降に記載されている。
可能な限り純粋で、宿主細胞に特異的な成分を含まないウイルス調製物を得るために行った精製工程は、MVAおよびWRウイルスの場合と同じであった(ジョクリク(Joklik)、Virology、第18巻、9〜18ページ(1962年)、ツアルトウら(Zwartouw et al.)、J.gen.Microbiol.第29巻、523〜529ページ(1962年))。予め感染させてから−30℃で保存した細胞培養物を解凍し、残っている細胞をプラスチック基材から振り落とすか、またはかき落とし、遠心分離(Sorvall(登録商標)遠心分離機、GSAローター、5000rpm、10℃で1時間)により細胞とウイルスを培地から取り出した。ウイルスおよび細胞小片からなる沈降物をPBS(沈降物の容積の10〜20倍)に1回懸濁し、懸濁液を上記の
ように遠心分離した。新たな沈降物を10倍量のRSB緩衝液(10mM トリス−HCl pH8.0、10mM KCl、1mM MgCl2)に懸濁し、残りの依然として無傷の細胞を崩壊させ、細胞膜からウイルス粒子を放出させるために超音波で短時間処理した(直径4mmのチップを装着したLabsonic 1510、ベンダーアンドホベイン(Bender and Hobein)[スイス チューリッヒ所在]から入手可能、60ワット、室温で2×10秒)。細胞核および比較的大きな細胞の破片は、続いて懸濁液を短時間遠心分離して除去した(Sorvall(登録商標)GSAローター、デュポン社(DuPont Co.)[D−6353ドイツ連邦共和国バド ナウハイム(Bad Nauheim)所在]から入手可能、3000rpm、10℃で3分間)。沈降物を、上記のように再度RSB緩衝液に懸濁し、超音波で処理し、遠心分離した。回収した、遊離ウイルス粒子を含む上清を合わせ、10mMトリス−HCl、pH8.0中35%ショ糖10mlのパッド上に重層し、Kontron TST28.38/17ローター(コントロンインストルメンテ(Kontron Instrumente)[スイス チューリッヒ所在];ベックマン(Beckman)SW 27ローターに相当)中で14000rpm、10℃で90分間遠心分離した。上清を傾瀉し、ウイルス粒子を含む沈降物を10mlの10mMトリス−HCl、pH8.0に溶解し、超音波で短時間処理し(室温で2×10秒、上記の装置)、さらに精製するため段階的勾配に供した。勾配の各段階はそれぞれ10mMトリス−HCl、pH8.0に溶解したショ糖5mlからなるものとした(ショ糖濃度段階:20%、25%、30%、35%および40%)。勾配試料をKontron TST28.38/17ローターで14000rpm、10℃で35分間遠心分離した。この遠心分離の後、ウイルス粒子を含むいくつかの分離帯が30%ショ糖と40%ショ糖の間の勾配の領域に見えた。この領域を勾配試料からサイフォン作用により排出させ(10ml)、このショ糖溶液をPBS(20ml)で希釈し、この溶液から遠心分離(Kontron TST28.38/17ローター、14000rpm、10℃で90分間)によりウイルス粒子を沈降させた。この時点でほとんど純粋なウイルス粒子のみからなる沈降物を、ウイルス濃度が平均1〜5×109pfu/mlになるようにPBSに溶解した。精製ウイルス保存溶液を、後続の実験のために直接またはPBSで希釈して使用した。
2.1 E3L欠失プラスミドの構築
E3L遺伝子の両側に隣接するMVAゲノムのDNA配列を、MVA(クローン化分離株F6、CEFで第582継代)のDNAを鋳型として用いたポリメラーゼ連鎖反応により増幅した。E3Lの上流隣接領域のプライマーは、5’−ATATGATTGGGCCCACTAGCGGCACCGAAAAAGAATTCC−3’(下線部はApaI部位)および5’−GTCAATAGCGGCCGCAGACATTTTTAGAGAGAACTAAC−3’(下線部はNotI部位)であった。下流領域のプライマーは、5’−TACATGAAACGCGTTCTATTGATGATAGTGACTATTTC−3’(下線部はMluI部位)および5’−GTTACGTCGGATCCAGATTCTGATTCTAGTTATC−3’(下線部はBamHI部位)とした。構築物をApaI/NotIまたはMluI/BamHIで切断し、プラスミドpΔK1L(スタイブら(Staib et al.)、2000年、Biotechniques、第28巻、1137〜1148ページ)の対応する部位に挿入して、E3L欠失プラスミドpΔE3L−K1Lを得た。
変異ウイルスMVA−ΔE3Lを、以前に記載された方法(スタイブら(Staib et al.)、2000年、Biotechniques、第28巻、1137〜1148ページ)を用いて作製した。簡単に述べると、6ウェル組織培養プレート(コスター(Costar)[米国ニューヨーク州コーニング(Corning)所在]で増殖させ
た1×106個のコンフルエントなBHK−21細胞の単層に細胞当たり0.01IUの感染効率(MOI)でMVAを感染させた。感染90分後に、製造業者の推奨に従いリン酸カルシウムを用いてウェル当たり10μgのプラスミドpΔE3L−K1L DNAで細胞をトランスフェクションした(CellPhect(登録商標)トランスフェクションキット、アマシャム・ファルマシア・バイオテク(Amersham Pharmacia Biotech)[ドイツ国フライブルク(Freiburg)所在])。感染48時間後に細胞をハーベストし、凍結−解凍を3回行い、カップ超音波処理器(Sonopuls HD 200[ドイツ国バンデリン(Bandelin)所在])でホモジナイズした。ハーベストした材料を培地で10倍希釈系列とした物(10−1〜10−4)を用いて、6ウェル組織培養プレートで増殖させたRK−13細胞のサブコンフルエントな状態の単層に感染させた。37℃で3日間インキュベートした後、変異MVA−ΔE3Lに感染したRK−13細胞巣を、空気置換ピペットを用いて吸引により20μl容を採取し、500μlの培地を入れた微小遠心チューブに移し、RK−13細胞の単層を新たに感染させるために凍結−解凍と超音波により処理した。RK−13細胞での継代時にすべての親MVAを除去した後、組換えウイルスを10倍希釈系列とした物(10−1〜10−6)を用いて、6ウェル組織培養プレート(コスター(Costar)[米国ニューヨーク州コーニング(Corning)所在]で増殖させたサブコンフルエントな状態のBHK−21細胞に感染させた。良く分離された感染BHK−21細胞巣をハーベストし、K1L陰性の変異MVA−ΔE3Lを単離した。
倍希釈物を用いてブロッキング緩衝液中で1時間探索した。洗浄した後、ペルオキシダーゼとコンジュゲートしたポリクローナルヤギ抗マウス抗体(IgG(H+L)、カタログ番号111−035−114、ディアノバ(Dianova)[ドイツ国ハンブルク所在]、希釈率1:10000)をブロッキング緩衝液で5000倍希釈したものと共にブロットを1時間インキュベートし、再び洗浄し、Kodak x−Omatフィルムを用いて高感度化学発光法(ECL、製造業者)による可視化により現像した。
低率増殖プロファイルを測定するために、CEFまたはBHK−21単層に細胞当たり0.05感染単位(IU)のMVA、MVA−ΔE3LまたはMVA−E3revを感染させた後、ウイルスの増幅をモニターした。5IUの感染効率(MOI)で細胞を感染させて、MVA、MVA−ΔE3LまたはMVA−E3revの1段階の増殖を分析した。すべての感染実験に、6ウェル組織培養プレートで増殖させたコンフルエントな単層を用いた。37℃で60分間ウイルスを吸着させた後、接種物を除去した。感染細胞をRPMI 1640で2回洗浄し、10%FCSを含む新鮮RPMI 1640培地とともに5%CO2雰囲気中37℃でインキュベートした。感染後(p.i.)複数の時点で感染細胞をハーベストし、凍結−解凍と短時間の超音波処理によりウイルスを放出させた。得られた溶解物の段階希釈物を6ウェル組織培養プレートで増殖させたコンフルエントなBHK−21単層上で2連で平板培養した。ウイルス感染細胞のワクシニアウイルス特異免疫染色のために、48時間p.i.の時点で培地を除去し、細胞をアセトン:メタノール(1:1、1ml/ウェル)で短時間固定した。洗浄し、PBS−2%FCS中でブロッキングした後、細胞をポリクローナルウサギ抗ワクシニア抗体(IgGフラクション、バイオジェネシス社(Biogenesis Ltd.)[英国プール(Poole)所在]、カタログ番号9503−2057、PBS−3%FCSで1:10000に希釈)とともに60分間インキュベートした。細胞をPBSで洗浄した後、ペルオキシダーゼとコンジュゲートしたポリクローナルヤギ抗ウサギ抗体(例えば、2次抗体の西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートした(IgG(H+L))、カタログ番号111−035−114、ディアノバ(Dianova)[ドイツ国ハンブルク所在]、PBS−3%FCSで1:1000に希釈)を加え、45分間インキュベートした。PBSで洗浄した後、抗体で標識された細胞をジアニシジン(シグマ(Sigma)No.09143)基質溶液で処理し、染色細胞巣を計数し、ワクシニアウイルス・プラーク・アッセイと同様にウイルス力価を計算した(IU/ml)。
ル硫酸ナトリウム(SDS)ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)により分離し、オートラジオグラフィーにより分析した。
events of apoptosis in vitro cell free mitotic extracts: a model system for analysis of the active phase of apoptosis)」、J.Cell.Biol.第123巻、7〜22ページ)で1:10に希釈した。反応は、平底の96ウェルプレートで37℃で1時間、3連で実施した。次いで、ミリポア(Millipore)のCytofluor(登録商標)96リーダーで390nm(励起)および460nm(発光)における蛍光を測定して、遊離AMCを測定した。バックグラウンドの蛍光(緩衝液と基質のみ)を差し引いた値を算出し、平均値および平均値の標準誤差の3倍(平均値/3×SEM)として表した。
ll Death Detection ELISAキット(ロシュ ダイアグノスティックス(Roche Diagnostics)[マンハイム所在]を用い、製造業者の指示に従ってアポトーシスの程度を分析した。概要を述べると、感染後16時間の時点で培地を除去し、細胞を溶解緩衝液中でインキュベートした。溶解後、無傷の核を遠心分離によりペレットとし、上清のアリコートをマイクロタイター・プレートのストレプトアビジンでコーティングしたウェルに移した。試料中に存在するアポトーシス性ヌクレオソームの量を、DNAおよびヒストンに対して作製したマウス・モノクローナル抗体ならびに分光光度分析を用いて測定した。
3.1 ベクタープラスミドの構築
E3Lを用いた選択による組換えMVAの作製を可能にするために、MVAゲノム内に天然に生じる欠失IIIの部位に正確に組換えDNAを挿入するためのMVA隣接配列(flankIII−1およびflankIII−2)を含むpIIIプラスミド・ベクター(サッターおよびモス(Sutter and Moss)1992年、スタイブら(Staib et al.)2000年)を基にして、新規のベクタープラスミドを構築した。プラスミド・ベクターpIII−E3−PsH5を作製するために、MVA E3L遺伝子の完全長コード配列をその本来のプロモーター配列の転写制御下にある状態で含む627bpのDNAフラグメントをPCRにより調製し、クレノウ(Klenow)で処理し、BamHI切断部位を介してプラスミドpLW9のflankIII−1およびflankIII−2のDNA配列の間に挿入した(ウイアット,エル.ら(Wyatt
L.et al.)、1996年、Vaccine、第14巻、1451〜1458ページ)。gfp読み取り枠を含む723bpのDNA断片を、制限エンドヌクレアーゼBamHIおよびNotIを用いてpEGFP−N1(クロンテックラボラトリーズ(CLONETECH Laboratories)GmbH[ドイツ国ハイデルベルク所在])から切り出し、Klenowポリメラーゼで処理し、pIII−E3−PsH5のSmaI切断部位に挿入して、pIII−E3−PsH5−gfpを得た。
6ウェル組織培養プレート(コスター(Costar)[米国ニューヨーク州コーニング(Corning)所在]で増殖させた1×106のコンフルエントなBHK−21細胞の単層に、細胞あたり0.01IUの感染効率(MOI)でMVA−ΔE3Lを感染さ
せた。感染90分後に、リン酸カルシウムを用いて製造業者の推奨に従いウェル当たり10μgのpIII−E3−PsH5−gfp DNAで細胞をトランスフェクションした(CellPhect(登録商標)トランスフェクションキット、アマシャム・ファルマシア・バイオテク(Amersham Pharmacia Biotech)[ドイツ国フライブルク(Freiburg)所在])。感染48時間後に、細胞をハーベストし、凍結−解凍を3回行い、カップ超音波処理器(Sonopuls HD 200[ドイツ国バンデリン(Bandelin)所在])でホモジナイズした。ハーベストした材料を培地で10倍希釈系列としたもの(10−1〜10−4)を用いて、6ウェル組織培養プレートで増殖させたCEF細胞のサブコンフルエントな単層に感染させた。37℃で3日間インキュベートした後、組換えMVAに感染したCEF細胞巣をGFP合成についてモニターし、空気置換ピペットを用いて20μlの容積を吸引により採取し、500μlの培地を入れた微小遠心チューブに移し、さらにCEF細胞単層に感染させるために凍結−解凍と超音波により処理した。CEF細胞におけるプラーク精製を3回連続して実施した後に、組換えMVA−PsH5−gfpウイルスをCEF単層に感染させて増幅し、DNAをPCRにより分析してウイルス・ストックの遺伝学的均一性を確認した。
(変異MVA−ΔE3Lの作製)
MVAのライフサイクルにおける重要なインターフェロン耐性遺伝子E3Lの意義を評価するために、相同的組換えを用いて、MVAゲノム内のE3L読み取り枠の完全なプロモーター配列およびコード配列をワクシニアウイルスK1L遺伝子発現カセットで置換した(図1A)。このマーカーは、ウサギ腎臓RK−13細胞への感染時に変異ウイルスの厳密な選択的増殖を可能にし、第2段階では、非選択的増殖条件を用いて、隣接する反復DNA配列間のさらなる相同的組換えにより同マーカーが再び簡単に除去される(スタイブら(Staib et al.)2000年)。E3L遺伝子配列が欠失した組換えMVAを、RK−13およびBHK−21細胞単層での数回のプラーク精製中に単離した。プラークのクローニング中、予想されたゲノム変異をPCRによりモニターした(図1B)。一次ウイルス・ストックをBHK−21細胞上で増幅し、ウイルスDNAのサザンブロット分析により再評価し(図1C)、MVA−ΔE3Lと命名した。アラビノシドCの存在下または非存在下で調製した細胞溶解物のウエスタンブロット分析から、野生型MVAを感染させた細胞でのE3Lタンパク質の合成が確認されたが、MVA−ΔE3Lを感染させた後にはE3Lポリペプチドを検出することは不可能であった(図1D)。
MVA−ΔE3Lの2次ウイルス・ストックを作製するために、コンフルエントなCEF単層に低い感染効率(MOI)で感染させたが、驚くべきことに、ウイルスは増殖しなかった。宿主域の表現型を想定して、BHK−21細胞およびCEF細胞の感染後のウイルス増殖を比較分析しようとした。増殖の欠如は、ウイルスの複製または伝播の欠陥に起因している可能性があった。最初に、細胞当たり0.1感染単位(IU)でMVAまたはMVA−ΔE3Lを細胞に感染させる多段階増殖実験においてウイルスの収率を測定した(図2A、2B)。この感染効率では、BHK−21細胞内でのMVAおよびMVA−ΔE3Lの複製と伝播はほぼ同じであり、感染後20時間〜48時間で達した感染力の力価のピークは非常に類似していた(図2A)。予想通り、MVAはCEF細胞中では効率よく複製された。これに対して、CEFにおけるMVA−ΔE3Lの力価は感染させた力価と比較して絶え間なく低下し、生産的ウイルス増殖が事実上ないことが示唆された(図2B)。さらに、10のMOIを用いて感染させて1段階のウイルス増殖を分析したが、再びBHK−21細胞中ではMVAとMVA−ΔE3Lの増殖能力が同等であることを見出した。多段階増殖分析からのデータを並べると、感染後8、22または48時間にCEF中で検出されたMVA−ΔE3Lの感染力の力価はウイルス吸着後に認められた感染力のレベルに決して到達しなかった(図2C、2D)。これらの実験からMVA−ΔE3Lは
CEFにおいて特異的な複製上の欠陥を有すると結論した。このような宿主域表現型がE3L遺伝子配列の欠失のみに起因することを検証するために、その本来のプロモーター配列の転写制御下にあるE3L遺伝子をMVA−ΔE3Lのゲノムに再挿入して復帰突然変異MVA−E3revを作製した。概要を述べると、MVA−ΔE3L感染BHK細胞をトランスフェクションするために、完全長のE3L遺伝子発現カセットならびにそのゲノム上の隣接配列からなるDNA断片を含むプラスミド・ベクターpE3Lrevを用いた。復帰突然変異ウイルスMVA−E3revは、CEF単層におけるプラーク精製により容易に単離可能であった。E3Lが安定に再挿入されたことがMVA−E3revゲノムDNAを用いたPCRにより確認され、細胞溶解物のウエスタンブロット分析により野生型MVAと同等のレベルでE3Lタンパク質が合成されることが明らかになった(データは示さず)。追加のスクリーニングまたは選択を実施する必要なしにMVA−E3revを単離可能であったという事実が既に、CEFにおけるMVA−ΔE3Lの増殖不全を首尾よく復帰変異させたことを示唆していた。それに対応して、BHK−21細胞およびCEF細胞の両方におけるMVA−E3revの多段階および1段階増殖分析において、ウイルス複製のレベルが野生型MVAと同様であることを見出した(図2A〜D)。以上のデータから、我々は、このウイルスが長期間継代されて生育してきた細胞培養系であるCEFにおいて、MVAの複製を維持するためにE3Lの機能が必要であると結論した。
CEFのMVA−ΔE3Lへの非許容感染をより十分に解析するために、感染性ウイルス子孫が生産されないことがウイルスのタンパク質合成の低下に起因するかどうかを測定しようとした。CEFおよびBHK細胞を、MVA、MVA−ΔE3LまたはMVA−E3revを感染させた後の様々な時点で[35S]メチオニンで代謝的に標識した。各標識期間の後に、溶解物を調製し、SDS−PAGEおよびオートラジオグラフィーにより分析した。MVAを感染させたBHK細胞では、後期ウイルスタンパク質合成が感染5時間後に起こり、感染10時間後には細胞のタンパク質合成を強力に遮断して顕著となった(図3A)。MVA−ΔE3LまたはMVA−E3revを感染させたBHK細胞ではウイルスタンパク質について同様のパターンが認められた(図3A)。MVAまたはMVA−E3revを感染させたCEFでは、豊富な後期ウイルスタンパク質合成が感染5時間後および10時間後に認められた(図3B)。これに対して、MVA−ΔE3Lを感染させたCEF細胞では、ウイルスのタンパク質産生に特異的なポリペプチドのバンドを検出することはほとんど不可能であった(図3B)。感染5時間後の時点で、一般的な後期ウイルスタンパク質と移動度が等しいいくつかの弱いポリペプチドのバンドが、宿主細胞のタンパク質合成の顕著な遮断を伴って見られるようになった。
ウイルスタンパク質合成の顕著な停止とウイルスDNA複製の能力維持とを特徴とするこの感染表現型は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞へのワクシニアウイルスの非許容感染(スペーナーら(Spehner et al.)、1988年、ラムゼイ−エウイングおよびモス(Ramsey−Ewing and Moss)、1995年)を想起させるものであった。ワクシニアウイルスのCHOへの不稔感染にはアポトーシスの誘導を伴うが、これは牛痘ウイルス遺伝子CHOhrの同時発現により回避し得る(インクら(Ink et al.)、1995年、ラムゼイ−エウイングおよびモス(Ramsey−Ewing and Moss)、1998年)。さらに、またワクシニアのE3L遺伝子産物がワクシニアウイルスに感染したHeLa細胞においてアポトーシスの誘導を阻害するとの報告もある(リーおよびエステバン(Lee and Esteban)、1994年、キブラーら(Kibler et al.)、1997年)。MVA−ΔE3Lによる感染24時間以内に光学顕微鏡によりCEF培養物をモニターすると異常な細胞収縮が観察されたので、CEF細胞におけるMVA−ΔE3Lの増殖制限がアポトーシスに関連している可能性があるかどうかを探求することは重要であると思われる。アポトーシスに関する最初の標準的アッセイでは、ヌクレオソームの「DNAラダー」(ウイリーら(Wyllie et al.)、1980年)に相当する180bp多量体へのDNAの特徴的な切断についてモニターした。MVA−ΔE3L、MVAまたはMVA−E3revのいずれかを感染させたCEF培養から細胞の全DNAを単離し、アガロースゲル電気泳動により分離し、臭化エチジウム染色により可視化した。16時間および24時間MVA−ΔE3Lを感染させたCEF細胞の試料において、アポトーシスを示唆する細胞DNAの典型的な断片化が観察された。これに対して、MVAまたは復帰突然変異ウイルスMVA−E3revを感染させたCEF細胞の試料ではそのようなDNAのラダー形成は検出されなかった(図4A)。アポトーシスの他の特徴は、核外ヌクレオソームの出現である。したがって、CEFの培養物をヘキスト3343で染色し、個々の細胞におけるアポトーシス小体についてスクリーニングした。MVA−ΔE3Lの感染16時間後に、ヘキスト3343で広範に染色された細胞質の空胞を容易に検出可能であった(図4B)。さらに、このアッセイでは、300〜500個の細胞を含む無作為に選択した範囲において細胞外染色を有する細胞の割合を測定することによりアポトーシス細胞の数を定量することが可能であった(3連で実施、図4C)。MVA−ΔE3Lによる感染後には、細胞あたり5IUの感染効率を用いた場合で全細胞の約20%にアポトーシスの明らかな徴候が認められた。細胞あたり20IUの感染効率で行った実験では、アポトーシス細胞の割合は約30%に増加した。これに対して、野生型MVAまたは復帰突然変異ウイルスMVA−ΔE3revを感染させた細胞で最高4%、および疑似感染細胞のわずか1%が核外染色について陽性として計数された。このアポトーシス過程がDNAレベルのみで起こるのではないことを示すために、特異的ペプチド基質Asp−Glu−Val−Asp(DEVD)を用いてカスパーゼによる細胞内タンパク質分解を調べた(サルベセンおよびディキシト(Salvesen and Dixit)、1997年)。確立された蛍光アッセイを用いて、感染16時間後にCEFから調製した細胞抽出物におけるDEVD切断活性を測定した(リンシンガーら(Linsinger et al.)、1999年)。この場合も、MVA−ΔE3Lによる感染後には著しく増強されたDEVD切断活性が認められたが、MVAまたはMVA−E3rev感染細胞からの抽出物では検出可能な活性があるとしてもごくわずかしか含んでいなかった(図4D)。これらの結果は、CEFにおけるMVA−ΔE3Lの増殖不全はアポトーシスの誘導に関連していることを明確に示していた。
たが、約30%の細胞がヘキスト染色でアポトーシス細胞と評価されたにすぎなかった。したがって、最初に、アポトーシスの度合に関してMVA−ΔE3Lを一層注意深く力価測定することに関心が払われた。CEF細胞に1、5、10または20IUのMVA−ΔE3L、MVAまたはMVA−E3revを感染させ、感染16時間後にマウス・モノクローナル抗体によるアポトーシス性ヌクレオソームを特異的に検出するELISAを用いてアポトーシスを定量した(Cell Death Detection ELISAキット、ロシュ ダイアグノスティックス(Roche Diagnostics)[マンハイム所在])(図5A)。細胞あたりの最低用量1IUのMVA−ΔE3Lを接種したCEFに明らかなアポトーシスの徴候が見出された。感染に用いるMVA−ΔE3L量の増加に伴いアポトーシスのレベルが一貫して増大したのに対して、さらに高い用量でMVAまたはMVA−E3revを感染させてもバックグラウンドレベルをわずかに超える量の細胞死がもたらされたに過ぎなかった。ヘキスト染色によるアポトーシス細胞の計数の精度は、感染細胞単層の取り扱い時にアポトーシス細胞の一部が脱離して分析の対象から外れると思われるため、限られたものであった可能性がある。MOI20での感染後に存在する細胞死の割合を分析する別のプロトコールを用いるために、アポトーシス状態の核をヨウ化プロピジウムで染色し、様々な時点でフローサイトメトリーにより計数した(ニコレッティら(Nicoletti et al.)、1991年)。MVA−ΔE3Lを感染させてから6時間という早い時点で、MVAまたはMVA−E3revを感染させたCEFと比較してアポトーシス状態の核の数が多いことが検出された(図5B)。後続の時点ではMVA−ΔE3L感染CEFにおける死細胞の割合は連続的に増加し、感染24時間後に全細胞の約70%になった。このデータは、MVA−ΔE3L感染CEFで認められるアポトーシスの程度と動態とがタンパク質およびDNAの合成の低下を特徴とする増殖制限を示す表現型と相関することを示唆していた。
E3Lが欠失したワクシニアウイルスWRによるHeLa細胞におけるアポトーシスの誘導は、IFNにより調節される主要な抗ウイルス酵素PKRおよびRNaseLの活性化を妨げる強力なdsRNA結合タンパク質としてのE3Lの機能に関連づけられている(リーおよびエステバン(Lee and Esteban)、1994年;キブラーら(Kibler et al.)、1997年)。このワクシニアウイルス変異体の他の特有な特徴は、IFN処理に対するその高い感受性である(ベアッティーら(Beattie et al.)、1991年;ベアッティーら(Beattie et al.)、1995年)。興味深いことに、ワクシニアウイルス・コペンハーゲン感染時においても、E3L機能の欠失はインターフェロン調節因子3(IRF−3)の活性化によるIFN−β合成の誘導をもたらす。したがって、MVA−ΔE3LによりCEFを感染させた後のIFNの存在についてモニターし比較することを試みた。我々は6ウェル組織培養プレートで増殖させたCEF単層に細胞あたり10IUのMVA−ΔE3L、MVA、MVA−E3rev、野生型ワクシニアウイルスCVA、またはWRを接種した。細胞を含まない上清を感染24時間後に収集し、確立されたアッセイを用いて組換え型ニワトリIFN(recIFN、250U/ml)と比較してニワトリI型IFNの活性について試験した(図6)。野生型ワクシニアウイルスCVAを感染させた細胞の上清は、検出可能なIFN活性を含んでいなかった(図6A)。同じ結果がワクシニアウイルスWRの感染後にも得られた(データは示さず)。これに対して、MVA感染CEFの培地にはIFN活性が明らかに存在していた(図6B)。驚くべきことに、最高レベルのIFNがMVA−ΔE3L感染後に認められ、対照として用いたrecIFNで得られた活性と同程度の活性に達した(図6C)。MVA−E3revの感染後にも、より低いレベルではあるが、変異型でないMVAの感染後と同等のIFN活性が検出された(図6D)。このデータは既に、MVAによるCEFの許容感染が生物学的に活性なI型IFNの蓄積を誘発し、一方、MVA−ΔE3Lの非許容感染はさらに多くのIFNを産生させることを示すものであった。
哺乳動物細胞へ感染させた場合、ワクシニアウイルスの複製はIFN活性に対して比較的抵抗性であることが認められている。興味深いことに、このことは、ニワトリのインターフェロンによる前処理がワクシニアウイルスの増殖を阻害し得るCEF培養物の場合には異なるようである。MVA感染に対するIFNの効果を測定するために、CEF単層を漸増量の組換え型ニワトリI型IFNで24時間前処理してから、該培養物を低いMOIでMVA、MVA−ΔE3LもしくはMVA−E3rev、または比較のためにワクシニアウイルスCVAもしくはWRに感染させた。感染48時間後に細胞単層を固定し、ウイルス感染細胞巣をワクシニアウイルス特異免疫染色により可視化した(図7)。ワクシニアウイルスCVAまたはWRの感染後には、疑似感染処理または低量のIFN(培地1mlあたり1または10U IFN)で処理した単層において形成されたような多数のウイルスプラークが示された。さらに、培地1mlあたり10UのIFNを存在させると、通常より小さいウイルスプラークが少なくなった。培地1mlあたり100UのIFNまたは培地1mlあたり1000のIFNとプレインキュベートした単層にはもはやプラーク形成は検出されなかった(データは示さず)。MVA感染CEFを免疫染色した結果、細胞単層から離れていない状態のウイルス陽性細胞巣が認められ、MVA感染による一般的な細胞変性が比較的低いことが実証された。このようなプラーク表現型の差があるにもかかわらず、IFN処理した際のMVA感染細胞巣の形成は、ワクシニアウイルスWRまたはCVAで認められるプラーク形成と非常に類似していた。培地1mlあたり最高10UまでのIFNで処理した単層にはMVA感染細胞が認められた。この後者の量は細胞巣の数と大きさに明らかに影響を及ぼし、一方、より高いIFN濃度では完全な増殖阻害がもたらされた。これと非常に対照的に、MVA−ΔE3Lを接種した単層にはIFN処理とは関係なく検出可能なウイルス感染細胞は存在せず、この変異体がCEFにおいて生産的に複製することは不可能であることが確認される。これに対して、MVA−E3rev感染では、野生型MVAで確立されたパターンと同じ細胞巣形成が再び認められた。このデータは、CEFにおけるワクシニアウイルス感染の相対的なIFN感受性を示唆した以前の試験を裏付けるものであり、また、CEF適応MVAのIFNによる阻害がワクシニアウイルス株WRおよびCVAの感染時に認められるIFN効果と非常に類似していることをさらに示していた。
ワクシニアウイルス感染における単一遺伝子依存的な宿主域表現型を、変異ウイルスゲノムへの該宿主域遺伝子の再挿入による効率のよい組換えウイルスの選択に見事に用いることが可能である。CEFにおけるMVA−ΔE3Lの増殖制限がそのような宿主域選択を可能にするものであるかどうかを確認するために、MVAゲノム内の欠失IIIの部位へ、その本来のプロモーターの転写制御下にあるE3Lコード配列を再導入することを目的として、MVA挿入プラスミドを構築した。ワクシニアウイルス特異的プロモーターPmH5とともに発現させるモデル組換え遺伝子として機能するA.victoriae gfp遺伝子の発現カセットを付加することにより、MVAベクタープラスミドpIII−E3L−PH5−gfpが得られた(図7A)。このプラスミドをMVA−ΔE3Lに感染したBHK−21細胞へトランスフェクションした後、ウイルス特異的細胞変性効果を示す多くの細胞の間にgfp遺伝子を発現しているいくつかの細胞群が認められた。このことは、組換えMVAが形成されたことを示唆するものであった。CEFにおけるウイルス増殖の選択的復元について試験するために、トランスフェクション後に得られたウイルス材料の10倍希釈物を6ウェル組織培養プレートで増殖させたCEF単層に接種した。3日後、事実上すべてがGFP産生細胞を含むウイルスプラークの形成が認められた。CEFでさらに増幅させるために処理した10個の十分に分離したプラークから、さらに1継代後に組換えMVA−PH5−GFPの8種の単離株を回収した。ウイルスDNAのPCR分析により、すべてのウイルス単離株がそのゲノム内の欠失IIIの部位に安定な
挿入配列を有する本物の組換え体であることが立証された(図7B)。これらのウイルス単離株が容易に得られたことは、CEFにおけるMVAの増殖にはE3Lの機能が本質的に必要であることを反映しており、また、MVA−ΔE3LのE3L特異的な回復を、組換えMVAを作製するための効率的な宿主域選択プロトコールとして提案することが可能であることを示唆している。
Claims (19)
- MVA ORF 050L遺伝子またはその機能的部分がウイルスゲノムにおいて不活性化されていることを特徴とするMVAノックアウト変異体。
- MVA ORF 050L遺伝子またはその機能的部分がウイルスゲノムからの欠失により不活性化されていることを特徴とする、請求項1に記載のMVAノックアウト変異体。
- 請求項1または2に記載の前記MVAに感染していることを特徴とする宿主細胞。
- 真核細胞である請求項3に記載の宿主細胞。
- BHK−21細胞、BS−C−1細胞、MA104細胞またはCV−1細胞である請求項4に記載の真核細胞。
- 請求項3〜5のいずれか一項に記載の宿主細胞を請求項1または2の組換えMVAに感染させる工程と、
該宿主細胞を、MVA ORF 050L遺伝子をコードするか、または機能的に同等のMVA ORF 050L由来ポリペプチドをコードする配列を含むDNAベクター構築物でトランスフェクションする工程と、
CEF細胞、ニワトリ胚由来LSCC−H32細胞または鳥類の細胞で増殖させることにより、復元されたMVAを選択する工程と、
からなる、組換えMVAを作製する方法。 - 前記構築物が外来タンパク質をコードするDNA配列をさらに含む、請求項6に記載の
方法。 - 前記外来タンパク質が治療用ポリペプチドおよび病原性因子からなる群に由来する異種ポリペプチドである、請求項7に記載の方法。
- 前記治療用ポリペプチドがt−PAまたはインターフェロンからなる請求項8に記載の方法。
- 前記異種ポリペプチドが、ウイルス、細菌、原虫および寄生体ならびに腫瘍細胞もしくは腫瘍関連抗原、またはそれらの機能的部分からなる、請求項8に記載の方法。
- 前記ウイルスがインフルエンザウイルス、麻疹および呼吸器合胞体ウイルス、デング熱ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ヒト肝炎ウイルス、ヘルペスウイルスまたは乳頭腫ウイルスからなる群から選択される、請求項10に記載の方法。
- 前記原虫が熱帯熱マラリア原虫である請求項10に記載の方法。
- 前記細菌が結核を引き起こすマイコバクテリアである請求項10に記載の方法。
- 前記腫瘍関連抗原が、黒色腫関連分化抗原、癌・精巣抗原、および腫瘍上で過剰発現する非変異の共通抗原から選択される、請求項10に記載の方法。
- 前記MVA ORF 050Lおよび外来タンパク質コード領域がそれぞれ、MVAゲノム内の非必須部位に隣接するDNA配列に隣接している、請求項7〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記非必須部位はMVAゲノム内の欠失IIIの部位である、請求項15に記載の方法。
- プラスミドである、請求項7〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記鳥類の細胞はウズラ線維芽細胞QT6またはQT35細胞である請求項6に記載の方法。
- 前記黒色腫関連分化抗原はチロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質1および2であり、前記癌・精巣抗原はMAGE−1、2、3、およびBAGEであり、前記腫瘍上で過剰発現する非変異の共通抗原はHer−2/neu、MUC−1およびp53である請求項14に記載の方法。
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