DE10125089A1 - Neue für das mtrA und/oder mtrB-Gen kodierende Nukleotidsequenzen - Google Patents
Neue für das mtrA und/oder mtrB-Gen kodierende NukleotidsequenzenInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein isoliertes Polynukleotid, enthaltend eine Polynukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe a) Polynukleotid, das mindestens zu 70% identisch ist mit einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2 enthält; b) Polynukleotid, das mindestens zu 70% identisch ist mit einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 3 enthält; c) Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die zu mindestens 70% identsich ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2; d) Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die zu mindestens 70% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 3; e) Polynukleotid, das komplementär ist zu den Polynukleotiden von a), b), c) oder d); und f) Polynukleotid, enthaltend mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide der Polynukleotidsequenz von a), b), c), d) oder e); und ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von coryneformen Bakterien, in denen zumindest das mtrA-Gen und/oder das mtrB-Gen abgeschwächt vorliegt, und die Verwendung von Polynukleotiden, die die erfindungsgemäßen Sequenzen enthalten, als Hybridisierungssonden.
Description
Gegenstand der Erfindung sind für das mtrA-Gen und/oder das
mtrB-Gen kodierende Nukleotidsequenzen aus coryneformen
Bakterien und ein Verfahren zur fermentativen Herstellung
von Aminosäuren unter Verwendung von Bakterien, in denen
das mtrA und/oder das mtrB-Gen abgeschwächt wird.
L-Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, finden in der
Humanmedizin und in der pharmazeutischen Industrie, in der
Lebensmittelindustrie und ganz besonders in der
Tierernährung Anwendung.
Es ist bekannt, daß Aminosäuren durch Fermentation von
Stämmen coryneformer Bakterien, insbesondere
Corynebacterium glutamicum, hergestellt werden. Wegen der
großen Bedeutung wird ständig an der Verbesserung der
Herstellverfahren gearbeitet. Verfahrensverbesserungen
können fermentationstechnische Maßnahmen wie zum Beispiel
Rührung und Versorgung mit Sauerstoff, oder die
Zusammensetzung der Nährmedien, wie zum Beispiel die
Zuckerkonzentration während der Fermentation, oder die
Aufarbeitung zur Produktform durch zum Beispiel
Ionenaustauschchromatographie oder die intrinsischen
Leistungseigenschaften des Mikroorganismus selbst
betreffen.
Zur Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser
Mikroorganismen werden Methoden der Mutagenese, Selektion
und Mutantenauswahl angewendet. Auf diese Weise erhält man
Stämme, die resistent gegen Antimetabolite oder auxotroph
für regulatorisch bedeutsame Metabolite sind und die
Aminosäuren produzieren.
Seit einigen Jahren werden ebenfalls Methoden der
rekombinanten DNA-Technik zur Stammverbesserung von
L-Aminosäure produzierenden Stämmen von Corynebacterium
eingesetzt, indem man einzelne Aminosäure-Biosynthesegene
amplifiziert und die Auswirkung auf die Aminosäure-
Produktion untersucht.
Die Erfinder haben sich zur Aufgabe gestellt, neue
Maßnahmen zur verbesserten fermentativen Herstellung von
Aminosäuren bereitzustellen.
Werden im folgenden L-Aminosäuren oder Aminosäuren erwähnt,
sind damit eine oder mehrere Aminosäuren einschließlich
ihrer Salze, ausgewählt aus der Gruppe L-Asparagin, L-
Threonin, L-Serin, L-Glutamat, L-Glycin, L-Alanin, L-
Cystein, L-Valin, L-Methionin, L-Isoleucin, L-Leucin, L-
Tyrosin, L-Phenylalanin, L-Histidin, L-Lysin, L-Tryptophan
und L-Arginin gemeint. Besonders bevorzugt ist L-Lysin.
Wenn im folgenden L-Lysin oder Lysin erwähnt werden, sind
damit nicht nur die Basen, sondern auch die Salze wie z. B.
Lysin-Monohydrochlorid oder Lysin-Sulfat gemeint.
Gegenstand der Erfindung ist ein isoliertes Polynukleotid
aus coryneformen Bakterien, enthaltend eine für das mtrA-Gen
und/oder das mtrB-Gen kodierende Polynukleotidsequenz,
ausgewählt aus der Gruppe
- a) Polynukleotid, das mindestens zu 70% identisch ist mit einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2 enthält,
- b) Polynukleotid, das mindestens zu 70% identisch ist mit einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 3 enthält,
- c) Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die zu mindestens 70% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2,
- d) Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die zu mindestens 70% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 3,
- e) Polynukleotid, das komplementär ist zu den Polynukleotiden von a), b), c) oder d), und
- f) Polynukleotid, enthaltend mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide der Polynukleotidsequenz von a), b), c), d) oder e),
wobei die Polypeptide bevorzugt die Aktivität des Response-
Regulators MtrA und/oder der Histidin-Proteinkinase MtrB
aufweisen.
Gegenstand der Erfindung sind ebenfalls die oben genannten
Polynukleotide, wobei es sich bevorzugt um replizierbare
DNA handelt, enthaltend:
- a) die Nukleotidsequenz, insbesondere zwischen den Positionen 1 bis 2717, gezeigt in SEQ ID No.1, oder
- b) mindestens eine Sequenz, die der Sequenz (i) innerhalb der Degeneriertheit des genetischen Kodes entspricht, oder
- c) mindestens eine Sequenz, die mit den zu den Sequenzen (i) oder (ii) komplementären Sequenzen hybridisiert, und gegebenenfalls
- d) funktionsneutralen Sinnmutationen in (i), die die Aktivität des Proteins/Polypeptids nicht verändern.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind schließlich
Polynukleotide ausgewählt aus der Gruppe
- a) Polynukleotide enthaltend mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide ausgewählt aus der Nukleotidsequenz von SEQ ID No. 1 zwischen den Positionen 1 und 541,
- b) Polynukleotide enthaltend mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide ausgewählt aus der Nukleotidsequenz von SEQ ID No. 1 zwischen den Positionen 542 und 1219,
- c) Polynukleotide enthaltend mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide ausgewählt aus der Nukleotidsequenz von SEQ ID No. 1 zwischen den Positionen 1220 und 1309,
- d) Polynukleotide enthaltend mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide ausgewählt aus der Nukleotidsequenz von SEQ ID No. 1 zwischen den Positionen 1310 und 2717,
- e) Polynukleotide enthaltend mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide ausgewählt aus der Nukleotidsequenz von SEQ ID No. 1 zwischen den Positionen 2718 und 3910.
Weitere Gegenstände sind:
replizierbare Polynukleotide, insbesondere DNA, enthaltend die Nukleotidsequenz, wie in SEQ ID No.1 dargestellt;
Polynukleotide, die für Polypeptide kodieren, die die Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID No. 2 beziehungsweise SEQ ID No.3 dargestellt, enthalten;
Vektoren, enthaltend Teile des erfindungsgemäßen Polynukleotids, mindestens aber 15 aufeinanderfolgende Nukleotide der beanspruchten Sequenz,
und coryneforme Bakterien, in denen das mtrA-Gen und/oder das mtrB-Gen, insbesondere durch eine Insertion oder Deletion, abgeschwächt ist.
replizierbare Polynukleotide, insbesondere DNA, enthaltend die Nukleotidsequenz, wie in SEQ ID No.1 dargestellt;
Polynukleotide, die für Polypeptide kodieren, die die Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID No. 2 beziehungsweise SEQ ID No.3 dargestellt, enthalten;
Vektoren, enthaltend Teile des erfindungsgemäßen Polynukleotids, mindestens aber 15 aufeinanderfolgende Nukleotide der beanspruchten Sequenz,
und coryneforme Bakterien, in denen das mtrA-Gen und/oder das mtrB-Gen, insbesondere durch eine Insertion oder Deletion, abgeschwächt ist.
Gegenstand der Erfindung sind ebenso Polynukleotide, die im
wesentlichen aus einer Polynukleotidsequenz bestehen, die
erhältlich sind durch Screening mittels Hybridisierung
einer entsprechenden Genbank eines coryneformen Bakteriums,
die das vollständige Gen oder Teile davon enthält, mit
einer Sonde, die die Sequenz des erfindungsgemäßen
Polynukleotids gemäß SEQ ID No.1 oder ein Fragment davon
enthält und Isolierung der genannten Polynukleotidsequenz.
Polynukleotide, die die Sequenzen gemäß der Erfindung
enthalten, sind als Hybridisierungssonden für RNA, cDNA und
DNA geeignet, um Nukleinsäuren beziehungsweise
Polynukleotide oder Gene in voller Länge zu isolieren, die
für den Response-Regulator MtrA und/oder die Histidin-
Proteinkinase MtrB kodieren, oder um solche Nukleinsäuren
beziehungsweise Polynukleotide oder Gene zu isolieren, die
eine hohe Ähnlichkeit mit der Sequenz des mtrA-Gens
und/oder des mtrB-Gens aufweisen. Sie sind ebenso zum
Einbau in sogenannte "arrays", "micro arrays" oder "DNA
chips" geeignet, um die entsprechenden Polynukleotide zu
detektieren und zu bestimmen.
Polynukleotide, die die Sequenzen gemäß der Erfindung
enthalten, sind weiterhin als Primer geeignet, mit deren
Hilfe mit der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) DNA von Genen
hergestellt werden kann, die für den Response-Regulator
MtrA und/oder die Histidin-Proteinkinase MtrB kodieren.
Solche als Sonden oder Primer dienenden Oligonukleotide
enthalten mindestens 25, 26, 27, 28, 29 oder 30, bevorzugt
mindestens 20, 21, 22, 23 oder 24, ganz besonders bevorzugt
mindestens 15, 16, 17, 18 oder 19 aufeinanderfolgende
Nukleotide. Geeignet sind ebenfalls Oligonukleotide mit
einer Länge von mindestens 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38,
39 oder 40 oder mindestens 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48,
49 oder 50 Nukleotiden. Gegebenenfalls sind auch
Oligonukleotide mit einer Länge von mindestens 100, 150,
200, 250 oder 300 Nukleotiden geeignet.
"Isoliert" bedeutet aus seinem natürlichen Umfeld
herausgetrennt.
"Polynukleotid" bezieht sich im allgemeinen auf
Polyribonukleotide und Polydeoxyribonukleotide, wobei es
sich um nicht modifizierte RNA oder DNA oder modifizierte
RNA oder DNA handeln kann.
Die Polynukleotide gemäß Erfindung schließen ein
Polynukleotid gemäß SEQ ID No. 1 oder ein daraus
hergestelltes Fragment und auch solche ein, die zu
wenigstens 70% bis 80%, bevorzugt zu wenigstens 81% bis
85%, besonders bevorzugt zu wenigstens 86% bis 90% und ganz
besonders bevorzugt zu wenigstens 91%, 93%, 95%, 97% oder
99% identisch sind mit dem Polynukleotid gemäß SEQ ID No. 1
oder einem daraus hergestellten Fragment.
Unter "Polypeptiden" versteht man Peptide oder Proteine,
die zwei oder mehr über Peptidbindungen verbundene
Aminosäuren enthalten.
Die Polypeptide gemäß Erfindung schließen ein Polypeptid
gemäß SEQ ID No. 2 und SEQ ID No. 3, insbesondere solche
mit der biologischen Aktivität des Response-Regulators MtrA
und der Histidin-Proteinkinase MtrB und auch solche ein,
die zu wenigstens 70% bis 80%, bevorzugt zu wenigstens 81%
bis 85%, besonders bevorzugt zu wenigstens 86% bis 90% und
ganz besonders bevorzugt zu wenigstens 91%, 93%, 95%, 97%
oder 99% identisch sind mit dem Polypeptid gemäß SEQ ID No.
2 und SEQ ID No. 3 und die genannten Aktivitäten aufweisen.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur
fermentativen Herstellung von Aminosäuren, ausgewählt aus
der Gruppe L-Asparagin, L-Threonin, L-Serin, L-Glutamat,
L-Glycin, L-Alanin, L-Cystein, L-Valin, L-Methionin, L-
Isoleucin, L-Leucin, L-Tyrosin, L-Phenylalanin, L-Histidin,
L-Lysin, L-Tryptophan und L-Arginin, unter Verwendung von
coryneformen Bakterien, die insbesondere bereits
Aminosäuren produzieren und in denen die für das mtrA
und/oder mtrB-Gen kodierenden Nukleotidsequenzen
abgeschwächt, insbesondere ausgeschaltet oder auf niedrigem
Niveau exprimiert werden.
Der Begriff "Abschwächung" beschreibt in diesem
Zusammenhang die Verringerung oder Ausschaltung der
intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme
(Proteine) in einem Mikroorganismus, die durch die
entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise
einen schwachen Promotor verwendet oder ein Gen bzw. Allel
verwendet, das für ein entsprechendes Enzym mit einer
niedrigen Aktivität kodiert bzw. das entsprechende Gen oder
Enzym (Protein) inaktiviert und gegebenenfalls diese
Maßnahmen kombiniert.
Die Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden
Erfindung sind, können Aminosäuren aus Glucose, Saccharose,
Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke, Cellulose oder
aus Glycerin und Ethanol herstellen. Es kann sich um
Vertreter coryneformer Bakterien insbesondere der Gattung
Corynebacterium handeln. Bei der Gattung Corynebacterium
ist insbesondere die Art Corynebacterium glutamicum zu
nennen, die in der Fachwelt für ihre Fähigkeit bekannt ist,
L-Aminosäuren zu produzieren.
Geeignete Stämme der Gattung Corynebacterium, insbesondere
der Art Corynebacterium glutamicum (C. glutamicum), sind
besonders die bekannten Wildtypstämme
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
und daraus hergestellte L-Aminosäuren produzierende
Mutanten beziehungsweise Stämme.
Die neuen, für den Response-Regulator MtrA und die
Histidin-Proteinkinase MtrB kodierenden Gene mtrA und mtrB-
Gen von C. glutamicum wurden isoliert. Beide Proteine sind
Teil eines Zwei-Komponenten-Systems. Zwei-Komponenten-
Regulationssysteme zeichnen sich dadurch aus, dass
verschiedene Response-Regulator-Proteine durch Sensor-
Kinasen aktiviert werden können.
Zur Isolierung des mtrA-Gens, des mtrB-Gens oder auch
anderer Gene von C. glutamicum wird zunächst eine Genbank
dieses Mikroorganismus in Escherichia coli (E. coli)
angelegt. Das Anlegen von Genbanken ist in allgemein
bekannten Lehrbüchern und Handbüchern niedergeschrieben.
Als Beispiel seien das Lehrbuch von Winnacker: Gene und
Klone, Eine Einführung in die Gentechnologie (Verlag
Chemie, Weinheim, Deutschland, 1990), oder das Handbuch von
Sambrook et al.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual
(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) genannt. Eine
sehr bekannte Genbank ist die des E.-coli-K-12 Stammes
W3110, die von Kohara et al. (Cell 50, 495-508 (1987)) in
λ-Vektoren angelegt wurde. Bathe et al. (Molecular and
General Genetics, 252: 255-265, 1996) beschreiben eine
Genbank von C. glutamicum ATCC13032, die mit Hilfe des
Cosmidvektors SuperCos I (Wahl et al., 1987, Proceedings of
the National Academy of Sciences USA, 84: 2160-2164) im E.-
coli-K-12-Stamm NM554 (Raleigh et al., 1988, Nucleic Acids
Research 16: 1563-1575) angelegt wurde.
Börmann et al. (Molecular Microbiology 6(3), 317-326
(1992)) wiederum beschreiben eine Genbank von C. glutamicum
ATCC13032 unter Verwendung des Cosmides pHC79 (Hohn und
Collins, 1980, Gene 11, 291-298).
Zur Herstellung einer Genbank von C. glutamicum in E. coli
können auch Plasmide wie pBR322 (Bolivar, 1979, Life
Sciences, 25, 807-818) oder pUC9 (Vieira et al., 1982,
Gene, 19: 259-268) verwendet werden. Als Wirte eignen sich
besonders solche E.-coli-Stämme, die restriktions- und
rekombinationsdefekt sind wie beispielsweise der Stamm
DHSαmcr, der von Grant et al. (Proceedings of the National
Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645-4649) beschrieben
wurde. Die mit Hilfe von Cosmiden oder anderen λ-Vektoren
klonierten langen DNA-Fragmente können anschließend
wiederum in gängige für die DNA-Sequenzierung geeignete
Vektoren subkloniert und anschließend sequenziert werden,
so wie es z. B. bei Sanger et al. (Proceedings of the
National Academy of Sciences of the United States of
America, 74: 5463-5467, 1977) beschrieben ist.
Die erhaltenen DNA-Sequenzen können dann mit bekannten
Algorithmen bzw. Sequenzanalyse-Programmen wie z. B. dem von
Staden (Nucleic Acids Research 14, 217-232(1986)), dem von
Marck (Nucleic Acids Research 16, 1829-1836 (1988)) oder
dem GCG-Programm von Butler (Methods of Biochemical
Analysis 39, 74-97 (1998)) untersucht werden.
Die neuen, für die Gene mtrA und mtrB kodierenden DNA-
Sequenzen von C. glutamicum wurden gefunden, die als SEQ ID
No. 1 Bestandteil der vorliegenden Erfindung sind.
Weiterhin wurde aus der vorliegenden DNA-Sequenz mit den
oben beschriebenen Methoden die Aminosäuresequenz des
entsprechenden Proteins abgeleitet. In SEQ ID No. 2 und SEQ
ID No. 3 sind die sich ergebenden Aminosäuresequenzen der
mtrA- und mtrB-Genprodukte dargestellt. Es ist bekannt, daß
wirtseigene Enzyme die N-terminale Aminosäure Methionin
bzw. Formylmethionin des gebildeten Proteins abspalten
können.
Kodierende DNA-Sequenzen, die sich aus SEQ ID No. 1 durch
die Degeneriertheit des genetischen Kodes ergeben, sind
ebenfalls Bestandteil der Erfindung. In gleicher Weise sind
DNA-Sequenzen, die mit SEQ ID No. 1 oder Teilen von SEQ ID No. 1
hybridisieren, Bestandteil der Erfindung. In der
Fachwelt sind weiterhin konservative Aminosäureaustausche
wie z. B. Austausch von Glycin gegen Alanin oder von
Asparaginsäure gegen Glutaminsäure in Proteinen als
"Sinnmutationen" (sense mutations) bekannt, die zu keiner
grundsätzlichen Veränderung der Aktivität des Proteins
führen, d. h. funktionsneutral sind. Derartige Mutationen
werden unter anderem auch als neutrale Substitutionen
bezeichnet. Weiterhin ist bekannt, daß Änderungen am N-
und/oder C-Terminus eines Proteins dessen Funktion nicht
wesentlich beeinträchtigen oder sogar stabilisieren können.
Angaben hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Ben-
Bassat et al. (Journal of Bacteriology 169: 751-757 (1987)),
bei O'Regan et al. (Gene 77: 237-251 (1989)), bei Sahin-Toth
et al. (Protein Sciences 3: 240-247 (1994)), bei Hochuli et
al. (Bio/Technology 6: 1321-1325 (1988)) und in bekannten
Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie.
Aminosäuresequenzen, die sich in entsprechender Weise aus
SEQ ID No. 2 ergeben, sind ebenfalls Bestandteil der
Erfindung.
In gleicher Weise sind DNA-Sequenzen, die mit SEQ ID No. 1
oder Teilen von SEQ ID No. 1 hybridisieren Bestandteil der
Erfindung. Schließlich sind DNA-Sequenzen Bestandteil der
Erfindung, die durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
unter Verwendung von Primern hergestellt werden, die sich
aus SEQ ID No. 1 ergeben. Derartige Oligonukleotide haben
typischerweise eine Länge von mindestens 15 Nukleotiden.
Anleitungen zur Identifizierung von DNA-Sequenzen mittels
Hybridisierung findet der Fachmann unter anderem im
Handbuch "The DIG System Users Guide for Filter
Hybridization" der Firma Boehringer Mannheim GmbH
(Mannheim, Deutschland, 1993) und bei Liebl et al.
(International Journal of Systematic Bacteriology 41:
255-260 (1991)). Die Hybridisierung findet unter stringenten
Bedingungen statt, das heisst, es werden nur Hybride
gebildet, bei denen Sonde und Zielsequenz, d. h. die mit
der Sonde behandelten Polynukleotide, mindestens 70%
identisch sind. Es ist bekannt, dass die Stringenz der
Hybridisierung einschließlich der Waschschritte durch
Variieren der Pufferzusammensetzung, der Temperatur und der
Salzkonzentration beeinflußt bzw. bestimmt wird. Die
Hybridisierungsreaktion wird vorzugsweise bei relativ
niedriger Stringenz im Vergleich zu den Waschschritten
durchgeführt (Hybaid Hybridisation Guide, Hybaid Limited,
Teddington, UK, 1996).
Für die Hybridisierungsreaktion kann beispielsweise ein 5 ×
SSC-Puffer bei einer Temperatur von ca. 50°C-68°C
eingesetzt werden. Dabei können Sonden auch mit
Polynukleotiden hybridisieren, die weniger als 70%
Identität zur Sequenz der Sonde aufweisen. Solche Hybride
sind weniger stabil und werden durch Waschen unter
stringenten Bedingungen entfernt. Dies kann beispielsweise
durch Senken der Salzkonzentration auf 2 × SSC und
gegebenenfalls nachfolgend 0,5 × SSC (The DIG System Users
Guide for Filter Hybridisation, Boehringer Mannheim,
Mannheim, Deutschland, 1995) erreicht werden, wobei eine
Temperatur von ca. 50°C-68°C eingestellt wird. Es ist
gegebenenfalls möglich die Salzkonzentration bis auf 0,1 ×
SSC zu senken. Durch schrittweise Erhöhung der
Hybridisierungstemperatur in Schritten von ca. 1-2°C von
50°C auf 68°C können Polynukleotidfragmente isoliert
werden, die beispielsweise mindestens 70% oder mindestens
80% oder mindestens 90% bis 95% oder mindestens 96% bis 99%
Identität zur Sequenz der eingesetzten Sonde besitzen. Es
ist ebenfalls möglich Polynukleotidfragmente zu isolieren,
die eine vollständige Identität zur Sequenz der
eingesetzten Sonde besitzen. Weitere Anleitungen zur
Hybridisierung sind in Form sogenannter Kits am Markt
erhältlich (z. B. DIG Easy Hyb von der Firma Roche
Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland, Catalog No.
1603558).
Anleitungen zur Amplifikation von DNA-Sequenzen mit Hilfe
der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) findet der Fachmann
unter anderem im Handbuch von Gait: Oligonucleotide
synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, UK,
1984) und bei Newton und Graham: PCR (Spektrum Akademischer
Verlag, Heidelberg, Deutschland, 1994).
Es wurde gefunden, daß coryneforme Bakterien nach
Abschwächung des mtrA-Gens und/oder des mtrB-Gens in
verbesserter Weise Aminosäuren produzieren.
Zur Erzielung einer Abschwächung können entweder die
Expression des mtrA-Gens und/oder des mtrB-Gens oder die
katalytischen beziehungsweise regulatorischen Eigenschaften
der Enzymproteine herabgesetzt oder ausgeschaltet werden.
Gegebenenfalls können beide Maßnahmen kombiniert werden.
Die Verringerung der Genexpression kann durch geeignete
Kulturführung oder durch genetische Veränderung (Mutation)
der Signalstrukturen der Genexpression erfolgen.
Signalstrukturen der Genexpression sind beispielsweise
Repressorgene, Aktivatorgene, Operatoren, Promotoren,
Attenuatoren, Ribosomenbindungsstellen, das Startkodon und
Terminatoren. Angaben hierzu findet der Fachmann z. B. in
der Patentanmeldung WO 96/15246, bei Boyd und Murphy
(Journal of Bacteriology 170: 5949 (1988)), bei Voskuil und
Chambliss (Nucleic Acids Research 26: 3548 (1998), bei
Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191
(1998)), bei Pátek et al. (Microbiology 142: 1297 (1996)),
Vasicova et al. (Journal of Bacteriology 181: 6188 (1999))
und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und
Molekularbiologie wie z. B. dem Lehrbuch von Knippers
("Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag,
Stuttgart, Deutschland, 1995) oder dem von Winnacker ("Gene
und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland,
1990).
Mutationen, die zu einer Veränderung bzw. Herabsetzung der
katalytischen Eigenschaften von Enzymproteinen führen, sind
aus dem Stand der Technik bekannt; als Beispiele seien die
Arbeiten von Qiu und Goodman (Journal of Biological
Chemistry 272: 8611-8617 (1997)), Sugimoto et al.
(Bioscience Biotechnology and Biochemistry 61: 1760-1762
(1997)) und Möckel ("Die Threonindehydratase aus
Corynebacterium glutamicum: Aufhebung der allosterischen
Regulation und Struktur des Enzyms", Berichte des
Forschungszentrums Jülichs, Jül-2906, ISSN09442952, Jülich,
Deutschland, 1994) genannt. Zusammenfassende Darstellungen
können bekannten Lehrbüchern der Genetik und
Molekularbiologie wie z. B. dem von Hagemann ("Allgemeine
Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen
werden.
Als Mutationen kommen Transitionen, Transversionen,
Insertionen und Deletionen in Betracht. In Abhängigkeit von
der Wirkung des Aminosäureaustausches auf die
Enzymaktivität wird von Fehlsinnmutationen ("missense
mutations") oder Nichtsinnmutationen ("nonsense mutations")
gesprochen. Insertionen oder Deletionen von mindestens
einem Basenpaar (bp) in einem Gen führen zu
Rasterverschiebungsmutationen ("frame shift mutations"), in
deren Folge falsche Aminosäuren eingebaut werden oder die
Translation vorzeitig abbricht. Deletionen von mehreren
Kodonen führen typischerweise zu einem vollständigen
Ausfall der Enzymaktivität. Anleitungen zur Erzeugung
derartiger Mutationen gehören zum Stand der Technik und
können bekannten Lehrbüchern der Genetik und
Molekularbiologie wie z. B. dem Lehrbuch von Knippers
("Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag,
Stuttgart, Deutschland, 1995), dem von Winnacker ("Gene und
Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland,
1990) oder dem von Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav
Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.
Eine gebräuchliche Methode, Gene von C. glutamicum zu
mutieren, ist die von Schwarzer und Pühler (Bio/Technology
9, 84-87 (1991)) beschriebene Methode der Gen-Unterbrechung
("gene disruption") und des Gen-Austauschs ("gene
replacement").
Bei der Methode der Gen-Unterbrechung wird ein zentraler
Teil der Kodierregion des interessierenden Gens in einen
Plasmidvektor kloniert, der in einem Wirt (typischerweise
E. coli), nicht aber in C. glutamicum replizieren kann. Als
Vektoren kommen beispielsweise pSUP301 (Simon et al.,
Bio/Technology 1, 784-791 (1983)), pK18mob oder pK19mob
(Schäfer et al., Gene 145, 69-73 (1994)), pk18mobsacB oder
pK19mobsacE (Jäger et al., Journal of Bacteriology 174:
5462-65 (1992)), pGEM-T (Promega corporation, Madison, WI,
USA), pCR2.1-TOPO (Shuman (1994). Journal of Biological
Chemistry 269: 32678-84; US-Patent 5,487,993), pCR®Blunt
(Firma Invitrogen, Groningen, Niederlande; Bernard et al.,
Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)) oder
pEM1 (Schrumpf et al. 1991, Journal of Bacteriology
173: 4510-4516) in Frage. Der Plasmidvektor, der das
zentrale Teil der Kodierregion des Gens enthält, wird
anschließend durch Konjugation oder Transformation in den
gewünschten Stamm von C. glutamicum überführt. Die Methode
der Konjugation ist beispielsweise bei Schäfer et al.
(Applied and Environmental Microbiology 60, 756-759 (1994))
beschrieben. Methoden zur Transformation sind
beispielsweise bei Thierbach et al. (Applied Microbiology
and Biotechnology 29, 356-362 (1988)), Dunican und Shivnan
(Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989)) und Tauch et al. (FEMS
Microbiological Letters 123, 343-347 (1994)) beschrieben.
Nach homologer Rekombination mittels eines "cross-over"-
Ereignisses wird die Kodierregion des betreffenden Gens
durch die Vektorsequenz unterbrochen und man erhält zwei
unvollständige Allele, denen jeweils das 3'- bzw. das 5'-
Ende fehlt. Diese Methode wurde beispielsweise von
Fitzpatrick et al. (Applied Microbiology and Biotechnology
42, 575-580 (1994)) zur Ausschaltung des recA-Gens von C.
glutamicum verwendet.
Bei der Methode des Genaustausches ("gene replacement")
wird eine Mutation wie z. B. eine Deletion, Insertion oder
Bäsenaustausch in dem interessierenden Gen in-vitro
hergestellt. Das hergestellte Allel wird wiederum in einen
für C. glutamicum nicht replikativen Vektor kloniert und
dieser anschließend durch Transformation oder Konjugation
in den gewünschten Wirt von C. glutamicum überführt. Nach
homologer Rekombination mittels eines ersten, Integration
bewirkenden "cross-over"-Ereignisses und eines geeigneten
zweiten, eine Exzision bewirkenden "cross-over"-Ereignisses
im Zielgen bzw. in der Zielsequenz erreicht man den Einbau
der Mutation bzw. des Allels. Diese Methode wurde
beispielsweise von Peters-Wendisch et al. (Microbiology
144, 915-927 (1998)) verwendet, um das pyc-Gen von C.
glutamicum durch eine Deletion auszuschalten.
In das mtrA-Gen und/oder das mtrB-Gen kann auf diese Weise
eine Deletion, Insertion oder ein Basenaustausch eingebaut
werden.
Zusätzlich kann es für die Produktion von L-Aminosäuren
vorteilhaft sein, zusätzlich zur Abschwächung des mtrA-Gens
und/oder mtrB-Gens eines oder mehrere Enzyme des jeweiligen
Biosyntheseweges, der Glykolyse, der Anaplerotik, des
Zitronensäure-Zyklus, des Pentosephosphat-Zyklus, des
Aminosäure-Exports und gegebenenfalls regulatorische
Proteine zu verstärken, insbesondere überzuexprimieren.
Der Begriff "Verstärkung" beschreibt in diesem Zusammenhang
die Erhöhung der intrazellulären Aktivität eines oder
mehrerer Enzyme (Proteine) in einem Mikroorganismus, die
durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man
beispielsweise die Kopienzahl des Gens bzw. der Gene
erhöht, einen starken Promotor verwendet oder ein Gen oder
Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym (Protein)
mit einer hohen Aktivität kodiert und gegebenenfalls diese
Maßnahmen kombiniert.
So kann für die Herstellung von L-Aminosäuren neben der
Abschwächung des mtrA-Gens und/oder des mtrB-Gens
gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus
der Gruppe
- - das für die Dihydrodipicolinat-Synthase kodierende Gen dapA (EP-B 0 197 335),
- - das für die Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase kodierende Gen gap (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086),
- - das für die Triosephosphat-Isomerase kodierende Gen tpi (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086),
- - das für die 3-Phosphoglycerat-Kinase kodierende Gen pgk (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086),
- - das für die Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase kodierende Gen zwf (JP-A-09224661),
- - das für die Pyruvat-Carboxylase kodierende Gen pyc (DE-A- 198 31 609),
- - das für die Malat-Chinon-Oxidoreduktase kodierende Gen mqo (Molenaar et al., European Journal of Biochemistry 254, 395-403 (1998)),
- - das für eine feed-back resistente Aspartatkinase kodierende Gen lysC (Accession No. P26512; EP-B-0387527; EP-A-0699759; WO 00/63388),
- - das für den Lysin-Export kodierende Gen lysE (DE-A-195 48 222),
- - das für die Homoserin-Dehydrogenase kodierende Gen hom (EP-A 0131171),
- - das für die Threonin-Dehydratase kodierende Gen ilvA (Möckel et al., Journal of Bacteriology (1992) 8065-8072)) oder das für eine "feed back resistente" Threonin- Dehydratase kodierende Allel ilvA(Fbr) (Möckel et al., (1994) Molecular Microbiology 13: 833-842),
- - das für die Acetohydroxysäure-Synthase kodierende Gen ilvBN (EP-0 356 739 B),
- - das für die Dihydroxysäuredehydratase kodierende Gen ilvD (Sahm und Eggeling (1999) Applied and Environmental Microbiology 65: 1973-1979),
- - das für das Zwa1-Protein kodierende Gen zwa1 (DE 199 59 328.0, DSM 13115)
verstärkt, insbesondere überexprimiert werden.
Weiterhin kann es für die Produktion von Aminosäuren
vorteilhaft sein, neben der Abschwächung des mtrA-Gens
und/oder des mtrB-Gens gleichzeitig eines oder mehrere der
Gene, ausgewählt aus der Gruppe
- - das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierende Gen pck (DE 199 50 409.1, DSM 13047),
- - das für die Glucose-6-Phosphat-Isomerase kodierende Gen pgi (US 09/396,478, DSM 12969),
- - das für die Pyruvat-Oxidase kodierende Gen poxB (DE 199 51 975.7, DSM 13114),
- - das für das Zwa2-Protein kodierende Gen zwa2 (DE 199 59 327.2, DSM 13113)
abzuschwächen, insbesondere die Expression zu verringern.
Weiterhin kann es für die Produktion von Aminosäuren
vorteilhaft sein, neben der Abschwächung des mtrA-Gens
und/oder des mtrB-Gens unerwünschte Nebenreaktionen
auszuschalten (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing
Microorganisms", in: Overproduction of Microbial Products,
Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London,
UK, 1982).
Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen sind
ebenfalls Gegenstand der Erfindung und können
kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch-Verfahren
(Satzkultivierung) oder im fed batch(Zulaufverfahren)- oder
repeated fed batch-Verfahren (repetitives Zulaufverfahren)
zum Zwecke der Produktion von L-Aminosäuren kultiviert
werden. Eine Zusammenfassung über bekannte
Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel
(Bioprozesstechnik 1. Einführung in die
Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart,
1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und
periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag,
Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.
Das zu verwendende Kulturmedium muß in geeigneter Weise den
Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen
von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im
Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der
American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA,
1981) enthalten.
Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlehydrate wie
z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose,
Melasse, Stärke und Cellulose, Öle und Fette, wie zum
Beispiel Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnußöl und Kokosfett,
Fettsäuren, wie zum Beispiel Palmitinsäure, Stearinsäure
und Linolsäure, Alkohole wie zum Beispiel Glycerin und
Ethanol und organische Säuren, wie zum Beispiel Essigsäure
verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als
Mischung verwendet werden.
Als Stickstoffquelle können organische stickstoffhaltige
Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt,
Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff
oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat,
Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und
Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen
können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
Als Phosphorquelle können Phosphorsäure,
Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder
die entsprechenden Natrium-haltigen Salze verwendet werden.
Das Kulturmedium muß weiterhin Salze von Metallen
enthalten, wie zum Beispiel Magnesiumsulfat oder
Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind.
Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren
und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen
eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies
geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genannten
Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen
Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der
Kultivierung zugefüttert werden.
Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen
wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak
beziehungsweise Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie
Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise
eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können
Antischaummittel, wie zum Beispiel Fettsäurepolyglykolester
eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von
Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende
Stoffe, wie zum Beispiel Antibiotika hinzugefügt werden. Um
aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff
oder sauerstoffhaltige Gasmischungen, wie zum Beispiel
Luft in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur
liegt normalerweise bei 20°C bis 45°C und vorzugsweise bei
25°C bis 40°C. Die Kultur wird solange fortgesetzt, bis
sich ein Maximum des gewünschten Produktes gebildet hat.
Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis
160 Stunden erreicht.
Methoden zur Bestimmung von L-Aminosäuren sind aus dem
Stand der Technik bekannt. Die Analyse kann zum Beispiel so
wie bei Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958),
1190) beschrieben durch Anionenaustausch-Chromatographie
mit anschließender Ninhydrin-Derivatisierung erfolgen, oder
sie kann durch reversed phase HPLC erfolgen, so wie bei
Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174)
beschrieben.
Das erfindungsgemäße Verfahren dient zur fermentativen
Herstellung von Aminosäuren.
Folgende Mikroorganismen wurden als Reinkultur am 11. April
2001 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und
Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) gemäß
Budapester Vertrag hinterlegt:
- - Escherichia coli Top10/pCR2.1mtrAint als DSM 14227,
- - Escherichia coli Top10/pCR2.1mtrBint als DSM 14228.
Die vorliegende Erfindung wird im folgenden anhand von
Ausführungsbeispielen näher erläutert.
Die Isolierung von Plasmid-DNA aus Escherichia coli sowie
alle Techniken zur Restriktion, Klenow- und alkalische
Phosphatasebehandlung wurden nach Sambrook et al.
(Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 1989, Cold Spring
Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA)
durchgeführt. Methoden zur Transformation von Escherichia
coli sind ebenfalls in diesem Handbuch beschrieben.
Die Zusammensetzung gängiger Nährmedien wie LB- oder TY-
Medium kann ebenfalls dem Handbuch von Sambrook et al.
entnommen werden.
Chromosomale DNA aus C. glutamicum ATCC 13032 wird wie bei
Tauch et al. (1995, Plasmid 33: 168-179) beschrieben
isoliert und mit dem Restriktionsenzym Sau3AI (Amersham
Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung
Sau3AI, Code no. 27-0913-02) partiell gespalten. Die DNA-
Fragmente werden mit shrimp alkalischer Phosphatase (Roche
Molecular Biochemicals, Mannheim, Deutschland,
Produktbeschreibung SAP, Code no. 1758250)
dephosphoryliert. Die DNA des Cosmid-Vektors SuperCos1
(Wahl et al. (1987), Proceedings of the National Academy of
Sciences, USA 84: 2160-2164), bezogen von der Firma
Stratagene (La Jolla, USA, Produktbeschreibung SuperCos1
Cosmid Vektor Kit, Code no. 251301) wird mit dem
Restriktionsenzym XbaI (Amersham Pharmacia, Freiburg,
Deutschland, Produktbeschreibung XbaI, Code no. 27-0948-02)
gespalten und ebenfalls mit shrimp alkalischer Phosphatase
dephosphoryliert.
Anschließend wird die Cosmid-DNA mit dem Restriktionsenzym
BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland,
Produktbeschreibung BamHI, Code no. 27-0868-04) gespalten.
Die auf diese Weise behandelte Cosmid-DNA wird mit der
behandelten ATCC13032-DNA gemischt und der Ansatz mit T4-
DNA-Ligase (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland,
Produktbeschreibung T4-DNA-Ligase, Code no. 27-0870-04)
behandelt. Das Ligationsgemisch wird anschließend mit Hilfe
des Gigapack II XL Packing Extracts (Stratagene, La Jolla,
USA, Produktbeschreibung Gigapack II XL Packing Extract,
Code no. 200217) in Phagen verpackt.
Zur Infektion des E.-coli-Stammes NM554 (Raleigh et al.
1988, Nucleic Acid Res. 16: 1563-1575) werden die Zellen in
10 mM MgSO4 aufgenommen und mit einem Aliquot der
Phagensuspension vermischt. Infektion und Titerung der
Cosmidbank werden wie bei Sambrook et al. (1989, Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor)
beschrieben durchgeführt, wobei die Zellen auf LB-Agar
(Lennox, 1955, Virology, 1: 190) + 100 mg/l Ampicillin
ausplattiert werden. Nach Inkubation über Nacht bei 37°C
werden rekombinante Einzelklone selektioniert.
Die Cosmid-DNA einer Einzelkolonie wird mit dem Qiaprep
Spin Miniprep Kit (Product No. 27106, Qiagen, Hilden,
Germany) nach Herstellerangaben isoliert und mit dem
Restriktionsenzym Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg,
Deutschland, Produktbeschreibung Sau3AI, Product No.
27-0913-02) partiell gespalten. Die DNA-Fragmente werden mit
shrimp alkalischer Phosphatase (Roche Molecular
Biochemicals, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung
SAP, Product No. 1758250) dephosphoryliert. Nach
gelelektrophoretischer Auftrennung erfolgt die Isolierung
der Cosmidfragmente im Größenbereich von 1500 bis 2000 bp
mit dem QiaExII Gel Extraction Kit (Product No. 20021,
Qiagen, Hilden, Germany).
Die DNA des Sequenziervektors pZero-1 bezogen von der Firma
Invitrogen (Groningen, Niederlande, Produktbeschreibung
Zero Background Cloning Kit, Product No. K2500-01) wird mit
dem Restriktionsenzym BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg,
Deutschland, Produktbeschreibung BamHI, Product No.
27-0868-04) gespalten. Die Ligation der Cosmidfragmente in den
Sequenziervektor pZero-1 wird wie von Sambrook et al.
(1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor) beschrieben durchgeführt, wobei das DNA-Gemisch mit
T4-Ligase (Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland) über
Nacht inkubiert wird. Dieses Ligationsgemisch wird
anschließend in den E.-coli-Stamm DH5aMCR (Grant, 1990,
Proceedings of the National Academy of Sciences, USA,
87: 4645-4649) elektroporiert (Tauch et al. 1994, FEMS
Microbiol. Letters, 123: 343-7) und auf LB-Agar (Lennox,
1955, Virology, 1: 190) mit 50 mg/l Zeocin ausplattiert.
Die Plasmidpräparation der rekombinanten Klone erfolgt mit
dem Biorobot 9600 (Product No. 900200, Qiagen, Hilden,
Deutschland). Die Sequenzierung erfolgt nach der Dideoxy-
Kettenabbruch-Methode von Sanger et al. (1977, Proceedings
of the National Academies of Sciences, USA, 74: 5463-5467)
mit Modifikationen nach Zimmermann et al. (1990,
Nucleic Acids Research, 18: 1067). Es wird der "RR dRhodamin
Terminator Cycle Sequencing Kit" von PE Applied Biosystems
(Product No. 403044, Weiterstadt, Deutschland) verwendet.
Die gelelektrophoretische Auftrennung und Analyse der
Sequenzierreaktion erfolgt in einem "Rotiphorese NF
Acrylamid/Bisacrylamid" Gel (29 : 1) (Product No. A124.1,
Roth, Karlsruhe, Germany) mit dem "ABI Prism 377"
Sequenziergerät von PE Applied Biosystems (Weiterstadt,
Deutschland).
Die erhaltenen Roh-Sequenzdaten werden anschließend unter
Anwendung des Staden-Programpakets (1986, Nucleic Acids
Research, 14: 17-231) Version 97-0 prozessiert. Die
Einzelsequenzen der pZerol-Derivate werden zu einem
zusammenhängenden Contig assembliert. Die computergestützte
Kodierbereichsanalyse wird mit dem Programm XNIP (Staden,
1986, Nucleic Acids Research, 14: 17-231) angefertigt.
Weitere Analysen werden mit den "BLAST search programs"
(Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Research,
25: 3893402) gegen die non-redundant-Datenbank des
"National Center for Biotechnology Information" (NCBI,
Bethesda, MD, USA) durchgeführt.
Die erhaltene Nukleotidsequenz ist in SEQ ID No. 1
dargestellt. Die Analyse der Nukleotidsequenz ergibt zwei
offene Leseraster von 681 Basenpaaren und 1512 Basenpaaren,
welche als mtrA-Gen und mtrB-Gen bezeichnet werden. Das
mtrA-Gen kodiert für ein Polypeptid von 226 Aminosäuren.
Das mtrB-Gen kodiert für ein Polypeptid von 503
Aminosäuren.
Aus dem Stamm ATCC 13032 wird nach der Methode von Eikmanns
et al. (Microbiology 140: 1817-1828 (1994)) chromosomale
DNA isoliert. Aufgrund der aus Beispiel 2 für C. glutamicum
bekannten Sequenz der Gene mtrA und mtrB werden die
folgenden Oligonukleotide für die Polymerase-Kettenreaktion
ausgewählt:
mtrA-int1:
5' TGA TGC TTC CAG GCA TGA AC 3'
mtrA-int2:
5' GAT CGC CGA CTT CGA TGA TT 3'
5' TGA TGC TTC CAG GCA TGA AC 3'
mtrA-int2:
5' GAT CGC CGA CTT CGA TGA TT 3'
mtrB-int1:
5' ACG ATG ACC TGG TGG TCT CT 3'
mtrB-int2:
5' GAC TCG AAT CGG TCC AAC TC 3'
5' ACG ATG ACC TGG TGG TCT CT 3'
mtrB-int2:
5' GAC TCG AAT CGG TCC AAC TC 3'
Die dargestellten Primer werden von der Firma MWG Biotech
(Ebersberg, Deutschland) synthetisiert und nach der
Standard-PCR-Methode von Innis et al. (PCR protocols. A
guide to methods and applications, 1990, Academic Press)
mit der Taq-Polymerase der Firma Boehringer Mannheim
(Deutschland, Produktbeschreibung Taq DNA Polymerase,
Product No. 1 146 165) die PCR-Reaktion durchgeführt. Mit
Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion ermöglichen die Primer
die Amplifikation eines 237 bp großen internen Fragmentes
des mtrA-Gens und eines 634 bp großen internen Fragmentes
des mtrB-Gens. Die so amplifizierten Produkte werden in
einem 0,8%igen Agarosegel elektrophoretisch geprüft.
Die amplifizierten DNA-Fragmente werden mit dem TOPO TA
Cloning Kit der Firma Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA,
USA; Katalog Nummer K4500-O1) jeweils in den Vektor pCR2.1-
TOPO (Mead at al. (1991) Bio/Technology 9: 657-663) ligiert.
Anschließend wird der E.-coli-Stamm TOP10 mit den
Ligationsansätzen (Hanahan, In: DNA cloning. A practical
approach. Vol. I. IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA,
1985) elektroporiert. Die Selektion von Plasmid-tragenden
Zellen erfolgt durch Ausplattieren des
Transformationsansatzes auf LB Agar (Sambrook et al.,
Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989),
der mit 50 mg/l Kanamycin supplementiert worden ist.
Plasmid-DNA wird aus jeweils einer Transformante mit Hilfe
des QlAprep Spin Miniprep Kit der Firma Qiagen isoliert und
durch Restriktion mit dem Restriktionsenzym EcoRI und
anschließender Agarosegel-Elektrophorese (0,8%) überprüft.
Die Plasmide werden pCR2.1mtrAint und pCR2.1mtrBint genannt
und sind in Fig. 1 und in Fig. 2 dargestellt.
Der in Beispiel 3 genannte Vektor pCR2.1mtrAint wird nach
der Elektroporationsmethode von Tauch et. al. (FEMS
Microbiological Letters, 123: 343-347 (1994)) in
Corynebacterium glutamicum DSM 5715 elektroporiert. Bei dem
Stamm DSM 5715 handelt es sich um einen AEC-resistenten
Lysin-Produzenten. Der Vektor pCR2.1mtrAint kann in DSM5715
nicht selbständig replizieren und bleibt nur dann in der
Zelle erhalten, wenn er ins Chromosom von DSM 5715
integriert hat. Die Selektion von Klonen mit ins Chromosom
integriertem pCR2.1mtrAint erfolgt durch Ausplattieren des
Elektroporationsansatzes auf LB Agar (Sambrook et al.,
Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.), der mit
15 mg/l Kanamycin supplementiert worden ist.
Für den Nachweis der Integration wird das mtrAint-Fragment
nach der Methode "The DIG System Users Guide for Filter
Hybridization" der Firma Boehringer Mannheim GmbH
(Mannheim, Deutschland, 1993) mit dem Dig-
Hybridisierungskit der Firma Boehringer markiert.
Chromosomale DNA eines potentiellen Integranten wird nach
der Methode von Eikmanns et al. (Microbiology 140:
1817-1828 (1994)) isoliert und jeweils mit den
Restriktionsenzymen KpnI, EcoRI und PstI geschnitten. Die
entstehenden Fragmente werden mittels der Agarosegel-
Elektrophorese aufgetrennt und mit dem Dig-Hybridierungskit
der Firma Boehringer bei 68°C hybridisiert. Das in Beispiel
3 genannte Plasmid pCR2.1mtrAint hat innerhalb des
chromosomalen mtrA-Gens ins Chromosom von DSM 5715
inseriert. Der Stamm wird als DSM 5715::pCR2.1mtrAint
bezeichnet.
Der in Beispiel 3 genannte Vektor pCR2.1mtrBint wird nach
der Elektroporationsmethode von Tauch et. al. (FEMS
Microbiological Letters, 123: 343-347 (1994)) in
Corynebacterium glutamicum DSM 5715 elektroporiert. Bei dem
Stamm DSM 5715 handelt es sich um einen AEC resistenten
Lysin-Produzenten. Der Vektor pCR2.1mtrBint kann in DSM5715
nicht selbständig replizieren und bleibt nur dann in der
Zelle erhalten, wenn er ins Chromosom von DSM 515
integriert hat. Die Selektion von Klonen mit ins Chromosom
integriertem pCR2.1mtrBint erfolgt durch Ausplattieren des
Elektroporationsansatzes auf LB Agar (Sambrook et al.,
Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.), der mit
15 mg/l Kanamycin supplementiert worden ist.
Für den Nachweis der Integration wird das mtrBint-Fragment
nach der Methode "The DIG System Users Guide for Filter
Hybridization" der Firma Boehringer Mannheim GmbH
(Mannheim, Deutschland, 1993) mit dem Dig-
Hybridisierungskit der Firma Boehringer markiert.
Chromosomale DNA eines potentiellen Integranten wird nach
der Methode von Eikmanns et al. (Microbiology 140: 1817-1828
(1994)) isoliert und jeweils mit den
Restriktionsenzymen KpnI, EcoRI und PstI geschnitten. Die
entstehenden Fragmente werden mittels der Agarosegel-
Elektrophorese aufgetrennt und mit dem Dig-Hybridierungskit
der Firma Boehringer bei 68°C hybridisiert. Das in Beispiel
3 genannte Plasmid pCR2.1mtrBint hat innerhalb des
chromosomalen mtrB-Gens ins Chromosom von DSM5715
inseriert. Der Stamm wird als DSM5715::pCR2.1mtrBint
bezeichnet.
Der in Beispiel 5 erhaltene C. glutamicum Stamm
DSM5715::pCR2:1mtrBint wird in einem zur Produktion von
Lysin geeigneten Nährmedium kultiviert und der Lysingehalt
im Kulturüberstand bestimmt.
Dazu wird der Stamm zunächst auf Agarplatte mit dem
entsprechenden Antibiotikum (Hirn-Herz-Agar mit Kanamycin
25 mg/l) für 24 Stunden bei 33°C inkubiert. Ausgehend von
dieser Agarplattenkultur wird eine Vorkultur angeimpft (10
ml Medium im 100-ml-Erlenmeyerkolben). Als Medium für die
Vorkultur wird das Vollmedium Cglil verwendet.
NaCl | 2,5 g/l |
Bacto-Pepton | 10 g/l |
Bacto-Yeast-Extrakt | 10 g/l |
Glucose (getrennt autoklaviert) | 2% (w/v) |
Der pH-Wert wird auf pH 7.4 eingestellt |
Diesem wird Kanamycin (25 mg/l) zugesetzt. Die Vorkultur
wird 16 Stunden bei 33°C bei 240 rpm auf dem Schüttler
inkubiert, Von dieser Vorkultur wird eine Hauptkultur
angeimpft, so daß die Anfangs-OD (660 nm) der Hauptkultur
0,1 OD beträgt. Für die Hauptkultur wird das Medium MM
verwendet.
CSL (Corn Steep Liquor) | 5 g/l |
MOPS (Morpholinopropansulfonsäure) | 20 g/l |
Glucose (getrennt autoklaviert) | 50 g/l |
(NH4) 2SO4) | 25 g/l |
KH2PO4 | 0,1 g/l |
MgSO4.7 H2O | 1,0 g/l |
CaCl2.2 H2O | 10 mg/l |
FeSO4.7 H2O | 10 mg/l |
MnSO4.H2O | 5,0 mg/l |
Biotin (sterilfiltriert) | 0,3 mg/l |
Thiamin.HCl (sterilfiltriert) | 0,2 mg/l |
Leucin (sterilitriert) | 0,1 g/l |
CaCO3 | 25 g/l |
CSL, MOPS und die Salzlösung werden mit Ammoniakwasser auf
pH 7 eingestellt und autoklaviert. Anschließend werden die
sterilen Substrat- und Vitaminlösungen zugesetzt sowie das
trocken autoklavierte CaCO3 zugesetzt.
Die Kultivierung erfolgt in 10 ml Volumen in 100 ml
Erlenmeyerkolben mit Schikanen. Es wurde Kanamycin (25
mg/l) zugesetzt. Die Kultivierung erfolgt bei 33°C und 80%
Luftfeuchtigkeit.
Nach 72 Stunden wird die OD bei einer Meßwellenlänge von
660 nm mit dem Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH,
München) ermittelt. Die gebildete Lysinmenge wird mit einem
Aminosäureanalysator der Firma Eppendorf-BioTronik
(Hamburg, Deutschland) durch Ionenaustauschchromatographie
und Nachsäulenderivatisierung mit Ninhydrindetektion
bestimmt.
In Tabelle 1 ist das Ergebnis des Versuchs dargestellt.
Kurze Beschreibung der Figuren:
Fig. 1 Karte des Plasmids pCR2.1mtrAint,
Fig. 2 Karte des Plasmids pCR2.1mtrBint.
Die verwendeten Abkürzungen und Bezeichnungen haben
folgende Bedeutung.
KmR: Kanamycin-Resistenz-Gen
KpnI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms KpnI
EcoRI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms EcoRI
PstI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms PstI
mtrAint: internes Fragment des mtrA-Gens
mtrBint: internes Fragment des mtrB-Gens
ColE1: Replikationsursprung des Plasmides ColE1
KpnI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms KpnI
EcoRI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms EcoRI
PstI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms PstI
mtrAint: internes Fragment des mtrA-Gens
mtrBint: internes Fragment des mtrB-Gens
ColE1: Replikationsursprung des Plasmides ColE1
Claims (21)
1. Isoliertes Polynukleotid aus coryneformen Bakterien,
enthaltend eine für das mtrA-Gen und/oder das mtrB-Gen
kodierende Polynukleotidsequenz, ausgewählt aus der
Gruppe
- a) Polynukleotid, das mindestens zu 70% identisch ist mit einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2 enthält,
- b) Polynukleotid, das mindestens zu 70% identisch ist mit einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 3 enthält,
- c) Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die zu mindestens 70% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2,
- d) Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die zu mindestens 70% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 3,
- e) Polynukleotid, das komplementär ist zu den Polynukleotiden von a), b), c) oder d), und
- f) Polynukleotid, enthaltend mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide der Polynukleotidsequenz von a), b), c), d) oder e), wobei die Polypeptide bevorzugt die Aktivität des Response-Regulators MtrA und/oder der Histidin- Proteinkinase MtrB aufweisen.
2. Polynukleotid gemäß Anspruch 1, wobei das
Polynukleotid eine in coryneformen Bakterien
replizierbare, bevorzugt rekombinante DNA ist.
3. Polynukleotid gemäß Anspruch 1, wobei das
Polynukleotid eine RNA ist.
4. Polynukleotid gemäß Anspruch 2, enthaltend die
Nukleinsäuresequenz wie in SEQ ID No. 1 dargestellt.
5. Replizierbare DNA gemäß Anspruch 2, enthaltend
- a) die Nukleotidsequenz, gezeigt in SEQ ID No. 1, oder
- b) mindestens eine Sequenz, die der Sequenz (i) innerhalb des Bereichs der Degeneration des genetischen Kodes entspricht, oder
- c) mindestens eine Sequenz, die mit der zur Sequenz (i) oder (ii) komplementären Sequenz hybridisiert, und gegebenenfalls
- d) funktionsneutrale Sinnmutationen in (i).
6. Replizierbare DNA gemäß Anspruch 5, dadurch
gekennzeichnet, daß die Hybridisierung
unter einer Stringenz entsprechend höchstens 2 × SSC
durchgeführt wird.
7. Polynukleotidsequenz gemäß Anspruch 1, die für ein
Polypeptid kodiert, das die in SEQ ID No, 2 und/oder
SEQ ID No. 3 dargestellte Aminosäuresequenz enthält.
8. Coryneforme Bakterien, in denen das mtrA-Gen und/oder
das mtrB-Gen abgeschwächt, insbesondere ausgeschaltet
wird (werden),
9. Integrationsvektor Top10/pCR2.1mtrAint, der
- 1. 9.1 ein 237 bp großes internes Fragment des mtrA-Gens trägt,
- 2. 9.2 dessen Restriktionskarte in Fig. 1 wiedergegeben wird und
- 3. 9.3 der in dem Escherichia-coli-Stamm Top10/pCR2.1mtrAint unter der Nr. DSM 14227 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen hinterlegt ist.
10. Integrationsvektor Top10/pCR2.1mtrBint, der
- 1. 10.1 ein 634 bp großes internes Fragment des mtrB-Gens trägt,
- 2. 10.2 dessen Restriktionskarte in Fig. 2 wiedergegeben wird und
- 3. 10.3 der in dem Escherichia-coli-Stamm Top10/pCR2.1mtrBint unter der Nr. DSM 14228 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen hinterlegt ist.
11. Verfahren zur fermentativen Herstellung von
L-Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, dadurch
gekennzeichnet, daß man folgende Schritte
durchführt:
- a) Fermentation der die gewünschte L-Aminosäure produzierenden coryneformen Bakterien, in denen man zumindest das mtrA-Gen und/oder das mtrB-Gen oder dafür kodierende Nukleotidsequenzen abschwächt, insbesondere ausschaltet;
- b) Anreicherung der L-Aminosäure im Medium oder in den Zellen der Bakterien, und
- c) Isolieren der L-Aminosäure.
12. Verfahren gemäß Anspruch 11, dadurch
gekennzeichnet, daß man Bakterien
einsetzt, in denen man zusätzlich weitere Gene des
Biosyntheseweges der gewünschten L-Aminosäure
verstärkt.
13. Verfahren gemäß Anspruch 11, dadurch
gekennzeichnet, daß man Bakterien
einsetzt, in denen die Stoffwechselwege zumindest
teilweise ausgeschaltet sind, die die Bildung der
gewünschten L-Aminosäure verringern.
14. Verfahren gemäß Anspruch 11, dadurch
gekennzeichnet, daß man die Expression
des (der) Polynukleotides (e), das (die) für das mtrA-
Gen und/oder das mtrB-Gen kodiert (kodieren)
abschwächt, insbesondere ausschaltet.
15. Verfahren gemäß Anspruch 11, dadurch
gekennzeichnet, daß man die
regulatorischen beziehungsweise katalytischen
Eigenschaften der Polypeptide (Enzymproteine)
verringert, für die die Polynukleotide mtrA und/oder
mtrB kodieren.
16. Verfahren gemäß Anspruch 11, dadurch
gekennzeichnet, daß man zur Herstellung
von L-Aminosäuren coryneforme Mikroorganismen
fermentiert, in denen man gleichzeitig eines oder
mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe
- 1. 16.1 das für die Dihydrodipicolinät-Synthase kodierende Gen dapA,
- 2. 16.2 das für die Glyceraldehyd-3-Phosphat- Dehydrogenase kodierende Gen gap,
- 3. 16.3 das für die Triosephosphat-Isomerase kodierende Gen tpi,
- 4. 16.4 das für die 3-Phosphoglycerat-Kinase kodierende Gen pgk,
- 5. 16.5 das für die Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase kodierende Gen zwf,
- 6. 16.6 das für die Pyruvat-Carboxylase kodierende Gen pyc,
- 7. 16.7 das für die Malat-Chinon-Oxidoreduktase kodierende Gen mqo,
- 8. 16.8 das für eine feed back resistente Aspartatkinase kodierende Gen lysC,
- 9. 16.9 das für den Lysin-Export kodierende Gen lysE,
- 10. 16.10 das für die Homoserin-Dehydrogenase kodierende Gen hom,
- 11. 16.11 das für die Threonin-Dehydratase kodierende Gen ilvA oder das für eine feed back resistente Threonin-Dehydratase kodierende Allel ilvA(Fbr),
- 12. 16.12 das für die Acetohydroxysäure-Synthase kodierende Gen ilvBN,
- 13. 16.13 das für die Dihydroxysäuredehydratase kodierende Gen ilvD,
- 14. 16.14 das für das Zwa1-Protein kodierende Gen zwa1,
17. Verfahren gemäß Anspruch 11, dadurch
gekennzeichnet, daß man zur Herstellung
von L-Aminosäuren coryneforme Mikroorganismen
fermentiert, in denen man gleichzeitig eines oder
mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe
- 1. 17.1 das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierende Gen pck,
- 2. 17.2 das für die Glucose-6-Phosphat-Isomerase kodierende Gen pgi,
- 3. 17.3 das für die Pyruvat-Oxidase kodierende Gen poxB,
- 4. 17.4 das für das Zwa2-Protein kodierende Gen zwa2, abschwächt.
18. Coryneforme Bakterien, die einen Vektor enthalten, der
Teile des Polynukleotids gemäß Anspruch 1, mindestens
aber 15 aufeinanderfolgende Nukleotide der
beanspruchten Sequenz, trägt.
19. Verfahren gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden
Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß man Mikroorganismen
der Art Corynebacterium glutamicum einsetzt.
20. Verfahren zum Auffinden von RNA, cDNA und DNA, um
Nukleinsäuren, beziehungsweise Polynukleotide oder
Gene zu isolieren, die für den Response-Regulator MtrA
und/oder die Histidin-Proteinkinase MtrB kodieren oder
eine hohe Ähnlichkeit mit der Sequenz des mtrA-Gens
und/oder des mtrB-Gens aufweisen, dadurch
gekennzeichnet, daß man das
Polynukleotid, enthaltend die Polynukleotidsequenzen
gemäß den Ansprüchen 1, 2, 3 oder 4, als
Hybridisierungssonden einsetzt.
21. Verfahren gemäß Anspruch 20, dadurch
gekennzeichnet, daß man arrays, micro arrays
oder DNA-chips einsetzt.
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