DE10065632A1 - Verfahren zum Nachweis von Polynukleotiden - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Polynukleotiden auf einem Träger, wobei der Träger eine Vielzahl von separaten Nachweisbereichen mit jeweils unterschiedlichen Polynukleotiden enthält. Die Polynukleotide in den Nachweisbereichen liegen - im Gegensatz zu bekannten DNA-Chip-Testformaten - in einer nicht an den Träger gebundenen Form vor. Weiterhin wird eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens offenbart.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Polynukleotiden auf
einem Träger, wobei der Träger eine Vielzahl von separaten
Nachweisbereichen mit jeweils unterschiedlichen Polynukleotiden enthält.
Die Polynukleotide in den Nachweisbereichen liegen - im Gegensatz zu
bekannten DNA-Chip-Testformaten - in einer nicht an den Träger
gebundenen Form vor. Weiterhin wird eine Vorrichtung zur Durchführung
des Verfahrens offenbart.
Die Verwendung sogenannter DNA-Chips zur Bestimmung von
Polynukleotiden ist bekannt (siehe z. B. europäische Patente EP 0 373 203
und 0 619 321). DNA-Chips des Standes der Technik enthalten eine
Vielzahl separater Nachweisbereiche auf der Oberfläche eines Trägers, die
jeweils unterschiedliche Polynukleotide in einer trägergebundenen Form
enthalten. Ein Nachteil dieser DNA-Chips besteht jedoch darin, dass sich
die Reaktivität der auf dem Träger immobilisierten Polynukleotide signifikant
von der Reaktivität freier Polynukleotide, wie sie in biologischen Systemen
vorliegen, unterscheidet. Dies führt zu grundsätzlichen Problemen bei der
Auswertung von Hybridisierungsexperimenten unter Verwendung gängiger
DNA-Chips.
Die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe bestand darin,
neue Verfahren zur Bestimmung von Polynukleotiden bereitzustellen, die
einerseits eine vergleichbare Effizienz wie gängige DNA-Chips aufweisen,
bei denen aber andererseits die mit der Verwendung immobilisierter
Polynukleotide auftretenden Nachteile beseitigt sind.
Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Bestimmung von
Polynukleotiden, umfassend die Schritte:
- a) Bereitstellen eines Trägers, der mehrere separate Nachweisbereiche enthält, in denen sich jeweils ein Polynukleotid befindet, wobei das Polynukleotid in einer nicht an den Träger gebundenen Form vorliegt,
- b) Inkontaktbringen der in den Nachweisbereichen befindlichen Polynukleotide mit Nachweissonden, wobei in einzelnen Nachweisbereichen jeweils verschiedene Kombinationen von Polynukleotid und Nachweissonde vorhanden sind, und
- c) Bestimmen einer Hybridisierung der Polynukleotide mit den Nachweissonden.
Ein wesentlicher Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin,
dass die Hybridisierung der zu untersuchenden Polynukleotide mit
Nachweissonden in sehr geringen Messvolumina und bei sehr geringen
Konzentrationen der Reaktionspartner durchgeführt werden kann. Hierzu
wird vorzugsweise das im europäischen Patent 0 679 251 beschriebene
Verfahren der Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie (FCS) oder ein anderes
fluoreszenzspektroskopisches Verfahren mit ausreichender Sensitivität
verwendet. Dies FCS umfasst vorzugsweise die Messung von einem oder
wenigen Probenmolekülen in einem Messvolumen, wobei die Konzentration
der zu bestimmenden Moleküle ≦ 10-6 mol/l beträgt und das Messvolumen
vorzugsweise ≦ 10-14 l ist. Die Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie
umfasst die Bestimmung stoffspezifischer Parameter, die durch
Lumineszenzmessungen an den zu bestimmenden Molekülen ermittelt
werden. Bei diesen Parametern kann es sich um
Translationsdiffusionskoeffizienten, Rotationsdiffusionskoeffizienten
oder/und um die Exzitationswellenlänge, die Emissionswellenlänge oder/und
die Lebensdauer eines angeregten Zustandes eines lumineszierenden
Substituenten oder die Kombination dieser Messgrößen handeln. Auf
Einzelheiten zur Verfahrensdurchführung und apparative Details zu den für
das Verfahren verwendeten Vorrichtungen wird auf die Offenbarung des
europäischen Patents 0 679 251 verwiesen.
Alternativ kann auch eine Fluoreszenzabklingmessung durchgeführt
werden, wobei man die Relaxationszeit der Fluoreszenzmarkierung
bestimmt, oder das Auftreten von Energietransfer- oder Quenchvorgängen
bestimmt werden.
Die in den Nachweisbereichen des Trägers angeordneten Polynukleotide
sind vorzugsweise Nukleinsäuren wie DNA oder RNA, wobei DNA-
Polynukleotide besonders bevorzugt sind. Andererseits können als
Polynukleotide auch Nukleinsäureanaloga, wie etwa Peptidnukleinsäuren
(PNA), eingesetzt werden. Die Polynukleotide können einerseits aus
natürlichen Quellen stammen, z. B. aus Gen- oder cDNA-Bibliotheken, und
Gene, cDNA-Moleküle oder Fragmente davon sein, andererseits kann es
sich jedoch auch um synthetisch erzeugte, z. B. kombinatorische
Polynukleotidsequenzen handeln. Die Polynukleotide liegen in einer Form
vor, die unter den Bedingungen des Nachweisverfahrens mit einer
komplementären Nachweissonde hybridisieren kann. Vorzugsweise liegen
die Polynukleotide in einzelsträngiger Form vor.
Der Träger enthält bevorzugt mehrere Nachweisbereiche, in denen sich
jeweils ein Polynukleotid mit unterschiedlicher Sequenz befindet. Es ist
jedoch auch möglich, einen Träger mit mehreren Nachweisbereichen zu
verwenden, die jeweils ein Polynukleotid mit gleicher Sequenz enthalten. In
diesem Falle muss für jeden dieser Nachweisbereiche eine andere
Nachweissonde eingesetzt werden. Die Länge der Polynukleotide in den
Nachweisbereichen beträgt vorzugsweise mindestens 10 Nukleotide bis zu
mehreren tausend Nukleotiden.
Die zur Untersuchung einer Hybridisierung mit den in den
Nachweisbereichen befindlichen Polynukleotiden verwendeten
Nachweissonden können - ebenso wie die Polynukleotide selbst - aus
natürlichen oder synthetischen Quellen stammen. Die Nachweissonden
tragen vorzugsweise eine oder mehrere Markierungsgruppen, diese
Markierungsgruppen können während der Synthese der Nachweissonden
(insbesondere bei chemischer Synthese oder bei Amplifikation) oder auch
im Anschluss an die Synthese der Nachweissonden (z. B. durch
enzymatische Anfügung am 5'- oder 3'-Ende) eingeführt werden. So
können markierte Nachweissonden z. B. durch reverse Transkription von
RNA-Molekülen, z. B. von mRNA-Molekülen unter Verwendung markierter
Primer, oder durch enzymatische Primerextension unter Verwendung
markierter Nukleotidbausteine erzeugt werden.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden
Polynukleotide verwendet, die an einen Mikropartikel gekoppelt sind. Dieser
Mikropartikel hat eine Größe, die ausreicht, um die
Diffusionsgeschwindigkeit eines daran gekoppelten Polynukleotids zu
verlangsamen. Andererseits ist der Mikropartikel aber auch ausreichend
klein genug, um sicherzustellen, dass das daran gekoppelte Polynukleotid
in seinem Reaktionsverhalten im Wesentlichen einem "freien", nicht aber
einen "immobilisierten" Polynukleotid entspricht. Die Größe der
Mikropartikel ist vorzugsweise ≦ 1 µm, besonders bevorzugt 10 nm bis
500 nm. Bei den Mikropartikeln kann es sich um Latexpartikel z. B. aus
Polystyrol oder anderen Polymeren, Metallsolpartikel, Silika-, Quarz- oder
Glaspartikel handeln. Die Bindung von Polynukleotiden an Mikropartikel
kann durch kovalente oder nicht-kovalente Wechselwirkungen erfolgen.
Beispielsweise kann die Bindung der Polynukleotide an den Mikropartikel
durch hochaffine Wechselwirkungen zwischen den Partnern eines
spezifischen Bindepaares, z. B. Biotin/Streptavidin oder Avidin, Hapten/Anti-
Hapten-Antikörper, Zucker/Lectin etc. vermittelt werden. So können
biotinylierte Polynukleotide an Streptavidin-beschichtete Mikropartikel
gekoppelt werden. Alternativ können auch die Polynukleotide adsorptiv an
Partikel gebunden werden. So kann eine Bindung von durch Einbau von
Alkanthiolgruppen modifizierten Polynukleotiden an Metallpartikel, z. B.
Goldpartikel, erfolgen. Noch eine weitere Alternative ist die kovalente
Immobilisierung, wobei die Bindung der Polynukleotide über reaktive
Silangruppen auf einer Silikaoberfläche vermittelt werden kann.
Gegebenenfalls können alternativ oder zusätzlich auch an Mikropartikel
gekoppelte Nachweissonden eingesetzt werden.
Eine weitere Möglichkeit besteht darin, die Polynukleotide bzw.
Nachweissonden durch trägergebundene Synthese am Partikel unter
Verwendung bekannter Festphasensynthesemethoden herzustellen.
An einen Mikropartikel kann ein einziger Polynukleotidstrang gebunden
werden. Es können jedoch auch mehrere, z. B. bis zu mehreren tausend
Polynukleotidstränge an einen Partikel gebunden werden. Die Bindung
erfolgt vorzugsweise über den 5'- oder den 3'-Terminus des
Polynukleotidstrangs.
Für das erfindungsgemäße Verfahren wird ein Träger mit mehreren,
vorzugsweise mit einer Vielzahl von 102 oder mehr separaten
Nachweisbereichen verwendet. Die Nachweisbereiche sind so ausgestaltet,
dass sie eine Hybridisierung des Polynukleotids mit der Nachweissonde in
Lösung ermöglichen. Vorzugsweise handelt es sich bei den
Nachweisbereichen um Vertiefungen in der Trägeroberfläche, wobei diese
Vertiefungen grundsätzlich eine beliebige Form aufweisen können, z. B.
kreisförmig, quadratisch, rautenförmig etc. Vorzugsweise enthalten die
Nachweisbereiche ein Volumen von ≦ 10-6 l und besonders bevorzugt von
≦ 10-8 l. Der Träger enthält vorzugsweise 10-3 l oder mehr, besonders
bevorzugt 10-4 l oder mehr separate Nachweisbereiche.
Bevorzugte Konzentrationen der zu bestimmenden Polynukleotide in den
Nachweisbereichen sind ≦ 10-6 mol/l, besonders bevorzugt 10-10 bis 10-14
mol/l, während die Nachweissonden in einer Konzentration von
vorzugsweise ≦ 10-4 mol/l, besonders bevorzugt 10-8 mol/l bis 10-11 mol/l
angeboten werden.
Für das erfindungsgemäße Verfahren werden vorzugsweise markierte
Nachweissonden verwendet, wobei durch Lumineszenzmessungen
nachweisbare Markierungen, insbesondere durch Fluoreszenzmessung
nachweisbare Markierungen bevorzugt sind. Wenn die in einem
Nachweisbereich verwendete Nachweissonde mit dem dort befindlichen
Polynukleotid hybridisiert, findet aufgrund dieser Hybridisierung eine
nachweisbare Änderung eines stoffspezifischen Parameters statt. Diese
nachweisbare Änderung kann durch Fluoreszenzmessung gemessen
werden. So erfolgt beispielsweise bei Hybridisierung von Nachweissonde
und Polynukleotid eine nachweisbare Mobilitätsverringerung des Hybrids
gegenüber den Ausgangskomponenten. Alternativ oder zusätzlich kann
auch das Auftreten von Quench- oder Energietransfervorgängen bei der
Hybridisierung nachgewiesen werden. Solche Energietransfervorgänge
treten beispielsweise bei Verwendung mehrerer verschiedener markierter
Sonden bzw. markierter Polynukleotide und markierter Sonden auf.
Beispielsweise kann die Detektion mittels konfokaler Einzelmoleküldetektion
wie etwa durch Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie gemäß EP 0 679
251 erfolgen, bei der ein sehr kleines, vorzugsweise ein konfokales
Volumenelement, beispielsweise 0,1 × 10-15 bis 20 × 10-12 l dem
Anregungslicht eines Lasers ausgesetzt wird, das die in diesem
Messvolumen befindlichen fluoreszenzmarkierten Nachweissonden zur
Emission von Fluoreszenzlicht anregt, wobei das emittierte Fluoreszenzlicht
mittels eines Fotodetektors gemessen wird und eine Korrelation zwischen
der zeitlichen Veränderung der gemessenen Emission und der Mobilität der
Fluoreszenzmarkierungsgruppe bestimmt werden kann. Die konfokale
Einzelmolekülbestimmung ist weiterhin bei Rigler und Mets (Soc. Photo-
Opt. Instrum. Eng. 1921 (1993), 239 ff.) und Mets und Rigler (J. Fluoresc. 4
(1994), 259-264) beschrieben.
Alternativ bzw. zusätzlich kann die Detektion auch durch eine
zeitaufgelöste Abklingmessung, ein sogenanntes Time Gating erfolgen, wie
beispielsweise von Rigler et al. Picosecond Single Photon Fluorescence
Spectroscopy of Nucleic Acids, in: "Ultrafast Phenomena", D. H. Auston
ed. Springer 1984, beschrieben. Dabei erfolgt die Anregung der
Fluoreszenzmoleküle innerhalb eines Messvolumens und anschließend
- vorzugsweise in einem zeitlichen Abstand von ≧ 100 ps - das Öffnen eines
Detektionsintervalls am Fotodetektor. Auf diese Weise können durch
Ramaneffekte erzeugte Hintergrundsignale ausreichend gering gehalten
werden, um eine im Wesentlichen störungsfreie Detektion zu ermöglichen.
Das Timegating ist besonders zur Messung von Quench- oder
Energietransfervorgängen geeignet.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens kann die
Bestimmung auch die Messung eines kreuzkorrelierten Signals umfassen,
das von einem mindestens 2 unterschiedliche Markierungen, insbesondere
Fluoreszenzmarkierungen, enthaltenden Sonden-Polynukleotidkomplex
stammt, wobei mehrere unterschiedlich markierte Sonden oder/und
Polynukleotide mit jeweils unterschiedlichen Markierungen eingesetzt
werden können. Diese Kreuzkorrelationsbestimmung ist beispielsweise bei
Schwille et. al. (Biophys.J. 72 (1997), 1878-1886) und Rigler et. al.
(J. Biotechnol. 63 (1998), 97-109) beschrieben.
Der für das Verfahren verwendete Träger sollte so ausgestaltet sein, dass
er eine optische Detektion in den Nachweisbereichen ermöglicht.
Vorzugsweise wird daher ein zumindest in den Nachweisbereichen optisch
transparenter Träger verwendet. Der Träger kann dabei entweder
vollständig optisch transparent sein oder eine optisch transparente Basis
und eine optisch undurchlässige Deckschicht mit Aussparungen in den
Nachweisbereichen enthalten. Geeignete Materialien für Träger sind
beispielsweise Verbundstoffträger aus Metall (z. B. Silicium für die
Deckschicht) und Glas (für die Basis). Derartige Träger können
beispielsweise durch Aufbringen einer Metallschicht mit vorgegebenen
Aussparungen für die Nachweisbereiche auf das Glas erzeugt werden.
Alternativ können Plastikträger, z. B. aus Polystyrol oder Polymeren auf
Acrylat- oder Methacrylatbasis eingesetzt werden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Vorrichtung zur Bestimmung
von Polynukleotiden umfassend einen Träger, der mehrere separate
Nachweisbereiche enthält, in denen sich jeweils ein Polynukleotid befindet,
wobei das Polynukleotid in einer nicht an den Träger gebundenen Form
vorliegt. Die Vorrichtung kann durch Aufbringen der Polynukleotide in die
Nachweisbereiche des Trägers in Form einer Lösung, vorzugsweise einer
wässrigen Lösung, und anschließendes Eintrocknen hergestellt werden. Die
auf diese Weise erzeugte Vorrichtung ist für lange Zeit, z. B. mehrere
Monate, stabil.
Noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Reagenzienkit zur
Bestimmung von Polynukleotiden, umfassend eine erfindungsgemäße
Vorrichtung und (a) einen Satz markierter Nachweissonden oder (b) Mittel
zur Herstellung eines Satzes markierter Nachweissonden, z. B. markierte
Primer oder markierte (Deoxy)ribonukleosidtriphosphate, sowie
gegebenenfalls Enzyme zur Herstellung geeigneter Nachweissonden.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann beispielsweise für die funktionelle
Genomik und zur Transkriptomanalyse eingesetzt werden.
Weiterhin soll die vorliegende Erfindung durch die nachfolgenden Figuren
und Beispiele erläutert werden. Es zeigen:
Fig. 1 die schematische Darstellung eines zur Durchführung
des erfindungsgemäßen Verfahrens geeigneten Trägers (2) mit einer
Vielzahl von in Form von Vertiefungen auf dem Träger ausgebildeten
Nachweisbereichen (4). Ein Träger mit einer Fläche von 1 bis 2 cm2 kann
beispielsweise bis zu 104 Vertiefungen enthalten.
Fig. 2 einen Querschnitt durch einen erfindungsgemäßen
Träger. Der Träger enthält eine Basis (6), vorzugsweise aus einem optisch
transparenten Material wie Glas, und eine Deckschicht (8) mit
Aussparungen, z. B. aus Silicium. Es sind zwei Nachweisbereiche (4a, 4b)
gezeigt, die jeweils ein an einen Mikropartikel gekoppeltes Polynukleotid
(10a, 10b) und eine Nachweissonde (12a, 12b) enthalten. Im
Nachweisbereich (4a) findet eine Hybridisierung des Polynukleotids (10a)
mit der Nachweissonde (12a) statt, während im Nachweisbereich (4b)
keine Hybridisierung zwischen dem Polynukleotid (10b) und der
Nachweissonde (12b) erfolgt. Der Nachweis einer Hybridisierung zwischen
Mikropartikel-gekoppeltem Polynukleotid (10a) und markierter
Nachweissonde (12a) kann durch Untersuchung von Einzelmolekülen
erfolgen.
Für den Nachweis kann eine vorzugsweise unter der Trägerbasis
angeordnete Detektionsvorrichtung (14) eingesetzt werden. Die
Detektionsvorrichtung (14) kann einen Laser und einen Detektor enthalten.
Vorzugsweise wird eine Laser-Detektormatrix bestehend aus einer
Punktmatrix von Laserpunkten erzeugt durch eine Diffraktionsoptik oder
einen Quanten-Well-Laser sowie einer Detektormatrix erzeugt durch
fasergekoppelte einzelne Avalanche-Fotodiodendetektoren oder eine
Avalanche-Fotodiodenmatrix verwendet. Alternativ kann auch eine
elektronische Detektormatrix, z. B. eine CCD-Kamera eingesetzt werden.
In einer Matrix von m × n Mikrovertiefungen auf einem oder mehreren
Träger(n) wird eine Bibliothek von 4n unterschiedlichen Nukleotidsequenzen
der Länge m erzeugt, wobei jede Sequenz in einen separaten
Nachweisbereich transferiert wird. Die Nukleotidsequenzen enthalten an
ihrem 5'-Ende eine Biotingruppe und werden an Streptavidin-beschichtete
Mikropartikel gekoppelt.
Eine mRNA- oder cDNA-Bibliothek wird durch enzymatische Reaktion, z. B.
mit terminaler Transferase oder Ligase am 3'- und/oder 5'-Ende mit
fluoreszenzmarkierten Nukleotiden versehen. Die markierten Nukleotide
werden in die Vertiefungen des Trägers pipettiert.
Eine spezifische Hybridisierung zwischen Polynukleotid und markierter
Nachweissonde erfolgt durch Analyse der Translationsbewegung unter
Verwendung konfokaler Einzelmolekülanalyse. Der Nachweis erfolgt durch
eine Laser-Detektormatrix.
Claims (17)
1. Verfahren zur Bestimmung von Polynukleotiden,
umfassend die Schritte:
- a) Bereitstellen eines Trägers, der mehrere separate Nachweisbereiche enthält, in denen sich jeweils ein Polynukleotid befindet, wobei das Polynukleotid in einer nicht an den Träger gebundenen Form vorliegt,
- b) Inkontaktbringen der in den Nachweisbereichen befindlichen Polynukleotide mit Nachweissonden, wobei in einzelnen Nachweisbereichen jeweils verschiedene Kombinationen von Polynukleotid und Nachweissonde vorhanden sind, und
- c) Bestimmen einer Hybridisierung der Polynukleotide mit den Nachweissonden.
2. Verfahren nach Anspruch 1
dadurch gekennzeichnet,
dass man ein Polynukleotid verwendet, das an einen Mikropartikel
gekoppelt ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Konzentration der Polynukleotide in den Nachweisbereichen
≦ 10-6 mol/l beträgt.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Nachweisbereiche ein Volumen von jeweils ≦ 10-6 l oder
weniger aufweisen.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4,
dadurch gekennzeichnet,
dass der Träger ≦ 103 oder mehr separate Nachweisbereiche enthält.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5,
dadurch gekennzeichnet,
dass man eine markierte Nachweissonde verwendet.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6,
dadurch gekennzeichnet,
dass man eine fluoreszenzmarkierte Nachweissonde verwendet.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Bestimmung durch konfokale Einzelmoleküldetektion, z. B.
durch Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie oder/und durch
zeitaufgelöste Abklingmessung erfolgt.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Bestimmung eine Untersuchung der Mobilität von
Polynukleotid oder/und Nachweissonde umfasst.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Bestimmung eine Untersuchung des Auftretens von
Quench- oder Energietransfervorgängen umfasst.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Bestimmung die Messung eines kreuzkorrelierten Signals
umfasst, das von einem, mindestens 2 unterschiedliche
Markierungen, insbesondere Fluoreszenzmarkierungen, enthaltenden
Sonden-Polynukleotidkomplex stammt.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11,
dadurch gekennzeichnet,
dass man einen zumindest in den Nachweisbereichen optisch
transparenten Träger verwendet.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12,
dadurch gekennzeichnet,
dass der Träger eine optisch transparente Basis und eine optisch
undurchlässige Deckschicht mit Aussparungen in den
Nachweisbereichen enthält.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13,
dadurch gekennzeichnet,
dass man einen Metall/Glas-Träger oder einen Plastikträger
verwendet.
15. Vorrichtung zur Bestimmung von Polynukleotiden,
umfassend:
einen Träger, der mehrere separate Nachweisbereiche enthält, in denen sich jeweils ein Polynukleotid befindet, wobei das Polynukleotid in einer nicht an den Träger gebundenen Form vorliegt.
einen Träger, der mehrere separate Nachweisbereiche enthält, in denen sich jeweils ein Polynukleotid befindet, wobei das Polynukleotid in einer nicht an den Träger gebundenen Form vorliegt.
16. Reagenzienkit zur Bestimmung von Polynukleotiden,
umfassend eine Vorrichtung nach Anspruch 15 und (a) einen Satz
markierter Nachweissonden oder (b) Mittel zur Herstellung eines
Satzes markierter Nachweissonden.
17. Verwendung der Vorrichtung nach Anspruch 15 oder eines
Reagenzienkits nach Anspruch 16 in einem Verfahren nach einem
der Ansprüche 1 bis 14.
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| 8141 | Disposal/no request for examination |