DE10061634A1

DE10061634A1 - Verfahren zur Bestimmung unbekannter DNA-Sequenzen in komplexen Genomen

Info

Publication number: DE10061634A1
Application number: DE10061634A
Authority: DE
Inventors: Rainer Stahl
Original assignee: FRIEDRICH WEISSHEIMER MALZFABRIK; WEISSHEIMER FRIEDR MALZFAB
Current assignee: Maltagen Forschung GmbH
Priority date: 2000-12-11
Filing date: 2000-12-11
Publication date: 2002-06-20
Anticipated expiration: 2020-12-12
Also published as: DE10061634B9; DE10061634B4

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung einer unbekannten Sequenz einer Region, die flankierend zu einer bekannten Sequenz liegt bzw. zum Bestimmen des Integrationsortes einer Fremd-DNS in einem komplexen Genom. Dabei wird eine Kombination an Verfahrensschritten gewählt, die zum raschen und spezifischen Nachweis der Sequenzen der die bekannte Sequenz flankierenden Regionen bzw. des Integrationsortes der Fremd-DNS führt, wobei die hohe Spezifität mit niedrigem Aufwand an Reagenzien und Materialien sowie einem geringen Arbeits- und Zeitaufwand erreicht wird.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Bestimmen von unbekannten Se quenzabschnitten, die vor (5'-) und/oder hinter (3'-) eines bekannten Sequenzabschnit tes liegen. Dies sind z. B., aber nicht nur, unbekannte Sequenzen in einem Genom, die neben einer auf künstliche, (z. B. Transformation) oder natürliche Weise (z. B. Kreuzung) eingebrachten Fremd-DNS liegen. Auf diese Weise lassen sich z. B. die Insertionsorte von rekombinanter DNS in transgenen Organismen, auch solcher mit komplexen Ge nomen, rasch bestimmen. Auch unbekannte Sequenzen von z. B. Promotoren oder Ter minatoren, sofern sich neben diesen eine bekannte Sequenz befindet, sowie die be kannte Markersequenzen flankierenden DNS-Regionen lassen sich mit der vorliegenden Erfindung identifizieren. Daneben ermöglicht die Methode auch die rasche Identifizie rung von unbekannten Genen.

Ferner betrifft die Erfindung Nukleinsäuremoleküle, die bei dieser Bestimmung einge setzt werden.

Klassische genetische Ansätze zur Identifizierung eines Gens basieren auf der Zer störung des Gens, wobei dies zu einer erkennbaren Phänotypänderung führt. Dieses Prinzip des "Gen-Ausschaltens" wird auch beim sog. "transposon tagging" eingesetzt. Transposons "springen" durch das Genom und können bei entsprechender Integration Gene inaktivieren, indem sie durch die Integration die Ausprägung des Gens unterbin den. Die Kenntnis der Umgebung des Transposons gibt Kenntnis über das Gen, wel ches zerstört wurde und ermöglicht es somit, einem neuen Phänotyp ein bestimmtes Gen zuzuordnen.

Heutzutage gibt es zahlreiche gentechnische Verfahren, bei denen ein gegebenes Ge nom durch das Einbringen von Fremd-DNS verändert wird in der Hoffnung, dass das so veränderte Genom seinem Wirt eine neue Eigenschaft verleiht. Häufig ist die Integration der Fremd-DNS nicht zielgerichtet. Bei der Transformation von Pflanzen kann beispiels weise Fremd-DNS mittels der "particle gun"-Technologie, mit Hilfe von Agrobakterien oder Polyethylenglykol-vermittelter Transformation in Wirtszellen eingebracht werden, wobei die so eingebrachte DNS zufällig und an mehreren verschiedenen Stellen des Genoms integriert. Die Identifizierung von Integrationsorten ist häufig aus verschiedenen Gründen wichtig.

So wird beispielsweise von Bestimmungen der Gentechnikverordnung in Zukunft ver langt, dass transgene Pflanzenlinien genauer charakterisiert werden müssen. Hierzu zählt auch die Sequenzanalyse der die Insertion flankierenden Regionen. Die Umge bung des Integrationsortes kann als eine Art genetischer Fingerabdruck eines Organis mus, wie z. B. einer Pflanze, verwendet werden, wobei anhand dieses Fingerabdrucks jeder Organismus eindeutig von einem Anderen unterschieden werden kann. Ferner ermöglicht die Analyse der Integrationsorte auch die Bestimmung der Mindest- Kopienzahl an eingebrachten Fremd-Sequenzen und die eindeutige Zuordnung jeder dieser Kopien zu ihrem Insertionsort. Eine solche Zuordnung ist bisher ohne die Anlage von Genbanken des betreffenden Organismus nicht möglich gewesen. Da mit der her kömmlichen PCR-Analytik lediglich angezeigt wird, ob eine eingebrachte Fremdsequenz anwesend ist oder nicht, und mit neueren PCR-Methoden wie auch mit der Southern- Technologie nur die ungefähre Kopienzahl ermittelt werden kann, ist es bisher nicht möglich gewesen, festzustellen, um welche Kopie (von mehreren Kopien) es sich bei dem erzeugten Signal handelt. Informationen von mindestens einer flankierenden Regi on einer Insertion ist sowohl für die PCR-Methode als auch für die Southern- Technologie Voraussetzung, um einzelne Kopien voneinander zu unterscheiden. Bei der Southern-Technologie kann dann eine Sonde gemacht, bei der PCR können entspre chende Startersequenzen hergestellt werden, um die Aufspaltung einer jeden einzelnen Kopie in den Nachfolgegenerationen verfolgen.

Werden beispielsweise vier verschiedene 5' und/oder 3' spezifische flankierende Se quenzen gefunden, bedeutet dies, dass ein bei einer Transformation eingebrachtes Gen an mindestens vier verschiedenen Orten im Genom inseriert ist. Mit Kenntnis dieser Se quenzen ist es möglich, jede einzelne Kopie zu identifizieren. Hierbei reicht es aus, dass nur die 5' oder 3' spezifischen flankierende Sequenz einer Insertion gefunden werden.

Mit der Kenntnis von beiden flankierenden Sequenzen einer Insertion ist es auch mög lich, die Nachkommen einer transgenen Pflanze mit Hilfe der PCR-Technologie, schon in einem sehr frühen Entwicklungsstadium direkt auf Heterozygotie bzw. Homozygotie für die jeweilige Insertion zu testen. Ergibt eine PCR mit Startersequenzen homolog zu den beiden flankierenden Regionen einer Insertion ein Fragment, wie es auch bei einem nichttransformierten Organismus derselben Varietät zu finden ist, so ist die Pflanze ent weder heterozygot oder aber nicht-transgen in Bezug auf diese Kopie der Fremd-DNS. Nur bei Organismen, die homozygot für diese Kopie der eingebrachten Fremd-DNS sind, würde die PCR zu keinem oder aber zu einem definierten größeren Fragment füh ren. Eine PCR mit Startersequenzen homolog zu Bereichen aus jeweils einer flankie renden Region dieser Kopie sowie aus der Insertion selbst hingegen führt zu einem Produkt und belegt das Vorhandensein dieser Kopie der Fremd-DNS im Genom. Auf diese Weise wird es ermöglicht, gezielt, schnell und zuverlässig eine homozygote Nach kommenschaft zu züchten, denn nur wenn die eingebrachten Fremd-Sequenzen bei der Nachkommenschaft der jeweiligen transgenen Organismen nicht als Allele vorliegen, ist gewährleistet, dass die weiteren Nachfolgegenerationen bezüglich dieser Fremdse quenzen nicht mehr aufspalten.

Im Stand der Technik sind mehrere Verfahren beschrieben, die dazu dienen, Integrati onsstellen einer Fremd-DNS zu charakterisieren. In allen Methoden sind lineare PCR- Schritte vorgesehen, um das Ausgangsmaterial anzureichern. Diese linearen Anreiche rungen erfolgen vor der Reinigung des Ausgangsmaterials von unerwünschten Ge nomstücken, so dass die Spezifität und Effektivität der nachfolgenden Schritte erheblich beeinträchtigt ist, wie Beispiel vier zeigt.

Der vorliegenden Erfindung lag das technische Problem zugrunde, ein Verfahren zum raschen Bestimmen einer unbekannten Sequenz in Nachbarschaft zu einer bekannten Sequenz, z. B. also des Integrationsortes von Fremd-DNS in einem Genom, anzugeben, wobei das Verfahren die erheblichen Nachteile aus dem Stand der Technik nicht mehr aufweisen sollte, insbesondere soll es eine eindeutige Bestimmung der unbekannte Se quenz, z. B. des Integrationsortes, ermöglichen. Schließlich soll das erfindungsgemäße Verfahren möglichst kostengünstig und einfach und schnell durchgeführt werden kön nen, wobei insbesondere der Einsatz teurer Reagenzien auf ein Minimum beschränkt werden soll.

Das genannte technische Problem wird erfindungsgemäß gelöst durch das Verfahren, umfassend die folgenden Schritte:

a) Bestimmen der 5'-ubekannten Sequenz (z. B. 5'-Integrationsstelle), umfassend die folgenden Schrille;
- 1. Spalten der genomischen DNS mit einem Restriktionsenzym;
- 2. Hybridisieren der gespaltenen DNS mit einer markierten Sonde bzw. mit einer markierten Sonde und einer unmarkierten Brückensonde;
- 3. Aufreinigen des mit der markierten Sonde hybridisierten Einzelstrangs;
- 4. Verknüpfung eines doppelsträngigen Adapters mit dem 3'-Ende bzw. 5'-Ende des aufgereinigten Einzelstrangs bzw. Verknüpfung eines doppelsträngigen A dapters mit dem 3'-Ende bzw. 5'-Ende und Verknüpfung der markierten Sonde mit dem 5'-Ende bzw. 3'-Ende des aufgereinigten Einzelstrangs;
- 5. Herstellen von Doppelstrang-DNS;
- 6. Amplifizieren der Doppelstrang-DNS nach a5); und
- 7. Sequenzanalyse der amplifizierten DNS; und/oder
b) Bestimmen der 3'-unbekannte Sequenz (z. B. der 3'-Integrationsstelle), umfas send die folgenden Schritte:
- 1. Bereitstellen einer Fraktion DNS aus Schritt a1) oder Spalten der genomischen DNS mit einem Restriktionsenzym, das gleich oder verschieden zu dem Enzym gemäß a1) sein kann;
- 2. Hybridisieren der gespaltenen DNS mit einer markierten Sonde bzw. mit einer markierten Sonde und einer unmarkierten Brückensonde;
- 3. Aufreinigen des mit der markierten Sonde hybridisierten Einzelstrangs;
- 4. Verknüpfen eines doppelsträngigen Adapters mit dem 3'-Ende bzw. 5'-Ende des aufgereinigten Einzelstranges bzw. Verknüpfen eines doppelsträngigen Adapters mit dem 3'-Ende bzw. 5'-Ende des aufgereinigten Einzelstranges und Verknüp fung der markierten Sonde mit dem 5'-Ende bzw. 3'-Ende des aufgereinigten Einzelstrangs;
- 5. Herstellen von Doppelstrang-DNS;
- 6. Amplifizieren der Doppelstrang-DNS; und
- 7. Sequenzanalyse der amplifizierten DNS, wobei die Maßnahmen der Schritte a1) bis a7) auch auf das Bestimmen der 3'-unbekannten Sequenz anwendbar sind und die Maßnahmen b1) bis b7) auf das Bestimmen der 5'-unbekannten Se quenz anwendbar sind.

Das Verfahren wird im folgenden näher erläutert und umfaßt die folgenden bevorzugten Maßnahmen:

a) Mit einer am 5' Ende markierten Sonde wird DNS untersucht, die wie folgt be handelt worden ist:
- 1. Spalten der genomischen DNS mit einem Restriktionsenzym, das einen 5' Überhang oder keinen Überhang (Fig. Ia.1; Fig. Ib.1) bzw. mit einem Restriktionsenzym, das einen 3' Überhang oder keinen Überhang (Fig. IV.1) erzeugt;
- 2. Hybridisieren der gespaltenen DNS mit einer markierten direkten Sonde (Fig. Ia.2; Fig. Ib.2), bzw. mit einer markierten indirekten Sonde mittels einer Brückensonde (Fig. IV.2);
- 3. Selektion des mit der Sonde reversibel verbundenen Einzelstrangs (Fig. Ia.2; Fig. 1b.2; Fig. IV.2);
- 4. Anfügen eines doppelsträngigen Adapters an das 5'-Ende des selektierten Einzal strangs durch eine kovalente Bindung (Fig. Ia.3; Fig. Ib.3) bzw. Anfügen eines dop pelsträngigen Adapters an das 3'-Ende des selektierten Einzelstrangs durch eine ko valente Bindung und kovalente Verknüpfung der Sonde mit dem 5' Ende des selek tierten Einzelstrangs (Fig. IV.3);
- 5. Herstellen von Doppelstrang vom selektierten Einzelstrang einschließlich der Adap tersequenz mit Hilfe einer zur Fremd-DNS bzw. zur bekannten genomischen Se quenz komplementären Startersequenz (Fig. Ia.4; Fig. Ib.4) bzw. mit Hilfe einer zur Adapter-Sequenz komplementären Startersequenz (Fig. IV.4);
- 6. Amplifizieren der Doppelstrang-DNS (Fig. Ia.5; Fig. Ib5; Fig. IV.5);
- 7. Amplifizieren der Doppelstrang-DNS mit einer innenliegenden Startersequenz (Fig. Ia.6; Fig. Ib.6; Fig. IV.6) und
- 8. Analyse des amplifizierten DNS-Produktes (Fig. Ia.7; Fig. Ib.7; Fig. IV.7).
b) Mit einer am 3' Ende markierten Sonde wird DNS untersucht, die wie folgt be handelt worden ist:
- 1. Spalten der genomischen DNS mit einem Restriktionsenzym, das einen 3' Überhang oder keinen Überhang (Fig. II.1), bzw. mit einem Restriktionsenzym, das einen 5' Ü berhang oder keinen Überhang (Fig. IIIa.1; Fig. IIIb.1) erzeugt;
- 2. Hybridisieren der gespaltenen DNS mit einer markierten direkten Sonde (Fig. II.2), bzw. mit einer markierten indirekten Sonde mittels einer Brückensonde (Fig. IIIa.2; Fig. IIIb.2);
- 3. Selektion des mit der Sonde reversibel verbundenen Einzelstrangs (Fig. II.2, Fig. IIIa.2; Fig. IIIb.2);
- 4. Anfügen eines doppelsträngigen Adapters an das 3'-Ende des selektierten Einzel strangs durch eine kovalente Bindung (Fig. II.3) bzw. Anfügen eines doppelsträngi gen Adapters an das 5'-Ende des selektierten Einzelstrangs durch eine kovalente Bindung und kovalente Verknüpfung der Sonde mit dem 3' Ende des selektierten Einzelstrangs (Fig. IIIa.3; Fig. IIIb.3);
- 5. Herstellen von Doppelstrang vom selektierten Einzelstrang inklusive der Adapterse quenz mit Hilfe einer zur Adaptersequenz komplementären Startersequenz (Fig. 11.4); bzw. mit Hilfe einer zur Fremd-DNS bzw. bekannten genomischen Sequenz komplementären Startersequenz (Fig. IIIa.4; Fig. IIIb.4);
- 6. Amplifizieren der Doppelstrang-DNS (Fig. II.5, Fig. IIIa.5. Fig. IIIb.5);
- 7. Amplifizieren der Doppelstrang-DNS mit einer innenliegenden Startersequenz (Fig. II.6, Fig. IIIa.6; Fig. IIIb.6) und
- 8. Analyse des amplifizierten DNS-Produktes (Fig. II.7, IIIa.7; Fig. IIIb.7).

Unter "komplexen Genomen" werden insbesondere Genome von Tieren und Pflanzen verstanden, hier insbesondere Genome von Getreidepflanzen.

"Fremd-DNS" kann eine beliebige bekannte DNS sein, die an einer Stelle ins Genom integriert wurde, an der sie sich üblicherweise nicht befindet. Somit wird z. B. auch ein wirtszelleigenes Transposon in diesem Sinne als Fremd-DNS angesehen, wenn das Transposon an eine Stelle ins Genom springt, an der es sich üblicherweise nicht befin det. In der Regel stellt Fremd-DNS jedoch eine DNS dar, die in dem Genom der Wirts zelle, in die die Fremd-DNS eingebracht wird, üblicherweise nicht vorhanden ist.

"5'-Integrationsstelle" bzw. "3'-Integrationsstelle", auch 5' unbekannte Sequenz bzw. 3' unbekannte Sequenz benannt, bezeichnet den Übergang zwischen der Fremd-DNS zu dem Genom der Empfängerzelle (Wirtszelle) am 5'-Ende der Fremd-DNS bzw. am 3'- Ende der Fremd-DNS, bzw. den Übergang zwischen der bekannten DNS-Sequenz zu der unbekannten Sequenz am 5'-Ende der bekannten Sequenz bzw. den Übergang zwi schen der bekannten DNS-Sequenz zu der unbekannten Sequenz am 3'-Ende der be kannten Sequenz. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann auch entweder nur die 5'-Integrationsstelle oder nur die 3'-Integrationsstelle bestimmt werden. Vorzugsweise werden jedoch beide Integrationsstellen bestimmt. Nach Isolieren der zu untersuchen den genomischen DNS wird diese mit einem Restriktionsenzym gespalten. Zahlreiche Restriktionsenzyme stehen dem Fachmann zur Verfügung, wobei er das Restriktionsen zym u. a. danach auswählt, welche Art an Enden er erzeugen will. Die mit dem Restrik tionsenzym erzeugten Enden spielen eine Rolle bei der weiteren Behandlung der ge spaltenen DNS, z. B. für das spätere Anfügen von Adapter. In der Regel wird das Re striktionsenzym auch ein nicht-methylierungssensitives Restriktionsenzym sein. Die mit dem Restriktionsenzym gespaltene DNS kann ggf. in zwei Teile aufgeteilt werden, wo bei die Fraktionen für die Analyse des 5'-Integrationsortes bzw. des 3'-Integrationsortes in separaten Verfahren eingesetzt werden. Falls die Enzyme, die für die Analyse der 5'- Integrationsstelle verwendet werden, verschieden sind von den Enzymen für die Analy se der 3'-Integrationsstelle, werden gleich zwei getrennte Restriktionsspaltungen durch geführt.

Die Behandlung kann nach verschiedenen Prozeduren erfolgen, wobei die zu verwen denden Sonden zu der jeweiligen Prozedur passen müssen:

Prozedur I (Fig. Ia; Fig. Ib, Fig. II)

Die gespaltene DNS wird denaturiert und mit einer am 5' Ende (Fig. Ia; Fig. Ib) bzw. am 3' Ende (Fig. II) markierten Sonde hybridisiert. Die markierte Sonde ist vorzugsweise 100% komplementär zu einem Abschnitt der Fremd-DNS bzw. der bekannten genomi schen DNS. Mit dieser markierten Sonde wird das zu untersuchende Restriktionsfrag ment selektiert und von anderen genomischen Restriktionsfragmenten, sowie von über schüssigem Adapter durch Waschen befreit. Während dieser Reinigung bleibt die mar kierte Sonde reversibel über Wasserstoffbrücken an den zu selektierenden Einzelstrang gebunden. Die zum Hybridisieren eingesetzte Sonde kann entweder direkt auf einen festen Träger fixiert sein - in diesem Falle wäre die Markierung gleichzeitig der Träger - oder die Markierung der Sonde reagiert mit einem komplementären Bindungspartner, der seinerseits auf dem festen Träger fixiert ist. Ein solcher kompetetiver Bindungspart ner auf dem festen Träger kann beispielsweise eine weitere Nukleinsäure sein oder ein Antikörper gegen die Markierung der Sonde oder ein weiterer Bindungspartner eines Bindungspaars, wie z. B. Antigen/Antikörper, Hormon/Rezeptor, Biotin/Avidin bzw. Streptavidin und ähnliches. Die eingesetzten Sonden besitzen vorzugsweise eine Länge von etwa 30 Nukleotiden oder größer.

Nach dem Reinigen wird an das freie Ende des zu analysierenden Einzelstrangs ein Adaptermolekül kovalent angefügt. Das Adaptermolekül besitzt vorzugsweise überhängende Enden, die komplementär sind zu den überhängenden Enden der genomischen DNS, die mittels der Restriktionsenzymspaltung erzeugt wurden. Ferner bestehen die einzelnen Oligonukleotide, die das Adaptermolekül bilden, vorzugsweise aus einer Komposition von jeweils nur 2 verschiedenen Basen, um so eine intramolekulare Hybri disierung der einzelnen Oligonukleotide zu unterbinden. Nach diesen Verfahrensschrit ten liegt beispielsweise ein Einzelstrang vor, an dessen 5'-Ende bzw. 3'-Ende sich die markierte Sonde nicht kovalent gebunden befindet und an dessen 3'-Ende bzw. 5'-Ende sich die Adaptersequenz befindet. Nach der Ligation wird der nun mit dem Adapter ko valent verknüpfte Einzelstrang nochmals in mehreren Waschschritten gereinigt, um die Ligations-Komponenten, die im Überschuß eingesetzten Adapter sowie möglicherweise noch vorhandene unspezifische genomische DNS zu entfernen. Dieser gut gereinigte Einzelstrang wird dann in einem folgenden Schritt zu einem Doppelstrang ergänzt, wo bei auf die Bedürfnisse des Einzelfalls abgestellt, hierfür zur Gegenstrangsynthese von bestimmten Startersequenzen ausgegangen wird. Hieran schließt sich die Amplifikation des erhaltenen Doppelstrangs an. Als Startersequenzen für die Amplifikation bieten sich einerseits Abschnitte der bekannten Vektorsequenz bzw. der bekannten genomischen Sequenz und andererseits der bekannten Adaptersequenz an. Sobald ausreichend amplifiziertes Material vorliegt, kann dieses der Sequenzanalyse zugeführt werden. Ge gebenenfalls erfolgt vor der Sequenzanalyse eine nochmalige Aufreinigung der amplifi zierten DNS, beispielsweise mittels Gelchromatographie, sowie möglicherweise die Klo nierung des amplifizierten Fragmentes.

Prozedur II (Fig. IIIa; Fig. IIIb; Fig. IV)

Die gespaltene DNS wird denaturiert und mit zwei verschiedenen Sonden hybridisiert. Die eine Sonde ist nicht markiert und ist zu ca. 50% (von der Mitte der Sonde bis zu ih rem 3'-Ende bei einer 3'-Markierung der markierten zweiten Sonde (Fig. IIIa; Fig. IIIb) bzw. von der Mitte der Sonde bis zu ihrem 5'-Ende bei einer 5'-Markierung der mar kierten zweiten Sonde (Fig. IV)) komplementär zu einem Abschnitt der Fremd-DNS bzw. zu einem Abschnitt der bekannten genomischen DNS. Zu weiteren ca. 50% (von der Mitte der Sonde bis zu ihrem 5'-Ende bei einer 3-Markierung der markierten zweiten Sonde (Fig. IIIa; Fig. IIIb) bzw. von der Mitte der Sonde bis zu ihrem 3'-Ende bei einer 5'-Markierung der markierten zweiten Sonde (Fig. IV)) ist sie komplementär zu der am 5'-Ende bzw. 3'-Ende markierten zweiten Sonde. Sie fungiert sozusagen als Brücken glied (Brückensonde) zwischen dem zu untersuchenden Restriktionsfragment und der am 5'- bzw. 3'-Ende markierten zweiten Sonde.

Mit diesem Hybrid aus markierter Sonde und nicht markierter Sonde wird das zu unter suchende Restriktionsfragment selektiert und von anderen genomischen Restriktions fragmenten und anderen Komponenten durch Waschen befreit. Während dieser Reini gung bleiben die markierte Sonde sowie die nicht markierte Brückensonde reversibel über Wasserstoffbrücken miteinander sowie mit dem zu selektierenden Einzelstrang verbunden. Die zur Hybridisierung eingesetzten Sonden können entweder direkt auf einen festen Träger fixiert sein - in diesem Falle wäre die Markierung gleichzeitig der Träger - oder die Markierung der markierten Sonde reagiert mit einem komplementären Bindungspartner, der seinerseits auf dem festen Träger fixiert ist. Ein solcher kompetetiver Bindungspartner auf dem festen Träger kann beispielsweise eine weitere Nukleinsäure sein oder ein Antikörper gegen die Markierung der Sonde oder ein weiterer Bindungspartner eines Bindungspaars, wie z. B. Antigen/Antikörper, Hor mon/Rezeptor, Biotin/Avidin bzw. Streptavidin und ähnliches. Die eingesetzten Sonden besitzen vorzugsweise eine Länge von etwa 30 Nukleotiden oder größer.

Nach dem Reinigen des gewünschten Einzelstrangs wird an das freie Ende des Einzel stranges ein Adaptermolekül angefügt. Das Adaptermolekül besitzt vorzugsweise über hängende Enden, die komplementär sind zu den überhängenden Enden der genomi schen DNS, die mittels der Restriktionsenzymspaltung erzeugt wurden. Ferner bestehen die einzelnen Oligonukleotide, die den Adapter bilden, bis auf die überhängenden En den, vorzugsweise aus einer Komposition A und G bzw. C und T, um so eine intramole kulare Hybridisierung der einzelnen Oligonukleotide zu unterbinden. Bei der Ligation des Adapters an das einzelsträngige Restriktionsfragment kommt es auch zu einer Ligation der markierten Sonde an das zu untersuchende Restriktionsfragment. Der Vorteil hier von ist, daß nun Adaptersequenz, einzelsträngiges Restriktionsfragment sowie markierte Sonde kovalent miteinander verbunden sind. Die nachfolgende Abtrennung von Ligati onskomponenten, überschüssigen Adaptern sowie eventuell noch vorhandenener uner wünschter genomischer DNS kann nun in Gegenwart von 0,1 M NaOH-Lösung erfolgen. Dadurch wird das Verfahren noch stringenter als in Prozedur I beschriebenen.

Nach diesen Verfahrensschritten liegt beispielsweise ein Einzelstrang vor, an dessen 5'- Ende bzw. 3'-Ende sich die markierte Sonde und an dessen 3'-Ende bzw. 5'-Ende sich die Adaptersequenz kovalent gebunden befindet. Dieser Einzelstrang wird in einem fol genden Schritt zu einem Doppelstrang ergänzt, wobei auf die Bedürfnisse des Einzel falls abgestellt, hierfür zur Gegenstrangsynthese von bestimmten Startersequenzen ausgegangen wird. Hieran schließt sich die Amplifikation des erhaltenen Doppelstrangs an. Als Startersequenzen für die Amplifikation bieten sich einerseits Abschnitte der be kannten Vektorsequenz bzw. der bekannten genomischen Sequenz und andererseits der bekannten Adaptersequenz an.

Sobald ausreichend amplifiziertes Material vorliegt, kann dieses der Sequenzanalyse zugeführt werden. Gegebenenfalls erfolgt vor der Sequenzanalyse eine nochmalige Reinigung der amplifizierten DNS, beispielsweise mittels Gelchromatographie, sowie möglicherweise die Klonierung des amplifizierten Fragmentes.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird zum Spalten der genomischen DNS ein häufig spaltendes Restriktionsenzym eingesetzt. Häufig spaltende Restriktionsenzyme in pflanzlichen oder tierischen Genomsequenzen sind beispielsweise solche, die nur 4 Nukleotide als Erkennungssequenz benötigen. Es können allerdings auch Enzyme mit längeren Erkennungssequenzen benutzt werden, die bevorzugt eingesetzt werden, um unbekannte Sequenzen längerer Fragmente zu identifizieren. Hierbei sind wieder be sonders solche Enzyme bevorzugt, die überhängende Enden erzeugen.

Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die verwendete Sonde entweder ausschließlich am 5'-Ende oder am 3'-Ende markiert. Diese Art der Markierung hat ge genüber der Markierung, die statistisch über das Sondenmolekül verteilt ist (indem z. B. mit einer Markierung versehene Nukleotide zur Herstellung der Sonde verwendet wer den), den Vorteil, dass ein möglichst kleiner Anteil der Sonde einer sterischen Hinde rung unterliegt, wenn die Sonde und der damit hybridisierte Einzelstrang an den festen Träger fixiert werden. Sondenmoleküle, die über ihre ganze Länge eine Markierung tra gen, können beispielsweise dann, wenn die Sonde zu einem späteren Zeitpunkt gleich zeitig als Starter dienen soll, Probleme bereiten, indem die Starterfunktion beeinträchtigt ist, weil den zur DNS-Synthese benötigten Enzymen der Zutritt zur Startersequenz auf Grund sterischer Hinderung erschwert ist.

Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Markierung der Sonde so gewählt, dass die Sonde an einen festen Träger fixiert werden kann. Dies lässt sich bei spielsweise dadurch erreichen, dass die Sonde Nukleotide umfasst, die nicht mit dem zu isolierenden Einzelstrang hybridisieren können, weil entsprechende komplementäre Nukleotide diesem Strang fehlen. Somit liegt eine Art "Linker" vor, der an die Oberfläche eines Trägers direkt kovalent gebunden werden kann. Alternativ kann an die Oberfläche des Trägers auch eine Sequenz gebunden sein, die komplementär ist zu dieser Linker sequenz, wobei dann das Sondenmolekül mittels Hybridisierung an den festen Träger fixiert wird. Schließlich können in oder an das Sondenmolekül auch Reste angefügt wer den, zu denen es komplementäre Bindungspartner gibt, wobei der komplementäre Bin dungspartner an einen festen Träger fixiert sein kann. Hierzu zählen beispielsweise die Bindungspaare Antigen/Antikörper, Hormon/Hormonrezeptor, Rezeptor/Ligand, Bio tin/Avidin bzw. Streptavidin.

Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Sonde kovalent durch einen Ligationsschritt an den DNS-Einzelstrang gebunden. Eine solche Variante ist beispiels weise in Fig. IV, Fig. IIIa und Fig. IIIb gezeigt. Das Verknüpfen des Einzelstrangs mit der Sonde kann selbstverständlich entweder am freien 3'-Ende oder am freien 5'-Ende des Einzelstrangs erfolgen. Falls die kovalente Verknüpfung am 3'-Ende des Einzel stranges erfolgt, wird eine 3'-markierte Sonde eingesetzt, die zunächst durch Hybridisie rung an eine "Brückensonde" an das 3'-Ende des Einzelstrangs herangeführt wird (Fig. IIIa.2; Fig. IIIb.2) und dann durch Ligation kovalent mit dem Einzelstrang verknüpft wird (Fig. IIIa.3; Fig. IIIb.3). Falls die kovalente Verknüpfung am 5'-Ende erfolgt, wird eine 5'- markierte Sonde eingesetzt, die zunächst durch Hybridisierung an eine "Brückensonde" an das 5'-Ende des Einzelstrangs herangeführt wird (Fig. IV.2) wird und dann durch Li gation kovalent mit dem Einzelstrang verknüpft wird (Fig. IV.3).

Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Reinigung des Sonden markierten Einzelstrangs mit Hilfe affinitätschromatographischer Methoden. Dabei wird die spezifische Wechselwirkung zwischen zwei Bindungspartnern ausgenutzt, wobei ein Bindungspartner die Markierung in der Sonde darstellt und der andere Bindungspartner an einen festen Träger gekoppelt ist. Über die spezifische Wechselwirkung wird die ge suchte DNS selektiv an dem festen Träger fixiert, so dass nicht gewünschte und nicht markierte DNS beispielsweise durch einfaches Waschen entfernt werden kann.

Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das Adaptermolekül an das 5'- Ende bzw. 3'-Ende des gereinigten Einzelstrangs ligiert. Somit entsteht ein Produkt, umfassend in 5'-/3'-Richtung die Adaptersequenz, unbekannte genomische Sequenz, bekannte Sequenz und Sondensequenz (Fig. IIIa.4; Fig. IIIb.4) bzw. das Produkt mit der (wieder in 5'/3'-Richtung) Sondensequenz, bekannte Sequenz, unbekannte genomi schen Sequenz, Adaptersequenz (Fig. IV.4).

Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird der gereinigte und mit Adapterse quenz und Sondensequenz ergänzte Einzelstrang zu einem Doppelstrang ergänzt, wo bei hierbei vorzugsweise aber nicht ausschließlich mindestens eine weiter innen liegen de Startersequenz eingesetzt wird.

Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Amplifikation der Doppel strang-DNS mit Hilfe der PCR, wobei jeweils vorzugsweise aber nicht ausschließlich mindestens eine weiter innen liegende Startersequenz eingesetzt wird.

Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird vor der Sequenzanalyse der amplifizierten DNS diese nochmals einem Reinigungsschritt unterzogen, beispielsweise mittels Gelchromatographie. Danach kann die DNS direkt der Sequenzanalyse zuge führt werden, oder das gereinigte doppelsträngige Fragment wird in einen geeigneten Klonierungsvektor eingebracht, der dann wiederum in der Sequenzierreaktion eingesetzt wird.

Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird der mit der Sonde kovalent ge bundene Einzelstrang nach dem Anfügen des doppelsträngigen Adapters einer Be handlung mit einer starken Base, vorzugsweise einer NaOH-Behandlung, unterzogen. Insbesondere die Kombination der NaOH-Behandlung mit der kovalenten Verknüpfung der Sonde an den Einzelstrang erlaubt eine besonders effiziente Reinigung des zu ana lysierenden Einzelstrangs.

Ein Nukleinsäuremolekül, umfassend eine 5'-Adaptersequenz, eine unbekannte geno mische Nukleinsäuresequenz, eine bekannte Sequenz und eine 3'-Sondensequenz mit einer Markierung oder eine 5'-Sondensequenz mit einer Markierung, einer bekannten Sequenz, eine unbekannte genomische Sequenz und eine 3'-Adaptersequenz ist ein besonders vorteilhaftes Produkt zur hochspezifischen Bestimmung des Integrationsortes einer Fremd-DNS in einem Genom mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens. Vor zugsweise handelt es sich bei dieser Nukleinsäure um einen DNS-Einzelstrang.

Ein fester Träger mit einer darauf aufgebrachten Nukleinsäure, wie oben beschrieben, ist ebenfalls ein wesentliches Element zum Durchführen des erfindungsgemäßen Ver fahrens.

Ein weiteres besonders vorteilhaftes Element in dem Gesamtverfahren stellt eine am 3'- Ende markierte Sonde dar. Diese Sonde ermöglicht das Herstellen der erfin dungsgemäßen Nukleinsäure wie oben beschrieben, die wiederum besonders gut ge eignet ist, die Spezifität des Gesamtverfahrens zu erhöhen. Bisher wurden für ähnliche Zwecke überwiegend 5'-markierte Sonden eingesetzt. Diese können jedoch nicht zur kovalenten Anknüpfung an das 3'-Ende des Einzelstrangs verwendet werden. Die An knüpfung an das 3' Ende des Einzelstrangs ermöglicht nun, auch Restriktionsenzyme einzusetzen, die 5' überhängende Enden generieren. Dies ist die überwiegende Anzahl aller bekannter Restriktionsenzyme. Weitere Vorteile des erfindungsgemäßen Verfah rens gegenüber bekannten Verfahren liegen u. a. darin, dass im erfindungsgemäßen Verfahren der Adapter erst nach einer Reinigung angefügt wird, d. h. gereinigte genomi sche Fragmente werden für die Ligation des Adapters bzw. für die Ligation des Adapters und der markierten Sonde eingesetzt. Erst nach der Ligation und nach einer weiteren Reinigung, die, abhängig von der Methode, entweder mit oder ohne starker Base erfolgt, dienen diese Moleküle als Matrize in der PCR. Bei dieser weiteren Reinigung werden insbesonders überschüssige Adapter entfernt, bei der Reinigung mit Hilfe einer Base zudem noch vorhandene unspezifische DNS, die im ersten Reinigungsschritt nicht ent fernt wurde. Dies gewährleistet eine sehr hohe Spezifität in der PCR. Schließlich erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren durch Verwendung von 5'- oder 3'-markierten Oligo nukleotidsonden erstmals eine Reinigung des genomischen Einzelstrangs unter deutlich verbesserten Bedingungen. Dies führt dazu, dass alle Sequenzen, die spezifisch oder unspezifisch an den gesuchten Einzelstrang binden, vor der PCR vollständig entfernt werden, so dass die Spezifität des Gesamtverfahrens deutlich gesteigert wird.

Figurenkurzbeschreibung

Fig. Ia zeigt die einzelnen Schritte zum Bestimmen von Integrationsstellen unter Verwendung einer 5'-markierten Sonde mit Prozedur I (wie Figur (b, jedoch unter Verwendung eines anderen Restriktionsenzymes zur Isolierung des ersten (5'-)Insertionspunktes einer Insertion)

Fig. Ib zeigt die einzelnen Schritte zum Bestimmen von Integrationsstellen unter Verwendung einer 5'-markierten Sonde mit Prozedur ((wie Fig. Ia, jedoch unter Verwendung eines anderen Restriktionsenzymes zur Isolierung des zweiten (3'-)Insertionspunktes einer Insertion)

Fig. II zeigt die einzelnen Schritte zum Bestimmen von Integrationsstellen unter Verwendung einer 3'-markierten Sonde mit Prozedur I

Fig. IIIa zeigt die einzelnen Schritte zum Bestimmen von Integrationsstellen unter Verwendung einer 3'-markierten Sonde und einer Brückensonde mit Pro zedur II, die eine zusätzliche Aufreinigung mittels NaOH ermöglicht (wie Fig. IIIb, jedoch unter Verwendung eines anderen Restriktionsenzymes zur Isolierung des ersten (5'-)Insertionspunktes einer Insertion)

Fig. IIIb zeigt die einzelnen Schritte zum Bestimmen von Integrationsstellen unter Verwendung einer 3'-markierten Sonde und einer Brückensonde mit Pro zedur II, die eine zusätzliche Aufreinigung mittels NaOH ermöglicht (wie Fig. IIIa, jedoch unter Verwendung eines anderen Restriktionsenzymes zur Isolierung des zweiten (3'-)Insertionspunktes einer Insertion)

Fig. IV zeigt die einzelnen Schritte zum Bestimmen von Integrationsstellen unter Verwendung einer 5'-markierten Sonde und einer Brückensonde mit Pro zedur II, die eine zusätzliche Aufreinigung mittels NaOH ermöglicht

Fig. V zeigt das Bandenmuster, das nach der Amplifikation einer Ziel-DNS mit linearer PCR beobachtet wird.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung

Beispiel 1 Bestimmung der beiden (5'- und 3'-)Insertionsstellen einer durch Agrobakterium- Transformation vermittelten Fremd-DNA im Genom von Gerstenpflanzen

Von Gerstenpflanzen wird DNS isoliert und mit einem Restriktionsenzym geschnitten. Die Wahl des Restriktionsenzyms richtet sich danach, ob die linke (5'-) oder rechte (3'-) flankierende Sequenz analysiert werden soll. Im Falle der linken Insertionssequenz wur de Sau3AI verwendet, das die Basenfolge GATC erkennt; bei der rechten Inser tionssequenz fand Taql Verwendung. Dieses Enzym erkennt die Basenfolge TCGA. Statistisch schneiden solche "four cutter" Enzyme nach jeweils 256 Basenpaaren. Nachdem die DNS jeweils mit einem der beiden Enzyme geschnitten worden ist, wird ein kurzes, am 5'-Ende biotinyliertes Oligonukleotid hinzugegeben. Diese markierte Sonde ist einzelsträngig und komplementär zu einem Stück der bekannten Sequenz, die in die transgene Pflanze eingebracht worden ist. In Abhängigkeit davon, ob die linke (5'-) oder rechte (3'-)flankierende Region einer Insertion herausgefunden werden soll, un terscheidet sich diese biotinylierte Sequenz.

Das Gemisch aus geschnittener DNS und Sonde wird auf 95°C erhitzt. Hierbei denatu riert die DNS, d. h. sie zerfällt in Einzelstränge. Man lässt das Gemisch langsam bis auf 68°C abkühlen und hält diese Temperatur für 3 Stunden bei. Hierbei finden nun die bio tinylierten Oligonukleotide ihre komplementären genomischen Sequenzen und haften an diesen fest. Mit Hilfe von Streptavidin, gekoppelt an ein stark magnetisches Polymer (Firma Dynal, Hamburg), werden die biotinylierten Oligonukleotide aus dem Gemisch gereinigt. An vielen von diesen Sonden haften nun die genomischen Gegenstränge. Da die Sonden im Überschuss eingesetzt werden, ist davon auszugehen, dass alle genomi schen Zielsequenzen herausgefischt werden. Es ist zu beachten, dass der Überschuss durch die limitierte Bindungskapazität des Streptavidins begrenzt wird. Bei einem zu hohen Überschuss würden fast ausschließlich biotinylierte Sonden selektiert, an denen kein genomisches Gegenstück haftet. Ein bevorzugtes Verhältnis von Sonden zu Ziel sequenzen ist in Beispiel 2 und Beispiel 3 angegeben.

Nach dieser Selektion werden Adapter mit Hilfe der T4-DNS Ligase an die Einzelstränge ligiert. Diese Adapter sind aufgrund sogenannter kurzer "Ankersequenzen" spezifisch für das eingesetzte Restriktionsenzym und damit auch für die linke bzw. rechte Inserti onssequenz. Nach der Ligation des Adapters und einem weiteren Reinigungsschritt mittels Streptavidin wird das Produkt als Matrize in einer PCR eingesetzt. Als Starter kommen zwei verschiedene Oligonukleotide zum Einsatz. Der eine Starter (1) liegt als innen liegender Starter wenige Basen intern vor der biotinylierten Sonde (nested Star ter), der andere Starter (2) ist komplementär zum jeweiligen Adapter, verlängert um die 4 Basen der Restriktionsschnittstelle.

Nach erfolgter PCR wird 1 µl dieser Reaktion in einer neuen PCR eingesetzt. Hierbei wird Starter (1) durch einen noch weiter innen liegenden Starter (3) (nested Starter) er setzt, der, wie auch Starter (2), am 5'-Ende phosphoryliert ist, um die spätere Klonie rung des Amplifikationsproduktes zu erleichtern. Das Produkt dieser Reaktion wird nach Reinigung über ein Agarosegel kloniert und sequenziert. Die Reinigung über ein Agaro segel ist vorteilhaft, da es in der Regel mehrere Integrationsorte gibt und man daher auch mehrere Fragmente amplifiziert.

Beispiel 2 Bestimmen des linken (5'-) bzw. rechten (3'-)Bruchpunktes (Integrationsort) nach Prozedur I A. Beschreibung der Methode für den linken Bruchpunkt mit 5'-markierter Sonde (Fig. Ia)

1. (Fig. Ia.1) 10 µg DNS einer transgenen Pflanze werden mit dem Restriktionsenzym Sau3AI geschnitten.
Restriktionsbedingungen:
1 × Sau3AI Puffer (New England Biolabs, Frankfurt)
1 × BSA (New England Biolabs, Frankfurt)
100 Units Sau3AI (New England Biolabs, Frankfurt)
in einem Gesamtvolumen von 100 µl, 12 h bei 37°C
2. (Fig. Ia.2) 500 µl 6 × SSC und 20 pmol der einzelsträngigen biotinylierten Sonde R193 werden zugegeben. Danach wird das Gemisch für 5 min. auf 95°C erhitzt (Denaturierung) und langsam auf 68°C abgekühlt. Die Inkubation bei 68°C dauert 3 Stunden.
Anschließend Zugabe von 50 µl der nach Herstellerangaben vorbereiteten Strepta vidin Beads (Dynal, Hamburg) und Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur. Da nach werden die Beads durch dreimaliges Waschen mit jeweils 600 µl Waschpuffer und zweimaliges Waschen mit jeweils 190 µl TE gereinigt. Der Überstand wird ab gehoben und verworfen.
3. (Fig. Ia.3) An die selektierten und gewaschenen Einzelstränge wird der Adapter li giert.
Die gewaschenen Streptavidin Beads, 180 pmol Adapter (R172/R187) und 12,5 U T4-DNS Ligase (5 U/µl; Boehringer, Mannheim) werden in 50 µl 1 × T4-DNS- Ligationspuffer (Boehringer, Mannheim) aufgenommen und für 12 Stunden bei 16°C inkubiert.
Anschließend werden die Beads wie in Schritt 2 durch dreimaliges Waschen mit jeweils 600 µl Waschpuffer und zweimaliges Waschen mit jeweils 190 µl TE gerei nigt.
Die so gereinigten Beads werden in 50 µl TE aufgenommen.
4. (Fig. Ia.4) Dann wird in der folgenden Reaktion zum einen mit dem Starter R176 der obere Strang kopiert und somit gleichzeitig ein Template für den Starter R205 ge schaffen. Danach wird mit dem Starter R176 und R205 das Fragment ampilfiziert (Fig. Ia.5).
PCR-Ansatz (25 µl):
PCR-Mix
20 pmol Starter R176
20 pmol Starter R205
1,5 µl Streptavidin Beads aus Schritt 3.
PCR-Zyklen: 20
5. (Fig. I.a.6) In einer weiteren PCR wird anschließend mit den Startern R179 und R205 das Fragment reamplifiziert.
PCR-Ansatz (25 µl):
PCR-Mix
20 pmol Starter R179
20 pmol Starter R205
1,0 µl Aliquot aus PCR-Ansatz von Schritt 4.
PCR-Zyklen: 40
6. Die Fragmente werden in einem Agarosegel aufgetrennt. Die gewünschten Banden werden ausgeschnitten und die DNS eluiert, anschließend in pUC18 ligiert und in E scherichia coli DH5alpha kloniert und nach Aufreinigung sequenziert.

B. Beschreibung der Methode für den rechten Bruchpunkt mit 5'-markierter Sonde Fig. Ib

1. (Fig. Ib.1) 10 µg DNS einer transgenen Pflanze werden mit dem Restriktionsenzym Taql geschnitten.
Restriktionsbedingungen:
1 × Taql Puffer (New England Biolabs, Frankfurt)
1 × BSA (New England Biolabs, Frankfurt)
100 Units Taql (New England Biolabs, Frankfurt) in einem Gesamtvolumen von 100 µl, 12 h bei 65°C
2. (Fig. Ib.2) 500 µl 6 × SSC und 20 pmol der einzelsträngigen biotinylierten Sonde R198 werden zugegeben. Danach wird das Gemisch für 5 min. auf 95°C erhitzt (Denaturierung) und langsam auf 68°C abgekühlt. Die Inkubation bei 68°C dauert 3 Stunden.
Anschließend Zugabe von 50 µl der nach Herstellerangaben vorbereiteten Strepta vidin Beads (Dynal, Hamburg) und Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur. Da nach werden die Beads durch dreimaliges Waschen mit jeweils 600 µl Waschpuffer und zweimaliges Waschen mit jeweils 190 µl TE gereinigt. Der Überstand wird ab gehoben und verworfen.
3. (Fig. Ib.3) An die selektierten und gewaschenen Einzelstränge wird der Adapter ligiert.
Die gewaschenen Streptavidin Beads, 180 µmol Adapter (R172/R202) und 12,5 U T4-DNS Ligase (5 U/µl; Boehringer, Mannheim) werden in 50 µl 1 × T4-DNS- Ligationspuffer (Boehringer, Mannheim) aufgenommen und für 12 Stunden bei 16°C inkubiert.
Anschließend werden die Beads wie in Schritt 2. durch dreimaliges Waschen mit jeweils 600 µl Waschpuffer und zweimaliges Waschen mit jeweils 190 µl TE gerei nigt.
Die so gereinigten Beads werden in 50 µl TE aufgenommen.
4. (Fig. Ib.4) Dann wird in der folgenden Reaktion zum einen mit dem Starter R200 der obere Strang kopiert und somit gleichzeitig ein Template für den Starter R206 ge schaffen. Danach wird mit dem Starter R200 und R206 das Fragment amplifiziert (Fig. Ib.5).
PCR-Ansatz (25 µl):
PCR-Mix
20 pmol Starter R200
20 pmol Starter R206
1,5 µl Streptavidin Beads aus Schritt 3.
PCR-Zyklen: 20
5. (Fig. Ib.6) In einer weiteren PCR wird anschließend mit den Startern R201 und R205 das Fragment reamplifiziert.
PCR-Ansatz (25 µl):
PCR-Mix
20 pmol Starter R201
20 pmol Starter R206
1,0 µl Aliquot aus PCR Ansatz von Schritt 5.
PCR-Zyklen: 40
6. Die Fragmente werden in einem Agarosegel aufgetrennt. Die gewünschten Banden werden ausgeschnitten und die DNS eluiert, anschließend in pUC18 ligiert und in E scherichia coli DH5alpha kloniert und nach Aufreinigung sequenziert.

C. Beschreibung der Methode für den linken Bruchpunkt mit 3'-markierter Sonde (Fig. II)

1. (Fig. II.1) 10 µg DNS einer transgenen Pflanze werden mit dem Restriktionsenzym NIaIII geschnitten.
Restriktionsbedingungen:
1 × NIaIII Puffer (New England Biolabs, Frankfurt)
1 × BSA (New England Biolabs, Frankfurt)
100 Units NIaIII (New England Biolabs, Frankfurt) in einem Gesamtvolumen von 100 µl, 12 h bei 37°C
2. (Fig. II.2) 500 µl 6 × SSC und 20 pmol der einzelsträngigen biotinylierten Sonde Y101 werden zugegeben. Danach wird das Gemisch für 5 min. auf 95°C erhitzt (Denaturierung) und langsam auf 68°C abgekühlt. Die Inkubation bei 68°C dauert 3 Stunden.
Anschließend Zugabe von 50 µl der nach Herstellerangaben vorbereiteten Strepta vidin Beads (Dynal, Hamburg) und Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur Da nach werden die Beads durch dreimaliges Waschen mit jeweils 600 µl Waschpuffer und zweimaliges Waschen mit jeweils 190 µl TE gereinigt. Der Überstand wird ab gehoben und verworfen.
3. (Fig. II.3) An die selektierten und gewaschenen Einzelstränge wird der Adapter li giert.
Die gewaschenen Streptavidin Beads, 180 pmol Adapter (Y200/202), und 12,5 U T4-DNS Ligase (5 U/µl; Boehringer, Mannheim) werden in 50 µl 1 × T4-DNS- Ligationspuffer (Boehringer, Mannheim) aufgenommen und für 12 Stunden bei 16°C inkubiert.
Anschließend werden die Beads wie in Schritt 2. durch dreimaliges Waschen mit jeweils 600 µl Waschpuffer und zweimaliges Waschen mit jeweils 190 µl TE gerei nigt.
Die so gereinigten Beads werden in 50 µl TE aufgenommen.
4. (Fig. II.4) Dann wird in der folgenden Reaktion zum einen mit dem Starter Y201 der obere Strang kopiert und somit gleichzeitig ein Template für den Starter R176 ge schaffen. Danach wird mit dem Starter Y201 und R176 das Fragment amplifiziert (Fig. II.5).
PCR-Ansatz (25 µl):
PCR-Mix
20 pmol Starter Y201
20 pmol Starter R176
1,5 µl Streptavidin Beads aus Schritt 3.
PCR-Zyklen: 20
5. (Fig. II.5) In einer weiteren PCR wird anschließend mit den Startern Y201 und R179 das Fragment reamplifiziert.
PCR-Ansatz (25 µl):
PCR-Mix
20 pmol Starter Y201
20 pmol Starter R179
1,0 µl Aliquot aus PCR-Ansatz von Schritt 4.
PCR-Zyklen: 40
6. Die Fragmente werden in einem Agarosegel aufgetrennt. Die gewünschten Banden werden ausgeschnitten und die DNS eluiert, anschließend in pUC18 ligiert und in E scherichia coli DH5alpha kloniert und nach Aufreinigung sequenziert.

D. Beschreibung der Methode für den rechten Bruchpunkt mit 3'-markierter Sonde

Die Durchführung erfolgt wie für den linken Bruchpunkt beschrieben (Fig. II) unter Ver wendung eines geeigneten Restriktionsenzyms und einer geeigneten 3'-markierter Son de sowie der entsprechenden geeigneten Startermoleküle.

Beispiel 3

Verfahren und Bestimmen des Integrationsortes, wobei ein zusätzlicher Reini gungsschritt mit NaOH erfolgt.

Beschreibung der Prozedur II

Falls in Beispiel 1, welches die Prozedur I beschreibt, noch zu viele unspezifische Pro dukte in der PCR entstehen, kann eine noch höhere Spezifität wie folgt erreicht werden:

A. Beschreibung der Methode für den linken Bruchpunkt mit 3'-markierter Sonde (Fig. IIIa)

1. (Fig. IIIa.1) 10 µg DNS einer transgenen Pflanze werden mit dem Restriktionsenzym Sau3A1 geschnitten.
Restriktionsbedingungen:
1 × Sau3A1 Puffer (New England Biolabs, Frankfurt)
1 × BSA (New England Biolabs, Frankfurt)
100 Units Sau3A1 (New England Biolabs, Frankfurt) in einem Gesamtvolumen von 100 µl, 12 h bei 37°C
2. (Fig. IIIa.2) 500 µl 6 × SSC und jeweils 20 pmol der Brückensonde R361 sowie der biotinylierten Sonde R360 werden zugegeben. Danach wird das Gemisch für 5 min. auf 95°C erhitzt (Denaturierung) und langsam auf 68°C abgekühlt. Die Inkubation bei 68°C dauert 3 Stunden.
Anschließend Zugabe von 50 µl der nach Herstellerangaben vorbereiteten Strepta vidin Beads (Dynal, Hamburg) und Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur. Da nach werden die Beads durch dreimaliges Waschen mit jeweils 600 µl Waschpuffer und zweimaliges Waschen mit jeweils 190 µl TE gereinigt. Der Überstand wird ab gehoben und verworfen.
3. (Fig. IIIa.3) An die selektierten und gewaschenen Einzelstränge werden nun Adap ter sowie die biotinylierte Sonde ligiert.
Die gewaschenen Streptavidin Beads, 180 µmol Adapter (R172/R187) und 12,5 U T4-DNS Ligase (5 U/µl; Boehringer, Mannheim) werden in 50 µl 1 × T4-DNS- Ligationspuffer (Boehringer, Mannheim) aufgenommen und für 12 Stunden bei 16°C inkubiert.
Anschließend werden die Beads wie in Schritt 2. durch dreimaliges Waschen mit jeweils 600 µl Waschpuffer und zweimaliges Waschen mit jeweils 190 µl TE gerei nigt.
Die so gereinigten Beads werden in 50 µl TE aufgenommen.
4. (Fig. IIIa.4) Dann wird in der folgenden Reaktion zum einen mit dem Starter R176 der obere Strang kopiert und somit gleichzeitig ein Template für den Starter R205 geschaffen. Danach wird mit dem Starter R176 und R205 das Fragment amplifiziert (Fig. IIIa.5).
PCR-Ansatz (25 µl):
PCR-Mix
20 pmol Starter R176
20 pmol Starter R205
1,5 µl Streptavidin Beads aus Schritt 3.
PCR-Zyklen 20:
5. (Fig. IIIa.6) In einer weiteren PCR wird anschließend mit den Startern R179 und R205 das Fragment reamplifiziert.
PCR-Ansatz (25 µl):
PCR-Mix
20 pmol Starter R179
20 pmol Starter R205
1,0 µl Aliquot aus PCR-Ansatz von Schritt 4.
PCR-Zyklen: 40
6. Die Fragmente werden in einem Agarosegel aufgetrennt. Die gewünschten Banden werden ausgeschnitten und die DNS eluiert, anschließend in pUC18 ligiert und in E scherichia coli DH5alpha kloniert und nach Aufreinigung sequenziert.

B. Beschreibung der Methode für den rechter Bruchpunkt mit 3'-markierter Sonde (Fig. IIIb)

1. (Fig. IIIb.1) 10 µg DNS einer transgenen Pflanze werden mit dem Restriktionsenzym Taql geschnitten.
Restriktionsbedingungen:
1 × Taql Puffer (New England Biolabs, Frankfurt)
1 × BSA (New England Biolabs, Frankfurt)
100 Units Taql (New England Biolabs, Frankfurt) in einem Gesamtvolumen von 100 µl, 12 h bei 65°C
2. (Fig. IIIb.2) 500 µl 6 × SSC und jeweils 20 pmol der Brückensonde Y102 sowie der biotinylierten Sonde R360 werden zugegeben. Danach wird das Gemisch für 5 min. auf 95°C erhitzt (Denaturierung) und langsam auf 68°C abgekühlt. Die Inkubation bei 68°C dauert 3 Stunden.
Anschließend Zugabe von 50 µl der nach Herstellerangaben vorbereiteten Strepta vidin Beads (Dynal, Hamburg) und Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur. Da nach werden die Beads durch dreimaliges Waschen mit jeweils 600 µl Waschpuffer und zweimaliges Waschen mit jeweils 190 µl TE gereinigt. Der Überstand wird ab gehoben und verworfen.
3. (Fig. IIIb.3) An die selektierten und gewaschenen Einzelstränge werden nun Adap ter sowie die biotinylierte Sonde ligiert.
Die gewaschenen Streptavidin Beads, 180 pmol Adapter (R172/R202) und 12,5 U T4-DNS Ligase (5 U/µl; Boehringer, Mannheim) werden in 50 µl 1 × T4-DNS- Ligationspuffer (Boehringer, Mannheim) aufgenommen und für 12 Stunden bei 16°C inkubiert.
Anschließend werden die Beads wie in Schritt 2. durch dreimaliges Waschen mit jeweils 600 µl Waschpuffer und zweimaliges Waschen mit jeweils 190 µl TE gerei nigt.
Die so gereinigten Beads werden in 50 µl TE aufgenommen.
4. (Fig. IIIb.4) Dann wird in der folgenden Reaktion zum einen mit dem Starter R200 der obere Strang kopiert und somit gleichzeitig ein Template für den Starter R206 geschaffen. Danach wird mit dem Starter R200 und R206 das Fragment amplifiziert (Fig. IIIb.5).
PCR-Ansatz (25 µl):
PCR-Mix
20 pmol Starter R200
20 pmol Starter R206
1,5 µl Streptavidin Beads aus Schritt 3.
PCR-Zyklen: 20
5. (Fig. IIIb.6) In einer weiteren PCR wird anschließend mit den Startern R201 und R206 das Fragment reamplifiziert.
PCR-Ansatz (25 µl):
PCR-Mix
20 pmol Starter R201
20 pmol Starter R206
1,0 µl Aliquot aus PCR-Ansatz von Schritt 4
1,5 U Taq-DNS-Polymerase (Biomaster, Köln)
PCR-Zyklen: 40
6. Die Fragmente werden in einem Agarosegel aufgetrennt. Die gewünschten Banden werden ausgeschnitten und die DNS eluiert, anschließend in pUC18 ligiert und in E scherichia coli DH5alpha kloniert und nach Aufreinigung sequenziert.

C. Beschreibung der Methode für den linken Bruchpunkt mit 5'-markierter Sonde (Fig. IV)

1. (Fig. IV.1) 10 µg DNS einer transgenen Pflanze werden mit dem Restriktionsenzym NIaIII geschnitten.
Restriktionsbedingungen:
1 × NIaIII Puffer (New England Biolabs, Frankfurt)
1 × BSA (New England Biolabs, Frankfurt)
100 Units NIaIII (New England Biolabs, Frankfurt) in einem Gesamtvolumen von 100 µl, 12 h bei 37°C
2. (Fig. IV.2) 500 µl 6 × SSC und jeweils 20 pmol der Brückensonde Y100 sowie der biotinylierten Sonde Y103 werden zugegeben. Danach wird das Gemisch für 5 min. auf 95°C erhitzt (Denaturierung) und langsam auf 68°C abgekühlt. Die Inkubation bei 68°C dauert 3 Stunden.
Anschließend Zugabe von 50 µl der nach Herstellerangaben vorbereiteten Strepta vidin Beads (Dynal, Hamburg) und Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur. Da nach werden die Beads durch dreimaliges Waschen mit jeweils 600 µl Waschpuffer und zweimaliges Waschen mit jeweils 190 µl TE gereinigt. Der Überstand wird ab gehoben und verworfen.
3. (Fig. IV.3) An die selektierten und gewaschenen Einzelstränge werden nun Adapter sowie die biotinylierte Sonde ligiert.
Die gewaschenen Streptavidin Beads, 180 pmol Adapter (Y200/Y202) und 12,5 U T4-DNS Ligase (5 U/µl; Boehringer, Mannheim) werden in 50 µl 1 × T4-DNS- Ligationspuffer (Boehringer, Mannheim) aufgenommen und für 12 Stunden bei 16°C inkubiert.
Anschließend werden die Beads wie in Schritt 2. durch dreimaliges Waschen mit jeweils 600 µl Waschpuffer und zweimaliges Waschen mit jeweils 190 µl TE gerei nigt.
Die so gereinigten Beads werden in 50 µl TE aufgenommen.
4. (Fig. IV.4) Dann wird in der folgenden Reaktion zum einen mit dem Starter Y201 der obere Strang kopiert und somit gleichzeitig ein Template für den Starter R176 ge schaffen. Danach wird mit dem Starter Y201 und R176 das Fragment amplifiziert (Fig. IV.5).
PCR-Ansatz (25 µl):
PCR-Mix
20 pmol Starter Y201
20 pmol Starter R176
1,5 µl Streptavidin Beads aus Schritt 3
Die PCR-Zyklen: 20
5. (Fig. IV.6) In einer weiteren PCR wird anschließend mit den Startern Y201 und R179 das Fragment reamplifiziert.
PCR-Ansatz (25 µl):
PCR-Mix
20 pmol Starter Y201
20 pmol Starter R179
1,0 µl Aliquot aus PCR-Ansatz von Schritt 4.
PCR-Zyklen: 40
6. Die Fragmente werden in einem Agarosegel aufgetrennt. Die gewünschten Banden werden ausgeschnitten und die DNS eluiert, anschließend in pUC18 ligiert und in E scherichia coli DH5alpha kloniert und nach Aufreinigung sequenziert.

D. Beschreibung der Methode für den rechten Bruchpunkt mit 5'-markierter Sonde

Die Durchführung erfolgt wie für den linken Bruchpunkt mit 5'-markierter Sonde be schrieben unter Verwendung eines geeigneten Restriktionsenzyms und des entspre chenden Brückengliedes sowie der entsprechenden Starter.

Beispiel 4 Fehlerrate bei linearer PCR

Lineare PCR sollte theoretisch eine Zielsequenz in einem Genom linear amplifizieren, d. h. 30 Zyklen resultieren in einer 30-fachen Anreicherung der eingesetzten DNS. Dass dies mit der Realität wenig zu tun hat, belegt folgendes Experiment:

Mit 14 willkürlich ausgewählten Startern wurde eine lineare PCR mit 30 Zyklen durch geführt. Es wurden folgende PCR-Bedingungen gewählt:
Endvolumen:
PCR-Ansatz (25 µl):
PCR-Mix
0,8 µM Starter
PCR-Zyklen: 30

Analyse der linearen PCR durch Agarosegelelektrophorese (Fig. V)

Benutzte Startersequenzen:
Spur 1 und 9: Marker Lambda-DNS mit EcoRI und HindIII gespalten
Spur 2: Starter R005
Spur 3: Starter R054
Spur 4: Starter R081
Spur 5: Starter R098
Spur 6: Starter R122
Spur 7: Starter R125
Spur 8: Starter R126
Spur 10: Starter R129
Spur 11: Starter R163
Spur 12: Starter R164
Spur 13: Starter R184
Spur 14: Starter R208
Spur 15: Starter R217
Spur 16: Starter R307

Ergebnis

Mit Ausnahme der Starter R054 und R125 binden alle Starter auch unspezifisch und dies führt unter den oben genannten Bedingungen zu einer Reihe von zufälligen Pro dukten.

Der Grund, warum diese in einer exponentiellen PCR mit zwei verschiedenen Startern nicht auftreten, ist folgender: Beide Starter finden schon während des ersten Zyklus ihre Zielsequenz und dadurch entsteht ein Vorteil für das zu amplifizierende Produkt. Alle anderen unspezifischen Produkte entwickeln sich erst während der nachfolgenden Zyk len.

Folgende Reaktionen führen zu unspezifischen Produkten:

a) Der Starter bindet an verschiedenen Stellen im Genom. Zufällig bindet er auch - in umgekehrter Orientierung - in relativer Nähe auf dem Gegen strang. Eine partielle Bindung ist durchaus ausreichend. In allen folgenden Zyklen findet nun eine exponentielle PCR statt, bei der die Starter nun vollständig auf beide Stränge passen.
b) Ein Starter bindet an verschiedenen Stellen im Genom und es ist nicht möglich, dass er auf dem Gegenstrang bindet. Hier entstehen viele lineare Produkte unterschiedlicher Länge. Unter Umständen kommt es dann zur Rekombination von zwei Fragmenten. Dadurch entstehen Produkte, die an ihrem 5'- und 3'-Ende die Sequenz des eingesetzten Starters haben. Auch in diesem Fall endet die lineare PCR mit einer exponentiellen Anrei cherung unspezifischer Produkte.

In den in der Literatur beschriebenen linearen PCRs wird das Problem noch verschärft, weil die DNS vorher gespalten und mit Adapter versehen wir. Da ein Adapter nichts an deres ist als zwei miteinander hybridisierte Starter, und diese in erheblichem Über schuss eingesetzt werden müssen, um zu gewährleisten, dass an jedes geschnittene DNS-Stück auch wirklich ein Adapter ligiert wird, findet in der anschließenden linearen "1-Starter PCR" in Wirklichkeit eine PCR mit drei Startern statt. Dadurch ist die Wahr scheinlichkeit, dass es zu einer unspezifischen exponentiellen PCR kommt, sehr hoch.

Reagenzien und PCR-Bedingungen, wie sie in Beispiel 1-4 verwendet wurden

6 × SSC:
0,9 M NaCl
90 mM Natrium Citrat
pH 7,0
Waschpuffer:
5,0 mm Tris HC1 pH 7,5
1,0 M NaCl
0,5% Triton × 100
TE:
10 mM Tris HCl pH 7,5
1 mM EDTA pH 8,0
PCR-Mix:
16 mM (NH₄

)₂

SO₄

67 mM Tris HCl pH 8,8
0,01% Tween 20
0,2 mM dNTP
1,5 U Taq DNS Polymerase (Life Technologies, Karlsruhe)
PCR-Bedingungen:
94°C 1 min
65°C 20 sec
72°C 1 min
Thermocyler: Hybaid Omnigene (MWG-Biotech, Ebersberg)
Gel zur Analyse der Fragmente: 1,5% Agarose

Sequenzen der Oligonukleotidstarter und Sonden, wie sie in Beispiel 1-4 verwen det wurden

Sequenzen für den linken Bruchpunkt mit 5'-markierter Sonde (Fig. Ia)

Sequenzen für den rechten Bruchpunkt mit 5'-markierter Sonde (Fig. Ib)

Sequenzen für den linken Bruchpunkt mit 3'-markierter Sonde (Fig. II)

Sequenzen für den linken Bruchpunkt mit 3'-markierter Sonde (Fig. IIIa)

Sequenzen für den rechten Bruchpunkt mit 3'-markierter Sonde (Fig. IIIb)

Sequenzen für den linken Bruchpunkt mit 5'-markierter Sonde (Fig. IV)

Für lineare PCR eingesetzte Starter (Fig. V)

Vorteile der Erfindung

Der entscheidende Unterschied des erfindungsgemäßen Verfahrens zu den anderen Methoden ist, dass (1) das gesuchte DNS-Fragment bereits zu Beginn der Analyse mit einem Biotin markierten Oligonukleotid hybridisiert und dadurch von den anderen durch den Restriktionsverdau der genomischen DNS enstandenen Fragmenten isoliert wird, und (2) vor der ersten PCR-Amplifikation wird ein Adapter an das bereits gereinigte DNS-Molekül ligiert. Es besteht so nicht die Gefahr, dass die PCR schon mit einem Ge misch aus falschen Matrizen startet, sowie (3) in Prozedur II kann man mit Hilfe eines am 3'- oder 5'-Ende mit Biotin markierten Oligonukleotids erstmals einen genomischen Einzelstrang durch die mit Hilfe einer Brückensonde erreichten Ligation der markierten Sonde an das gesuchte DNS-Molekül sehr spezifisch reinigen. Alle spezifisch oder un spezifisch an den gesuchten Einzelstrang bindende Komponenten werden hier vor der PCR entfernt. Die Spezifität und Stringenz wird dadurch dramatisch gesteigert.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung von unbekannten Sequenzabschnitten flankierend zu bekannten Sequenzabschnitten, auch in einem sehr komplexen Genom, umfassend die folgenden Schritte:

a) Bestimmen der 5' unbekannte Sequenz, umfassend die folgenden Schritte;
- 1. Spalten der genomischen DNS mit einem Restriktionsenzym;
- 2. Hybridisieren der gespaltenen DNS mit einer markierten Sonde bzw. mit einer markierten Sonde und einer unmarkierten Brückensonde;
- 3. Aufreinigen des mit der markierten Sonde hybridisierten Einzelstrangs;
- 4. Verknüpfen eines doppelsträngigen Adapters mit dem 3'-Ende bzw. 5'-Ende des aufgereinigten Einzelstrangs bzw. Verknüpfen eines doppelsträngigen A dapters mit dem 3'-Ende bzw. 5'-Ende und Verknüpfen der markierten Sonde mit dem 5'-Ende bzw. 3'-Ende des aufgereinigten Einzelstrangs;
- 5. Herstellen von Doppelstrang-DNS;
- 6. Amplifizieren der Doppelstrang-DNS nach a5); und
- 7. Sequenzanalyse der amplifizierten DNS; und/oder
b) Bestimmen der 3' unbekannten Sequenz, umfassend die folgenden Schritte:
- 1. Bereitstellen einer Fraktion DNS aus Schritt a1) oder Spalten der genomischen DNS mit einem Restriktionsenzym, das gleich oder verschieden zu dem Enzym gemäß a1) sein kann;
- 2. Hybridisieren der gespaltenen DNS mit einer markierten Sonde bzw. mit einer markierten Sonde und einer unmarkierten Brückensonde;
- 3. Aufreinigen des mit der markierten Sonde hybridisierten Einzelstrangs;
- 4. Verknüpfen eines doppelsträngigen Adapters mit dem 3'-Ende bzw. 5'-Ende des aufgereinigten Einzelstranges bzw. Verknüpfen eines doppelsträngigen Adapters mit dem 3'-Ende bzw. 5'-Ende des aufgereinigten Einzelstranges und Verknüpfen der markierten Sonde mit dem 5'-Ende bzw. 3'-Ende des aufgereinigten Einzel strangs;
- 5. Herstellen von Doppelstrang-DNS;
- 6. Amplifizieren der Doppelstrang-DNS; und
- 7. Sequenzanalyse der amplifizierten DNS, wobei die Maßnahmen der Schritte a1) bis a7) auch auf das Bestimmen der 3' unbekannten Sequenz anwendbar sind und die Maßnahmen b1) bis b7) auf das Bestimmen der 5' unbekannten Se quenz anwendbar sind.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Spalten der DNS gemäß a1) und/oder b1) mit einem häufig spaltenden Restriktionsenzym, vorzugs weise einem Enzym, das eine 4 Nukleotide umfassende Erkennungssequenz benö tigt, erfolgt.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Sonde nach a2) und/oder b2) am 5'- oder am 3'-Ende markiert ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass die Mar kierung der Sonde von einem komplementären Bindungspartner erkannt werden kann.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass die Auf reinigung des mit der Sonde markierten Einzelstrangs gemäß Schritt a3) und/oder b3) mit Hilfe eines zu der Markierung der Sonde komplementären Partners erfolgt, vorzugsweise nach Art einer Affinitätschromatographie.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, dass der A dapter gemäß Schritt a4) und/oder b4) an das 3'-Ende bzw. 5'-Ende des auf gereinigten Einzelstranges ligiert wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet, dass die mar kierte Sonde gemäß a4) und/oder b4) an das freie 3'-Ende oder 5'-Ende des aufge reinigten Einzelstranges ligiert wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-7, dadurch gekennzeichnet, dass der mit dem Adapter und der Sonde versehene Einzelstrang zum Doppelstrang ergänzt wird, vorzugsweise ausgehend von mindestens einem nested Starter.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-8, dadurch gekennzeichnet, dass die Amplifikation der Doppelstrang-DNS nach Schritt a6) und/oder b6) mittels der PCR und vorzugsweise mittels nested Startern durchgeführt wird.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-9, dadurch gekennzeichnet, dass vor der Sequenzanalyse gemäß Schritt a7) bzw. b7) die amplifizierte DNS nochmals aufge reinigt wird.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-10, dadurch gekennzeichnet, dass zwi schen Schritt a4) und a5) bzw. b4) und b5) eine weitere Aufreinigung des Einzel stranges mittels einer starken Base, vorzugsweise einer NaOH-Behandlung, erfolgt.

12. Nukleinsäuremolekül, umfassend eine 5'-Adaptersequenz, eine unbekannte geno mische Nukleinsäuresequenz, eine Vektorsequenz bzw. eine bekannte genomische Nukleinsäuresequenz und eine 3'-Sondensequenz mit einer Markierung oder eine 5'-Sondensequenz mit einer Markierung, eine Vektorsequenz bzw. eine bekannte genomische Nukleinsäuresequenz, eine unbekannte genomische Nukleinsäurese quenz und eine 3'-Adaptersequenz.

13. Nukleinsäure nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen Nuklein säure-Einzelstrang darstellt.

14. Fester Träger mit einer darauf aufgebrachten Nukleinsäure nach Anspruch 12 oder 13.

15. Sonde ausgewählt aus einer 5'-markierten Sonde, 3'-markierten Sonde, 5'- biotinylierten- oder 3'-biotinylierten Sonde.