DE10059986C2

DE10059986C2 - Verfahren zur nicht-kovalenten Immobilisierung hitzeresistenter Biomoleküle auf Implantatmaterialien

Info

Publication number: DE10059986C2
Application number: DE2000159986
Authority: DE
Inventors: Martin Wiemann; Lars Winkler
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2000-11-30
Filing date: 2000-11-30
Publication date: 2003-02-13
Anticipated expiration: 2020-12-01
Also published as: DE10059986A1

Description

Hintergrund

Der Einsalz von metallischen Knochenimplantaten hat in den letzen Jahren zunehmend an Bedeutung gewonnen. Hüftgelenkdysplasien, Fehlstellungen der Hüfte, komplizierte Brüche im Oberschenkelhalsbereich machen den Einsatz von mehr als 150.000 enossalen Implantaten in der Bundesrepublik Deutschland pro Jahr notwendig. Durch die konsequente Weiterentwicklung von Implantatmaterialien wie Titan, rostfreien Stählen, Keramiklegierungen etc. gelang es, die Standzeiten zementfreier Implantate auf mehr als 10 Jahre auszudehnen. Die aufwendige und schmerzhafte Prozedur muß jedoch oft schon nach wenigen Jahren wiederholt werden, da es durch mangelnde Osseointegration und Partikelabrieb im Bereich von künstlichen Gelenkflächen, gefolgt von sterilen Entzündungen, zu Lockerungen kommt, die einen Ersatz des Implantates notwendig macht. Diese Kausalkette trifft häufig junge Patienten unter 55 Jahren, die eine hohe Bewegungsleistung haben, und denen deswegen zu einer Verschiebung der Operation in einen späteren Lebensabschnitt geraten wird, was eine einschneidende Beeinträchtigung ihrer Lebensqualität beinhaltet. Patienten, die die erste oder bereits zweite künstliche Hüfte verlieren, weisen in der Regel eine Atrophie des Implantatbettes im Oberschenkelknochen auf, was eine erneute Implantation oft unmöglich macht, da sowohl die Primärfestigkeit des Implantats als auch die zu erwartende Wachstumsleistung des Knochens - und damit die Osseointegration - zu gering ist. In solchen Fällen ist eine großflächige Osseointegration im Bereich der Kontaktzonen und eine unmittelbare Verbindung von lebendem Knochengewebe mit der Implantatoberfläche erstrebenswert. Diese Verbindung ist nicht nur Voraussetzung für eine geeignete Einleitung von Druck- und Zugkräften in den Knochen, was wiederum von entscheidender Bedeutung für den Knochenerhalt, bzw. Knochenumbau ist, sondern verhindert wahrscheinlich auch ein unerwünschtes Voranschreiten entzündlicher Prozesse in den Raum zwischen Implantat und Knochengewebe. Es ist heute allgemein akzeptiert, dass gut eingepaßte und integrierte Hüften langfristig die besten Prognosen haben. Da es aber bei jedem Einsatz eines in Serie gefertigten Implantas trotz guter Primärstabilität zu einer individuell verschiedenen Bildung von Spalträumen zwischen Knochen und Implantatoberfläche kommt, ist ein möglichst vollständiger Schluß der Spalträume durch lebendes Knochengewebe anzustreben. Eine Bildung eines bindegewebigen Interfaces ist hingegen von Nachteil. Noch schlechtere Voraussetzungen bestehen für die oben genannten Folgeimplantate, bei denen weite Spalträume ein häufig unlösbares Problem darstellen.

Eine Stimulation der Knochenwachstums zur Erlangung einer perfekten Osseointegration erscheint daher sinnvoll. Knochenwachstumsfaktoren, die zusammen mit dem Implantat bzw. an dessen Oberfläche angeboten werden, sind nach dem jetzigen Stand des Wissens geeignet um dieses Problem zu lösen. Das setzt aber voraus, dass solche Wachstumsfaktoren zumindest für einige Wochen am Ort verbleiben, damit sie in vivo möglichst lokal wirksam werden.

Die wünschenswerte Spaltüberbrückungsleistung des Knochengewebes kann beschleunigt werden, indem Knochenwachstum-fördernde Peptide eingesetzt werden, wie z. B. das "bone-morphogenetic protein" (BMP). Dieses Peptid ist in der Lage, im Tierversuch Knochenneubildung zu induzieren. Versuche von Prof. Müller und Mitarbeitern der Orthopädie der Universitätsklinik Essen an Schafen haben darüber hinaus gezeigt, dass BMP, das erstmals kovalent an Metalloberflächen gekoppelt war, ein ausgeprägtes Knochenwachstum induzierte, so dass die Spaltüberbrückungsleistung von mit BMP beschichtetem Gewebe deutlich größer war als bei nicht-BMP beschichteten Kontrollen. Unter dem Oberbegriff BMP sind Peptide einer Proteinfamilie zu verstehen, von denen insbesondere BMP-2, BMP-3, BMP-7, TGFalpha, TGFbeta, in ähnlicher Weise wirksam sind.

Ein besonderes Problem bei der Anwendung von BMPs besteht darin, dass diese Peptide zahlreiche Wirkungen auf andere Zellen haben können, so daß es nicht ratsam erscheint, nicht-immobilisierte Peptide zur Knochenheilung einzusetzen. Neuere klinische Studien mit BMP-7 und BMP-2, die derzeit am Menschen laufen, und bei denen Proteine der BMP-Familie zusammen mit einem Kollagen- Trägermaterial in den Organismus eingebracht werden, zeigten bislang keine ausgeprägten schädlichen Nebenwirkungen. Dennoch wurde von unerwünschter ektoper Knochenbildung berichtet, wenn die lokal applizierten BMP-Mengen im Milligramm-Bereich lagen. Insgesamt scheint die Rückhaltung von nicht- immobilisiertem BMP am Applikationsort neueren Untersuchungen zufolge gering zu sein. Auch lassen die hohen Herstellungskosten bioaktiver Wirkstoffe, insbesondere von BMP, eine zielgerichtete Immobilisierung aus wirtschaftlicher Sicht wünschenswert erscheinen.

Nach dem bisherigen Stand der Technik können Wachstumsfaktoren unter Beibehaltung ihrer biologischen Aktivität kovalent an Polymeroberflächen gekoppelt werden, um z. B. in der Zellkultur spezifische Wirkungen, wie eine Steigerung der Zell-Adhäsion an Polymeroberfächen, auszulösen (DE 35 21 684 A1). In ähnlicher Weise lässt sich BMP-2 kovalent an modifizierte Metalloberflächen koppeln (WO 99/26674 A2). Mit dem zuletzt genannten Verfahren ließ sich im Tierversuch eine gesteigerte Knochenneubildung sowie eine gesteigerte Spaltüberbrückungsleistung des Knochens erreichen. Eine Modifikation dieses Verfahrens sieht vor (DE 199 47 263 A1), zunächst Trägermoleküle an die Oberflächen vom Implantatmaterialien kovalent zu koppeln, um in einem zweiten Schritt bioaktive Stoffe (wie z. B. Hormone) unter Ausnutzung ihrer Affinität zum Trägermolekül an das Implantat zu binden bzw. diese dort reversibel anzureichern. Für die Praxis der BMP-2 Beschichtung von dreidimensionalen Implantaten sind beide Verfahren jedoch zu kompliziert, da die kovalente Kopplung in jedem Fall einige biochemisch zu kontrollierende Schritte erfordert, die in Tauchverfahren durchgeführt werden müssen und daher an komplexen Implantatoberflächen nur schwer oder gar nicht zu standardisieren sind. Darüberhinaus bergen sie durch Verwendung vieler biochemischer Komponenten und Lösungsmittel ein erhöhtes Risiko, das Präparat mit Keimen oder Giftstoffen zu belasten. Nicht zuletzt führt eine kovalente Bindung neue antigene Determinanten in Proteine ein, was aus immunologischer Sicht eine unvorhersehbare Gefährdung des Patienten darstellt.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht nun darin,

1. ein Verfahren zur Beschichtung von Implantaten mit BMP so zu vereinfachen, dass möglichst unter Verzicht auf biochemische Arbeitsschritte eine bekannte Menge von BMP oder verwandten Biomolekülen reproduzierbar und standardisiert auf der Oberfläche eines Implantats immobilisiert werden kann,
2. eine Möglichkeit zu schaffen, eine Vielzahl von verschiedenen bestehenden Implantatformen und Materialien mit BMP zu beschichten,
3. eng umgrenzte und vorher bestimmbare Areale eines Implantats lokal mit BMP zu beschichten,
4. die benötigte BMP-Menge aus Kostengründen möglichst gering zu halten.
5. eine Beschichtung von Implantaten in kurzer Zeit vor Ort, z. B. noch im Operationsaal, durchführen zu können,
6. das Kontaminationsrisiko in der Endphase einer Implantatbeschichtung zu vermindern.

Erfindungsgemäß werden diese Aufgaben dadurch gelöst, dass BMP in einem biologisch unbedenklichen Lösungsmittel (wie z. B. sterilem Wasser) unter allgemein sterilen Bedingungen auf die gereingten Implantatoberflächen aufgebracht wird. Dazu können gleichermaßen Tropf-, Sprüh-, oder Tauchverfahren angewandt werden. Die Wahl des geeigneten Verfahrens wird dabei durch Form und Größe des Implants bestimmt. Im Unterschied zu einer reinen Adsorption des Biomoleküls an die Oberfläche von Implantatmaterialien, wird im vorliegenden Fall durch Verdunstung des Lösungsmittels (Wasser oder geeignete organische Lösungsmittel wie z. B. Acetonitril) ein Trocknung und damit Aufkonzentrierung der Wirksubstanz an der Oberfläche erreicht. Sequentielle und dadurch additive Beschichtungen sind verlustfrei möglich, wobei die Menge des aufgebrachten, vormals gelösten Peptids bekannt ist. In einem nächsten Schritt wird eine Hitzebehandlung vorgenommen, bei der Wassermoleküle aus der BMP-2-Schicht weitestgehend entfernt werden. Dieses Einbrennen bindet Makromoleküle sehr fest an Oberflächen und führt im Falle des BMP-2 zu einer Verkrustung vieler Moleküllagen, die auch nach dem Waschen mit Wasser bestehen bleiben. Im Fall der BMP-2 Beschichtung erfolgt durch die Hitzebehandlung eine Steigerung der biologischen Wirksamkeit um 50-100%. Erhalt bzw. Steigerung der biologischen Wirksamkeit können mit einem Biotest nachgewiesen werden (siehe nächster Abschnitt). Nach dem Abkühlen bleibt die biologische Aktivität des immobilisierten BMP für Wochen erhalten. Die Lagerung BMP beschichteter Implantate ist daher problemlos möglich. Zur Hitzebehandlung können Temperaturen bis 135°C eingesetzt werden, so dass eine gleichzeitige Abtötung von Keimen erfolgt (sofern diese noch vorhanden sein sollten), was die Betriebssicherheit solcher Implantate weiter erhöht.

Erfindungsgemäß wird die biologische Aktivität BMP beschichteter Implantate mit in vitro und in vivo Methoden überprüft. Für die in vitro Prüfung werden z. B. murine Test-Zellen (Zelllinie MC3T3-E1), die durch biologisch aktives BMP zur Expression bestimmter Proteine angeregt werden, auf die BMP-beschichtete Oberfläche ausgebracht und für 2-3 Tage unter Zellkulturbedingungen konfluent inkubiert. Lokale BMP Stimulation mit lokal immobilisiertem BMP führt in solchen Tests zu einer lokal gesteigerten Expression von Osteocalcin und der Alkalischen Phosphatse (ALP). Die ALP-Aktivität kann mit kommerziel erhältlichen Farbreaktionen nachgewiesen werden. Der vorgestellte Test wird nachfolgend als BMP-Reporter-Zell-Test (siehe unten) bezeichnet. Mit dem BMP-Reporter-Zell-Test wurde gezeigt, dass die BMP- Wirkung bei adsorptiv-gebundenem, hitzefixiertem BMP-2 lokal begrenzt bleibt. Der ALP-induzierende Effekt bleibt auch dann scharf umgrenzt, wenn Zellen erst innerhalb von Tagen auf BMP-2 beschichtete Flächen aufwachsen, wie es auch in vivo bei BMP-2 beschichteten Implantaten der Fall war. Die in vivo Prüfung erfolgte durch Implantation BMP-2 beschichteter Prüfkörper in lebendes Knochengewebe (Schafskondylen). Neugebildeter Knochen überbrückt dabei einen 1 mm breiten Spalt. Eine lokale Beschichtung der Prüfkörper mit dem Knochenwachstumsfaktor BMP-2 nach dem vorgestellten Verfahren, führte zu einer lokal gesteigerten Knochenneubildung im spongiösen Knochengewebe. Die histologische Prüfung der Spaltüberbrückungsleistung sowie die röntgenologische Messung der Knochendichte um das Implantat dienten dabei als ein Maß für die lokale Wirksamkeit des aufgebrachten BMP-2.

Erfindungsgemäß kann eine nicht-kovalente Immobilisierung des BMP auch dann erhalten werden, wenn zuvor eine nicht-kovalente Beschichtung der Metalloberfläche mit Peptiden, Proteinen oder einem Proteingemisch (wie z. B. Serum) aufgebracht wird. Anschließende Hitzefixierung des BMP-2 kann die induzierte ALP-Expression wiederum steigern. Die Bindung von BMP-2 an Serumkomponenten ist im Gegensatz zu seinen spezifischen Interaktionen mit verschiedenen Proteinen (Fibronektin) oder Biomolekülen (Heparin) bislang unbekannt.

Erfindungsgemäß ist es möglich, den Test auf dreidimensional geformten Prüfkörpern bestehend aus Metallen wie Titan, Metalllegierungen, Glas, Nitrocellulose, Polylactit oder Polystyrol einzusetzen, sofern diese Materialien nicht zytotoxisch sind. Auf allen genannten Materialien kann z. B. BMP-2 erfolgreich immobilisiert werden, wobei die nachfolgende Hitzefixierung die Aktivität steigert. Eine Auswertung der erhaltenen BMP-2 Signale mit digitalen Image-Analyse- Verfahren ergab eine große Korrelation der ALP-Expression mit der immobilisierten BMP-2-Menge. Es ist daher möglich, mit dem BMP-Reporter-Zell-Test die Menge von gebundenem BMP-2 anhand einer Standardkurve zu ermitteln. Dies ist für den angestrebten Einsatz von BMP-beschichteten Implantaten auch insofern von Bedeutung, als bislang unbekannte Wirkungen von Metalloberflächen auf das Überleben von Zellen erst in Verbindung mit einer BMP-Beschichtung evident werden können. Die Anwendung des BMP-Reporter-Zell-Tests auf allen Materialen erschließt diese Möglichkeit auch für die toxikologische Prüfung in vitro.

Neben BMP-2, 3, 4 und 7 besitzen auch andere Peptide/Petidgemische osteoinduktive Eigenschaften. Thrombozyten, die z. B. vor Ort in der Arztpraxis durch einfache Zentrifugationsverfahren aus Patienten-Blut gewonnen werden können, enthalten u. a. den Tumor-Growth-Faktor-beta, den Platelet-Derived-Growth-Faktor, sowie andere, das Wachstum und die Differenzierung fördernde Peptide. Ihr Einsatz zur Stimulation des Knochenwachstums ist besonders attraktiv, da aufgrund der Patienten-eigenen Herkunft keine immunologischen oder entzündlichen Komplikationen zu erwarten sind. Auch Thrombozytenlysate oder Bestandteile daraus können eingesetzt werden, um Oberflächen von Implantaten mit Peptiden zu beschichten und damit zu biologisieren.

Gemäß einer Modifikation des Verfahrens können durch eine Hitzebehandlung (100°C, 30 min) Bestandteile aus einem Thrombozytenlysat immobilisiert und bioaktiv erhalten werden, die im BMP-Reporter-Zell-Test eine Expression der alkalischen Knochenphosphatase stimulieren. Wegen der weitgehenden Übereinstimmung menschlicher und muriner Wachstumsfaktoren ist der BMP- Reporter-Zell-Test geeignet, um diese Effekte aufzudecken. Da die Induktion der ALP bei Knochenzellen eine Reihe von durch BMP-2 ausgelösten Differenzierungs- bedingten Protein-Expressionen begleitet, ist wahrscheinlich, dass Hitze-fixiertes Thrombozytenlysat in besonderer Weise osteoinduktiv ist. Nicht-Hitze-fixiertes Thrombozytenlysat löste den Effekt nicht aus.

Beispiel 1 Immobilisierung und Visualisierung von adsorptiv gebundenem BMP-2 auf Titan, 316L Stahl, Nitrocellulose und Glas auf flachen metallischen Probenkörpern

Elektropolierte Probenkörper aus Titan oder 316L Stahl werden in 5%iger HNO₃ für 2 Stunden bei 80°C gereinigt, anschließend gründlich gewässert und in Methanol aufbewahrt. Zur BMP-2 Beschichtung werden die Prüfkörper getrocknet und mit kleinen Tropfen (0,5-1 µl) einer wässrigen Lösung (pH 4) beschichtet, die 0,1-0,2 mg BMP-2/ml enthält. Die Tropfen werden im sterilen Luftstrom eingetrocknet und anschließend der Hitzebehandlung ausgesetzt. Temperaturen zwischen 100 und 135°C für 30 min reichen aus, um die gewünschte Steigerung der Aktivität zu erzielen. Die so vorbehandelten Prüfkörper werden auf Raumtemperatur abgekühlt und im BMP-Zell-Reporter-Test untersucht: Auf die Prüfkörper wird eine Zellsuspension von frisch trypsinierten MC3T3-E1-Zellen (1 × 10⁵-1 × 10⁶ Zellen/ml) gegeben, so dass sie ca. 2 mm hoch von Medium bedeckt sind. Während der nächsten 60 min wird das Präparat unter Zellkulturbedingungen (37°C, 100% Luftfeuchtigkeit, 5% CO₂ in der Gasphase) im Brutschrank gehalten, so dass die Zellen anheften können. Anschließend wird das Medium ausgetauscht und das Präparat für weitere 3 Tage unter Zellkulturbedingungen inkubiert. Zum Nachweis der alkalischen Knochenphosphatase hat sich eine 5minütige Fixierung der aufgewachsenen Zellen in 2% Paraformaldehyd (in 0,1 M Phosphatpuffer pH 7.4) bewährt, bevor die Enzymaktivität mit histochemischen Methoden sichtbar gemacht wird. Als Substrat dient ein Gemisch aus 5-Bromo-4-chioro-3-indolylphosphat (BCIP) und Nitrobluetetrazolium (NBT), das dem Fachmann bekannt ist. An Stellen hoher ALP-Expression ergibt sich eine blauschwarze Färbung, deren Intensität vermessen werden kann.

Die Hitzebehandlung führte im Vergleich zur einfachen Trocknung zu einer um 50- 100% gesteigerten Bildung von ALP durch die aufsiedelnden Zellen, gemessen im BMP-Reporter-Zell-Test.

Beispiel 2 Immobilisierung von BMP-2 auf einem Plasma-gespritzten Titan Rundkörper für Implantationsexperimente

An einer Stelle eines runden oder zylindrischen Testkörpers werden lokal 4 mal je 1 µl der BMP-2 Lösung (wie Beispiel 1) eingetrocknet. Eine Plasma-behandelte aufgerauhte und dadurch hydrophil gemachte Titan-Oberfläche führt zur sichtbaren Ausbreitung der Tropfen, so dass das benetzte Areal erkannt und dokumentiert werden kann. Nach Hitzebehandlung (siehe Beispiel 1) lässt der BMP-Reporter-Zell- Test die Position und die Menge der aufgebrachten Biomoleküle erkennen. Zur Beschichtung mit Zellen muss der Probenkörper so fixiert werden, dass die zu untersuchende Stelle sowie ihre Umgebung gleichmäßig von anhaftenden Zellen bedeckt wird. Dabei ist die schnelle Adhäsion der verwandten MC3T3-E1 Zellen von Vorteil. Die Überschichtung mit der Zellsuspension erfolgt wie in Beispiel 1 beschrieben.

Beispiel 3 Hitzefixierung von Thrombozytenlysat

"Platelet-enriched Plasma", ein durch Zentrifugation aus menschlichem Vollblut hergestelltes Thrombozytenlysat, wird auf einem Metal-Prüfkörper aus Titan oder 316L Stahl eingetrocknet und bei trockener Hitze (100°C, 30 min) fixiert. Der Zell- Reporter-Test ergibt unter diesen Bedingungen eine positive Reaktion, d. h. eine gesteigerte lokale Expression der ALP, die ohne vorangehende Hitzefixierung nicht beobachtet werden kann.

Beispiel 4 Bestimmung der Aktivität von Hitze-fixiertem BMP-2 nach längerer Inkubation in der Zellkultur

In einer Modifikation des BMP-Reporter-Zell-Tests wird BMP-2 hitzefixiert und erst unter Zellkulturbedingungen (alpha-MEM Medium, 20% Fetales Kälberserum, 37°C) im Verlauf von 8 Tagen von Zellen überwachsen. Die Wachstumsfront der Zellen ist dabei nach Vitalfärbung (z. B. mit Neutralrot) klar zu erkennen. Die unter diesen Bedingungen erhaltene lokale Expression der ALP durch die aufgewachsenen Zellen zeigt, dass BMP am Immobilisationsort verbleibt.

Beispiel 5 Abdiffusion von Hitze-fixiertem BMP-2

Eine langsame Abdiffusion von immobilisiertem BMP-2 ist erwünscht und kann in vitro erfasst werden, indem über dem lokal immobilisierten BMP-2 ein konfluenter Rasen von MC3T3-E1 Zellen in geringer Entfernung angebracht wird. BMP-2 befindet sich dazu auf einem Träger (z. B. Metall), während die Zellen auf einem Deckglas wachsen. Der Spaltraum zwischen BMP-2 und Zellen beträgt 0,13 mm (wenn ein Deckglas als Abstandshalter fungiert) und ist mit Zellkulturmedium angefüllt. Eine geringe lokale Stimulation der alkalischen Phosphatase in den entfernten Zellen ist unter diesen Bedingungen nach 3 Tagen nachweisbar. In größerer Entfernung von der BMP-2-Quelle kommt es nicht zur Stimulation der ALP- Expression.

Claims

1. Verfahren zur Immobilisierung von hitzeresistentem BMP an Implantatmaterialien durch nicht-kovalente Adsorption, dadurch gekennzeichnet, dass eine einmalige oder mehrmalige Eintrocknung der BMP-haltigen Lösung auf einem Implantatmaterial erfolgt und eine nachfolgende Hitzebehandlung die Immobilisierung des BMP fördert oder seine biologische Wirksamkeit steigert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zunächst eine Schicht eines Trägerproteins auf die Implantatoberfläche aufgebracht wird und in einem weiteren Schritt BMP adsorptiv gebunden wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass nicht-kovalent aufgebrachtes BMP durch Anwendung von kreuzvernetzenden Reagenzien untereinander verbunden wird, mit dem Ziel, die eingetrocknete Schicht des BMP sekundär zu stabilisieren.

4. Verfahren nach Artspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass als Implantatmaterialien Metalle, mit besonderem Titan, Stahl, Metalllegierungen Keramiken oder Kunststoffe eingesetzt werden.

5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass eine Hitzesterilisation des Implantatkörpers bei gleichzeitiger Beschichtung mit BM P vorgenommen wird.

6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass eine räumlich abgegrenzte Beschichtung von Implantaten mit BMP vorgenommen wird und BMP-haltige Lösungen durch Sprüh-, Tropf-, oder Tauchverfahren lokal aufgebracht und immobilisiert werden.

7. Verfahren nach den Ansprüchen 1-6, dadurch gekennzeichnet dass BMP-2, weitere Moleküle der BMP-Familie, insbesondere BMP-3 und BMP-7 und zusätzlich wundheilungsrelevante und hitzestabile Mediatormoleküle, insbesondere TGF alpha und TGF beta, aufgebracht werden.