DE10051628A1 - Mittel zur Inaktivierung von pathogenen Keimen und dessen Verwendung - Google Patents
Mittel zur Inaktivierung von pathogenen Keimen und dessen VerwendungInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Mittel zur Inaktivierung von pathogenen Keimen, bestehend aus einem einzelsträngigen Oligonukleotid mit weniger als 7 spezifischen Nukleotiden und einem anhängenden reaktiven Konjungat, vorzugsweise Eisen-EDTA, sowie die Verwendung dieses Mittels, insbesondere zur Inaktivierung von Viren in Blut oder Blutbestandteilen. Durch geringe Anzahl der Nukleotide ist dabei eine sehr unspezifische Anlagerung an alle bekannten pathogenen Keime möglich, wobei die reaktive Gruppe das Genom der pathogenen Keime zerstört.
Description
Die Erfindung betrifft ein Mittel zur Inaktivierung von pathogene Keimen bestehend
aus einem einzelsträngigen Oligonukleotid mit weniger als 7 spezifischen Nukleoti
den und einem anhängenden Konjungat, sowie die Verwendung dieses Mittels,
insbesondere zur Inaktivierung von Viren in Blut oder Blutbestandteilen.
Bei der Verwendung von Blutprodukten beispielsweise bei der Transfusion von hu
manem Blut oder bei der Gewinnung von Proteinen aus Blut oder Blutbestandteilen
besteht ein großer Bedarf, die pathogenen Keime abzutöten, bevor die Produkte
ihrer bestimmungsgemäßen Verwendung zugeführt werden. Im Stand der Technik
sind bereits diverse Methoden und Stoffe bekannt, die eine Inaktivierung von pa
thogenen Keimen bewirken, jedoch zu viele schädigende Nebenwirkungen aufwei
sen. Beispielsweise wirken manche Stoffe toxisch oder sind nicht zur Abtötung von
Viren geeignet, wie zum Beispiel Antibiotika.
Um auch Viren abtöten zu können, werden oft Stoffe verwendet, die eine hohe oxi
dierende oder alkylierende Wirkung haben und/oder sich an das Genom anlagern.
Daher sind diese Stoffe auch für andere Zellen mutagen oder cancerogen. Weiterhin
stellt sich das Problem, daß sie dennoch für eine große Anzahl von Viren auf
grund deren Heterogenität versagen. Um auch Viren zu inaktivieren, sollte eine
Anlagerung an Nukleinsäuren zwar erfolgen, aber möglichst keine mutagenen oder
cancerogenen Eigenschaften aufweisen.
Ein Oligonukleotid ist ein natürlich vorkommender Stoff, der oben genannte Eigen
schaften aufweist, wobei man sinnvollerweise das antisense Oligonukleotid ein
setzt. Von antisense Oligonukleotiden ist bekannt, daß sie sich beispielsweise an
die mRNA (messenger Ribonukleinsäure) anlagern und damit die Bildung des Pro
teins verhindern. Ebenso können Oligonukleotide an RNA der Viren binden oder
mit mindestens drei Thymin oder Cytosin als Basen in Folge mit doppelsträngiger
Desoxyribonukleinsäure (dsDNA) sogar eine Triple-Helix, also einen Dreifachstrang
bilden und dadurch bedingt sterisch das Ablesen der genetischen Information bloc
kieren oder gar zu Strangbrüchen führen.
In der WO 95/32986 und in der WO 92/05284 sind ebenfalls antisense Oligonu
kleotide beschrieben, welche pathogene Keime inhibierende Eigenschaften aufwei
sen. Dabei besteht das Oligonukleotid jeweils aus Sequenzen, die zu der Nuklein
säuresequenz des pathogenen Keimes komplementär sind oder im Falle der WO 92/05284
an spezifische strategische Seiten der Microben binden. Somit werden
nur spezifische pathogene Zielkeime erfasst und die Oligonukleotide sind nicht für
möglichst alle pathogenen Keime, insbesondere nicht für alle Virenarten geeignet.
Weiterhin ist bekannt, Strangbrüche in der DNA oder RNA zu induzieren durch ein
Konjungat mit einer reaktiven Gruppe, wie beispielsweise ein EDTA-Eisen Chelat
komplex, der an das Ende eines Oligonukleotides angehängt ist. In der Literatur
stelle Gene 72 (1988), Seite 361-371 zeigen die Autoren Boidet-Foget et al., daß
ein spezifisches Schneiden von einzelsträngiger und doppelsträngiger DNA möglich
ist. In Nucleic Acids Research, Vol. 15 Nr. 23(1), Seite 9909 bis 9919 zeigen die
Autoren Zerial et al. ebenfalls eine sehr selektive Inhibierung von Typ A Influenza
Viren mittels eines spezifischen Oligonukleotides mit einem reaktiven Konjungat.
Diese Selektivität ist darauf zurückzuführen, daß das einzusetzende Oligonukleotid
spezifisch als Komplementärstrang zu einer konservativen DNA-Sequenz syntheti
siert wurde. Dabei paaren bekanntlich die Basen Cytosin stets mit Guanin und
Thymin oder sein Gegenstück in der RNA, Uracil, stets mit Adenin. Diese Adhäsi
onskräfte sind zum einen temperaturabhängig zum anderen abhängig von der
Menge der zueinander passenden Paare. Mit dieser Methode läßt sich demnach
spezifisch eine Virensorte oder eine Klasse von Viren mit Gemeinsamkeiten inhibie
ren, aber eine Inaktivierung von möglichst allen pathogenen Keimen scheint damit
nicht möglich.
In Tabelle 1 sind die wichtigsten bei einer Blutübertragung relevanten Viren und
Bakterien aufgezeigt. Daraus ist zu ersehen, daß manche Viren doppelsträngige
Desoxyribonukleinsäure (dsDNA) besitzen, andere einzelsträngige Ribonukleinsäu
re (ssRNA) oder Viren behüllt oder unbehüllt sind.
Da bei einer Inaktivierung möglichst alle pathogenen Keime erreicht werden sollten,
stellt sich die Aufgabe, ein unspezifisches Agens zu finden, welches jedoch mög
lichst ungefährlich bei der Verwendung ist. Die Aufgabe wird durch die Merkmale
des ersten Anspruchs gelöst.
Dabei wird unter pathogenen Keimen alle für Organismen zu Krankheitsbildern füh
renden Keime mit einem Genom verstanden, wie Bakterien oder Viren. Die geringe
Spezifität wird durch die maximale Länge des Oligonukleotids von 6 spezifischen
Nukleotiden erreicht, wobei spezifisches Nukleotid bedeutet, daß ihre Base aus der
Gruppe der spezifischen Basen Guanin, Adenin, Thymin, Uracil und/oder Cytosin
ausgewählt sind. Statistisch findet eine derartiges synthetisches Oligonukleotid
mehrere Treffer auf einem Genom, so daß möglichst alle pathogenen Keime, vor
allem alle Virenarten inaktiviert werden können. Wird die Nukleotidfolge aus spezifi
schen Nukleotiden länger als 6 Nukleotide, werden die Treffer auf dem Genom er
heblich kleiner, da nur eine Anlagerung genau am komplementären Strang erfolgt.
Damit steigt die Spezifität und als Folge davon natürlich auch die Selektivität, was
in der vorliegenden Erfindung nicht erwünscht ist.
Des weiteren wird vorteilhafterweise eine Seite des Oligonukleotides mit einer
Schutzgruppe versehen, die den Abbau des Oligonukleotides zumindest verzögert.
Vorteilhafterweise wird für diese Schutzgruppe ein weiteres Nukleotid verwendet,
da dieses wiederum natürlich vorkommt und im menschlischen oder tierischen Kör
per nicht giftig wirken kann. Um ihre Wirksamkeit als Schutzgruppe entfalten zu
können, wird das weitere Nukleotid spiegelsymmetrisch zu den anderen Nukleoti
den eingebaut, so daß möglichst wenig RNasen oder DNasen eine Angriffsmög
lichkeit geboten wird. Dieses Schutzgruppen-Nukleotid trägt nicht zur Bindung an
einen Komplementärstrang bei und wird daher bei der Längenbestimmung des Oli
gonukleotides nicht mitgezählt.
Die Zerstörung des Genoms erfolgt durch das an das freie Ende des Oligonukleoti
des angehängte reaktive Konjungat, welches bevorzugt ein Eisen-EDTA (Ethylen
diamintetraacetat) ist. Erfindungsgemäß können alle reaktiven Konjungate, die eine
Zerstörung des Genoms bewirken, an das Oligonukleotid angehängt werden. Als
weiteres Beispiel sei das Eisen-DTPA (Diethylentriaminpentaacetat) genannt, doch
werden auch diese Konjungate vorteilhafterweise derart gewählt, daß sie vom
menschlischen Körper toleriert werden. Im Falle von EDTA und Eisen sind beides
bereits zugelassene Medikamente zur Förderung eines gesunden Blutbildes, und
können unbedenklich eingesetzt werden, so daß sie besonders bevorzugt sind.
Außer den fünf oben genannten spezifischen Basen existieren auch sogenannte
universelle Basen, die mit allen oder zumindest mehreren Basen eine Basenpaar
bildung eingehen. Diese können - wie das 5-Nitroindol - synthetisch sein oder - wie
das Inosin - natürlich vorkommend. Inosin, welches eine Base der transfer RNA
(tRNA) ist, kann mit Cytosin, Adenosin und Uracil eine Basenpaarbildung eingehen.
Der Einsatz einer universellen Base ermöglicht eine Bindung des Oligonukleotides
bei höheren Temperaturen, wobei aber der Vorteil erhalten bleibt, möglichst viele
Bindungen mit Genomen pathogener Keime zu erhalten mit nur wenigen spezifi
schen Nukleotiden.
Entsprechend der Verwendung des Inaktivierungsmittels ist der erfindungsgemäße
Einsatz des Inosin als universelle Base bevorzugt, beispielsweise in Blut oder Blut
komponenten, die für die Transfusion vorgesehen sind. Aber auch andere univer
selle Basen sind beispielsweise für die Verwendung in vitro denkbar.
Durch den Einsatz von universellen Basen kann auch ein größeres Oligonukleotid
synthetisiert werden, welches immer noch unspezifisch an DNA und RNA bindet.
Dabei entscheidet die Länge des Genoms über die Häufigkeit einer Anlagerung.
Tabelle 2 zeigt die Häufigkeit der Basenbaarbildung von Oligonukleotiden mit je
weils vier verschiedenen spezifischen Basen und mehreren Inosinen als universel
len Basen mit jeweils verschiedenen Virenarten.
Es wird des weiteren vorgeschlagen, daß sich das erfindungsgemäße Oligonukleo
tid an eine dsDNA binden kann. Es hat sich gezeigt, daß Folgen gleicher Nukleoti
den mit den Basen entweder Thymin oder Cytosin besonders vorteilhaft an dsDNA
binden und mit der DNA eine Triple-Helix eingehen. Aus diesem Grund wird bevor
zugt eine derartige Struktur verwendet, besonders bevorzugt eine Folge von min
destens drei Cytosinen, da Cytosin eine etwa doppelt so hohe bindungsstärke an
DNA aufweist als Thymin.
In Tabelle 3 ist aufgezeigt, wie häufig ein Oligonukleotid, bestehend aus minde
stens drei Inosinen und mindestens drei weiteren spezifischen, aber jeweils glei
chen Basen, einen Komplementärteil im Genom verschiedener pathogener Keime
findet.
Im Falle einer Weiterverwendung im menschlischen oder tierischen Körper muß ein
Inaktivierungsmittel, welches nicht schadfrei im Körper abgebaut werden kann, vor
Infusion neutralisiert werden bzw. entfernt werden. Abgesehen von dem zusätzli
chen Aufwand, der mit der Entfernung von toxischen oder mutagenen Stoffen ver
bunden ist, muß man auch bei der Handhabung große Sorgfalt gewähren lassen.
Beispielsweise unterliegen diese Stoffe einer Kennzeichnungspflicht und das ent
sprechende Labor einer besonderen Aufsichtspflicht. Aus diesen Gründen ist ein
erfindungsgemäßes Mittel bestehend aus natürlich vorkommenden Nukleotiden,
einem Nucleotid als Schutzgruppe und einem Eisen-EDTA Komplex besonders be
vorzugt.
Um die Wirksamkeit des erfindungsgemäßen Oligonukleotids zu testen, wurde in
vitro eine Inaktivierung des als besonders resistent bekannten Bakteriophagen MS2
durchgeführt. Dabei wurde ein Oligonukleotid bestehend aus I I C C C C I I mit ei
nem EDTA-Konjungat 5'-seitig in einer Konzentration von 20 µmol/l 180 min bei 6°C
und weiteren 80 min bei Raumtemperatur mit dem Phagen in einem Tris-Puffer pH
5.0 mit 6 g/l, Tris, 5,8 g/l NaCl, 2 g/l, MgSO4 × 7H2O und 1 g/l, Albumin incubiert. Der Ti
ter wurde wie üblich durch eine Phagenverdünnungsreihe mit jeweils 100 µl der
Phagenverdünnung, 100 µl einer E.coli-Bakteriebkultur auf 2,5 ml Weichagar be
stimmt.
Während die Konzentration vor Inaktivierung 20 × 109 pfu/ml betrug, konnten nach
Incubation nur noch 51 × 103 pfu/ml ausgezählt werden. Daraus ergibt sich somit ein
Inaktivierungsfaktor von 10 log 3,6.
Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Oligonukleotides ist in der Tempera
turabhängigkeit der Basenpaarbildung zu sehen. Wie oben bereits erwähnt, hängt
die Aneinanderlagerung von Nukleinsäuren außer von der Anzahl der komplemen
tären Basen auch von der Temperatur ab. Je länger und spezifischer der komple
mentäre Strang, desto schwieriger ist die Denaturierung des Doppelstranges, desto
höher ist demnach die Temperatur zur Denaturierung anzusetzen. Daher lagern
sich hoch spezifische Oligonukleotide in einem weiten Temperaturbereich an RNA
oder DNA, während sich unspezifische Nukleotide wie das erfindungsgemäße nur
bei niedrigen Temperaturen anlagern.
Dieser Effekt wird erfindungsgemäß bei der Verwendung des Oligonukleotides als
Inaktivierungsmittel in genutzt, die zur Infusion in den menschlichen Körper vorge
sehen sind, da lediglich RNA und DNA der pathogenen Keime geschädigt werden
sollen, nicht aber die humanen Zellen. Werden physiologische Lösungen wie Blut
oder Blutbestandteile bei Raumtemperatur oder niedrigeren Temperaturen mit dem
erfindungsgemäßen Oligonukleotid gelagert, wie dies beispielsweise immer bei der
Lagerung von Erythrozytenkonzentraten oder Blutplättchenkonzentraten vorge
schrieben ist, so kann das unspezifische Oligonukleotid in potentiell vorhandenen
pathogenen Keimen seine Wirkung entfalten, ist im Körper bei 37°C aber unwirk
sam, da es bei dieser Temperatur nicht mehr anlagern kann.
Besonders vorteilhaft ist es, wenn das Oligonukleotid weniger als 4 spezifische Ba
sen aufweist, da das Anlagern dann erst bei Kühlschranktemperatur erfolgen kann
und jede Handhabung völlig problemlos ist und keinerlei Kennzeichnungpflicht un
terliegt. Im Falle von Blutprodukten kann jede Blutbank die Inaktivierung durchfüh
ren, ohne besondere Schutzmaßnahmen für das Personal oder den Spender ein
zuhalten. Auch wird im Körper der Abbau des bevorzugten erfindungsgemäßen
Oligonukleotides durch körpereigene RNasen oder DNasen nur zu unschädlichen,
da wiederum körpereigenen Nukleotiden erfolgen.
Claims (19)
1. Mittel zur Inaktivierung von pathogenen Keimen, bestehend aus einem einzel
strängigen Oligonukleotid, welches befähigt ist, mit doppelsträngigen DNA-
Abschnitten eine Triple-Helix zu bilden und mindestens einem Konjungat da
durch gekennzeichnet, daß das Oligonukleotid aus weniger als 7 spezifischen
Nukleotiden besteht, wobei spezifische Nukleotide ausschließlich Basen tragen,
die ausgewählt sind aus der Gruppe der spezifischen Basen Adenin, Cytosin,
Thymin, Uracil und/oder Guanin.
2. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Konjungat eine reak
tive Gruppe enthält.
3. Mittel nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die reaktive Gruppe Ei
sen (II)-Ionen enthält.
4. Mittel nach Anspruch 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß die reaktive Gruppe
ein Eisen-EDTA-Komplex ist.
5. Mittel nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die reaktive Gruppe
ein Eisen-DTPA-Komplex ist.
6. Mittel nach einem oder mehreren der vorangegangenen Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß das Oligonukleotid zusätzlich mindestens ein weiteres Nu
kleotid enthält, wobei jedes weitere Nukleotid ausschließlich eine universelle
Base aufweist.
7. Mittel nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die universelle Base aus
gewählt ist aus der Gruppe Inosin und 5-Nitroindol, bevorzugt Inosin.
8. Mittel nach einem oder mehreren der vorangegangenen Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß es eine Schutzgruppe enthält.
9. Mittel nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Schutzgruppe ein Nu
kletid ist, welches spiegelsymmetrisch zu anderen Nukleotiden angefügt ist.
10. Mittel nach einem oder mehreren der vorangegangenen Ansprüchen, dadurch
gekennzeichnet, daß als spezifische Base mindestens dreimal, vorzugsweise
viermal die gleiche Base in Folge vorhanden ist.
11. Mittel nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die spezifische Base
Cytosin ist.
12. Mittel nach einem oder mehreren der vorangegangenen Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß sich an die Folge von spezifischen Basen an mindestens
einer Seite mindestens ein weiteres Nukleotid mit einer universellen Base an
schließt.
13. Mittel nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die spezifische Base
jeweils Cytosin und die universelle Base jeweils Inosin ist.
14. Verwendung eines Mittels zur Inaktivierung von pathogenen Keimen, insbeson
dere zur Inaktivierung von Viren, dadurch gekennzeichnet, daß die Inaktivierung
durch mehrfache unspezifische Anlagerung an DNA oder RNA von pathogenen
Keimen und Zerstören der DNA oder RNA an dieser Stelle erfolgt.
15. Verwendung nach einem oder mehreren der vorangegangenen Ansprüche, da
durch gekennzeichnet, daß die unspezifische Anlagerung bei einer Temperatur
von weniger als 30°C erfolgt.
16. Verwendung nach einem oder mehreren der vorangegangenen Ansprüche, da
durch gekennzeichnet, daß die unspezifische Anlagerung bei Kühlschranktem
peratur erfolgt.
17. Verwendung nach einem oder mehreren der vorangegangenen Ansprüchen,
dadurch gekennzeichnet, daß die Inaktivierung in physiologischen Lösungen
erfolgt.
18. Verwendung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die physiologi
schen Lösungen Blut- oder Blutbestandteile sind.
19. Verwendung nach einem oder mehreren der vorangegangenen Ansprüche, da
durch gekennzeichnet, daß das Mittel zur Inaktivierung von pathogenen Keimen
oder dessen Bestandteile nach erfolgter Inaktivierung aus den physiologischen
Lösungen entfernt wird.
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