DE10024063A1 - Kultursystem Mikrokapillare - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Kultursystem zur Modellierung von kapillaren Gefäßen und zur in vivo-ähnlichen Versorgung eines Zellkulturraumes auf der Grundlage poröser, mit biologischen Grenzflächen, Membranen oder Zellen besiedelter oder mit bioimitierender Grenzflächen belegter hohler Polymerfasern in einem Kulturraum. Das Kultursystem besteht aus einem intrakapillaren Raum (IR) in einem Kulturraum, dem extrakapillaren Raum (ER), wobei die modellierenden kapillaren Gefäße innen- und außenseitig von beweglichen Medien umgeben oder durchströmt werden. Das Volumenverhältnis von ER zur IR beträgt 2 : 1 bis 20 : 1. Damit ist der maximale Abstand der Zellen im ER von der versorgenden Hohlfaser (IR) 0,9 mm. Das System eignet sich zur Simulierung körpereigener biologischer Vorgänge und zur Kultivierung von Säugerzellen und -geweben.

Description

Die Erfindung betrifft ein Kultursystem zur Modellierung von kapillaren Gefäßen und zur in vivo-ähnlichen Versorgung eines Zellkulturraumes auf der Grundlage poröser, mit biologischen Grenzflächen, Membranen oder Zellen besiedelter oder mit bioimitierender Grenzflächen belegter, hohler Polymerfasern in einem Kulturraum. Das System eignet sich zur Simulierung körpereigener biologischer Vorgänge und zur Kultivierung von Säugerzellen und -geweben.

Es ist bekannt, dass sich körpereigene, biologische Vorgänge (z. B. Angiogenese, Entzündung, Metastasierung oder Substanztransportvorgänge) auch in vitro an porösen, zweidimensionalen Membranen untersuchen lassen (Snyderman, R., Science 213, 1981, 230-237). Diese Membranen vermitteln die Zelladhäsion und ermöglichen eine Migration von biologischen Substanzen und Zellen durch die Poren. Diese genannten biologischen Vorgänge treten im Körper in oder an dreidimensional durchströmten körpereigenen Systemen auf. Daher ist für eine korrekte in vitro-Modellierung und Versorgung auch eine dreidimensionale Anordnung/Kultivierung der Zellen (Williams, S., Lab. Invest. 69, 1993, 491-493) bzw. des Gewebes und eine strömende Versorgung (Lasky, L., Science 2581, 19921, 964-969) notwendig. Das Aufklären von mikroskopischer Struktur und Ultrastruktur von Geweben und Organe fördert ganz wesentlich das funktionelle Verständnis des Organismus und kommt so der Qualität ärztlichen Handelns zugute (Welsch, U., "Histologie", Vorwort der vierten Auflage, Urban und Schwarzenberg 1997).

Die Nutzung von Hohlfasern für Zellkultivierungen und Untersuchungen, bei denen Zellen innen, außen oder beidseitig an Fasern wachsen können, wurde in den Dokumenten WO 89/11529 und WO 95/02037 beschrieben. Allerdings sind die in WO 95/02037 genannten porösen Fasern maximal mit Mikrofiltrationsausschlussgrenzen (Porengröße bis 0,8 µm) herstellbar. Damit kann nur Stoffaustausch, nicht aber Wanderung von Zellen und Mikroorganismen durch die Wand hindurch gewährleistet werden. Das beschriebene Verfahren und die entsprechende Vorrichtung dienen der Kultivierung von Zellen, insbesondere von Hepatocyten, aber nicht zur Modellierung einer Kapillare.

Das Grundprinzip eines Kultursystems Mikrokapillare zur Modellierung/Simulierung von kapillaren Gefäßen ist aus der Patentanmeldung DE 197 11 114 bekannt. Das Kultursystem besteht aus einer oder aus mehreren porösen polymeren Kapillaren, Intrakapillarer Raum (IR) genannt, die in einem Kulturraum, Extrakapillarer Raum (ER) genannt, eingebettet sind. Der IR steht z. B. für ein kapillares Blutgefäß, der ER modelliert das Gewebe. Das Kultursystem gestattet damit eine dreidimensionale Anordnung von Zellen in einem intrakapillaren und extrakapillaren Raum und wird so der räumlichen Anordnung von Zellen in vivo gerecht. Ein Nachteil dieser Mikrokapillare besteht darin, dass Gewebe im ER nicht ausreichend mittels Hohlfaser versorgt werden können. Die Ursache dafür liegt in den Größenverhältnissen des ER und der Hohlfaser. Der Innendurchmesser des ER ist 3,8 mm, der Außendurchmesser der Hohlfaser beträgt 0,2 mm; dadurch wird der maximale Abstand der Zellen im ER von der versorgenden Hohlfaser 1,8 mm.

Dieser Abstand von 1,8 mm ist für eine Nährstoffversorgung der meisten Zelltypen zu groß. Somit kann nur eine Gefäß-Gewebe-Simulation durchgeführt werden, die zwar Endothelzellen auf der inneren Oberfläche der Hohlfaser beinhaltet, aber kein tatsächliches Gewebe (höhere Zellkonzentration) im ER.

Infolge dieses großen Abstandes wird die Untersuchung von Metastasierungsvorgängen nur aus der Hohlfaser in den ER möglich, nicht aber eine umgekehrte "Wanderung der Zellen", da sie vorher im ER absterben könnten. Ein weitere Nachteil der beschriebenen Mikrokapillare sind die Zugänge zum IR. Sie wurden mit Luerzugängen realisiert. Dafür benötigt man aufgrund des entstehenden Totraumes etwa doppelt so viele Zellen (bzw. Zellkonzentration in der Lösung) zum Beimpfen mit Endothelzellen. Ein zusätzlicher Nachteil ist der Durchmesser der Hohlfaser, da für eine Kultivierung von Zellen im ER deutlich höhere Volumenströme/größere Membranoberfläche für den Stoffaustausch notwendig sind. Über die geometrische Anordnung der Zugänge werden keine Angaben gemacht. Ferner entsteht ein weiterer Nachteil durch die zylindrische Ausführung des ER. Durch die Rundung der ER- Wandung ist es nur begrenzt möglich das Innere des ER bzw. die Membran/IR zu mikroskopieren.

Aufgrund der Nachteile sind mit der beschriebenen Mikrokapillare aus DE 197 11 114 differenzierten Zustände in ER und IR sowie eine Kultivierung von Zellen im ER nur eingeschränkt möglich, die dort beschriebene Hohlfaser ohne zusätzlichen Zelllayer ermöglicht keine direkte Unterscheidung, da sie passierbar für Zellen, Bakterien, Viren und Substanzen ist. Daher kann nur mit Endothelzellen gearbeitet werden, nicht mit anderen Membranen mit kleineren cut offs.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die Nachteile der beschriebenen Mikrokapillare aus DE 197 11 114 zu beseitigen und das kultivierte Gewebe am Ende der Kultivierung einer histologischen Analyse zuzuführen.

Die Aufgabe wurde dadurch gelöst, dass in einem Kultursystems Mikrokapillare zur Simulierung körpereigener Systeme mit einem intrazellularen (IR) und extrazellularen Raum (ER) das Volumenverhältnis von ER zu IR 2 : 1 bis 20 : 1 ist und damit der maximale Abstand der Zellen im ER von der versorgenden Hohlfaser maximal 0,9 mm beträgt. Die Aufgabe wurde außerdem dadurch gelöst, dass eine Zugangsgeometrie entwickelt wurde, die den notwendigen Größenverhältnissen von ER und IR Rechnung trägt und ein minimales Totvolumen für die Zugänge für den extra- und den intrakapillaren Raum (IR) aufweist. Erfindungsgemäß wurden für die Zugänge Stopfen aus Silikon (Septen), die für Kanülen passierbar sind, verwendet. Die gesamten Zugänge zum intra- und extrakapillaren Raum liegen in einer Ebene mit der hohlen porösen Kapillare. Drittens wurde die Aufgabe durch eine Sollbruchstelle im Reaktormantel senkrecht zur Zugangsebene gelöst, so dass das Aufbrechen des Kulturraumes in Höhe der Ebene der Mikrokapillare erfolgt. Außerdem wurde die ER-Wandung als Quaderform mit abgerundeten Ecken ausgeführt, was das flächendeckende Mikroskopieren des Innenraums ermöglicht. Als Zugänge für den extrakapillaren Raum werden Luerkegelverbindungen (ISO 594-1, Luer-Innenkegel) verwendet.

Überraschenderweise hat sich herausgestellt, dass mit der erfindungsgemäßen Mikrokapillare im ER Verhältnisse vorherrschen, die eine ausreichende Nährstoffversorgung gewährleisten. Mit dem erfindungsgemäßen Kultursystem sind differenzierte Zustände im IR und ER sowie eine Kultivierung von Zellen im ER möglich.

Die erfindungsgemäße Zugangsgeometrie ermöglicht es, das Totvolumen zwischen den Septen und dem IR bzw. ER kleiner als 20 µl zu halten. Außerdem gewährleistet die Anordnung der Zugänge in einer Ebene mit der hohlen porösen Kapillare die Kombination des erfindungsgemäßen Kultursystem Mikrokapillare zu einem Reaktorensystem auf engstem Raum. Aufgrund dieser Anordnung kann ein Parallelversuch mit identischen oder unterschiedlichen Bedingungen und geringem räumlichen und experimentellen Aufwand durchgeführt werden, um einen direkten Vergleich der Reaktion von Zellen bzw. Gewebe zuzulassen.

Das erfindungsgemäße Kultursystem Mikrokapillare weist durch die Gestaltung der Geometrie ein minimales Totvolumen in den Zugängen von IR und ER auf. Die Zugänge des ER sind darüber hinaus so angeordnet, dass sie mit den Kanten des ER abschließen und damit das Auftreten eines nicht durchspülten Totraums vermeiden. Die Anordnung der Zugänge für den extra- und den intrakapillaren Raum wird mit dem geringst sinnvollen Abstand zueinander ausgeführt. Das Volumen des Ein- und Auslaufbereichs (4) des extrakapillaren Raumes (ER) ist durch eine starke Reduzierung des Durchmessers deutlich kleiner als das definierte Volumen des ER selbst.

Die Anordnung der Zugänge zum extra- und intrakapillaren Raum und die modifizierte Wandung des ER sind so gestaltet, dass ein Mikroskopieren des Kulturraumes mittels eines Aufsichts- oder Inverslichtmikroskopes ermöglicht wird. In der Mitte des extrakapillaren Raumes (ER) steht ein Zugangsport für die Applikation von Wirkstoffen oder zur Aufnahme von Meßsonden zur Onlinemessung von Prozess- und Zellparametern direkt und symmetrisch in den extrakapillaren Raum zur Verfügung.

Die Sollbruchstelle im Reaktormantel senkrecht zur Zugangsebene ist so ausgeführt, dass das Aufbrechen des Kulturraumes in Höhe der Ebene der Mikrokapillare erfolgt. Das kultivierte Gewebe kann dem Kulturraum entnommen und der histologischen Analyse zugeführt werden. Die Simulierung der körpereigenen Systeme wurde mit Hilfe kapillarer Gefäße gelöst, die aus porösen polymeren hohlen Fasern, dem intrakapillaren Raum (IR; Fig. 1, Fig. 2), bestehen und die sich in einem abgeschlossenen Raum, dem extrakapillaren Raum (ER; Fig. 1, Fig. 2), befinden. Als Grenzflächen werden biologische Materialien, wie Membranen oder Zellen, oder bioimitierende Materialien eingesetzt. Analog den körpereigenen Vorgängen werden die zu modellierenden, porösen kapillaren Gefäße innen- und außenseitig mit fluiden Medien umgeben oder durchströmt.

Unter biologischen Grenzflächen werden biologische Membranen und konfluente Zellmonolayer aus biologischen Substanzen, wie Zellen, Mikroorganismen, Viren und ihre Bestandteile, ferner Biomoleküle, wie Eiweiße, Lipide, Zucker und deren Einzelbestandteile verstanden. Unter bioimitierenden Grenzflächen werden Membranen und Oberflächenmodifikationen aus biokompatiblen Materialien, mit Überschneidung der bereits oben aufgeführten Bestandteile, verstanden, welche identische bzw. ähnliche Eigenschaften wie in vivo-Grenzflächen aufweisen.

Die kapillare Faser mit Poren wird so im ER angeordnet, dass sie bei Besiedelung mit menschlichen oder tierischen Zellen, ähnlich den Kapillarsystemen im Organismus, von Flüssigkeiten durchströmt werden und die Zellen oder Gewebe im ER versorgen können. Das bedeutet, dass - ähnlich den körpereigenen Systemen - eine ausreichende Versorgung mit den lebensnotwendigen Substanzen gewährleistet ist. Sowohl IR (Fig. 1: Zugang 1) als auch ER (Fig. 1 Zugang 2) können mittels separater Zugänge versorgt und durchspült werden. Weiterhin können jeweils Proben aus ER und IR gezogen werden, und ein Animpfport (Fig. 1: Zugang 3) ermöglicht die lokale Applikation von Mikromengen eines Wirkstoffes in den ER oder zur Aufnahme von Meßsonden, die lili die Online-Beobachtung, -Messung und -Protokollierung der Prozess- und Stoffwechselparameter des Zellsystems genutzt werden. Die Sollbruchstelle im Reaktormantel ermöglicht eine abschließende Untersuchung der Gewebestrukturen.

Das Wesen der Erfindung besteht in einer Kombination bekannter - Kultursystem Mikrokapillare, extra- und intrakapillarer Raum - und neuer Elemente - Geometrie und Kulturraumvolumen - und neuer Lösungswege - optimierte Innenraumform für das Mikroskopieren des Kulturraumes, abschließender Zugang zum Gewebe - die sich gegenseitig beeinflussen und in ihrer neuen Gesamtwirkung einen Gebrauchsvorteil und den erstrebten Erfolg ergeben, der darin liegt, dass sich nunmehr differenzierte Zustände in den Bereichen ER und IR sowie eine Kultivierung im ER erreichen lassen, eine lokale Unterversorgung von Zellen und Gewebe in Toträumen verhindert und der Kulturraum ER nicht unnötig erweitert wird.

Mit der Erfindung wird erreicht, dass das Volumen des Kulturraumes (ER) deutlich gegenüber dem Volumen der Zugangsgeometrien überwiegt und sich in diesen Bereichen keine unterversorgten Zonen von Zellen und Geweben ausbilden können (minimales Totvolumen). Daher lässt sich das System günstig für eine Simulation und Modellierung der biologischen Vorgänge in körpereigenen Systemen verwenden.

Eine vorteilhafte Ausgestaltung der Erfindung wird dadurch erreicht, dass die gesamten Zugänge zum intra- und extrakapillaren Raum in einer Ebene mit der hohlen porösen Kapillare liegen und dass mehrere Reaktoren nebeneinander angeordnet werden können, ohne dass es zu räumlichen Behinderungen der Zugänge kommt.

Erfindungsgemäß ermöglicht es die Anwendung des Kultursystems Mikrokapillare den Benutzern, mehrere Systeme parallel in einem Versuchsaufbau zusammenzufügen und trotzdem die Versorgung aller Einzelsysteme ohne Einschränkung zu gewährleisten.

Weiterhin wird eine große Variabilität durch das große Spektrum an verwendbaren Kapillarmembranen erreicht. Es können alle biokompatiblen Membranen für eine Zell- bzw. Gewebekultivierung genutzt werden. Damit erweitert sich das Repertoire des erfindungsgemäßen Systems, beispielsweise auf die triviale Zellvermehrung in einer neuen Größenordnung, bezogen auf die Animpfzellzahl und der erreichbaren Zelldichte in einem kontinuierlichen, dynamischen System. Aufgrund der Gestaltung des extrazellulären Raums (ER-Volumen) kann sich ein Mikromillieu in der Umgebung (ER) der Zellen schnell einstellen und sich damit ein in vivo-like Gewebe ausbilden.

Eine weitere vorteilhafte Ausgestaltung der Erfindung liegt darin, dass die Anordnung der Zugänge zum extra- und intrakapillaren Raum und die ER-Wandung so gestaltet sind, dass ein Mikroskopieren des Kulturraumes mittels eines Aufsichts- oder Inverslichtmikroskopes ermöglicht wird.

Damit wird den Benutzern während der Kultivierung ermöglicht, die Zellen oder das Gewebe mit optischen Geräten zu kontrollieren und zu validieren, ohne dass die Sterilität des Systems dadurch gefährdet wird.

Für die optimale optische Ausnutzung sind die Wandung des Kulturraums und die äußere Körperwandung parallel zueinander angeordnet und besitzen einen Abstand von weniger als 2 mm.

Eine zusätzliche Ausgestaltung der Erfindung wird dadurch erreicht, dass in der Mitte des extrakapillaren Raumes ein Zugangsport JUr die Applikation von Wirkstoffen oder Meßsonden direkt und symmetrisch in den extrakapillaren Raum zur Verfügung steht. Dieser Port lässt eine Zugabe von Wirkstoffen direkt in den ER zu, ohne die eigentlichen ER- Zugängen an der ER-Peripherie zu benutzen, wodurch sich die Auswirkung der Applikation symmetrisch im ER ausbilden kann, ohne das Totvolumen relevant zu vergrößern. Alternativ kann mit einer Sonde, welche durch den Zugangsport in den ER reicht, eine Online-Messung des Systems durchgeführt werden. Dabei ist auch in diesem Fall die symmetrische Portanordnung von Vorteil, da sie basierend auf dem Abstand zu Ein- und Auslauf, eine unbeeinflusste und daher statistisch ausgewogene Messung repräsentiert.

Eine weitere nützliche Ausgestaltung der Erfindung besteht darin, dass eine vorab eingebrachte Sollbruchstelle im Reaktormantel einen abschließenden Zugang zum kultivierten Gewebe zuläßt und das Gewebe somit einer histologischen Untersuchung zur Verfügung steht.

Das erfindungsgemäße Kultursystem Mikrokapillare kann als Einwegsystem verwendet werden und ermöglicht dadurch einen erhöhten Schutz für den Anwender und die Umwelt.

Die folgenden Beispiele dienen der Verdeutlichung der Erfindung, ohne sie auf diese Beispiele zu beschränken.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1 Beschreibung von ER und IR

In einem Kulturraum von 22 mm Länge beträgt das ER-Volumen 160 µL und das Volumen des IR 18 µL. Der Durchmesser der Hohlfaser ist 1 mm. (1 mm für 10 µm Poren, 1,3 mm für 100 kD)

Durch eine weitere Erhöhung oder Verringerung des Faserdurchmessers kann ein Vol.- Verhältnis IR : ER = 1 : 2 bis 1 : 20 erzielt werden. Das Gesamtvolumen von IR und ER beträgt weniger als 1 ml.

Beispiel 2 Endothelzellbarriere

Es konnte in Experimenten festgestellt werden, dass im hier beschriebenen Kultursystem Mikrokapillare Endothelzellen die innere Oberfläche des IR (10 µm Poren) unter Perfusionsbedingungen besiedeln und eine Zellbarriere (Monolayer) in vivo-like ausbilden.

Beispiel 3 Migration/Durchdringung einer Membran

Es konnte erreicht werden, dass im hier beschriebenen Kultursystem Mikrokapillare eine humane, epitheliale Brustkrebszelllinie (MATU) aus dem IR transmembral (10 µm Poren) in den ER expandiert.

Beispiel 4 Gewebekultivierung/-versorgung

Es konnten weiterhin murine Gewebestückchen im ER des hier beschriebenen Kultursystems Mikrokapillare über die kontinuierliche IR-Perfusion (100 kDalton Membran) versorgt und kultiviert werden. Mit einer gezielten Toxinzugabe in den IR konnte ergänzend ein Vitalitätsverlust der Zellen im ER herbei geführt werden.

Beispiel 5 Zellkultivierung/-proliferation

Es konnte außerdem feststellen werden, dass im hier beschriebenen Kultursystem Mikrokapillare eine humane T-Zelllinie (Jurkat) mit geringer Anfangszellzahl im ER durch eine kontinuierliche Versorgung über die IR-Perfusion (100 kDalton Membran) kultiviert und die Zellen um über das Zwanzigfache vermehrt werden.

Bezugszeichenliste

1

+

2

+

3

Zugänge

4

Das Volumen des Ein- und Auslaufbereichs

5

Kulturraum

6

Poröse hohle Kapillare
ER Extrakapillarer Raum
IR Intrakapillarer Raum

Claims (12)

1. Kultursystem Mikrokapillare als Bio-Reaktorsystem zur in vitro-Kultivierung und Simulierung körpereigener Systeme, das aus porösen, mit biologischen Grenzflächen besiedelten polymeren hohlen Fasern, einem intrakapillaren Raum (IR) in einem Kulturraum, dem extrakapillaren Raum (ER), besteht, wobei die modellierenden kapillaren Gefäße innen- und außenseitig von beweglichen Medien umgeben oder durchströmt werden, dadurch gekennzeichnet, dass das Volumenverhältnis von ER zu IR 2 : 1 bis 20 : 1 ist und damit der maximale Abstand der Zellen im ER von der versorgenden Hohlfaser (IR) 0,9 mm beträgt.

2. Kultursystem Mikrokapillare nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die gesamten Zugänge zum intra- und extrakapillaren Raum in einer Ebene mit der hohlen porösen Kapillare liegen.

3. Kultursystem Mikrokapillare nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Zugänge für den intrakapillaren Raum Septen für Kanülen verwendet werden.

4. Kultursystem Mikrokapillare nach Anspruch 1 und 3, dadurch gekennzeichnet, dass als Zugänge für den extrakapillaren Raum Luerkegelverbindungen (ISO 594-1, Luer- Innenkegel) verwendet werden.

5. Kultursystem Mikrokapillare nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Reaktormantel eine Sollbruchstelle senkrecht zur Zugangsebene enthält.

6. Kultursystem Mikrokapillare nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der extrakapilläre Raum eine Quaderform mit abgerundeten Ecken besitzt.

7. Kultursystem Mikrokapillare nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass in der Mitte des extrakapillaren Raumes ein Zugangsport für die Applikation von Wirkstoffen oder zur Einführung von Meßsonden für die Onlinemessung der Prozessparameter direkt und symmetrisch in den extrakapillaren Raum zur Verfügung steht.

8. Kultursystem Mikrokapillare nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Wandung des Kulturraums und die äußere Körperwandung parallel zueinander sind und einen Abstand von weniger als 2 mm besitzen.

9. Kultursystem Mikrokapillare nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass als Grenzflächen biologische Membranen und/oder Zellmonolayer aus biologischen Substanzen wie Zellen, Mikroorganismen, Viren und ihren Bestandteilen, ferner Eiweiße, Lipide, Zucker und deren Einzelbestandteile, oder bioimmitierende Membranen aus biokompatiblen Substanzen mit ähnlichen oder gleichen Bestandteilen eingesetzt werden.

10. Kultursystem Mikrokapillare nach Anspruch 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Zellkulturvolumen im Kultursystem weniger als 1 ml beträgt.

11. Verwendung des Kultursystems Mikrokapillare nach einem der Ansprüche 1 bis 10 zur Simulierung körpereigener biologischer Vorgänge und zur Kultivierung von Säugerzellen und -geweben.

12. Verwendung des Kultursystems Mikrokapillare nach einem der Ansprüche 1 bis 10 als Einwegsystem.