DE10009420A1 - Chemotaxis-Diagnostikum - Google Patents

Abstract

Es wird ein Verfahren zur Bestimmung der Chemotaxis-Aktivität von Granulotyten in einer Probe beschrieben, bei dem man die Expression eines Zelladhäsionsmoleküls bestimmt.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Chemotaxis- Aktivität von Granulozyten in einer Probe sowie ein dafür geeignetes Reagenzienkit. Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Diagnose eines Immundefekts oder/und einer Granulozytenfunktionsstörung.

Ein Säugerorganismus verfügt zur Abwehr von eindringenden Fremdkörpern, wie etwa Mikroorganismen, sowie zur Beseitigen von alten und beschädigten Zellen oder Zelltrümmern über Mechanismen, die zur Auflösung dieser unerwünschten Bestandteile führen. Zunächst erfolgt eine Opsonisierung der Bakterien oder Zellen, wodurch deren Phagozytose durch Leukozyten stimuliert wird. Die zur Phagozytose fähigen Leukozyten bewegen sich gleichzeitig auf den eingedrungenen Fremdkörper zu, ein Vorgang, der als Chemotaxis bezeichnet wird. Die Chemotaxis kann durch ein Konzentrationsgefälle bestimmter Reizstoffe, die mit spezifischen Rezeptoren, sogenannten Chemorezeptoren, erkannt werden, ausgelöst werden. Chemotaktisch wirksame Stoffe bewirken zumeist eine Bewegung in Richtung der höheren Reizstoffkonzentration (postivie Chemotaxis), in seltenen Fällen auch eine Bewegung von ihr weg (negativ Chemotaxis). Dann erfolgt eine Adsorption, d. h. die unerwünschten Bestandteile werden an der Oberfläche der zur Phagozytose befähigten Leukozyten, im wesentlichen Monozyten, Makrophagen und polymorphkernigen Leukozyten, gebunden. Bei der nachfolgenden Phagozytose wird der als fremd erkannte Bestandteil von der Zeile umschlossen und anschließend durch Degradation vernichtet.

Um die Leistung des Immunsystems insgesamt zu beurteilen, müssen Zahl und Funktion der Leukozyten analysiert werden. Die Zählung mit Hilfe eines differenzieren den Hämatologieautomaten gegebenenfalls unter zusätzlichem Einsatz monoklonaler Antikörper ist heute bereits klinische Routine. Allerdings besteht aufgrund der zahlreichen unterschiedlichen Funktionen der Leukozyten im Rahmen der Immunabwehr noch Bedarf, die bestehenden Testmöglichkeiten durch Funktionsanalysen zu ergänzen.

Die erste Linie der Immunabwehr stellen, wie oben erläutert, die phagozytären Zellen dar und ihre Prüfung wurde im Vergleich zur Untersuchung der Lymphozyten bisher weitgehend vernachlässigt. Die in der Literatur beschriebenen Verfahren zur Analyse phagozytärer Leistung, beispielsweise die Auszählung im Mikroskop, sind im klinischen Laboralltag unpraktisch, da sie arbeitsaufwendig und in der Bewertung subjektiv sind. Bei dem sogenannten Boydenkammer-Test müssen die Leukozyten einem Konzentrationsgradienten eines Chemotaxins folgend eine Membran durchwandern. Mikroskopisch ausgewertet wird dann die Entfernung der Wanderungsfront bzw. die Zellen an der Unterseite der Membran. Weiterhin ist im Stand der Technik die Messung des Formwandels von neutrophilen Granulozyten beschrieben, welcher auch zytometrisch sichtbar wird. Aufgrund der mit der Durchführung dieser Tests verbunden Schwierigkeiten war die Untersuchung auf Chemotaxis bisher jedoch Speziallabors vorbehalten.

Darüber hinaus können derzeit nur weit weniger als 50% der klinisch beobachteten Immundefekte im Labor diagnostiziert werden.

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es deshalb, ein Verfahren bereitzustellen, mit welchem weitere Leukozytenfunktionen, insbesondere die Chemotaxis, untersucht werden können.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zur Bestimmung der Chemotaxis-Aktivität von Granulozyten in einer Probe, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man die Expression eines Zelladhäsionsmoleküls bestimmt.

Der Test auf Chemotaxis reiht sich ein in eine Serie anderer Tests, die zur Abklärung der Leukozytenfunktion bei der Frage eines Immundefekts oder einer Immunstimulation notwendig sind. Es wurde festgestellt, dass sich der Phagozytoseprozeß in verschiedene Teilschritte, wie etwa Opsonisierung, Chemotaxis, Adsorption, Phagozytose, Vernichtung und Antigenpräsentation zerlegen läßt. Diese Teilschritte können dann einzeln überprüft werden, wodurch die verschiedenen Funktionen der Leukozyten analysiert und bestimmt werden können.

Die Chemotaxis ist bei Granulozytenfunktionsstörungen relativ häufig betroffen und ist bei etwa 50% der angeborenen Immundefekte beeinträchtigt.

Es wurde nun überraschenderweise festgestellt, daß parallel zur Chemotaxis-Funktion von Granulozyten eine Änderung der Expressiondichte von Zelladhäsionsmolekülen der Granulozyten auftritt. Durch Bestimmung der Expression eines Zelladhäsionsmoleküls kann damit ein für den klinischen Alltag der Laborroutine geeigneter, reproduzierbarer Test bereitgestellt werden, der eine vergleichsweise einfache Quantifizierung der Chemotaxis-Funktion von Granulozyten erlaubt. Das erfindungsgemäße Verfahren ist mit Hilfe der Durchflußzytometrie objektiv quantifizierbar und reproduzierbar.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere zur Bestimmung der Chemotaxis-Aktivität von neutrophilen Granulozyten geeignet. Aufgabe der neutrophilen Granulozyten ist die Beseitigung von eingedrungenen Bakterien und abgestorbenen körpereigenen Zellen durch Phagozytose, meist im Rahmen einer entzündlichen Reaktion.

Zelladhäsionsmoleküle sind Rezeptormoleküle, die auf Oberflächen von Zellen auftreten. Zumeist handelt es sich bei Zelladhäsionsmolekülen um Glykoproteine, die spezifisch an andere Zellen binden oder mit Bestandteilen der extrazellulären Matrix (ECM) in Wechselwirkung treten. Auf Zellen des Immunsystems finden sich insbesondere Zelladhäsionsmoleküle, die für die Adhäsion an Zielzellen verantwortlich sind. Das endotheliale Leukozytenadhäsionsmolekül 1 (ELAM-1) zeigt eine Strukturverwandtschaft mit gewissen Lectinen, dem epidermalen Wachstumsfaktor, und Komplement-Regulationsproteinen aus der Selektin- oder LECCAM- Superfamilie und ist beispielsweise bei der Anheftung von Leukozyten an Entzündungsherde beteiligt.

Bevorzugt wird die Expression eines Zelladhäsionsmoleküls bestimmt, welches eine Lectindomäne umfaßt, insbesondere eines Zelladhäsionsmoleküls ausgewählt aus L-Selektin, CD62, insbesondere CD62L oder CD62b, LECAM-1, Mel-14, LAM-1, Leu-8, TQ1, LEC.CAM-1, DREG56, GMP-140 und ELAM. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die Expression des Zelladhäsionsmoleküls LECAM-1 bestimmt. Die Änderung der Expressionsdichte des Zelladhäsionsmoleküls LECAM ist direkt mit der Chemotaxis-Aktivität von neutrophilen Granulozyten korreliert. Je höher die Chemotaxis-Aktivität der Granulozyten ist, desto geringer ist die Expressionsdichte des Zelladhäsionsmoleküls an der Zelloberfläche der Granulozyten. Deshalb wird in einer bevorzugten Ausführungsform die mit der Steigerung der Chemotaxis-Aktivität einhergehende Abnahme der Expressionsdichte eines Zelladhäsionsmoleküls, insbesondere LECAM, an der Zelloberfläche der Granulozyten bestimmt.

Zur Bestimmung der Expression wird bevorzugt ein für das Zelladhäsionsmolekül spezifisches Bindemolekül, insbesondere ein spezifischer Antikörper, verwendet. Die Expression kann dann durch geeignete Markierungsgruppen, wie etwa Fluoreszenzmarkierungen, Latexbeads, Enzymmarkierungen oder ähnliches, sichtbar gemacht werden.

Es können sowohl direkte als auch indirekte Markierungen verwendet werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Probe mit einem Chemotaxis-Stimulans vorinkubiert. Bevorzugt wird als Chemotaxis-Stimulas ein chemotaktisches Peptid zur Stimulierung von Granulozyten verwendet. Geeignete chemotaktische Peptide sind beispielsweise Peptide, die einen N- terminalen N-Formyl-Rest aufweisen, insbesondere Peptide ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus fMLP (N-Formyl-Met-Leu-Phe) oder Strukturanaloga davon, z. B. N-Formyl-Met-Leu-Phe-Benzylamid, N-Formyl- Met-Leu-Phe-Methylester, N-Formyl-Met-Leu-Phe-Phe, N-Formyl-Met-Phe und N-Formyl-NorLeu-Leu-Phe. Besonders bevorzugt wird als Chemotaxis- Stimulans fMLP eingesetzt. Die Endkonzentration des Chemotaxis- Stimulans, insbesondere eines chemotaktischen Peptids, in der Probe beträgt bevorzugt 10^-9 bis 10^-5 Mol/l, bevorzugt 10^-8 bis 10^-6 Mol/l, insbesondere etwa 5 × 10^-8 Mol/l. Bevorzugt erfolgt die Inkubation mit dem Chemotaxis-Stimulans bei einer Temperatur von 20 bis 50°C, insbesondere 30 bis 40°C, besonders bevorzugt etwa 36 bis 38°C für 2 bis 120 Minuten, vorzugsweise 5 bis 60 Minuten, insbesondere 10 bis 30 Minuten und besonders bevorzugt etwa 20 Minuten. Es ist auch möglich, das erfindungsgemäße Verfahren in mehreren parallelen Ansätzen mit verschiedenen Inkubationszeiten oder/und bei verschiedenen Inkubationstemperaturen durchzuführen, so daß eine Zeitkinetik gemessen werden kann, die weitere Aussagen über die Chemotaxis-Aktivität zuläßt.

Die Auswertung der Bestimmung der Expression des Zelladhäsionsmoleküls kann mit geeigneten Verfahren, etwa einem Durchflußzytometer, einem Bildanalysesystem (z. B. auf Mikroskopbasis) oder in einem Spektralfluorimeter (auch für Mikrotiterplatten geeignet) durchgeführt werden. Vorzugsweise erfolgt die Bestimmung in einem Durchflußzytometer, was eine objektiv quantifizierbare und reproduzierbare Auswertung ermöglicht.

Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß die Chemotaxis-Aktivität sowohl in einer aufbereiteten als auch in einer nicht aufgereinigten Körperflüssigkeit, insbesondere in Vollblut, gemessen werden kann. Dadurch kann die Meßgenauigkeit weiter erhöht werden, da Aufreinigungs- bzw. Aufbereitungsschritte nicht zwingend erforderlich sind. Zur Bestimmung der Chemotaxis-Aktivität wird als Probe bevorzugt Vollblut und insbesondere heparinisiertes Vollblut verwendet.

Es ist aber auch möglich, eine aufbereitete Körperflüssigkeit, bevorzugt ein Leukozyten-reiches Plasma, zu verwenden.

Als Probe wird insbesondere eine Körperflüssigkeit von Säugern, bevorzugt eine humane Probe, eingesetzt.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung der Chemotaxis-Aktivität kann vorteilhaft mit weiteren Verfahren zur Bestimmung von Leukozyten- Funktionen kombiniert werden. Auf diese Weise können weitere analytische oder/und diagnostische Informationen erhalten werden.

Beispielsweise kann weiterhin eine Form- oder/und Größenbestimmung der Granulozyten auf herkömmliche Weise erfolgen. Die Form- oder/und Größenänderung der Granulozyten wird bevorzugt in einem Durchflußzytometer bestimmt.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Granulozyten nach einer Inkubation mit einem Chemotaxis- Stimulans durch eine poröse Membran geleitet. Bevorzugt wird eine poröse Membran mit einem definierten Öffnungsdurchmesser verwendet.

Dadurch kann auch die Zahl von durch eine poröse Membran gewanderten Granulozyten bestimmt werden. Die Zellzählung wird bevorzugt durch Zugabe von Latexbeads in einem Durchflußzytometer durchgeführt.

Bevorzugt werden parallel mit steigender Sensitivität die Formänderung, die Abnahme der Expressionsdichte eines Zelladhäsionsmoleküls, insbesondere LECAM, und die Zahl der durch die Membran gewanderten Granulozyten gemessen.

Unabhängig von der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es vorteilhaft, zur Kontrolle immer eine Probe eines gesunden Probanden mitzuführen.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Reagenzienkit zur Bestimmung der Chemotaxis-Aktivität von Granulozyten, welcher dadurch gekennzeichnet ist, daß er einen spezifischen Bindepartner zum Nachweis der Expression eines Zelladhäsionsmoleküls sowie ein Chemotaxis-Stimulans enthält. Bevorzugt liegen die beiden Komponenten physikalisch getrennt voneinander vor. Die Komponenten des Reagenzienkits können z. B. fertige Lösungen sein oder auch Lyophilisate darstellen, aus denen der Anwender die Lösungen erst herstellt. Der Reagenzienkit kann weiterhin übliche Puffer und Hilfsstoffe umfassen.

Bevorzugt ist der in dem Reagenzienkit enthaltene spezifische Bindepartner ein Antikörper gegen das Zelladhäsionsmolekül, insbesondere ein Antikörper gegen den Cluster CD62b. Der Reagenzienkit kann weiterhin eine direkte oder indirekte Markierung, insbesondere eine Fluoreszenzmarkierung, enthalten.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Diagnose eines Immundefekts oder/und einer Granulozytenfunktionsstörung, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man die Chemotaxis-Aktivität von Granulozyten in einer Probe aus dem Patienten durch das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung der Chemotaxis-Aktivität bestimmt und in einem weiteren Ansatz die Chemotaxis-Aktivität einer negativen Kontrollprobe bestimmt und das Vorhandensein oder die Abwesenheit eines Immundefekts oder/und einer Granulozytenfunktionsstörung durch Vergleich der erhaltenen Werte ermittelt. Granulozytenfunktionsstörungen manifestieren sich z. B. in rezidivierenden Hautabszessen oder Wundheilungsstörungen.

Zur Diagnose eines Immundefekts oder/und einer Granulozytenfunktionsstörung kann das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung der Chemotaxis-Aktivität sowie der erfindungsgemäße Reagenzienkit ebenfalls eingesetzt werden.

Fig. 1 zeigt die verschiedenen Schritte des Phagozytoseprozesses.

Fig. 2 zeigt eine schematische Darstellung des erfindungsgemäßen Chemotaxis-Tests.

Fig. 3 zeigt die mit einem Durchflußzytometer erhaltenen Ergebnisse.

Fig. 3A zeigt die Negativkontrolle mit PBS, während Fig. 3B einen Ansatz mit 5 × 10^-8 MfMLP zeigt. Es ist eine Verringerung der Oberflächenexpression des Zelladhäsionsmoleküls LECAM-1 um etwa eine Größenordnung zu sehen. Die Zellzahl der neutrophilen Granulozyten (Region R2) wird in Relation zur konstanten Zahl von Beads (R1) gezeigt, wobei hier bei Stimulation (Fig. 3B) eine deutliche Erhöhung der durch die Membran gewanderten Zellen zu sehen ist.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert.

Beispiel 1 Granulozyten-Funktionstest auf Chemotaxis aus Leukozyten-reichem Plasma 1.1 Anreicherung

1 ml Ficoll (Ficoll-Trennmedium, Firma Seromed, Bestell-Nr. L6113 (endotoxinarm)) wird in einem Eppendorf-Gefäß vorgelegt und 1 ml frisches (maximal 8 Stunden alt) Heparin-Vollblut (endotoxinarmes Heparin) wird vorsichtig bei Raumtemperatur überschichtet. Man läßt den Ansatz so lange bei Raumtemperatur stehen, bis eine deutliche Phasentrennung zu beobachten ist. Nach einer Spontansedimentation von etwa 40 Minuten bei Raumtemperatur verbleiben die Leukozyten und Thrombozyten über der Ficoll-Phase, während die Erythrozyten nach unten sedimentiert sind. Das Absinken der Erythrozyten tritt nach ca. 30 bis 40 Minuten recht plötzlich ein. Wird eine ältere Blutprobe, beispielsweise eine Blutprobe vom Vortag, verwendet, dauert der Sedimentationsvorgang wesentlich länger.

Ca. 500 µl der die obere Phase bildenden Zellsuspension werden abgenommen und gegebenenfalls auf Eis gelagert. Bei dieser Phase handelt es sich um ein Leukozyten-reiches Plasma (LRP).

1.2 Stimulation und Chemotaxis

In einer Lochplatte (beispielsweise eine 24-Loch-Platte) werden pro Patient als Negativkontrolle 350 µl PBS (phosphatgepufferte Salzlösung ohne Calcium und Magnesium; z. B. Firma Biochrom, Berlin) und für den Ansatz 350 µl 5 × 10^-8 M fMLP (hergestellt aus einer 10^-3 M Stammlösung, 1 : 20.000 vorverdünnt in PBS) vorgelegt. Zur Erhöhung der Genauigkeit sind mindestens zwei Ansätze pro Patient zu empfehlen. Daneben sollte zur Verbesserung der Testergebnisse neben dem Patienten ein gesunder Kontrollproband mitangesetzt werden.

In jedes Loch der Lochplatte wird eine Membran eingesetzt und auf diese je 100 µl der unter 1.1 erhaltenen Zellsuspension eingefüllt. Als Membran werden bevorzugt Zellkulturinserts mit definierter Porengröße verwendet. Die Zellsuspension kann beispielsweise mittels Pipette eingefüllt werden.

Zur Stimulation wird 20 Minuten im Wasserbad bei 37°C inkubiert. Dann werden die Zellen, die durch die Membran gewandert sind, geerntet. Dazu werden die Inserts abgeklopft, herausgenommen und die Zellsuspension in FACS-Röhrchen überführt. Die Röhrchen können zur Lagerung auf Eis gestellt werden.

1.3 Markierung

Zu den transferierten Zellen wird 10 µl des monoklonalen Antikörpers LECAM-1 FITC (Immunotech, Bestell-Nr. 1231) zugegeben und das Gemisch gevortext. Anschließend erfolgt eine Inkubation für 15 Minuten bei 4°C auf Eis.

1.4 Messung

Der Lösung werden 20 µl LDS (Laserfarbstoff LDS 751, Firma Exiton oder Styryl 8, Firma Lambda Physik, Göttingen; zum Ausschluß der Erythrozyen, 1 mg/ml, vorverdünnt 1 : 50 in PBS) zugegeben. Parallel werden Zellpartikel (Calibrite Eichpartikel, Becton Dickinson, Bestell Nr. 349502) mindestens 20 Sekunden gevortext und dem Ansatz 10 µl Zellpartikellösung zugegeben. Anschließend wird für ca. 10 Minuten inkubiert. Die Messung erfolgt danach am FACScan, wobei die Stabilität der Meßprobe mindestens 2 Stunden auf Eis im Dunkeln beträgt. Die Messung wird nach Aufnahme von jeweils 1.000 bzw. 2.000 Latexpartikeln gestoppt. Die Messung am FACScan entspricht weitgehend der Vorgehensweise bei einer Immunfluoreszenzmessung zur Lymphozytentypisierung. Als Sheatriflüssigkeit wird FACS-Flow (Firma Becton Dickinson, Bestell Nr. 342003) oder eine andere Trägerflüssigkeit mit niedriger Eigenfluoreszenz verwendet. Die Verstärker- und Kompensationseinstellung erfolgt mit ungefärbten, FITC- und PE-gefärbten Mikropartikeln (Beads) über Autocomp- Software oder manuell. Es werden die PMT-Spannungen verändert. Die ungefärbten Beads liegen vom Nullkanal getrennt in der ersten Dekade und die FITC- bzw. PE-gefärbten Beads liegen jeweils auf ca. Mitte der Skala (Kanal 100). Die Eichung und Qualitätskontrolle für Fluoreszenzmessungen (Intensität pro Zelle) wird mit den Calibrites durchgeführt. Die Datenaufnahme und die Auswertung erfolgen mit dem CellQuest-Programm. Zur Auswertung wird ein Fenster um die Granulozytenpopulation gesetzt.

Die Marker werden so gesetzt, daß die Auswerteregion den Bereich innerhalb der halbmaximalen Gipfelwerte einschließt. Weiterhin wird der Mittelwert des FSC der Granulozyten in der Darstellung SCC vs FSC betrachtet.

Eine zweite Region wird zur Zählung der Zellen um die Zellpartikel gesetzt und so lange aquiriert, bis hier 1.000 bzw. 2.000 Ereignisse genommen sind. Die Anzahl der Granulozyten in der PBS-Kontrolle und dem fMLP- Ansatz kann dann direkt miteinander verglichen werden.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die Fluoreszenzintensität bewertet, d. h. es wird eine quantitative Immunfluoreszenz gemessen.

Beurteilt wird die Verringerung der LECAM-1-Fluoreszenz im fMLP-Ansatz im Vergleich zum PBS-Ansatz beim Patienten und einem gesunden Kontrollprobanden sowie die Zunahme des FSC-Signals (vgl. Fig. 3).

Beispiel 2 Chemotaxis-Test in Vollblut

Zur Durchführung der Bestimmung der Chemotaxis-Aktivität von Granulozyten in Vollblut wird das oben angegebene Protokoll folgendermaßen abgeändert:

Lithium-Heparinblut wird auf Eis gekühlt, um eine Voraktivierung der Granulozyten zu verhindern. In ein FACS-Röhrchen werden je Ansatz 100 µl Vollblut pipettiert. Zur Vollblutprobe werden dann 20 µl einer fMLP- Lösung (Vorverdünnung 1 : 5.000) oder 20 µl RPMI-Medium bzw. HBSS- Puffer (NH₄Cl-Lyselösung (10 × Stammlösung in 1 l Aqua bidest 89,9 NH₄Cl, 10,0 g KHCO₃, 370,0 mg EDTA) als Negativkontrolle gegeben. Die Proben werden auf einem Vortexmischer kurz gemischt. Anschließend werden die Proben bei 37°C 15 Minuten im Wasserbad inkubiert. Dann werden die Proben zum Abstoppen der Reaktion auf Eis gestellt. Es erfolgt die Zugabe von je 10 µl LECAM-1-FITC. Nach guter Durchmischung (Fortexen) werden die Proben im Eiswasserbad 15 Minuten unter Lichtausschluß inkubiert. Danach erfolgt die Zugabe von je 3 ml NH₄Cl- Lyselösung (HBSS (Hanks gepufferte Kochsalzlösung; z. B. von Life Technologies, Katalog Nr. 24020)). Die Proben werden auf dem Fortexmischer gemischt und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Danach werden die Proben zweimal mit RPMI-Medium bzw. HBSS-Puffer durch Zentrifugation (5 Minuten, 250 × g) gewaschen. Danach erfolgt eine Zugabe von je 20 µl LDS und eine Inkubation von 5 Minuten auf Eis. Die Bestimmung der Abnahme der LECAM-1-Fluoreszenz und die Zunahme des FSC-Signals erfolgt mittels durchflußcytometrischer Messung.

Claims (29)

1. Verfahren zur Bestimmung der Chemotaxis-Aktivität von Granulozyten in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, daß man die Expression eines Zelladhäsionsmoleküls bestimmt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Chemotaxis-Aktivität von neutrophilen Granulozyten bestimmt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Expression eines Zelladhäsionsmoleküls bestimmt, welches eine Lectindomäne umfaßt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Zelladhäsionsmolekül ausgewählt wird aus L-Selektin, CD62L, LECAM-1, Mel-14, LAM-1, Leu-8, TQ1, LEC.CAM-1, DREG56, GMP-140 und ELAM.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Expression des Zelladhäsionsmoleküls LECAM-1 bestimmt wird.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die mit der Chemotaxis-Aktivität einhergehende Abnahme der Expressionsdichte des Zelladhäsionsmoleküls an der Zelloberfläche der Granulozyten bestimmt wird.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zur Bestimmung der Expression ein für das Zelladhäsionsmolekül spezifisches Bindemolekül verwendet wird.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die Probe mit Chemotaxis-Stimulans vorinkubiert.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß als Chemotaxis-Stimulans fMLP verwendet wird.

10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die Bestimmung in einem Durchflußzytometer durchführt.

11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zum Nachweis eine Fluoreszenzmarkierung eingesetzt wird.

12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als Probe Vollblut verwendet wird.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß als Probe heparinisiertes Vollblut verwendet wird.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß als Probe Leukozyten-reiches Plasma verwendet wird.

15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe eine Humanprobe ist.

16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß weiterhin eine Form- oder/und Größenbestimmung der Granulozyten erfolgt.

17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Granulozyten nach einer Inkubation mit einem Chemotaxis- Stimulans durch eine poröse Membran geleitet werden.

18. Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Form- oder/und Größenänderung der Granulozyten in einem Durchflußzytometer bestimmt wird.

19. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß weiterhin die Zahl von durch eine poröse Membran gewanderter Granulozyten bestimmt wird.

20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellzählung durch Zugabe von Latexbeads in einem Durchflußzytometer durchgeführt wird.

21. Reagenzienkit zur Bestimmung der Chemotaxis-Aktivität von Granulozyten, dadurch gekennzeichnet, daß er einen spezifischen Bindepartner zum Nachweis der Expression eines Zelladhäsionsmoleküls sowie ein Chemotaxis-Stimulans enthält.

22. Reagenzienkit nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß der spezifische Bindepartner ein Antikörper gegen das Zelladhäsionsmolekül ist.

23. Reagenzienkit nach Anspruch 21 oder 22, dadurch gekennzeichnet, daß ein Antikörper gegen den Cluster CD62b enthalten ist.

24. Reagenzienkit nach einem der Ansprüche 21 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß er eine direkte oder indirekte Markierung enthält.

25. Reagenzienkit nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß die Markierung eine Fluoreszenmarkierung ist.

26. Reagenzienkit nach einem der Ansprüche 21 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß er weiterhin übliche Puffer, Hilfs- oder/und Zusatzstoffe enthält.

27. Verfahren zur Diagnose eines Immundefekts oder/und einer Granulozytenfunktionsstörung, dadurch gekennzeichnet, daß man die Chemotaxis-Aktivität von Granulozyten in einer Probe aus dem Patienten durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20 bestimmt und in einem weiteren Ansatz die Chemotaxis- Aktivität einer negativen Kontrollprobe bestimmt und das Vorhandensein oder die Abwesenheit eines Immundefekts oder/und einer Granulozytenfunktionsstörung durch Vergleich der erhaltenen Werte ermittelt.

28. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 20 zur Diagnose eines Immundefekts oder/und einer Granulozytenfunktionsstörung.

29. Verwendung eines Reagenzienkits nach einem der Ansprüche 21 bis 26 bei der Diagnose eines Immundefekts oder/und einer Granulozytenfunktionsstörung.