DE60002466T2

DE60002466T2 - Quantifizierungsverfahren für endotheliale mikroteilchen

Info

Publication number: DE60002466T2
Application number: DE60002466T
Authority: DE
Inventors: Michel Canton; Françoise DIGNAT-GEORGE
Original assignee: Biocytex SRL
Current assignee: Biocytex SRL
Priority date: 1999-07-01
Filing date: 2000-06-30
Publication date: 2004-04-01
Anticipated expiration: 2020-07-01
Also published as: WO2001002835A1; ES2193095T3; DE60002466D1; FR2795820A1; EP1192443A1; DK1192443T3; ATE239221T1; EP1192443B1

Description

Die Erfindung betrifft ein Monoreagens und einen dieses umfassenden diagnostischen Kit, welche für die Detektion und die Quantifizierung von Mikroteilchen endothelialen Ursprungs in einer Plasmaprobe durch Durchflusszytometrie bestimmt sind. Das Monoreagens umfasst eine Mischung von für Membranmoleküle der Endothelzellen spezifischen monoklonalen Antikörpern, wobei die Mischung einen mit einem Fluorochrom 1 markierten Antikörper (1) und einen mit einem Fluorochrom 2 markierten Antikörper (2) umfasst, wobei die Antikörper (1) und (2) nicht die gleiche Spezifität aufweisen, und vier Populationen von Mikrokugeln, welche jeweils dazu dienen, den Analysenbereich zu definieren, den minimalen Intensitätsschwellenwert zu definieren, bzw. die Zählung der Mikroteilchen erlauben. Die Erfindung erstreckt sich gleichfalls auf ein Verfahren zur Quantifizierung von Mikroteilchen endothelialen Ursprungs, welches das Monoreagens und den Kit einsetzt.
Unter der Einwirkung von bestimmten Stimuli, wie Zytokinen, Interleukinen oder infektiösen Mitteln produziert die Plasmamembran der Endothelzellen Mikrovesikel. Dieses Granulationsoder Knospungsphänomen der Membran könnte eine größere katalytische Oberfläche für den Zusammenbau des enzymatischen Prothrombin-Komplexes, welcher ein essentieller Schritt der Gerinnungskaskade, welche Thrombin, das Schlüsselenzym der Fibrinbildung, erzeugt, ist, exponieren. Die Existenz von Mikrovesikeln endothelialen Ursprungs und folglich von Markern für eine endotheliale Aktivierung oder eine endotheliale Erkrankung könnte eine Ursache oder eine Folge von akuten oder chronischen Gefäßläsionen sein.
Eine Untersuchung, auf der Grundlage von welcher die Erfindung vollendet worden ist, hat gezeigt, dass endotheliale Mikro teilchen (EMP) im peripheren menschlichen Blut vorhanden sind (Combes, V, et al., 1. Juli 1999. Endothelial microparticules: induction by TNF in vitro and possible implications for dissemination for prothrombotic activity in patients with lupus anticoagulant; The Journal of Clinical Investigation; Band 104, Nr. 1, welche unter Bezugnahme in die Beschreibung aufgenommen wird).
Tatsächlich wurden zum ersten Mal EMP in hoher Konzentration im Plasma von Patienten, welche ein Lupusantikoagulans (LA) aufweisen, nachgewiesen. Es wurde festgestellt, dass bei diesen Patienten die abnormale Gerinnung stark mit Thromboserisiken verbunden ist (Harris E., Pierangeli S., Gharavi A. E., 1998. Diagnosis of the antiphospholipid syndrome: a proposal for use of laboratory tests. Lupus 7: 5144–5148; und Whal, D. G., Guillemin F., de Maistre E., Perret C., Lecompte T. und Thibaut G, 1997. Risk for venous thrombosis related to antiphospholipid antibodies in systemic lupus erythematosus – A meto-analysis. Lupus 6: 467–473; welche in die Beschreibung unter Bezugnahme aufgenommen wird.
In Combes et al., 1999, wurde die Quantifizierung der EMP durch Durchflusszytometrie ausgeführt, wie folgt: Suspensionen, welche 10⁵ Zellen oder durch 10⁶ Zellen produzierte Mikroteilchen enthielten, wurden durch ein Coulter^TM Epix^TM XL (Coultronics, Frankreich, Margency) analysiert. Die Mikroteilchen wurden definiert, dass sie Elemente mit einem Durchmesser von unter 1,5 μm waren, und mit spezifischen Antikörpern markiert. Die Anzahl von Teilchen wird ausgewertet, indem mit FITC-Annexin V markierte Antikörper eingesetzt werden, wie zuvor in Jy, W., Horstman, L. L., Arce M. und Ahn U.S. 1992. Clinical significance of platelet microparticles in autoimmune thrombocytopenias, J. Lab. C1in. Med. 119: 334–345, welche in die Beschreibung unter Bezugnahme aufgenommen wird, beschrieben. Kalibrierte Latex-Kügelchen (Sigma) wurden als Standard verwendet und es wurde zu jeder Probe eine bekannte Anzahl von Kügelchen zugesetzt.
Die Veröffentlichung Combes et al. zeigt, dass im Plasma von Patienten, die die Symptome einer Thrombose aufweisen, eine signifikant höhere Anzahl von EMP als im Plasma von symptomlosen Patienten vorhanden ist.
Die Technik der Durchflusszytometrie ist den Fachleuten auf diesem Gebiet wohlbekannt und wird für die Quantifizierung und die Unterscheidung von Zellen und von Mikrovesikeln geläufig eingesetzt. Man kann beispielsweise die Methode aufführen, die darauf abzielt, die von Plättchen abgeleiteten Mikrovesikel im Plasma zu quantifizieren, wie in Combes et al., 1997. A new flow cytometry method of platelet-derivated microvesicule quantitation in Plasma. Thrombosis and Haemostasis 77 (1) Seite 8, beschrieben. Gleichwohl beschreibt diese Veröffentlichung kein Verfahren für den Nachweis und die Quantifizierung von endothelialen Mikroteilchen, welches in einer Doppelmarkierung besteht und unterschiedliche Populationen von Mikrokugeln einsetzt.
V. Latger et al., Journal des maladis vasculaire, Band 24, Nr. 1, Februar 1999 (1999-02), Seiten 11–18, beschreiben ein Monoreagens, welches eine Mischung von für die Membranmoleküle der Endothelzellen spezifischen monoklonalen Antikörpern, wobei die genannten Antikörper nicht die gleiche Spezifität aufweisen, und eine Mischung von Mikrokugeln, welche umfasst:

– eine Population A von mit einem Fluorochrom markierten Mikrokugeln,
– eine Population von Mikrokugeln B, deren Anzahl bekannt ist, umfasst.

Beschreibung
Die Erfindung betrifft eine Perfektionierung und eine Anpassung der in Combes et al. eingesetzten Technik für die Quantifizierung der EMPs im Plasma. Das Verfahren, welches Gegenstand der Erfindung ist, besteht in einer Doppelmarkierung, welche nicht nur erlaubt, das Signal zu verstärken, sondern gleichfalls das Verhältnis zwischen zwei Markern zu berechnen und so den physiologischen Zustand der Patienten zu verfolgen.
Ein erster Aspekt der Erfindung bezieht sich auf ein Monoreagens für den Nachweis und die Quantifizierung von Mikroteilchen endothelialen Ursprungs in einer Plasmaprobe durch Durchflusszytometrie, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es eine Mischung von für Membranmoleküle der Endothelzellen spezifischen monoklonalen Antikörpern, wobei die Mischung einen mit einem Fluorochrom 1 markierten Antikörper (1) und einen mit einem Fluorochrom 2 markierten Antikörper (2) umfasst, wobei die Antikörper (1) und (2) nicht dieselbe Spezifität aufweisen, und eine Mischung von Mikrokugeln, umfassend:

– eine mit einem Fluorochrom markierte Population A von Mikrokugeln (Eichprobe), die dazu dient, den Analysenbereich der Mikroteilchen in Hinblick auf die Größe (Lichtdiffusionsparameter) zu definieren, und deren Differenzierung erlaubt,
– eine Population von Mikrokugeln B (Eichprobe), deren Anzahl bekannt ist und die der Zählung der Mikroteilchen dient,
– eine einzig mit dem Fluorochrom 1 markierte Population von Mikrokugeln C, die dazu dient, hinsichtlich des Fluoreszenzparameters des Fluorochroms 1 den minimalen Intensitätsschwellenwert, der die mit den Fluorochrom-1-Antikörpern markierten Mikroteilchen charakterisiert, zu definieren,
– und eine Population von Mikrokugeln D mit identischem Durchmesser wie C und einzig mit dem Fluorochrom 2 markiert, die dazu dient, den Analysenbereich der hinsichtlich des Fluorochroms 2 als positiv angesehenen Ereignisse zu definieren, umfasst.

Ein solches Monoreagens erlaubt die Doppelfarbmarkierung der endothelialen Mikroteilchen dergestalt, dass die Differenzierung zwischen diesen Mikroteilchen und deren Äquivalent, insbesondere deren Plättchen-Äquivalent, optimiert wird. Es erlaubt gleichfalls die Standardisierung der Unterscheidungsschwellenwerte der endothelialen Mikroteilchen von den anderen Teilchen und Zelltrümmern, die für ein Hintergrundrauschen verantwortlich sein können, und die Standardisierung der Zählung der endothelialen Mikroteilchen bezogen auf die vorstehend erwähnten Eichprobe-Mikrokugeln.
Das Monoreagens umfasst vorteilhafterweise eine Mischung von monoklonalen Antikörpern, die insbesondere ausgewählt werden unter CD51-PE (Marker für Vitronectin, bezeichnet gleichfalls als alpha V beta 3, Klon AMF7, Immunotech, Marseille, Frankreich), CD9-PE (Klon SN4/C3-3A2, Alexis Corporation), CD34-PE (Klon 43.Al, Alexis Corporation), CD146-FITC (Klon S-Endo 1, COM2F6 oder COM3D9, Biocytex). Selbstverständlich kann ein jeglicher äquivalenter Antikörper, der aus einer anderen Quelle stammt, eingesetzt werden, um die Erfindung auszuführen. Es werden vorzugweise die Antikörper anti-CD51 und anti-CD14b eingesetzt.
Bei einer vorteilhaften Ausführungsweise haben die Mikrokugeln A einen Durchmesser zwischen 0,5 und 1 μm, vorzugsweise 0,8 μm und die Mikrokugeln B und C haben einen Durchmesser zwischen 2 und 10 μm, vorzugsweise 3 μm, Der Durchmesser der Mikrokugeln C und D kann sich von jenem der Kugeln B dergestalt unter scheiden, dass die Populationen C + D auf einfache Weise durch die Lichtdiffusionsparameter von der Population B getrennt werden. Der Durchmesser der Mikrokugeln B, C und D kann auch identisch sein. Die Populationen C und D können in einem relativen Anteil oder Verhältnis von 1/3 bis 2/3, vorzugsweise 1/2 vorhanden sein.
Die folgenden Materialien können als fester Träger eingesetzt werden:
Die organischen Polymere, wie die Polysaccharide, die Styrol-Polymere, die Polyacrylate, Polyacrylamid, die Hydroxyethylpolymethacrylate, die Polyvinyle, die Polystyrole und die Polymere, die aromatische Gruppen enthalten. Der bevorzugte feste Träger ist auf Basis von Latex.
Die Fluorochrome werden vorzugsweise insbesondere unter Phycoerythrin und FITC (Fluoresceinisothiocyanat) ausgewählt. Nichtsdestoweniger kann man gleichfalls Duochrom, Allophycocyanin, PE-Tandem, Ultralite 700 und Texas red aufführen (diese Fluorochrome sind im Handel erhältlich).
Ein zweiter Aspekt der Erfindung hat einen diagnostischen Kit zum Gegenstand, welcher ein Monoreagens, wie oben definiert, umfasst, der für den Nachweis und die Quantifizierung von endothelialen Mikroteilchen in menschlichem Plasma bestimmt ist. Dieser diagnostische Kit kann außerdem eine Negativkontroll-Referenzprobe umfassen, die aus einem Pool von normalen plättchenarmen menschlichen Plasmas stammt, wobei die Probe in flüssiger oder lyophilisierter Form vorliegt.
Ein ergänzender Aspekt der Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Quantifizierung von endothelialen Mikroteilchen im Blut, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte umfasst:

a) Herstellung von plättchenarmem Plasma durch Zentrifugation und Mikrofiltration,
b) Inkubation des Plasmas mit einem erfindungsgemäßen Monoreagens dergestalt, dass eine Doppelfarbmarkierung der Mikroteilchen erhalten wird,
c) Unterscheidung und Zählung der Mikroteilchen durch Durchflusszytometrie.

Die folgenden Veröffentlichungen und Patente geben die Gesamtheit der Grundlagen betreffend die Technik der Analyse durch Durchflusszytometrie wieder und werden in die Beschreibung durch Bezugnahme aufgenommen:

– McHugh, T. M., „Flow Cytometry and the Application of Microsphere-Based Fluorescence Immunoassays", Immunochemica, Band 5 (1991).
– Shapiro, H. M., Practical Flow Cytometry, Kap.7, S. 115–198 (1988).
– Gosling, „A Decade of Development in Immunoassay Methodology, Clin. Chem., Band 36, 5. 1408–1427 (1990).
– Sigma, Katalog Immunochemicals, S. 285 (1992).
– Cappel Product Guide (1991).
– Bangs, „Latex Agglutination Tests", Am. Clinical Lab. News Edition (1988).
– Cantarero et al., „The Adsorptive Characteristics of Proteins for Polystyrene and Their Significance in solid-Phase Immunoassays", Analytical Biochemistry, Band 105, S. 375–382 (1980).
– Wilson et al., „A New Microsphere-based Immunofluorescence Assay using Flow Cytometry", J. Immuno. Meth., Band 107, S. 225–230 (1988).
– Bangs, „Microsphere-Based Tests and Immunoassays for Fun and Profit", Bangs Laboratories Seminar (1991).
– Rhone-Poulenc, „Estapor-brand Microspheres", Bangs Laboratories Technical Reference #21.
– Walker et al. (Hrsg)., Techniques in Molecular Biology, S. 113–135 und 273–283 (1982).
– Fulwyler et al., „Flow Microsphere Immunoassay for the Quantitative and Simultaneous Detection of Multiple Soluble Analytes", Methods in Cell Biology, Band 33, S. 613– 619 (1990).
– US 4,499,052 ; US 4,526,276 ; US 4,717,655 ; US 4,859,584 ; US 4,783,401 und US 4,762,701 , WO 98/21593 und US 5,567,627, insbesondere Seite 8 bis Seite 14.

Das plättchenarme Plasma kann durch doppelte Zentrifugation und Filtration durch Millipore 1 μm oder durch eine jegliche äquivalente Methode erhalten werden. Man führt vorzugsweise eine erste Zentrifugation während 10 bis 15 min zwischen 2 und 18°C und bei etwa 1500 G aus, man nimmt den dekantierten Überstand wieder auf, dann führt man eine zweite Zentrifugation unter den gleichen Bedingungen aus.
Ein ergänzender Aspekt der Erfindung bezieht sich auf die Verwendung eines vorstehend erläuterten Monoreagens oder eines vorstehend erläuterten Kits für den Nachweis von prokoagulierenden Aktivitäten während thrombotischer oder prothrombotischer Erkrankungen, wie den Lupusantikoagulantien, und/oder für den Nachweis von akuten oder chronischen Gefäßläsionen.
Beispiele 1: Bevorzugte Merkmale der Mikrokugeln
Das Monoreagens umfasst zusätzlich zu den für die einen durch ein Fluorochrom 1 (z. B. FITC) und für die anderen durch ein Fluorochrom 2 (z. B. Phycoerythrin) markierten Antikörpern 4 Populationen von Mikrokugeln.
Diese 4 Populationen von Mikrokugeln spielen bei der zytometrischen Analyse der Probe die folgenden speziellen Rollen:

a) Eine Population von Mikrokugeln A (μS A) mit einem Durchmesser zwischen 0,5 und 1 μm, vorzugsweise 0,8 μm, dient dazu, den Analysenbereich der Mikroteilchen in Hinblick auf die Größe (Lichtdiffusionsparameter / „Scatters") zu definieren. Diese Mikrokugeln A tragen vorzugsweise ein Fluorochrom, das deren einfache Unterscheidung innerhalb der biologischen Probe erlaubt.
b) Eine Population von Mikrokugeln B (μS B) mit einem Durchmesser zwischen 2 und 10 μm, vorzugsweise 3 μm, und deren absolute Anzahl in dem Test perfekt bekannt ist, dient der absoluten Zählung der in der Probe enthaltenen Mikroteilchen.
c) Eine einzig mit dem Fluorochrom 1 markierte Population von Mikrokugeln C (μS C) mit einem Durchmesser zwischen 2 und 10 μm dient dazu, hinsichtlich des Fluoreszenzparameters 1 den minimalen Intensitätsschwellenwert, der die mit den Fluorochrom-1-Antikörpern markierten Mikroteilchen charakterisiert, zu definieren.
d) Eine Population von Mikrokugeln D (μS D) mit identischem Durchmesser wie C und einzig mit dem Fluorochrom 2 markiert, dient dazu, den Analysenbereich der hinsichtlich des Fluorochroms 2 als positiv angesehenen Ereignisse zu definieren.

Der Durchmesser der Mikrokugeln C und D wird vorzugsweise so ausgewählt, dass er verschieden ist von jenem der Kugeln B, um durch die Scatter auf einfache Weise die Populationen C + D von der Population B zu trennen (z. B. C und D = 5 μm und B = 3 μm). Man kann aber auch bevorzugen, B, C und D von gleicher Größe (z. B. B = C = D = 3 μm) zu kombinieren und die hinsichtlich der Größe homogene Gesamtheit (B + C + D) für die Funktionen von Zählung und Regulierung der Fluoreszenzen einzusezen.
Die Populationen C und D sind in der Mischung in einem relativen Anteil oder Verhältnis von 1/3 bis 2/3, vorzugsweise 1/2 repräsentiert. Die Fluoreszenzeigenschaften der Mikrokugeln C und D sind die folgenden:
Die mittlere Fluoreszenzintensität liegt zwischen dem 3- und 100-fachen, vorzugsweise 10- bis 30-fachen der Intensität der Mikroteilchen einer erfindungsgemäß behandelten Negativkontroll-Referenzprobe. Die Negativkontroll-Referenzprobe wird ausgehend von einem Pool von normalem plättchenarmem menschlichem Plasma, welches durch einen 1 μm-Filter filtriert und in Aliquots eingefroren wird, hergestellt. Ein Aliquot wird mit den Monoreagenzien und unter den Testbedingungen in Gegenwart eines 10-fachen molaren Überschusses von jedem der Antikörper, welche die Monoreagenzien bilden, markiert (Inhibition der Fluoreszenzmarkierung).
Die mittlere Fluoreszenzintensität der Mikrokugeln C (bzw. D) wird als stabile Referenz herangezogen, um die Position des Positiv-Schwellenwerts der Mikroteilchen für das Fluorochrom 1 zu ermitteln. Ebenso werden die Mikrokugeln D als stabile Referenz herangezogen, um die Position des Positiv-Schwellenwerts der Mikroteilchen für das Fluorochrom 2 zu ermitteln. Diese Schwellenwerte werden Charge für Charge so definiert, dass eine Hauptmenge (70% bis 99,999%, vorzugsweise 98%) der Mikroteilchen der oben definierten Negativkontroll-Referenzprobe sich in der Region einer Fluoreszenzintensität unter den Schwellenwerten befindet (1, Region Q3). Der Multiplikator-Koeffizient (alpha), welcher die mittlere Fluoreszenzintensität der Kugeln (stabile Referenz) und den entsprechenden Fluoreszenzintensitätsschwellenwert verbindet, ist ein für die Charge charakteristischer Parameter. Er erlaubt, jeden Schwellenwert auf reproduzierbare Weise zu positionieren gemäß der Formel:
Schwellenwert-Fluol-Intensität = alpha x MFI μS C.
Beispiel 2: Veranschaulichung des erfindungsgemäßen Verfahrens in drei Schritten
Schritt 1: Dieser Schritt besteht darin, die Mikrokugeln C und D (μS C+D) entsprechend den Fluoreszenzwerten in der Region R1 der 1 auszuwählen. Es werden die Fluoreszenzparameter (PMTv, Kompensationen) und die Schwellenwertniveaus (1, S1 und S2) reguliert.
Schritt 2: Die Fluoreszenzen werden ungegatet (ohne Eingrenzung) analysiert. Die Mikrokugeln A werden auf LFL1 ausgewählt (2, Region R4). Die die endothelialen Mikroteilchen (μP endoth) definierende Region R3, welche die Mikrokugeln A (μS A) enthält, wird reguliert.
Schritt 3: Die Proben werden analysiert, indem die Mikroteilchen in der Region R3 ausgewählt werden (3). Eine gegebene Anzahl von Mikrokugeln B (μS B) (Region R2) wird bestimmt und man zählt die Mikroteilchen (Region Q2).
Beispiel 3: Quantifizierung der EMP bei einem an einem Lupusantikoagulans leidenden Patienten.
Die in den 4.A bis 4.H gezeigten Zytogramme sind eine Visualisierung des Tests unter Einsatz des erfindungsgemäßen Monoreagens gemäß den Schritten des Verfahrens des vorangegangenen Beispiels.
Die Experimente wurden unter Verwendung eines mit PE markierten anti-CD51 (Immunotech) und eines mit FITC markierten anti-CD146 (Biocytex) ausgeführt.
Die Negativprobe ist ein normales, mit Citrat behandeltes Plasma.
Die Positivprobe ist ein plättchenarmes Plasma, welches von einem an einem Lupusantikoagulans leidenden Patienten stammt.
Die zytometrische Ablesung wurde ausgeführt, indem 20000 interne Eichproben-Kugeln gezählt wurden. Die Anzahl von doppelt markierten Mikrovesikeln, welche in der Region Q2 des Zytogramms lokalisiert sind, wird aus der Zählung der Kugeln abgeleitet.

Claims

Monoreagens für den Nachweis und die Quantifizierung von Mikroteilchen endothelialen Ursprungs in einer Plasmaprobe durch Durchflusszytometrie, wobei das sogenannte Monoreagens enthält i) eine Mischung von für Membranmoleküle der Endothelzellen spezifischen monoklonalen Antikörpern enthält, wobei die Mischung einen mit einem Fluorochrom 1 markierten Antikörper (1) und einen mit einem Fluorochrom 2 markierten Antikörper (2) umfasst, wobei die Antikörper (1) und (2) nicht dieselbe Spezifität aufweisen, und ii) eine Mischung von Mikrokugeln, umfassend – eine mit einem Fluorochrom markierte Population A von Mikrokugeln (Eichprobe), die dazu dient, den Analysenbereich der Mikroteilchen in Hinblick auf die Größe (Lichtdiffusionsparameter) zu definieren, und deren Differenzierung erlaubt, – eine Population von Mikrokugeln B (Eichprobe), deren Anzahl bekannt ist und die der Zählung der Mikroteilchen dient, – eine einzig mit dem Fluorochrom 1 markierte Population von Mikrokugeln C, die dazu dient, hinsichtlich des Fluoreszenzparameters des Fluorochroms 1 den minimalen Intensitätsschwellenwert, der die mit den Fluorochrom-1-Antikörpern markierten Mikroteilchen charakterisiert, zu definieren, – und eine Population von Mikrokugeln D mit identischem Durchmesser wie C und einzig mit dem Fluorochrom 2 markiert, die dazu dient, den Analysenbereich der hinsichtlich des Fluorochroms 2 als positiv angesehenen Ereignisse zu definieren.
Monoreagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Antikörper insbesondere unter den anti-CD51, anti-CD34, anti-CD9 und anti-CD146 ausgewählt sind.
Monoreagens nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Antikörper ein anti-CD51 und anti-CD146 sind.
Monoreagens nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikrokugeln A einen Durchmesser zwischen 0,5 und 1 μm, vorzugsweise 0,8 μm haben und die Mikrokugeln B und C einen Durchmesser zwischen 2 und 10 μm, vorzugsweise 3 μm haben.
Monoreagens nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Durchmesser der Mikrokugeln C und D sich von jenem der Kugeln B so unterscheidet, dass die Populationen C + D auf einfache Weise anhand der Lichtdiffusionsparameter von der Population B getrennt werden können.
Monoreagens nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Durchmesser der Mikrokugeln B, C und D identisch ist.
Monoreagens nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Populationen C und D in einem relativen Anteil von 1/3 bis 2/3, vorzugsweise 1/2 vorhanden sind.
Monoreagens nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Fluorochrome insbesondere unter Phycoerythrin und FITC ausgewählt sind.
Diagnostischer Kit, umfassend ein Monoreagens nach einem der Ansprüche 1 bis 8, der für den Nachweis und die Quantifizierung von endothelialen Mikroteilchen in menschlichem Plasma bestimmt ist.
Diagnostischer Kit nach Anspruch 9, umfassend außerdem eine Negativkontroll-Referenzprobe, die aus einem Pool von normalen plättchenarmen menschlichen Plasmas stammt, wobei die Probe in flüssiger oder lyophilisierter Form vorliegt.
Verfahren zur Quantifizierung von endothelialen Mikroteilchen im Blut, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte umfasst: a) Herstellung von plättchenarmem Plasma durch Zentrifugation und Mikrofiltration, b) Inkubation des Plasmas mit einem Monoreagens nach einem der Ansprüche 1 bis 8 dergestalt, dass eine Doppelfarbmarkierung der Mikroteilchen erhalten wird, c) Unterscheidung und Zählung der Mikroteilchen durch Durchflusszytometrie.
Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das plättchenarme Plasma durch doppelte Zentrifugation und Filtration durch Millipore 1 μm erhalten wird.
Verwendung eines Monoreagens nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder eines Kits nach einem der Ansprüche 9 und 10 für den Nachweis der prokoagulierenden Aktivitäten während thrombotischer oder prothrombotischer Erkrankungen, wie den Lupusantikoagulantien.
Verwendung eines Monoreagens nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder eines Kits nach einem der Ansprüche 9 und 10 für den Nachweis von akuten oder chronischen Gefäßläsionen.
Verwendung eines Monoreagens nach einem der Ansprüche 1 bis 8 für die Doppelfarbmarkierung der endothelialen Mikroteilchen dergestalt, dass die Differenzierung zwischen den Mi kroteilchen und deren Äquivalent, insbesondere deren Plättchen-Äquivalent, optimiert wird.
Verwendung eines Monoreagens nach einem der Ansprüche 1 bis 8 für die Standardisierung der Unterscheidungsschwellenwerte der endothelialen Mikroteilchen von den anderen Teilchen und Zelltrümmern, die für ein Hintergrundrauschen verantwortlich sein können.
Verwendung eines Monoreagens nach einem der Ansprüche 1 bis 8 für die Standardisierung der Zählung der endothelialen Mikroteilchen bezogen auf die Mikrokugeln der Eichproben.