DE10001390A1 - Zelllinie zur Herstellung und Produktion von Schafadenovirusvektoren - Google Patents

Zelllinie zur Herstellung und Produktion von Schafadenovirusvektoren

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Abstract

Die Erfindung betrifft die Schafembryo-Zelllinie HVO-156 (DSM...) oder davon abgeleitete Zelllinien und deren Verwendung zur Herstellung und Vermehrung von Schafadenoviren, insbesondere rekombinanten Schafadenoviren, die vom Isolat OAV 287 abgeleitet sind.

Description

Die Erfindung betrifft die Schafembryo-Zelllinie HVO-156 (DSM . . . .) oder davon abgeleitete Zelllinien und deren Verwendung zur Herstellung und Vermehrung von Schafadenoviren, insbesondere rekombinanten Schafadenoviren, die vom Isolat OAV 287 abgeleitet sind.
Genetische Defekte können Erkrankungen, wie Krebs, zystische Fibrose, muskuläre Dystrophie und andere, hervorrufen. Zur Behebung dieser genetischen Defekte sind bereits eine Vielzahl von gentherapeutischen Verfahren vorgeschlagen worden. Grundlage einer erfolgreichen Gentherapie sind Verfahren zur Herstellung von Vektoren, die therapeutische Gene mit ausreichend hoher Effizienz in die genetisch defekten Zielzellen einbringen können.
Das evolutionär hochentwickelte Vermögen von Viren, genetisches Material in Säugerzellen einzuschleusen, legt die Verwendung von viralen Vektoren für die Gentherapie nahe. Bisher wurden in erster Linie humane Viren mit geringem pathogenen Potenzial wie attenuierte Adenoviren, adenoassoziierte Viren, Herpesviren und Retroviren als Vektoren eingesetzt. Dabei wurde erkannt, dass keines der genannten Systeme für beliebige gentherapeutische Anwendungen einsetzbar ist. Allgemein spricht gegen eine erfolgreiche Anwendung von humanen viralen Vektoen beim Menschen eine endemisch präexistierende Immunität in den meisten Menschen, die durch eine Infektion mit diesen Viren in der Kindheit hervorgerufen wurde.
Virale Vektoren, die in der Lage sind, diese präexistierende Immunität beim Menschen zu überwinden, basieren u. a. auf Schafadenoviren, insbesondere dem Schafadenovirusisolat OAV 287. Dieses Virus und die Verwendung rekombinanter Varianten davon für die Gentherapie wird in WO 96/03508 und WO 97/06826 beschrieben. Allerdings ist die Herstellung und Vermehrung derartiger Viren bislang mit Problemen behaftet. Die dafür derzeit ausschließlich verfügbare Schaflungen-Zelllinie CSL 503 (Pye et al., Austr. Vet. J. 66: 231-232 (1989)) ist nur wenig effizient. So entsteht bei Transfektion dieser Zelllinie mit rekombinanter Schafadenovirus-DNA nur eine geringe Anzahl rekombinanter Schafadenoviren. Darüber hinaus hat die Zelllinie CSL 503 nur eine relativ kurze Lebensspanne von üblicherweise weniger als 20 Passagen und erlaubt daher nur eine vergleichsweise geringe Vermehrungsrate von Viren.
Es besteht daher das Bedürfnis zur Bereitstellung alternativer Zelllinien, die eine höhere Effizienz zur Herstellung von Adenoviren besitzen. Es wurde festgestellt, dass Schafembryo-Zelllinien, insbesondere die Schafembryo- Zelllinie HVO-156 (DSM . . . .) oder davon abgeleitete Zelllinien eine solche effiziente Vermehrung von Adenoviren ermöglichen. Diese Zellen zeichnen sich durch eine hohe Lebensspanne (mindestens 40-malige Passagierbarkeit entsprechend < 100 Generationen), eine gute Transfizierbarkeit mit rekombinanter DNA, eine hohe Effizienz der Entstehung von rekombinanten Schafadenoviren und eine hohe Vermehrungsrate von rekombinanten Schafadenoviren aus.
Ein Gegenstand der Erfindung ist somit die Schafembryo-Zelllinie HVO-156 (DSM . . . .) oder eine davon abgeleitete Zelllinie. Diese Zelllinie wurde am 21. Dezember 1999 bei der DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH), Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags hinterlegt.
Die hinterlegte Zelllinie oder davon z. B. durch Subklonierung abgeleitete Zelllinien sowie andere Schafembryo-Zelllinien eignen sich zur Herstellung oder/und Vermehrung von Adenoviren, insbesondere von Schafadenoviren, wie etwa von Schafadenoviren des Isolats OAV 287 und davon abgeleiteten rekombinanten Viren.
Weiterhin soll die Erfindung durch die nachfolgenden Abbildungen und Beispiele erläutert werden. Es zeigen:
Abb. 1 die Morphologie von HVO-156-Zellen (DSM . . . .) vor Kultivierung (A) und nach Kultivierung für 40 Passagen (B),
Abb. 2 die Transfektionseffizienz für ein Plasmid in HVO-156- Zellen bei Lipofektion: (A) Mocktransfektion, (B) Transfektion mit Plasmid und
Abb. 3 die Produktionseffizienz für ein rekombinantes Schafadenovirus in HVO-156-Zellen.
Beispiel 1
HVO-156-Zellen wurden in DMEM bei 37 (oder 40) °C für bis zu 40 Passagen kultiviert. Die Zellen wurden vor der Kultivierung und danach morphologisch analysiert. Es ergaben sich keine Veränderungen im morphologischen Erscheinungsbild, wie aus einem Vergleich der Abb. 1A (Morphologie vor der Kultivierung) und 1B (Morphologie nach 40 Passagen) ersichtlich ist.
Beispiel 2
2 µg des Plasmids pRSVßgal bpA (Hofmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995), 10099-10103) mit einer lacZ-Expressionskassette wurde mittels Lipofektion (Lipofectamin, Gibco) in HVO-156-Zellen transfiziert. Nach 48 Stunden wurde die lacZ-Expression histologisch durch Blaufärbung der Zellkerne in Folge des lacZ-vermittelten Substratumsatzes nachgewiesen. Abb. 2A zeigt eine Mock-Transfektion. Aus der Abb. 2B ergibt sich nach Auszählung der dunklen Zellkerne eine Transfektionseffizienz von ca. 80% für die Lipofektion.
Beispiel 3
5 µg DNA eines linearisierten Genoms des rekombinanten Schafadenovirus pOAVhAAT (Hofmann et al. (1999), J. Virol. 73, 6930-6936) wurde in HVO-156-Zellen mittels Lipofektion transfiziert und die Effizienz der Entstehung von rekombinanten Schafadenoviren wurde bestimmt. Bei sechs Rescue-Versuchen wurden fünf rekombinante Viren gefunden.
Dies ist eine sehr hohe Effizienz, da bei der Zelllinie CSL 503 unter vergleichbaren Bedingungen bei durchschnittlich 8 Transfektions­ experimenten nur ein rekombinantes Virus gefunden wird.
Beispiel 4
Die Menge von in HVO-156-Zellen produzierten rekombinanten Schafadenoviren OAVhAAT (Hofmann et al. (1999), J. Virol. 73, 6930- 6936) wurde in Abhängigkeit von der eingesetzten Virusmenge analysiert. 3 × 105 Zellen wurden bei MOIs (Multiplizitäten der Infektion) von 0,2/2/10 infiziert und der Titer des gesamten produzierten Virus wurde nach 48 Stunden, wie bei Hofmann et al., supra, beschrieben, durch einen Endpunkt- Verdünnungs-Assay bestimmt.
Die Menge der produzierten Viren pro Zelle kann Abb. 3 entnommen werden. Bei einer MOI von 2 betrug die produzierte Virusmenge ca 1,4 × 104 infektiöse Partikel pro Zelle.

Claims (4)

1. Verwendung von Schafembryo-Zelllinien zur Herstellung oder/und Vermehrung von Adenoviren.
2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelllinie HVO-156 (DSM . . . .) oder eine davon abgeleitete Zelllinie eingesetzt wird.
3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2 zur Herstellung oder/und Vermehrung von Schafadenoviren.
4. Verwendung nach einem der Ansprüche 2 bis 4 zur Herstellung oder/und Vermehrung von Schafadenoviren des Isolats OAV 287 und davon abgeleiteten rekombinanten Viren.
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