DD301781B5 - Virussichere humane Transfer-Faktor-Praeparate und Verfahren zu ihrer Herstellung - Google Patents

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Dio Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von virussicheren humanen Transfer-Faktor-Präparaten aus peripheren Blutleukozyten gesunder Blutspender, wobei sich das Virusinaktivierungsverfahren durch eine gleichzeitige Erhöhung der immunologisihon In-vitro-Wirksamkoit bei der Modulation des zellulären Immunsystems auszeichnet. Das medizinische Bedürfnis für die Entwicklung und Herstellung von humanenTransfer-Faktor-Präparaten ergab sich aus den in den letzten Jahron gewonnenen neuen Erkenntnissen über Immundofokterkrankungen und der noch immer unbefriedigenden Situation in dor therapeutischen Beeinflußbarkeit dieser oft lebensbedrohlichen Erkrankungen. Der Transfer-Faktor beeinflußt als Immunmodulator in vitro und in vivo dio Korrelate der zellulären Immunität, ohne daß dessen wirksame Komponenten und deren Wirkungsweise im einzelnen bekannt wären. Er wird aus immunkompetenten Zellen gewonnen und scheint in äußerst komplexer Weise, als Ensemble soiner einzelnen Bestandteile, auf das Immunsystem Einfluß zu nehmen. Transfer-Faktor setzt sich aus einem Gemisch niedermolekularer Polypeptide (MG < 10000D)mit bis zu 12 Aminosäuren und einem Ribonukloinsäureantoil von 2 bis 3 Nukleotidbasen zusammen.

Als Indikationon für die therapeutische Anwendung des Transfer-Faktors gelten alle Situationen, bei denen eine Einschränkung der immunologischen Reaktionsfähigkeit nachgewiesen wurde oder mit hoher Wahrscheinlichkeit zu vermuten ist, wie

- primäre und sekundäre Immundefekte,

- schwere chronisch rezidivierende Infektionen mit Erregerpersistenz (z. B. Zytomegalie-, Epstein-Barr- ur\d Herpes-Virusinfektionen, chronische mucocutane Candidiasis)

- ausgewählte Autoimmunerkrankungon (z. B. Rheumatoidarthritis hoher Aktivität, Lupus orythematodes, endogene Uveitis). Kontraindikationen sind nicht bekannt.

In don letzten Jahren, besonders seit der Entdeckung der AIDS-Viren und ihrer Auswirkungen, ist die Virussicherheil von Blutpraparaten zu einem ethischen Anliegen höchster Priorität geworden. Die Notwendigkeit der Eliminierung und Inaktivierung von im menschlichen Blut vorkommenden Viren wie Hepatitis B-, Hepatitis-Delta-, Non A-Non B-Hepatitis-, AIDS-, HTLV-1 -, Herpes-, Parvo-, Hepatitis A- sowie Creutzfeldt-Jakob-Disease-Viren ist heute, besonders bei Großpoolpräparaten, unumstritten. Um diesen Erfordernissen Rechnung zu tragen, ist zum Schütze des Patienten und aus ethisch-moralischen Gründen eine effiziente Vii usinaktivierung für im Großpoolverfahron hergestollto Transfer-Faktor-Präparate unabdingbar.

Charakteristik dor bekannten technischen Lösungen

Bisher wurden humane Transfer-Faktor-Präparate überwiegend als Einzelpräparationen gezielt von ausgewählten Probanden wie Rekonvaleszenten oder Verwandten der Patienten bzw. in geringen Poolgrößen von 10 bis 20 Blutspendern durch Zellseparation am Spender bzw. durch eine auf die maximale Gewinnung der Leukozyten orientierte Fraktionierung des Blutes gowonnen. Diese Art der Transfer-Faktor-Herstellung ist zwar im Hinblickauf die Übertragung von Viruserkrankungen auf Grund der Begrenztheit der Spenderzahl mit einem kalkulierbaren Risiko behaftet, erweist sich jedoch für langfristige Therapien mit einem einheitlichen, standardisierten Präparat als ungeeignet und ist außerdem nicht effektiv, technisch aufwendig und kostenintensiv. Infolge der geringen Poolgrößen war es nicht möglich, Parameter zur Zusammensetzung und vor allem zur immunologischen In-vitro-Wirksamkeit anzugeben. Um diesen Mangel zu beseitigen, wurden Großpoolverfahren zur Transfer-Faktor-Herstellung entwickelt, die zwar die Anforderungen der Arzneimittelgesetzgebung an ein Arzneimittel hinsichtlich Einheitlichkeit und Standardisierbarkeit erfüllen konnten (DDR-WP Nr. 211443 vom 11.7.84; METZNER u.a., Dialysierbarer

Leukozytenextrakt (DLE]-Herstellung, Charakterisierung, immunologische Aktivitäten und klinische Anwendung, Allergologio, P I9], 379-387 (1985); FRANKE u. a., Experiences for the Standardization of human Largo Pool DLE-Proparation, Proceedings 5th International Symposium on Transfor-Factor, Bratislava 198G, 574-596 [1987]), jedoch durch die Vielzahl der Spender trotz gewissenhaftem Spenderscrooning und sorgfältiger Dokumentation das Risiko der Kontamination des Pools mit virusbehaftetem Material in sich bargen. Tonsillen als Ausgangsmaterial für die Transfor-Faktor-Herstellung konnten den arzneimittelrechtlichen Anforderungen nicht genügen, da es sich hierbei um pathogenes Material handelt und der Nachweis, daß virogene und pyrogone Bestandteile mit Sicherheit nicht ins Endprodukt gelangen können, nicht geführt werden konnte. Buffy coats von gesunden Blutspendern bieten durch die gesetzlich geregelten Anforderungen an Blutspender von der arzneimittelrechtlichen Seite her gute Voraussetzungen als Ausgangsmaterial, zumal sie bei der Trennung des Frischblutes in plasmatische und zelluläre Bestandteile in großen Mengen anfallen und bisher als weitgehend ungenutztes Nebenprodukt verworfen wurden. Jedoch auch hier kann die Übertragung einer Virusinfektion infolge der begrenzten Aussage der diagnostischen Screeningmethoden und des diagnostischen „Fensters" nicht mit Sicherheit ausgeschlossen werden. Deshalb war es erforderlich, als organisatorische Vorsichtsmaßnahme eine sechsmonatige Quarantänolagemng nach der Blutabnahme anzuschließen, um bei eventuell in dioser Zeit auftretenden Viruserkrankungen der Blutspender das Ausgangsmaterial von der Weiterverarbeitung sperren zu können. Diese Maßnahme war mit einem hohen organisatorischen Aufwand verbunden und führte im Falle eines positiven Befundes zum Verlust einer größeren Menge buffy coats, im Extremfall zur Sperrung oiner ganzen Charge. Eine absolute Virussicherheit konnte jedoch auch mit dieser Maßnahme nicht erzielt werden. Die gebräuchlichsten Methoden zur Virusinaktivierung in Blutderivaten sind die Behandlung mit ß-Propiolacton und UV-Licht, die Immuiineutralisation, Erhitzen in flüssiger Phase, Erhitzen im lyophilisierten Zustand, Erhitzen des Lyophilisats in Gegenwart von organischen Lösungsmitteln oder Dampf und die Lösungsmittel/Detergentien-Behandlung (A. M. Prince et al., Eur. J. Epidemiol. 3:103-118 (1987)). Die Effizienz der Methoden ist unterschiedlich, ebenso die Resistenz der Viren gegenüber den einzelnen Verfahren. Das sicherste Verfahren gegenüber allen im menschlichen Blut vorkommenden Viren ist nach dom gegenwärtigen Wissensstand die zehnstündige Temperaturbehandlung bei +6O⁰C in flüssiger Phase (Pasteurisierung). Nachteil fast aller Methoden ist, darunter auch der Pastourisierung, daß zur Stabilisierung der Blutderivate während der Inaktivierung Schutzsubstanzen in erheblichen Konzentrationen zugesetzt werden müssen, die anschließend quantitativ und mit erheblichem apparativem Aufwand wieder entfernt werden müssen. Trotzdem kommt es bei allon Verfahren zu einem teilweise bedeutendem Aktivitätsverlust der Präparate, was sich ungünstig auf die Ausbeute auswirkt und ein Hinweis auf Denaturiorungserscheinungen ist. Über Virusinaktivierungsverfahren von Transfer-Faktor-Präparaten finden sich in der Literatur keine Hinweise, was Ausdruck dafür sein dürfte, daß einerseits in der im Herstellungsverfahren beinhalteten Ultrafiltration bzw. Dialyse eine ausreichende Barriere gegen das Eindringen von virogenem Material gesehen wird, andererseits diesem Problem noch zu wenig Aufmerksamkeit geschenkt wird, ganz im Gegensatz zu plasmatischen Blutderivaten.

Für gerinnungsaktive Plasmafraktionen, die während der Pasteurisierung mit Glyzin und Saccharose stabilisiert wurden, konnte folgende Effizienz des Virusinaktivierungsverfahrens ermittelt werden: Hepatitis B-Viren 10⁴⁵CID₆₀

Non A-Non B-Hepatitis-Viren 10⁶⁵CID₆₀

HI-Viren 10⁵⁵TCID₆₀

(Vox Sang. 54: 236 (19881).

Ausgehend von der Tatsache, daß die für die labilen Gerinnungsfaktoren erforderlichen Stabilisatoren ebenso die Viren stabilisieren (Transfusion 25: 523-527 [1985]), kann geschlußfolgert werden, daß bei einer thermischen Behandlung des Transfer-Faktors ohne Zusatz von Stabilisatoren die Effizienz der Virusincktivierung noch bedeutend höher liegt. In klinischen Versuchen konnte nachgewiesen werden, daß bei der Therapie mit Gerinnungsfaktorenkonzentraten, die verschiedenen Virusinaktivierungsverfahren unterzogen worden waren, die Pasteurisierung (10 Stunden bei 60°C in Lösung) das einzige Verfahren war, das keine Hepatitis-Infektionen zur Folge hatte (Mew. Engl. J. Mod. 316: 918-922 (1987)).

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, mit dem „Transfer-Faktor (human) VS" ein virussicheres immunbiologisches Therapeutikum zur Immunmodulation der T-zellabhängigen Reaktionsfähigkeit unter Verwendung von bei der Präparation leukozytenarmer Erythrozytonsedimente anfallander buffy coats auf sehr effektive Weise herzustellen, ohne daß sich das Virusinaktivierungsverfahren nachteilig auf die Zusammensetzung und biologische Verträglichkeit des Produktes auswirkt und mit keinem Verlust an immunologischer Aktivität verbunden ist. Damit soll eine ausreichende Sicherheit vor der möglichen Übertragung von Virusinfektionen erreicht worden, die es erlaubt, Präparate mit sehr hohen Ausgangspoolgrößen, die in sich einheitlich und in ihrer Zusammensetzung und immunologischen Wirksamkeit standardisiert sind, herzustellen und auf bisher erforderliche .Quarantänelagerungen zu verzichten. Das Virusinaktivierungsverfahren sollte sicher, auch gegenüber relativ resistenden Viren sein, und ebenso die mögliche Übertragung einer Non A-Non B-Hepatitis mit Sicherheit verhindern und möglichst ohne physiologisch nicht unbedenkliche Stabilisatoren und Schutzsubstanzen auskommen, die einen Einfluß auf die Transfer-Faktor-Wirkung ausüben können bzw. anschließend entfernt werden müssen. Ües Virusinaktivierungsverfahren muß sich in das bisherige Verfahren zur Transfer-Faktor-Präparation nahtlos integrieren Ifissen und mit den vorhandenen Apparaturen anhand der Verfahrensparameter eindeutig verifizieren lassen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Die in der Charakteristik der bekannten Lösungen beschriebenen Mängel lassen sich auf die folgenden Ursachen zurückführen: Einzelne Präparationen von Transfer-Faktor durch Zellseparation am Blutspender, Rekonvaleszenten bzw. Verwandten des Patienten bzw. die Limitierung der Poolgröße, um ein mögliches Infektionsrisiko so gering wie möglich zu halten, führten zu keinem einheitlichen und standardisierbaren Präparat, was für eine langfristige und zielgerichtete Therapie aber unerläßlich ist.

Großpoolverfahren zur Transfer-Faktor-Herstellung, dio bisher ohne virusinaktivierende Schritte arbeiteten, haftete dagegen trotz gewissenhaftem Blutspenderscreening und einer sechsmonatigen Quarantänelagorung, die eine mögliche Virusinfektion von Blutspendern signalisieren und zu einer Sperrung der Präparate führen sollte, die Gefahr an, daß auch unter dem Aspekt der im PraparationsverTahren beinhalteten Ultrafiltration bzw. Dialyse potentiell virogones Material in das Endprodukt gelangen und damit Auslöser einer Virusinfektion sein könnte. Besonders im Hinblick auf die im Blutsponderscreening nicht sicher nachweisbare Non Α·Νοη B-Hepatitis und die nicht in jedem Fall und zu jedem Zeitpunkt nachweisbaren HIV-Antikörper bei einer HIV-Infektion ist eine Vrusinaktivierung als Sicherheitsmaßnahme für den Empfänger unabdingbar geworden. Um diose Ursachen zu beseitigen, liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu entwickeln, bei dem unter Einordnung in den technologischen Ablauf der Präparation von humsnom Transfer-Faktor aus buffy coats ein virusinaktivierender Schritt zwischengeschaltet wird, der bei der Gewährleistung einer hohen Virussicherheit die biologische Zusammensetzung der Transfer-Faktor-Präparate so wenig wie möglich verändert und deren immunologische WiiKsomkeit nicht nachteilig beeinflußt. Dabei sollte möglichst auf eine chemische Virusinaktivierung verzichtet worden, da die zuzusetzenden Agenzien und Hilfsstoffe physiologisch nicht unbedenklich sind und deshalb mit hohem Aufwand w!eder quantitativ entfernt werden müssen und die Auswirkungen dieser Stoffe auf die bisher nur ungenügend bekannte Zusammensetzung der wirksamen Bestandteile des Transfer-Faktors nicht kalkulierbar sind.

Durch eine thermische Behandlung des Transfer-Faktors in flüssiger Phase gelingt es dagegen puf technologisch überraschend eir.facho und wenig kostenintensive Woise, sämtliche bekannten humanen Viren bzw. virogene Bestandteile effektiv und hochwirksam zu inaktivieren ohne daß sich die Zusammensetzung der wirksamen Komponenten des Transfer-Faktors wesentlich verändert und ohne jeglichen Verlust an immunologischer Aktivität. Gleichzeitig führt die thermische Behandlung zu einer Aktivierung der wirksamen Bestandteile des Transfer-Faktors, was in einer deutlichen Erhöhung der immunologischen In-vitro-Aktivität der Präparate zum Ausdruck kommt. Erfindungsgemäß wird das dadurc'., erreicht, daß das aus den durch mehrfache Einf.-ier-Auftauschritte lysierten buffy coats gewonnene Ultrafiltrat nach oiner Sterilfiltration in verschlossenen Flaschen innerhalb von 3 bis 5 Stunden langsam auf +60 bis +7O⁰C aufgeheizt wird und anschließend bei der konstant gehaltenen Temperatur 10 bis 11! Stunden lang pasteurisertwird. Anschließend wird in 1,5 bis 2 Stunden auf Zimmertemperatur abgekühlt und sofort rollend eingefroren. Die Zwischenlyophilisation des pasteurisierten Ultrafiltrats erfolgt beginnend bei -30 bis -35⁰C unter einem Vakuum von 13,3 bis 40,0Pa ca. 5 Tage lang bei -20⁰C bis zu einer Endtemperatur von +20⁰C nach 7 Tagen. Nach Durchführung der in-prozeß-Kontrolle des Peptid- und Ribose-Gehalts im Ultrafiltrat erfolgt nach dem Lösen des Lyophilisats in aqua ad Injektionen und erneuter Sterilfiltration die Portionierung des gepoolten Präparates in 5 ml ä 5 Transfer-Faktor-Einheiten in 7,5-ml-Rollrnndflaschen, dia sich in sterilisierten Kassetten mit dicht schließendem Deckel befinden, unter Laminar-flow-Bedingungen. Nach dem Einfrieren bei -35°C erfolgt die Lyophilisation unter den gleichen obengenannten Bedingungen.

Die thermische Behandlung in flüssiger Phase zur Virusinaktivierung kann jedoch anstelle im Ultrafiltrat auch erst im wiederaufgelösten Zwischenlyophilisat durchgeführt werden. Dazu wird nach der in-prozeß-Bestimmung des Peptid- und Ribose-Gehalts im Ultrafiltrat d-as Zwischonlyophilisat in dem entsprechenden Volumen aqua ad injektionem gelöst, die Lösung in einer Bluko-Flasche gepoolt und anschließend nach einem 3- bis 5stündigen Aufheizen auf +60 bis +7O⁰C bei der konstant gehaltenen Endtemperatur 10 bis 12 Stunden lang pasteurisiert. Nach einer Abkühlungszeit von 1,5 bis 2 Stunden bis auf Zimmertemperatur wird nach einer erneuten Sterilfiltration sofort zu 5ml & 5 Transfer-Faktor-Einheiten in 7,5-ml-Rollrandflaschen abgefüllt, eingefroren und lyophilisiert. Zum Lösen des Zwischenlyophilisats können auch Aminosäurelösungen, vorzugsweise Glyzin in 0,1-bis 1,0molarer Konzentration, oder 0,1-bis 2,0%ige Albuminlösung verwendet werden.

Zur Stabilisierung des Transfer-Faktors während der thermischen Behandlung sind diese Zusätze jedoch nicht erforderlich. Sie stellen nur Tablettierhilfsmittel dar, die während der Lyophilisation einen gleichmäßigen Strukturaufbau des Lyophilisats gewährleisten.

Bei exakter Einhaltung und Dokumentation der Prozeßparameter während der Virusinaktivierung ist die thermische Behandlung in flüssiger Phase über 10 Stunden bei +6O⁰C als absolut sicherste Methode zu betrachten, um alle im Blut und in Blutderivaten vorkommenden Viren abzutöten. Das auf die erfindungsgemäße Weise hergestellte virussichere humane Transfer-Faktor-Präparat ist steril, pyrogenfrei und weist im Tierversuch eine gute Verträglichkeit auf. Jede Transfer-Faktor-Gharge, die einer Ausgangspoolgröße von 1200-1500 buffy coats entstammt, wird entsprechend der geltenden Prüfanweisung auf die physiko- und biochemischen Parameter sowie auf die immunologische In-vitro-Wirksamkeit geprüft. Die Restfeuchte der lyophilisierten Substanz darf bei einer Verwendbarkeitsdauer ab Freigabe von 18 Monaten 5,0 Ma.-% betragen. Der pH-Wert des in isoionischer NaCI-lnjekticnslösung gelösten Präparates muß im Bereich von 5,8 bis 6,8 liegen. Nach Lösen in aqua ad injektionem muß das Verhältnis der optischen Dichte bei 260nm und 280nm 2,40 ± 0,40 betragen. Der Ribose-Gehalt von 5TF-Einheiten muß im Bereich von 1,0 bis 5,0 mg, vorzugsweise 3,0 bis 4,5mg, und der Peptid-Gehalt im Bereich von 15,0 bis 30,0mg, vorzugsweise von 15,0 bis 20,0 mg, liegen. Die immunologische Wirksamkeit jeder virusinaktivierten Transfer-Faktor-Charge wird im Mikro-Lymphozytentransformationstest (LTT) und im £-Rosetten-Recovery-Test untersucht und darf keine Aktivitätsminderung in beiden Tests gegenüber der unbehandelten Charge aufweisen. Die Pasteurisierung kann zu einer deutlichen Aktivitätserhöhung im Vergleich zur unbehandelten Charge führen, so daß im LTT der Verstärkungsindex als Maß für die durch Transfer-Faktor erhöhte Stimulierbarkeit der Lymphozyten sowohl ohne als auch mit Phytohämagglutinin bis zum Zwei- bis Dreifachen der Norm und im E-Rosetten-Recovery-Test der Recovery-Index als Maß der Beschleunigung der Fähigkeit zur E-Rosettenbildung trypsinierter humaner Lymphozyten unter Transfer-Faktor-Inkubation auf das 1,5- bis 2fache der Norm zunimmt. Untersuchungen in der Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) zeigen eine gute Übereinstimmung der Elutionsprofile der pasteurisierten Chargen mit der unbehandelten Charge. Durch die Pasteurisierung entstehen keine Denaturierungsprodukte oder Spaltprodukte, obwohl es im niederen Molekulargewichtsbereich Verschiebungen in den Konzentrationen der Transfer-Faktor-Bestandteile untereinander, abhängig von der Führung des Pasteurisationsprozesses, gibt.

Ausführungsbeispiel

Die Erfindung soll nachstehend an einigen Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.

Beispiel 1

Die durch zehnmaliges Einfrieren und Auftauen aufgeschlossenen buffy coats von 1200 frischen CPD-Blutkonserven wurden nach der Abtrennung der Zelltrümmer durch Zentrifugatlon (40min bei 2000 U/min +4⁰C) einer Ultrafiltration mit anschließender Sterilfiltration unterzogen und das Ultrafiltrat unter Laminar-flow-Bedingungen zu jeweils 300ml in 500-ml-Blukoflaschon abgefüllt. Ein Drittel dor Charge wurde unmittelbar im Anschluß an die Sterilfiltration innerhalb von vier Stunden von Zimmertemperatur auf +6O⁰C aufgeheizt, 10 Stunden lang bei dieser Temperatur pasteurisiert und innerhalb von zwei Stunden auf +20⁰C abgekühlt. Das pasteurisierte Ultrafiltrat wurde anschließend sofort bei einer Temperatur -40⁰C rollend eingefroren.

Die beiden anderen Drittel dor Charge wurden im Anschluß an die Sterilfiltration sofort rollend eingefroren und die gesamte Charge lyophilisiert. Das zweite Drittel der Charge wurde in der durch die in-prozeß-Kontrolledes Peptid- und Ribose-Gehalts des Ultraf iltrats ermittelten Menge aqua ad Injektionen gelöst, innerhalb von 4 Stunden von Zimmertemperatur auf +6O⁰C aufgeheizt, 10 Stunden lang bei dieser Temperatur pasteurisiert und Innerhalb von zwei Stunden auf +20⁰C abgekühlt. Daran anschließend wurde erneut sterilfiltriert und unter Laminar-flow-Bedingungen in 7,5-ml-lnjektionsflaschen, die in Kassetten mit dicht schließendem Deckel sterilisiert worden waren, zu 5 TF-Einheiten abgefüllt. Das erste und dritte Drittel der Charge wurden in dem ermittelten Volumen aqua ad Injektionen gelöst und ebenfalls unter den obengenannten Bedingungen portioniert. Nach der Lyophilisation wurden folgende Parameter ermittelt:

TF	5TFE	unbehandelt	Ultrafiltrat	gelöstes Zwischen-
	Peptid (mg)			lyophilisat
Ribose(mg)		10 h 6O0C	10 h 6O0C
pH	17,0	17,0	15,5
OD2eo/ODJ8o	3,4	3,7	3,5
5,8	5,8	5,9
2,60	2,67	2,21

Sowohl die pasteurisierten als auch die unbehandelten TF-Präparate waren steril, pyrogenfrei und wiesen eine sehr gute Verträglichkeit im Tierversuch auf.

Die immunologischen Untersuchungen der In-vitro-Wirksamkeit im LlT sowi9 im E-Rosetton-Recovery-Test wiesen nicht nur auf keine Verringerung der Aktivität duich die Pasteurisierung hin, sondern zeigen einen deutlichen Anstieg der immunologischen Aktivität:

Test	TF	LTT	1,66	E-Rosetten-Recovery
	Verstärkungsindex Vlmax		Recovery-Index
unbehandelt	ohne PHA mit PHA	1,98	R'mix
Ultrafiltrat	1,59		2,00
10h 6O0C
gelöstes Zwischen-	2,22	2,13	2,60
lyophilisat
10h 6O0C
	2,31	2.95

Der Vergloich der Elutionsprofile der Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) zeigt, daß sowohl bei den pasteurisierten, als auch bei den unbehandelten Präparaten acht charakteristische Peaks erscheinen, wobei im unteren Molekulargewichtsbereich Unterschiede in den Flächenanteilen zu verzeichnen sind. Die geringsten Unterschie.de in den Konzentrationen der Transfer-Faktor-Fraktionen zur unbehandelten Charge weisen die aus dem 10h lang bei +60⁰C pasteurisierten Ultrafiltrat hervorgegangenen Präparate auf.

Beispiel 2

Die Herstellung der Yransfer-FaktorPräparate erfolgte analog der im Beispiel 1 beschriebenen Art und Weise. Als Ausgangsmaterial dienten 1 500 buffy coats frischer CPD-Blutkonserven. Nach der Ultrafiltration und Sterilfiltration wurde das Ultrafiltrat in drei Teile geteilt, eingefroren und lyophilisiert. Die Lyophilisate wurden in dem nach der in-prozeß-Kontrolle des Peptid- und Ribose-Gehalts im Ultrafiltrat ermittelten Lösungsmittelvolumen gelöst, zwei Drittel der Charge zur Virusinaktivierung innerhalb von 3,5 Stunden auf +6O⁰C aufgeheizt, 12 Stunden lang bei dieser Temperatur pasteurisiert und anschließend innerhalb von 1,5 Stunden auf Zimmertemperatur abgekühlt. Als Lösungsmittel wurden aqua ad Injektionen (ohne Pasteurisierung) sowie 0,1%ige Albuminlösung und 0,266 m Glyzinlösung verwendet. Die im jeweiligen Lösungsmittel gelösten Zwischenlyophilisate wurden nach der Pasteurisierung sterilfiltriert und wie im Beispiel 1 beschrieben zu jeweils 5 TF-Einheiten abgefüllt, eingefroren und lyophilisiert. Folgende biochemischen und physikalischen Parameter wurden ermittelt:

TF gelöst in

5TFE aquaadinj. 0,1% Albumin 0,266 mGlyzin

unbehandelt 10 h 6O⁰C 10h60°C

Peptid (mg) 31,4 36,5» 31,8

Ribose(mg) 4,3 4,2 4,1

pH 5,85 5,90 5,80

2,54 2,40 2,49

* 5mg Albumin

Alle Präparate waren steril, pyrogenfrei und wiesen eine gute Verträglichkeit im Tierversuch auf. Die immunologischen Untersuchungen der In-vitro-Wirksamkeit im LTT und im E-Rosetten-Rocovery-Test zeigten ebenfalls einen deutlichen An&tieg der Aktivität durch die thermische Behandlung in flüssiger Phase.

Test	TF	LTT	mit PHA	E-Rosetten-Recovery
			Recovery-Index
	Verstärkungsindex		Rl(n«x
gelöst In:	VL„	1,58
aqua ad Injektionen	ohnoPHA
unbehandolt		1,81
0,1 %Albumin			2,15
10 h 60°C	1,51	2,03
0,266m Glyzin		2,54
10 h 6O0C	1,96
	2,45
2,15

Aus den Ausführungsbeispielen geht die besondere Eignung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung eines virussicheren, standardisierten und in seiner immunologischen Aktivität durch die thermische Behandlung in fiüssigor Phase gesteigerten Transfer-Faktor-Präparates hervor. Durch die Integration des virusinaktivierenden Schritt'» 5, der ohne zusätzliche Agenzien oder Stabilisatoren durchgeführt werden kann und sich damit problemlos in praktizierte Großpoolverfahren zur Transfer- Faktor-Herstellung einordnen läßt, gelingt es auf eine sehr rationelle und kostengünstige Weise, die Sicherheit des Präparates gegenüber Virusübertragungen mit einer Erhöhung der immunologischen Aktivität auf sinnfällige Art zu verbinden.

Claims (5)

1. Verfahren zur Herstellung virussichoror humaner Transfer-Faktor-Präparate aus dem durch 10- bis 12malige Einfrier-Auftau-Zyklen erfolgten Aufschluß von 1200 bis 1500 frischen buffy coats, die bei der Auftronnung von Frischblut in plasmatische und zelluläre Bestandteile anfallen, anschließender Behandlung des Aufschlusses durch Ultrafiltration oder Dialyse, Sterilfiltration, Portionierung sowie Einfrieren bei :3 -40⁰C und Lyophilisiorung, dadurch gekennzeichnet, aaß das durch Ultrafiltration oder Dialyse gewonnene oder das nach einer Zwischenlyophilisation erneut gelöste Filtrat in flüssiger Phaso über 10 bis 12 Stunden einor thormischen Behandlung bei +6O⁰C bis +70⁰C (Pasteurisation) unterworfen wird.

2. Vorfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die thermische Behandlung in flüssiger Phase mit einor Aufheizrato von 0,10 bis0,25°C/min und einer Abkühlgeschwindigkeit von 0,30 bis 0,55°C/min erfolgt.

3. Vorfahren nach Anspruch 1 und 2, dudurch gekennzeichnet, daß zum Wiederauflösen des Zwischonlyophilisats aqua ad injektionem, als auch Aminosäurelösungon, vorzugsweise 0,1 bis 1,0m Glyzinlösung oder 0,1- bis 2,0%ige Albuminlösung verwendet worden.

4. Virussichere humane Transfer-Faktor-Präparato, dadurch gekennzeichnet, daß eine therapeutische Dosis der nach den Ansprüchen 1 bis 3 erhaltenen lyophilisierten Präparate zu je

5 Transfer-Faktor-Einheiten einen Poptid-Gehalt von 15,0 bis 30,0mg, vorzugsweise von 15,0 bis 20,0mg, einen Ribose-Gehalt von 1,0 bis 5,0mg, vorzugsweise 3,0 bis 4,5mg, eine Restfeuchte <5,0Ma.-% und nach dem Lösen in destilliertem Wasser ein Verhältnis der optischen Dichten bei 260 nm und 280 nm von 2,40 ± 0,40 aufweisen.