DD293432A5 - Verfahren zur bestimmung von androstenon und anderer delta 16-steroide in biologischem material - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Androstenon und anderer D16-Steroide in biologischem Material, insbesondere von Schlachtkoerpern von Ebern, um eine moegliche Verwertung fuer die menschliche Ernaehrung zu erlauben. Aufgabe der Erfindung ist die Entwicklung eines schnellen, einfach zu handhabenden sowie sicheren Analyseverfahrens. Erfindungsgemaesz erfolgt die Bestimmung von Androstenon und anderer D16-Steroide nach Verseifung von Fettproben mittels methanolischer Kalilauge bzw. enzymatischer Hydrolyse von Blutplasma oder Speichel, durch eine Extraktion der Steroide mit n-Hexan bzw. Methanol und nachfolgender Reinigung der Extrakte. Nach dem Einengen der Extrakte erfolgt eine Hochleistungsduennschichtchromatographie an Kieselgel 60. Nach Entwicklung der HPTLC-Fertigplatten und nachfolgender Bestrahlung mit UV-Licht der Wellenlaenge 254 nm erfolgt eine semiquantitative Bestimmung. Die Erfassungsgrenzen der D16-Steroide liegen zwischen 5 und 150 ng/ml bzw. g Probe.{D16-Steroid-Screening-Test; Ebergeruch; Duennschichtchromatografie; Androstenon-Nachweis; Schlachtkoerperuntersuchung; biologisches Material; objektive sensorische Qualitaetspruefung}

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Androstenon und anderer Δ16-Steroide in biologischem Material, insbes. von Schlachtkörpern von Ebern, um eine mögliche Verwertung für die menschliche Ernährung zu erlauben.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Biologisches Material vom Eber enthält einen mehr oder weniger starken arteigenen Geschlechtsgeruch, der unterschiedlich beschrieben wird: schweißig, zwieblig, ranzig.

Patterson 1968, bei Claus, R (1970) Diss TH München isolierte aus dem Fettgewebe geruchbelasteter Eberschlachtkörper einen spezifischen Stoff, der diesen Geschlecl sgeroch maßgeblich hervorruft. Nach der Strukturaufklärung dieser chemischen Verbindung konnte das 16-Steroid (5a-Androst-16en-3on) synthetisiert und als Indikatorsubstanz für den Ebergeruch angeboten werden.

Eberschlachtkörper werden auf den Schlachthöfen einer sensorischen Qualitätskontrolle unterzogen. Eine geschulte Fachjury prüft die aufsteigenden Fräsen beim Erhitzen von Eberfett, ob sie den typischen Ebergeruch aufweisen. Das Ergebnis dieser sogenannten Lötkolbenprobe unterliegt starken subjektiven Einflüssen. Vor allem nach dem Prüfen einer geruchsbelasteten Probe ist die Flexibilität der menschlichen Nase gestört. Die Mitglieder der Jury können auch nur eine geringe Anzahl Proben je Tag prüfen.

Auf der Suche nach objektiven Untersuchungsmethoden wurde der Ebergeruch analysiert und von Claus, Wien, tierärztl. Mschr. 65, S.381-388 (1978) als eine Kombination aus 21 verschiedenen, chemischen Verbindungen festgestellt. Untersuchungen über den prozentualen Anxeil der einzelnen, chemischen Verbindungen am Ebergeruch ergaben, daß das Androstenon (5a-Androst-16en-3on) mit den signifikant höchsten Konzentrationen (Bonneau, A review Livestock Prod. Sei.; Amsterdam 9[6], S.687-705 [1982]) beteiligt ist. Korrelationskoeffizienten der Andiostenonkonzent rat ionen mit den dazu gehörigen sensorischen Prüfergebnissen gestatten es, das Androstenon als Indikatorsubstanz für den Ebergaruch anzusehen. Erst unter dieser Voraussetzung war es möglich, über den Androstenongehalt im Fett, mittels einer biochemischen Analysenmethode, eine objektive Einschätzung der Geruchsintensitäten des Probenmaterials vornehmen zu können. Ordnet man dem organoleptischen Wahrnehmungsvermögen von Ebergeruch die entsprechenden Androstenonkonzentrationen zu, ergibt sich die Empfehlung von Claus 1978. Danach liegt die Wahrnehmungschwelle für Ebergeruch bei 0,3 Mg Androstenon/g Fett. Die Europäische Vereinigung für Tierzucht (ETV) empfiehlt 0,5 \ig Androstenon/g Fett als zulässigen Grenzwert Voss und Holtz, Tierzüchter 25 (11),S.462-465(1982).

Mittels der Androstenon-Bestimmung ist es möglich, den Eberschlachtkörper objektiv auf seine sensorische Qualität zu beurteilen.

Brooksbank u. Haslewood, Biochem. J. 80,488 (1961) und Brooksbank, J. Endocrin, 24,435 (1962) berichten über eine kolorimetrische Bestimmungsmethode für Androstenon. Die zu geringe Empfindlichkeit von 1 Q\ig Androstenon regte zur weiteren Entwicklung empfindlicherer Androstenon-Bestimmungsmethoden an. Mit der Dünnschichtchromatographie wurde ein brauchbarer Weg zur Isolierung der Δ16-Steroide aus dem Eberfett gefunden. Einen echten analytischen Fortschritt erzielte die Gaschromatographie, gekoppelt an die Dünnschichtchromatographie Höbe u. Mitarb., Arch, exper. Vet. med., Leipzig 36 (5), S. 739-750 (1982). Diese Kopplung ermöglichte zwar die Untersuchung biologischen Materials, jedoch ist diese Kombination für Routineanalysen zu kostenaufwendig und verlangt hochqualifiziertes Fachpersonal. Der Radioimmunoassay (RIA), als hochempfindliche Nachweismethode, kann aus ökonomischen Gründen nicht für die routinemäßige Gütekontrolle der sensorischen Qualität eingesetzt werden. Claus und Mitarb., Arch. f. Lebensmittelhyg. 39 (4), S.87 (1988) halten ein enzymimmunologisches Meßverfahren auf Mikrotiterplatten (MTE) für möglich. A. B. Mortensen (DD Ap 202762 Int. Cl. GO1N 33/12) schlägt vor, über den Skatolgehalt eine Aussage der sensorischen Qualität zu erreichen.

Ziel der Erfindung

Das Ziel des Verfahrens besteht darin, biologisches Material von lebenden Tieren oder Schlachtkörpern objektiv auf den Gehalt an Androstenon und andere A16-Steroide semiquantitativ zu bestimmen und damit durch Vergleich mit den festgelegten Grenzwerten eine Entscheidung über die Verwertbarkeit von Schlachtfleisch von Ebern zu ermöglichen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Biologische« Material von männlichen Tieren₍insbes. von Schweinen^ann einen erhöhten A16-Steroidgehalt aufweisen. Die

Δ16-Steroide verursachen einen geschlechtsbezogenen sensorischen Einfluß, wobei der Steroidgehalt mit der Intensität des Einflusses korreliert. Im Extremfall kann die Einflußnahme auf die sensorische Qualität so stark ansteigen, daß das biologische Material für den Menschen genußuntauglich wird. Als typisches Beispiel ist hierfür der Schlachtkörper des unkastrierten Ebers zu nennen.

Es ist deshalb Aufgabe dor Erfindung, ein schnelles, einfach zu handhabendes sowie sicheres Analyseverfahreii zu entwickeln.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß vom geschlachteten Tier Fettproben entnommen werden, und nach entsprechender Aufarbeitung und Extraktion chromatografisch auf HP^TLC-Fertigplatten der Gehalt der Δ16-Steroide

semiquantitativ aufgetrennt und identifiziert werden. Überraschende weise wurde dabei gefunden, daß unter Verwendung von UV-Licht der Wellenlänge = 254 nm eine bis zu lOOOfache Empfindlichkeitssteigerung gegenüber den bisherigen Verfahren erreicht wird. Das erfindungsgemäße Verfahren setzt sich aus folgenden Einzelschritten zusammen:

Das zerkleinerte Fett einer Mischprobe wird durch mehrstündiges Erhitzen mit methanolischer Kalilauge verseift. Nach dem Abkühlen der Probe wird mehrmals mit η-Hexan extrahiert. Nach dem Waschen der n-Hexanphasen mit 70%igem Methanol und destilliertom Wasser und Trockenen des Hexanextraktes mit geeignetem Trockenmittel, wie z. B. wasserfreiem Natriumsulfat, wird unter Vakuum bei Temperaturen bis zu 4O⁰C bis zur Trockene eingeengt.

Der Rückstand wird in Chloroform gelöst und in üblicherweise auf die HPTLC-Fertigplatten aufgebracht und anschließend mit Laufmittfilgemisch entwickelt.

für 5a-Androst-16 en-3-or: Benzen/Isopropanol 98:2

für5a-Androst-16en-3a-ol: Benzen/Methanol 98:2

für 5a-Androst-16 en-3ß-ol: Benzen/Methanol 98:2

Die HPTLC-Fertigplatten werden luftgetrocknet und mit dem Sprühreagenz (Eisessig, Schwefelsäure, p-Methoxybenzaldehyd) benetzt. Nach kurzzeitigem Erhitzen auf 120°C wird unter einer UV-Lampe (Wellenlänge = 254 nm) die Fertigplatte betrachtet.

Die Δ16-Steroide fluoreszieren je nach Konzentration rosarot bis rotbraun. Die farbliche Intensität ist konzentrationsabhängig, durch Vergleich mitlaufender Standardsubstanzen ist eine schnelle Zuordnung und s^miquantitative Mengenbestimmung mögl'-h.

Mit dort. Verfahren können auch VerLiufsuntersuchungen Ober den Gehalt von Δ16-Steroiden am lebenden Tier vorgenommen werden. Für diese Untersuchungen eignen sich als Pi obcnmaterial besonders Blutplasma und Speichel.

Das Verfahi en besitzt eine Empfindlichkeit von:

< 10 ng Δ16-Steroide als Reinsubstanz

5 ng A16-Steroide/ml Plasma oder Speichel 150 ng A16-Steroide/g Fett.

Die hohe Empfindlichkeit bietet die Gewähr, daß biologisches Material (Schlachtkörper von Ebern) unter Beachtung eines A16-Steroidgrenzwertes in seiner Qualität bewertet werden kann. Das Verfahren gestattet eine Automatisierung und kann mit anderen Verfahren gekoppelt werden. Die Einführung des Verfahrens benötigt keinen größeren apparativen Aufwand. Es läßt sich in jedem, für allgemeine chemische Arbeiten eingerichtetem Labor, also auch direkt auf dem Schlachthof, durchführen.

Ausführungsbeispiele

Anhand von zwei Ausführungsbeispielen wird die Erfindung näher erläutert.

Beispiel 1

Die Untersuchung einer Fettprobe

Claus 1978 untersuchte Eberschlachtkörper auf Maximal- und Minimalgehalt der A16-Steroide an anatomisch unterschiedlichen Entnahmestellen. Dazu wurde von 4 Eberschtochtkörperhälften jeweils an 9 verschiedenen Stellen Fett entnommen. Die ermittelten unterschiedlichen Androstenonkonzentrationen ließen keine Vorzugsstelle signifikant sichern. Es wird deshalb zur Untersuchung des A16-Steroidguhaltes im Fett empfohlen, eine Mischprobe von verschiedenen Entnahmestellen des Schlachtkörpers einzusetzen.

5g zerkleinertes Fett einer Mischprobe werden in einom 100ml Schliffrundkolben mit 10ml n-Heptan und 15ml 10%iger methanolischer Kalilauge 2 Stunden am Rückfluß gekocht (Kaufmann und Mitarb. 1975). Der unter fließendem Wasser abgekühlte Inhalt wird mit 20ml Wasser sowie 20ml Methanol versetzt, in einen Scheidetrichter gegeben und nacheinander mit 30ml, 25ml und 20ml η-Hexan ausgeschüttelt. Die gesammelten Hexrnphasen werden 3x mit jeweils 5ml 70%igem Methanol und 3x mit 5ml Wasser gewaschen. Alle wäßrigen und methanolisch: η Phasen sind zu verwerfen. Mit wasserfreiem Natriumsulfat wird der Hexanextrakt getrocknet und das Natriumsulfat mit ca. 10ml η-Hexan nachgewaschen. Das gesamte Hexan wird unter leichtem Vakuum bei 40⁰C eingeengt. Zur Verminderung von Androstenonverlusten ist das Einengen zeitkonstant vorzunehmen. Unter unseren Bedingungen wurden für ca. 80ml Hexan 16 bis 18min Einengungszeit benötigt. Auftretende Feuchtigkeit muß unbedingt entfernt werden. Der Kolben mit dem trockenen Extrakt kann verschlossen in der Tiefkühltruhe zwischengelagert werden. Der Rückstand im Rundkolben wird mit ChIc roform aufgenommen und das Volumen mit einer Mikroliterdosierspritze in einen Eppendorf becher quantitativ überführt. Das Chloroformvolumen sollte sich in dem Bereich 200 bis 250 μΙ bewegen. Aus dem Eppendorf becher wird ein aliquoter Teil pu lktförmig (2-3 mm Durchmesser) 15 mm vom unteren Plattenrund auf die Nano-DC-Platte aufgetragen. Für Fettproben hat sic.i ein Auftragsvolumen von 10 bis 30 μΙ bewährt. In Nachbarschaft zu den Startflecken der Proben werden ausgewählte Reinsubstanzkonzentrationen der Δ16-Steroide plaziert. Vor jede Probe sollten mehrere, unterschiedliche Volumen auf eine DC-Platte aufgetragen werden. Die Zugabe einer bestimmten Menge Reinsubstanz zu eiiiam kleineren aufgetragenem Probenvolumen erleichtert das Abschätzen der Fluoreszenzintensitäten.

Das vorgestellte Verfahren ermöglicht auf einer HPTLC-Fertigplatte (10 χ 10cm) die gleichzeitige Isolierung und Identifizierung der drei Δ16-Sterolde (5a-Androst-16en-3on, 5a-Androst-16en-3aol und 5a-Androst-16en-3ßol). Für die Bevorzugung einer der drei Steroide empfiehlt sich das entsprechende Laufmittel zu wählen. Für Androstenon ein Gemisch aus Benzol/iso-Propanol 98:2 und für die 3a- und Jß-Androstenole Benzol/Methanol 98:2.

Die chromotographierten Platten werden im Abzug luftgetrocknet und gleichmäßig mit dem Sprühreagenz (48,5ml Eisessig, 1,0ml Schwefelsäure und 0,5ml p-Methoxybenzaldehyd, Kritchevsky und Trepper 1968) benetzt. Die DC-Platten sollten im Bereich der Steroidilecken transparent erscheinen. In einem auf 120⁰C vorgewärmten Trockenschrank werden die besprühten DC-Platten 2 bis 3min erhitzt und zum Entwickeln der Fluoreszenzintensitäten im UV-Licht (254nm) betrachtet. Im UV-Licht fluoreszieren die A16-Steroide je nach der Konzentration rosarot bis rotbraun. Die farbliche Intensität der Steroidflecken ist konzentrationsabhängig. Der mitgeführte Standard erleichtert das Auffinden der gesuchten A16-Steroide und gestattet den Vergleich der einzelnen Intensitäten für eine Screening-Aussage. Die Erfassungsgrenze beträgt 150ng A16-Steroide/g Fett.

Beispiel 2 Die Untersuchung einer Plasma- oder Speichelprobe Heparinisiertes Blut wird zentrifugiert und das gewonnene Plasma für die Untersuchung eingesetzt. Speichel wird von

heterogenen Bestandteilen befreit und kann zur Hydrolyse eingesetzt werden.

30-5OmI Plasma und das gleiche Volumen physiologisch e Kochsalzlösung werden mit 1N Essigsäure auf pH 5,2 eingestellt.

Anschließend erfolgt die Zugabe von 30ml Acetatpuffer (,oH 5,2) und 0,2ml Enzymlösung (ß-Glucuronidase/Arylsulfatase aus Helix pomatia). Die Inkubation erfolgt 2 Stunden bei 55⁰C in einem verschlossenen Erlenmeyerkolben. Das Hydrolysat wird unter

fließendem Wasser abgekühlt und über eine vorbereitete Florisilsäure gegeben. Ungefähr 1 g mit Methanol und Wassergewaschenes Florisil wird für die Füllung der Mikrosäule benötigt. Die gefüllte Mikrosäulo wird mit 100ml physiologische

Kochsalzlösung gewaschenund kann dann für das Hydrolysat eingesetzt werden. Nach dem Durchlaufen durch die Säule wird

diese mit 10ml 1/10N Natronlauge und 30ml Kochsalzlösung gewaschen und anschließend mit der Wasserstrahlpumpetrockengesaugt.

25ml Methanol eluieren die A16-Stercide aus dem Florisil direkt in einen 50ml Spitzbodenschliffkolben. Der Methanolextraktwird bei 40°C und unter leichtem Vakuum bis zur Trockene eingeengt. Der Rückstand kann sofort für die

Dünnschichtchromatographie verwendet werden, wobei sich die Aufarbeitung und der Einsatz des Extraktes von Plasma und Speichel nicht von dem des Fettes unterscheidet. Die Chloroformextrakte von Plasma und Speichel enthalten weniger Verunreinigungen und können deshalb mit einem größeren Volumen auf die Nano-DC-Platte aufgetragen werden (empfohlenes Volumen 30 bis 5OpIj. Die Erfassungsgrenze beträgt 5 ng A16-Steroide/ml Plasma oder Speichel.

Claims (2)

1. Verfahren zur Bestimmung von Androstenon und anderer Δ16 Steroide in biologischem Material mittels Hochleistungs-dünnschichtchromatografie', gekennzeichnet dadurch, daß nach Verseifung von Fettproben mit methanolischer Kalilauge und Extraktion des Steroide mittels η-Hexan und nachfolgender Reinigung des Extraktes mit Methanol und Wasser oder daß nach enzymatischer Hydrolyse von Blutplasma oder Speichel, nach säulenchromatografiscfier Reinigung an Magnesiumsilicat und Eliminierung mit Methanol bei vermindertem Druck bis zur Trocknung eingeengt wurden, der verbleibende Rest in Chloroform gelöst und an Kieselgel 60-HPTLC-Fertigplatten chromatografiert und entwickelt und nachfolgend unter Bestrahlung mit UV-Licht der Wellenlänge λ = 254nm ausgewertet wird.

2. Verfahren nach Anspruch !,gekennzeichnet dadurch, daß als Laufmittel Gemische von Benzen mit Methanol oder Isopropanol im Verhältnis 98:2 verwendet werden.