DD293134A5 - Verfahren zur Herstellung monoklonaler anti-D-Antikörper und eines daraufbasierenden Testpräparates - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung humaner monoklonaler Antikoerper(hmAK) der Klasse IgG gegen das Blutgruppenmerkmal D(Rho) auf humanen Erythrozyten und eines darauf beruhenden Testpraeparates. Der hmAK CB-haD wird aus der Hybridomzellinie H-CB-haD (ZIM-0513) durch Kultivierung in serumfreiem Medium sowie Reinigung mittels Protein-A-Sepharose gewonnen. Die Zellinie ihrerseits wird durch Fusion humaner Lymphozyten mit der Human-Maus-Heteromyelomzellinie CB-Fu2 (ZIM-0314) erhalten. Das Testpraeparat wird durch Konzentration, Dialyse und Zusatz von gereinigtem CB-haD aus dem Kulturueberstand der Zellinie H-CB-haD entwickelt. Das Anwendungsgebiet der Erfindung ist die Blutgruppendiagnostik.{monoklonale Antikoerper(mAK); humane mAK; humane Erythrozyten; Blutgruppenmerkmal D(Rho); Hybridomzellinien; Lymphozyten; Heteromyelomzellinie; CB-Fu2; Reinigung; Testpraeparat; Blutgruppendiagnostik}

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung .„ . ..

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler anti-D-Antikörper, insbesondere zur Herstellung agglutinierender humaner mAK (hmAK) der Klasse IgG gegen D (Rho) auf humanen Erythrozyten, sowie eines darauf basierenden Testpräparates. Das Anwendungsgebiet der Erfindung ist die Blutgruppendiagnostik.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Die Produktion hmAK stellt eine Quelle von Antikörpern für die Diagnostik, Prophylaxe und Therapie verschiedener Erkrankungen des Menschen dar. Es werden international Anstrengungen zur Erzeugung von hmAK gegen bakterielle und virale Antigene, Tumor- und Zeil- bzw. Gewebeantigene unternommen (James, K. u. Bell, G.T.: Human monoclonal antibody production. Current status and future prospects. J. of Immunol. Meth. 100 [1987], 5—40). Dabei werden hauptsächlich zwei Herstellungsmethoden angewandt:

1. die somatische Fusion von humanen B-Lymphozyten mit murinen, heterologen (Mensch χ Maus) oder humanen Myelomlinien

2. die Immortalisierung humaner B-Lymphozyten durch Transformation mit dem Epstein-Barr-Virus.

Zusätzlich findet auch die Kombination von Transformation und anschließender somatischer Fusion Anwendung, so z. B. bei der Herstellung hmAK gegen das Blutgruppenmerkmal Rho(D) (Bron, D.; Feinberg, M. B.; Teng, N.N.H. u. Kaplan, H.S.: Production of human monoclonal IgG antibodies against Rhesus [D] antigen. Proc. Natl. Acad. Sei. USA Vol.81 [1984] 3214-3217). HmAK wurden auch gegen eine Reihe anderer blutgruppenspezifischer Oberflächenantigene auf humanen Erythrozyten entwickelt (Goossens, D.; Champomier F.; Rouger, Ph. u. Salmon, Ch.: Human monoclonal antibodies against blood group antigens. J. of Immunol. Meth., 101 [1987] 193-200). Die bisher gegen das Blutgruppenmerkmal Rho(D) hergestellten humanen monoklonalen Antikörper wurden überwiegend überEBV-Transformation entwickelt (N. C. Hughes-Jones: Monoclonal antibodies as potential blood typing reagents. Immunology Today, Vol.9, No. 3, [1988]). Außerdem ist eine Arbeit bekannt, in derein humaner monoklonaler Antikörper der Klasse IgM durch direkte somatische Fusion von Lymphozyten mit einer humanen lymphoblastoiden Zellinie entwickelt wurde (Lowe, A. D.; Green, S. M.; Voak, D.; Gibson, T.; Lennox, E. S.; A Human-Human Monoclonal Anti-D by Direct Fusion with a Lymphoblastoid Line. Vox Sang. 51: 212—216 [1986]). Humane monoklonale anti-D-Antikörper der Klasse IgG aus direkten Fusionen mit Mensch-Maus-Heteromyelomlinien sind noch nicht beschrieben worden.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung besteht darin, einen humanen monoklonalen anti-D-Antikörper sowie ein Testpräparat auf seiner Grundlage für die Blutgruppendiagnostik im Rhesussystem herzustellen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu entwickeln, mit dem zunächst Hybridomzellinien erzeugt werden können, aus denen sich in anschließenden Verfahrensschritten mAK gegen das Blutgruppenmerkmal D(Rho) auf humanen Erythrozyten und ein Testpräparat für die Blutgruppendiagnostik im Rhesussystem herstellen lassen. Erfindungsgemäß wurde die Aufgabe dadurch gelöst, daß periphere Lymphozyten, die nach Boosterung von rh-Negativen mit Orh-positiven Erythrozyten gewonnen werden, mit der Heteromyelomzellinie CB-Fu2 (ZIM-0314; DD-WP 274446) fusioniert werden, daraus die monoklonale Hybridomzellinie H-CB-haD (ZIM-0513) etabliert, an serumfreies Kulturmedium adaptiert und aus dem zellfreien Kulturüberstand

der humane monoklonale Antikörper CB-haD isoliert wird. Die Lymphozyten werden am 11 .Tag nach Boosterung gewonnen und direkt mit der Heteromyelomzellinie CB-Fu2 (ZIM-0314) fusioniert. Überraschenderweise hat sich herausgestellt, daß ein aus der Fusion gewonnenes Hybridom einen anti-D-spezifischen Antikörper der Klasse IgG sezerniert. Es wird als H-CB-haD bezeichnet und ist in der Hinterlegungsstelle des Zentralinstitutes für Molekularbiologie (ZIM) der AdW der DDR, Berlin-Buch, unter der Nummer ZIM-0513 hinterlegt worden. Tabelle 1 zeigt die Resultate der Testung des Antikörpersauf seine Spezifität an mit Bromelin behandelten Panellerythrozyten. Die Zellinie H-CB-haD wurde an serumfreies Medium adaptiert und in größerem Maßstab in vitro kultiviert. Der Antikörper wurde im zellfreien Kulturüberstand mittels ELISA-Technik quantifiziert und in den Testsystemen eingesetzt. Mit Hilfe der ELISA-Technik wurde außerdem gezeigt, daß der hmAK zur Klasse IgG gehört und leichte Ketten des Types Lambda besitzt.

Das Testpräparat fürdie Blutgruppenbestimmung im Rhesussystem wird dadurch hergestellt, daß der von der Zellinie H-CB-haD gewonnene zellfreie Kulturüberstand auf einen definierten Proteingehalt eingestellt, durch Zusatz von gereinigtem CB-haD-Antikörper auf eine spezifische anti-D-Aktivität gebracht und mittels Dialyse in einen definierten Phosphatpuffer überführt wird. Das Testpräparat wird als CB-anti-D bezeichnet.

Tabelle 1: Ergebnisse der Testung des hmAK CB-haD an mit Bromelin behandelten Panellerythrozyten

Panellerythrozyten Nr.	1 2	3	4	5	6	7	8
Reaktion des hmAK CB-haD	+ +	+	+	.-	-	-	-
D(Rho)-spezifische Reaktion	+ +	+	+	-	-	-	-

Ausführungsbeispiele

1. Zellpräparation und Zellfusion

Mittels Dichtezentrifugation werden die mononukleären Zellen gewonnen. Die monokukleären Zellen sowie die CB-Fu2-Zellen werden in RPMI-1640 (Moore, G.E. et al., J. Am. Assoc. 199,519-524,1967) zweimal sedimentiert und anschließend in einem 1:5-Verhältnis von Heteromyelomzellen zu mononukleären Zellen gemischt und sedimentiert. Nach dem Dekantieren des Überstandes und der Resuspendierung des Sediments in der Restflüssigkeit wird langsam unter ständiger Bewegung des Sedimentes autoklaviertes, noch flüssiges Polyethylenglykol 1500 zugegeben. Nach einer Wirkzeit von 90see wird das Polyethylenglykol durch Zugabe von RPMI-1640 langsam verdünnt. Anschließend werden die Zellen nochmals gewaschen. Das Sediment wird in einem Medium folgender Zusammensetzung aufgenommen: Basismedium - IMEM:HamsF12 im Verhältnis 1:1 Proteinzusätze— ölsäurekomplexiertes Rinderserumalbumin - 1 g/l

— Humanserumtransferrin, eisengesättigt - 10mg/l

- Rinderinsulin - 10mg/l sowie 2mM L-Glutamin und 2mM Na-Pyruvat.

Die Zelldichte der Suspension wird auf 10⁶Zellen/ml eingestellt und je 0,150ml dieser Suspension pro Kavität einer 96-WeII-Platte einpipettiert. Nach 24h wird pro Kavität eine vierfach konzentrierte Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin(HAT)-Lösung zugesetzt. Nach 10 Tagen Kultivierung in feuchter, 5% CO₂-haltiger Atmosphäre werden die Zellkulturüberstände gesammelt und hinsichtlich einer spezifischen Antikörperproduktion getestet. Positive Kulturen werden in RPMI-1640-Basismedium mit Proteinzusätzen von 1 g/l Rinderserumalbumin, 10 mg/ml Humanserumtransferrin und 10 mg/ml Rinderinsulin sowohl kloniert, als auch vergrößert und konserviert.

2. Erythrozytenbindungsassay: Zum spezifischen Nachweis von anti-D-Antikörper werden je 0,05ml Kulturüberstand aus den Kavitäten mit Zellwachstum entnommen und in die Kavitäten einer 96-Well-Rundbodenplatte übertragen. Dann werden je 0,1 ml 0,5%iger Erythrozytensuspension in isotoner Kochsalzlösung und je 0,05ml Bromelinlösung pro Kavität zupipettiert. Die Testplatten werden 20min bei 37°C und danach 20min bei 4°C inkubiert. Bei Zimmertemperatur wird die vollständige Sedimentation der Erythrozyten auf den Rundboden der Kavität abgewartet und das Reaktionsergebnis visuell abgelesen. Der Test wird mit Erythrozyten der Blutgruppenspezifitäten Orh-positiv, Orh-negativ, Arh-negativ, Brh-negativ, ABrh-negativ sowie mit allen Varianten von Panellerythrozyten durchgeführt.

3. Antikörperaufreinigung: 2 Liter zellfreien Kulturüberstandes der Zellinie H-CB-haD werden über eine eine Tangentialflußdruckfilteranlage mit einer Filterfläche von 260cm² und einer Ausschlußgrenze von 3OkD auf 50 ml konzentriert. Mit einer 1 M Tris-Lösung wird der pH-Wert des Konzentrates auf 8,6 eingestellt. Das Konzentrat wird auf eine Protein-A-Sepharose-Säule mit einem Gelvolumen von 5 ml aufgetragen und der Antikörper in einem pH-Wert eingestellt und elektrophoretisch auf Reinheit analysiert.

4. Testpräparatherstellung: Der während der Kultivierung der Zellinie H-CB-haD entstandene Zellkulturüberstand wird durch Konzentrieren auf einen definierten Proteingehalt von 50g/l eingestellt. Mit gereinigtem CB-haD-Antkörper wird eine definierte spezifische Aktivität von 250IE gegenüber einem internationalen Standard eingestellt. Danach wird das Konzentrat extensiv gegen einen Phosphatpuffer mit Zusatz von 15OmM NaCI und einem pH-Wert von 6,5 dialysiert. Das Präparat wird mit 0,1 % NaN₃ versetzt, sterilfiltriert und bei 4°C gelagert.

Claims (4)

1. Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper (mAK) gegen das Blutgruppenmerkmal D(Rho) auf humanen Erythrozyten durch Fusion von durch Boosterung von rh-Negativen mit Orh-positiven Erythrozyten gewonnenen peripheren Lymphozyten, dadurch gekennzeichnet, daß die derart gewonnenen Lymphozyten mit der Heteromyelomzellinie CB-Fu2 (ZIM-0314) fusioniert werden, daraus die monoklonal Hybridmonozellinie H-CB-haD (ZIM-0513) etabliert, an ein Kulturmedium adaptiert und aus dem zellfreien Kulturüberstand der humane monoklonale Antikörper CB-haD isoliert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Lymphozyten am 11.Tag nach Boosterung gewonnen werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die monoklonale Hybridmonozellinie H-CB-haD (ZIM-0513) in einem serumfreien Kulturmedium kultiviert wird.

4. Testpräparat CB-anti-D, dadurch gekennzeichnet, daß ein von der Zellinie H-CB-haD gewonnener Kulturüberstand auf einen definierten Proteingehalt eingestellt, durch Zusatz von gereinigtem CB-haD-Antikörper auf eine definierte spezifische anti-D-Aktivität gebracht und mittels Dialyse in einen definierten Phosphatpuffer überführt wird.