DD284896A5 - Verfahren zur stabilisierung ligninolytischer enzyme - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Stabilisierung ligninolytischer Enzyme. Die Erfindung kann in der Abwasserreinigung und in der biotechnologischen Industrie eingesetzt werden. Erfindungsgemaesz wird der p H-Wert der Enzymloesung in einen Bereich eingestellt in dem das Enzym keine Aktivitaet besitzt und der nicht dem Enzymsekretionsbereich entspricht. Dadurch wird eine hohe Lagerfaehigkeit der Enzyme erreicht, was wesentlich zur Verringerung der an sich bekannten Enzymverluste fuehrt.{Enzyme; p H-Wert-AEnderung; Lauge; Biokatalisatoren; Enzymsekretion; Abwasserreinigung; Lagerstabilitaet; Puffersubstanz; Kulturfiltrat}

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft die Stabilisierung in Lösung befindlicher ligninolytischer Enzyme. Sie führt zur Verbesserung der Lagerstabilität dieser Biokatalysatoren und zur Verringerung von Aktivitätsverlusten bei Aufarbeitungsoperationen entsprechender Enzymrohextrakte.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Im Interesse der Entwicklung umweltfreundlicher Verfahren gewinnen biotechnologische Prozesse zunehmend an Bedeutung. So besteht die Möglichkeit, unter dem Aspekt einer umfassenden Nutzung rezenter Kohlenstoffquellen native Lignine und deren Folgeprodukte, aber auch aromatische Verbindungen der stoffwandelnden Industrie unter Verwendung ligninolytischer Biokatalysatoren zu modifizieren.

Für die Ökonomie dieser Prozesse bildet die Enzymherstellung einen entscheidenden Kostenfaktor. Von Nachteil ist hierbei die relativ geringe Stabilität der zum Einsatz gelangenden Enzyme. Während der Enzymproduktion ist zu beobachten, daß die Enzymaktivität im Kulturmedium ein Maximum durchläuft (Zonari, N.; Romette, J.-L.; Thomas, D.; CR. Acad. Sei. Paris, t. 304, Serie III, 13,1987,341-345; Mustranta, A. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1987,27,21-26), was auf eine partielle Denaturierung der bereits gebildeten Enzyme zurückgeführt werden kann. Um das Fortschreiten des Denaturierungsprozesses zu verzögern, wird im Labormaßstab das Enzym aufkonzentriert und bei -20°C gelagert. Jedoch konnte hierbei beobachtet werden, daß die Laccaseaktivität nach 2monatiger Lagerzeit um 25% abgesunken war.

Verschiedene Bemühungen, Enzyme zu stabilisieren, sind aus der Patentliteratur bekannt. Den Schwerpunkt bilden Enzyme, die bereits technisch genutzt werden (z. B. Proteasen, Amylasen) oder im medizinischen Bereich für diagnostische Zwecke zum Einsatz gelangen (z. B. Alkoholdehydrogenase, Glucose-ö-Phosphatdehydrogenase, Peroxidase). Im allgemeinen erfolgt die Stabilisierung im entsprechenden pH-Optimumdes Enzyms (JP 61-166394, DD 260280, DE 2629808, DE 3436678). Im SU 883176 wird die Stabilisierung am isoelektrischen Punkt vorgenommen. Als Stabilisatoren werden organische Polymere (SU 883176, DE 2740957), Formalin (SU 883176), Phenol (DE 3509238), Rohzucker (DE 3040005), Serumproteine (DE 3040005, DE 2629808, DE 3100076, EU-A 170992), polyvalente Metallionen (US 41-69812, JP 61-166394), Salze niedermolekularer organischer Säuren (EP 0052780), Alkohol und Salze organischer Säuren (DE 3102025), grenzflächenaktive Substanzen (DE 34366787) oder kationische Polyelektrolyte (EP 0193925) verwendet. Schwermetalle werden mit Komplexbildnern (DE 2629808, SU 1306953) entfernt. SH-Gruppenhaltige Enzyme sind mit Na₂SO₃ (SU 1306953) oder Cystein (DE 2629808) stabilisierbar. Zur Stabilitätserhöhung ligninolytischer Enzyme konnten keine Hinweise erhalten werden. Diesem Enzymsystem steht die Peroxidase am nächsten. Für deren Stabilisierung werden polyvalente Metallionen wie z. B. Al, Zn, Mg, Fe (US-A 4169012), Phenol, das auch ein oder mehrere Substituenten wie z. B. Alkylgruppen, Chlor- oder Bromatome tragen kann (DE 3509238) oder serumproteinhaltige Präparate mit 8-Anilino-i-naphthalin-sulfonsäure (DE 3100076) bzw. 4-Aminoantipyrin (Eu-A 170992) verwendet. Diese Stabilisatoren haben den Nachteil, daß sie in technischen Prozessen zu Umweltbelastungen führen. Außerdem ist zu erwarten, daß die organischen Stabilisatoren die Prozeßanalytik negativ beeinflussen.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung besteht darin, mit einfachen Mitteln die ligninolytischen Enzyme soweit zu stabilisieren, daß sie in wäßrigen Lösungen ohne Aktivitätsverlust gelagert werden können.

Die Stabilisierung soll darüber hinaus weder die Prozeßanalytik negativ beeinflussen noch zu Umweltbelastungen führen.

Wesen der Erfindung

DerErfindung liegt die Aufgabe zugrunde, den Denaturierungsprozeß gelöster ligninolytischer Enzyme mittels technologischer Maßnahmen so weit zu verzögern, daß sie ohne nennenswerte Aufwendungen längere Zeiträume gelagert werden können. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß lediglich der pH-Wert der Enzymlösung in einen Bereich verschoben wird, der nicht dem Wirkungsoptimum des Enzyms und nicht dem Sekretionsbereich des Organismus entspricht. Dieses Verfahren unterscheidet sich außerdem von den bisher bekannten, als auf die Zugabe zusätzlicher Stabilisatoren verzichtet wird.

Für das Enzymsystem von Trametes spez. mit pH-Optima für Laccase von 4,7 und für Peroxidase von 5,8 erwies sich z. B. der neutrale bis schwach alkalische pH-Bereich und für Ligninase von Phanerochaete chrys. mit einem pH-Optimum von 3,1 der pH-Bereich um 6 als besonders günstig. Die mit diesem Prozeß verbundene Senkung der Wasserstoffionenkonzentration wirkt der Enzyminaktivierung entgegen. Wird die pH-Korrektur unmittelbar nach Beendigung der Enzymsekretion vorgenommen, so können die anschließenden Aufarbeitungsoperationen ohne Aktivitätsverlust bei Raumtemperatur vorgenommen werden. Kulturfiltrate waren bei Raumtemperatur 3 Wochen und bei +4°C mehr als 4 Monate ohne Verlust an Laccaseaktivität lagerbar. Die in diesem Medium enthaltene Peroxidase war unter den gleichen Bedingungen mehr als 8 Wochen stabil, während Ligninase von Phanerochaete chrys. bei pH 6 etwa einen Monat ohne Aktivitätsverlust aufbewahrt werden konnte. Zur pH-Regulierung können sowohl Pufferlösungen als auch Laugen verwendet werden. Die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens hat die Vorteile, daß

- die Abtrennung der Biomasse sowie anschließend erforderliche Aufarbeitungsoperationen bei Raumtemperatur vorgenommen,

- die KuIturfiltrate etwa 3 Wochen bei Raumtemperatur oder mehrere Monate bei +4⁰C ohne Aktivitätsverlust gelagert und

- auf die im Laboratorium üblichen Aufkonzentrierungen und Lagerungenn bei — 20⁰C verzichtet werden können.

Hervorgehoben werden muß außerdem, daß diese Stabilisierungsmethode beim Einsatz des Enzyms in biotechnologischen Verfahren die Prozeßanalytik nicht beeinflußt und zusätzliche Umweltbelastungen durch Zugabe organischer oder anorganischer Stabilisatoren ausschließt

In den folgenden Beispielen wird die Erfindung näher erläutert:

Beispiel 1

Der pH-Wert eines Kulturfiltrates von Trametes sp. mit einer Laccaseaktivität von 24 U_acm~³ wurde durch Zugabe von Phosphatpuffer nach Sörensen der pH-Wert von 4,8 auf 8 eingestellt und bei Raumtemperatur stehengelassen. Nach 21 Tagen wurde unter Verwendung von O-Phenylendiamin als Substrat die Enzymaktivität kontrolliert. Sie betrug 23 U_acm~³ entsprechend 96% der Ausgangsaktivität.

Ohne pH-Korrektur war die Aktivität unter gleichen Lagerbedingungen bereits nach 15 Tagen auf 7% der Ausgangsaktivität gesunken.

Beispiel 2

Nach Beendigung der Enzymsekretion wurde der pH-Wert eines Kulturmediums durch Zugabe von Natronlauge von 4,8 auf 7,0 eingestellt. Anschließend wurde die Biomasse durch Filtration über Glaswolle abgetrennt. Die Laccaseaktivität betrug 52 U, cm"³. Die so gewonnene Enzymlösung wurde zur weiteren Reinigung übereineG4-Fritteund danach steril filtriert. Die Laccaseaktivität betrug 50 U₈ cm"³. Alle Operationen wurden bei Raumtemperatur vorgenommen.

Ohne pH-Korrektur betrug der Aktivitätsverlust 19%.

Beispiel 3

Der pH-Wert eines Kulturfiltrates von Trametes sp. mit einer Laccaseaktivität von 30 U_ocm~³ wurde durch Zugabe von Natronlauge von 4,8 auf 6,9 gebracht. Diese Lösung wurde bei +4°C aufbewahrt und nach 60 Tagen die Enzymaktivität kontrolliert. Sie betrug 30,5 U₃cm"³, d.h. die Lagerung erfolgte ohne Aktivitätsverlust. Ohne pH-Korrektur sank die Aktivität unter sonst gleichen Lagerbedingungen auf 43% der Ausgangsaktivität.

Beispiel 4

Der pH-Wert eines Kulturfiltrates von Trametes sp. mit einer Laccaseaktivität von 30 U_ecm~³ wurde durch Pufferzugabe von 4,8 auf 8 angehoben. Diese Lösung wurde 120 Tage bei +4⁰C aufbewahrt und danach die Aktivität kontrolliert. Sie betrug 28,8 U₃Cm"³, entsprechend 96% der Ausgangsaktivität.

Ohne pH-Korrektur sank die Aktivität unter sonst gleichen Lagerbedingungen innerhalb 90 Tagen um 86%.

Beispiel 5

Der pH-Wert eines Kulturfiltrates von Trametes sp. mit einer Peroxidaseaktivität von 260 U, · cm"³ gegenüber O-Phenylendiamin als Substrat wurde durch Pufferzugabe von 4,6 auf 6,9 angehoben. Diese Lösung wurde 60 Tage bei +4⁰C aufbewahrt und danach die Aktivität kontrolliert. Sie betrug 259 U₈ · cm"³, d. h. die Lagerung erfolgte ohne Aktivitätsverlust.

Beispiel 6

Der pH-Wert eines Kulturfiltrates von Phanerochaete chrys. mit einer Ligninaseaktivität von 188 U/l gegenüber Veratrylalkohol wurde durch Zugabe von Natronlauge von 4,9 auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt. Diese Lösung wurde bei +4°C gelagert und nach 30 und 60 Tagen die Aktivitäten kontrolliert: Nach 30 Tagen waren 185 U/l (entsprechend 98% der Ausgangsaktivität) und nach 60 Tagen 142 U/l (entsprechend 75,5% der Ausgangsaktivität) nachweisbar.

Claims (4)

1. Verfahren zur Stabilisierung ligninolytischer Enzyme, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert der Enzymlösung in einen Bereich eingestellt wird, in dem das Enzym keine Aktivität besitzt und der nicht dem Enzymsekretionsbereich entspricht, vorzugsweise pH 7 bis 8.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die pH-Einstellung nach Beendigung der Enzymsekretion erfolgt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die pH-Einstellung im Kulturfiltrat vorgenommen wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die pH-Einstellung nach erfolgter . Reinigung vorgenommen wird.