DD279547A1

DD279547A1 - Immunenzymometrisches bestimmungsverfahren fuer den quantitativen nachweis von human-interferon-alpha-2

Info

Publication number: DD279547A1
Application number: DD29528086A
Authority: DD
Inventors: Franz Noll; Petra Below; Frank Schneider; Matthias Gaestel; Christoph Dauth
Original assignee: Akad Wissenschaften Ddr
Priority date: 1986-10-15
Filing date: 1986-10-15
Publication date: 1990-06-06

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum quantitativen Nachweis von Human-Interferon-alpha-2. Das Ziel der Erfindung ist die Entwicklung eines Testsystems, das die quantitative Bestimmung von natuerlichem bzw. rekombinantem Human-Interferon-alpha-2 mit Hilfe eines immunchemischen Verfahrens rationell und sicher moeglich macht. Das erfindungsgemaesse Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass ein erster Antikoerper gegen Human-Interferon-alpha an eine feste Phase adsorbiert wird, man die zu bestimmende interferonhaltige Loesung zugibt und nach einer gewissen Inkubationszeit einen zweiten, mit einem Enzym markierten Antikoerper hinzufuegt und schliesslich die Enzymaktivitaet des an der festen Phase fixierten Immunkomplexes misst. Anwendungsgebiet der Erfindung sind die Medizin und die Biotechnologie.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Durchführung von quantitativen Bestimmungen von Human-lnterferori-alpha-2, das für die medizinische Diagnostik, die biomedizinische Grundlagenforschung und für die Prozeßführung bei der biotec.inologischen Herstellung von lnterferon-aipha-2 benötigt wird.

Charakteristik der bekannten technischen Lösung

Interferone (IFN) shd körpereigene S'offe, die im Rahmen der Abwehrreaktion des Organismus gegen virale Infektionen gebildet werden und eine Infektionsausbreitung verhindern. Die IFNc haben großes medizinisches und biologisches Interesse auf sich gezogen, weil sie neben ihrer antiviralen Wirksamkeit auch proliferationshemmend wirken sowie eine immunodulatorische Aktivität aufweisen. Die Heterogenität dieser Stoffklasse macht die Verfügbarkeit molekularspezifischer Bestimmungsmethoden notwendig.

Bisher erfolgt auch in internationalem Maßstab der quantitative Nachweis von Interferonen über die Bestimmung ihrei antiviralen Aktivität. Gemessen wird hierbei die Hemmung einer Infektionsausbreitung in einer in vitro-Zeilkultur, d. h. die Unterdrückung des durch das infizierende Virus hervorgerufenen cytopathischen Effektes (CPE). Die Resultate werden in internationalen Einheiten (IU) angegeben. Eine Einheit ist definiert als der reziproke Wert jener IFN-Verdünnung, die entwede> die Virusplaque-Bildung zu 50% hemmt oder 50% des Zellrasens schützt. Eine IU entspricht 1-5pg Human-Interferon-alpha.

Diese Methode der Konzentrationsbestimmung von IFN ist sehr zeitaufwendig, arbeitsintensiv und erfordert eine kostspielige, störanfällige Zellkultur. Da dieser Test auf einem Titrationsverfahren beruht, bei dem eine mehr oder weniger subjektive Titererfassung die Grundlage für die Konzentrationsangabe in einer untersuchten IFN-Lösung darstellt, ergeben sich große Fehlermöglichkeiten, die bis .zu 100% betragen können.

Seit der Verfügbarkeit von monoklonalen Antikörpern (mAK) gegen Human-Interferon-alpha (z.B. Secher, D.S. and D. C. Burke, Nature285,446-450/1980 + US-PS 4423147) wurden mehrere immunchemische Methoden beschrieben, um schneller, sicherer und genauer als mit dem biologischen Test IFN-Konzentrationen in Lösungen bestimmen zu können.

Solche immunchemische Verfahren auf der Grundlage des Einsatzes von monoklonalen Antikörpern können auf verschiedenen Testprinzipien beruhen:

a) Radioimmunoassays als kompetetive Bindungstests (Meurs, E. et al., Infect. Immun. 37,919-926 (1982); Trotta, P. et al., J. 8iol. Resp. Modif. 2, 348-359 (1983); Parnier, J. et al., J. Nucl. Medicine 25, 765-772 (1984)).

b) Immunradiometrische Assays (Secher, D. S., Nature 290, 501-502 [1981 ]; Staehelin, T. et al., Methods Enzymol. 79, 589 [1981];Horovitzetal., in: ImmunoenzymaticTechniques,ed.S. Avrameas,p. 193,ElsevierAmsteidam [1983|; Protzmann, W. et al., J. Clin, Microbiol. 22,596-599 (1985)).

c) Enzymimmunoassays (Gallati, H., J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 20,907-914 [1982); Berthold, W. et al.. Arzneimittelforsch. 35, 364-369(1985)).

Die beschriebenen Verfahren nutzen mAK bzw. polygonale Antikörper (aus Antiseren) gegen Human-Interferon-alpha in unterschiedlichen Kombinationen und Testverfahren, wobei Fostphasensysteme und /erfahren in Lösung angewendet werden.

Die erreichten Testparameter variieren hinsichtlich der Empfindlichkeit, der Zeitdauer, des Arbeitsaufwandes und des Detektionssystems (Radioaktivität, Enzymaktivität). Bei den beschriebenen Festphasensystemen werden meist Polystryrol-Kugeln in entsprechenden Reagenzgläsern oder PVC-bzw. Polystyroltestplatten als feste Phase eingesetzt. Die Bescnichtung der festen Phase mit Antikörpern erfolgt durch Benetzen der Oberfläche des Plastmaterials mit der Antikörper-haltigen Lösung für eine gewisse Zeit.

Die bisher veröffentlichten Verfahren betreffen entweder HulFN-alpha-2 ode/ Leukozyten-IFN (HulFN-alpha). Für HulFN-alpha-1 gibt es bisher keine publizierte immunchemische Bestimmungsmethode. Die Hi.vna Cell Tech verkauft einen Testkit mit dem mAK „JOK", mit dem es möglich sein könnte, HulFN-alpha-1 zu bestimmen; ohn ι daß dies im Prospekt ausgewiesen wäre. Die Testempfindliclikeit der einzelnen vorgeschlagenen Verfahi en wird unterschiedlich angegeben und hängt in erheblichem Maße von den Testbedingungen ab.

Mit extrem langen Testzeiten, die für Routinebestimmungen nicht akzeptabel sind, sollen für HulFN-alpha-2 noch 5 IU/ml nachweisbar sein.

Die Nachteile der bisher bekannten immunchemischen Verfahren zum quantitativen Nachweis von Human-Interferon-alpha sind in der Art und Weise der Beschichtung der Plastmaterialien, der z.T. sehr langen Reaktionszeiten, der langen Meßzeiten und der in einigen Fällen beschriebenen komplizierten Technik zur Trennung von freien und gebundenen Radioaktivitäten (bei den auf kompetitiver Bindung beruhenden Radioimmunoassays) begründet.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, Human-lnterferon-alpha-2 mit Hilfe eines immunenzymometrischen Testes unter Verwendung des Zwei-Seiten-Systems in rationeller Weise quantitativ, schnell und sicher bestimmen zu können, wobei wegen der Vermeidung des Einsatzes von Radioaktivität ein umweltfreundliches Verfahren zur Anwendung kommen soll.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Das erfindungsgemäße Verfahren zum quantitativen Nachweis von Human-lnterferon-alpha-2 mit Hilfe eines immunchemischen Verfahrens in Form eines immunenzymometrischen Assays ist dadurch gekennzeichnet, daß der erste Antikörper an die Oberfläche der Näpfe von Mikrotesrplatten aus Polystyrol oder einem anderen Material wie z. B. PVC als Trägermaterial für den Festphasen-Immunoassay angetrocknet wird. Solche Antikörper-beschichteten Platten sind bei 4⁰C in trockenem Zustand für mehrere Wochen haltbar. In die Reaktionsnäpfe der mit Antikörpern beschichteten Platten werden erfindungsgemäß nacheinander zuerst die zu messende IFN-haltige Lösung, dann der 2. Antikörper (z.B. monoklonaler Antikörper), der mit Meerrettich-Peroxydase nach bekanntem Verfahren markiert ist, eingefüllt und inkubiert. Ein bevorzugt eingesetzter mAK ist ZIM-IIB 2 (ZIMListe 1986 0086). Nach gründlichem Waschen der Reaktionsgefäße wird eine Substratlösung (Farbstoff) zugegeben, und nach angemessener Reaktionszeit die Reaktion durch Zugabe einer Säure gestoppt. Die entstandene Färbung in den einzelnen Näpfen der Mikrotiterplatte wird schließlich durch photometrische Messung der Extinktion an einem entsprechend geeigneten Photometer quantifiziert.

Alle Arbeiten lassen sich bei Zimmertemperatur durchführen. Der Test läuft als „one-tube-assay " und ist damit sehr einfach und leicht handhabbar. Die Testanordnung gestattet die gleichzeitige Bestimmung von vielen Proben durch eine Person in weniger als 5 Stunden. Der Test ist sowohl für natürliches wie für rekombinantes Human-IFN-alpha-2 geeignet, darüber hinaus auch für die Bestir,..lung von Hybrid-IFN-Molekülen, die Epitope enthalten, mit denen mAK gegen Human-IFN-alpha-2 reagieren. Die Erfindung soll an einem Ausführungsbeispiil noch näher erläutert werden.

Ausführungsbeispiel

Immunenzymometrisches Bestimmungsverfahren für den quantitativen Nachweis von Human-lnterferon-alpha-2: Als Reaktionsgefäße werden die Näpfe von 96er-Mikrotestplatten verwendet. In die einzelnen Näpfe werden je 200 μΙ des ersten Antikörpers (polyklonaleanti-Human-lnterferon-alphr-Antikörper vom Schaf; 25pg/ml Beschichtungspufferder Zusammensetzung 0.015M Na₂CO₃ - 0,035M NaHCJ₃ - 0,02% NaN₃-pH9,6; 5000 Neutralisationseinheiten/ml) einpipettiert und über Nacht bei 37^CC angetrocknet. Anschließpr.j werden die Näpfe der Mikrotestplatten je mit 200μΙ TBS (Tris-gepufferte Salzlösung: 0.05M Tris-0,2M NaCI, pHH7,4 - 0,1 %Tween 20) oder mit 200μΙ einer proteinhaltigen Lösung in TBS gefüllt und /weeks Blockierung der noch freien proteinbindenden Stellen für 1 Std. bei Zimmertemperatur inkubiert und dann wieder ausgegossen. Danach werden 100μΙ einer IFN-Standard-Lösung bzw. der zu untersuchenden Probe verschiedenen Verdünnungsgrades eingefüllt und für 3 Stunden inkubiert (Schütte! in feuchter Kammer). Nach 3maligem Waschen mit H₂O werden 50μΙ des mit Peroxydase markierten mAK ZIM-IIB 2 eingefüllt und für 1 Stunde bei Zimmertemperatur inkubiert (Schütteln in fsuchter Kammer). Nach mindestens 5maligem Waschen mit H₂O werden in die einzelnen Näpfe jeweils 240μΙ einer Substratlösung z.B.:

O-Phenylendiamin 0,4 mg/ml

H₂O₂ 0,015%ig

Phosph.-Zitratpuffer pH 5,0

einpipettiert und für einige Minuten (z. B. 15 Minuten) inkubiert. Mit 60μΙ 2,5N H₂SO₄ wird die Farbreaktion in den Näpfen abgestoppt. Die Farbintensität in den einzelnen Näpfen wird schließlich photometrisch bei einer Wellenlänge von 492 nm gemessen.

Aus de' gemessenen Extinktion kann anhand der Standardkurve der IFN-alpha-2-Gehalt einer Lösung ermittelt werden.

Claims

1. Immunenzymomeirisches Bestimmungsverfahren für den quantitativen !Nachweis von Humanlnterferon-alpha-2, dadurch gekerm .eichnet, daß der erct° Antikörper ein polyklonaler Antikörper eines Vertebratenorganismus gegen HulFN-alpha oder ^inmonoklonaler Antikörper, der mit HuIFN-alpha-2 reagiert, und der zweite Antikörper mit einem Enzym markiert ist und entweder polyklonaler oder monoklonaler Herkunft ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der erste Antikörper an die feste Phase entweder angetrocknet oder durch feuchte Beladung an die Wände des Reaktionsgefäßes absorbiert wird.