DD207768A1 - Verfahren zur bestimmung von reduzierten pyridinphosphonukleotiden in loesungen - Google Patents

Abstract

DAS ZIEL UND DIE AUFGABE DER ERFINDUNG BESTEHEN DARIN, EIN VERFAHREN ZUR ANALYTISCHEN BESTIMMUNG REDUZIERTER PYRIDINPHOSPHONUKLEOTIDE ZU ENTWICKELN, BEI DEM EINE PEROXIDASE-ENZYMELEKTRODE BENUTZT WIRD. ERFINDUNGSGEMAESS WIRD DIE AUFGABE DADURCH GELOEST, DASS DIE AEROBE OXYDATION DER REDUZIERTEN PYRIDINPHOSPHONUKLEOTIDE, DIE IN GEGENWART VON PEROXIDASEN MIT SEHR GERINGER GESCHWINDIGKEIT ABLAEUFT, DURCH ZUSATZ VON COKATALYSATOREN SO STARK BESCHLEUNIGT WIRD, DASS DIESE REAKTION MIT ENZYMELEKTRODEN GEMESSEN WERDEN KANN. ALS COKATALYSATOREN WERDEN SALZE DES ZWEIWERTIGEN MANGANS IN VERBINDUNG MIT PHENOLISCHEN VERBINDUNGEN UND REDOXFARBSTOFFEN SOWIE SULFITIONEN EINGESETZT. DIE ERFINDUNG IST IN DER MEDIZINISCHEN DIAGNOSTIK UND IN DER PRODUKTIONSKONTROLLE EINSETZBAR.

Description

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Dr. D. Kirstein

Dr. F. Scheller

P. Schubert

B. Dekowski . :

H. Sens

"Verfahren zur Bestimmung von reduzierten Pyridinphosphonukleotiden in Lösungen" '

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein qualitatives und quantitatives Bestimmungsverfahren für reduzierte Pyridinphosphonukleotide, 1,4-Dihydronikotinamidadenindinukleotid (HADH) und 1,4-Dihydronikotinamidadenindinukleotidphosphat (KADPH) mit Hilfe einer Perozldase-Enzymelektrode. Der Einsatz der Enzymelektrode ist in der medizinischen Diagnostik möglich, z. B. für die Bestimmung von freiem EfADH oder HADPH sowie zur Bestimmung von Enzymen und deren Substraten, die bei Reaktionen beteiligt sind, in deren Verlauf reduzierte Pyridinphosphonukleotide entstehen oder verbraucht werden.

Weiterhin ist der Einsatz in Laboratorien und in der Produktion für Meß- und Kontrollzwecke möglich.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen Der nachweis und die Bestimmung von HADH und S^-ADPH (im folgenden als HAD(P)H zusammengefaßt) werden gegenwärtig durch Messung der optischen Dichte bei 340 nm durchgeführt. Diese Methode ist stark abhängig von der optischen Transparenz der zu untersuchenden Probe und liefert bei stärk getrübten lösungen bzw. bei Anwesenheit von Substanzen mit starker optischer Absorption bei der genannten Wellenlänge ungenaue Ergebnisse. Weiterhin sind Versuche bekannt, diesen Nachteil durch Anwendung elektrochemischer, insbesondere amperometri-,scher Methoden zu umgehen. Bei diesen Verfahren wird die Abnahme der Sauerstoffkonzentration in der Meßlösung bei der

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ka.talytischen Oxydation von HAD(P)H bestimmt. Als Katalysatoren werden autoxidable chemische Verbindungen, z. B. Phenazinmethosulfat (Ä. A. Malinauskas und J. J. Kulys Biotechnol. Bioeng. 2^ 513 (1979)) oder Enzyme wie Diaphorase oder Peroxidase benatzt (F. S. Cheng and G. D. Christian Anal. Chem. 4£> 1785 (1977)). Die Säuerstoffmessung erfolgt mit Hilfe handelsüblicher amperometrischer Sauerstoffmeßgeräte über Sauerstoff elektroden.

Ferner ist es bekannt, die HAD(P)H-Qxydation nicht in der gesamten Lösung, sondern nur an modifizierten Elektroden durchzuführen. Derartige Modifizierungen erfolgen durch Bindung bestimmter Chemikalien an die Elektrodenoberfläche (H. Huck und H. L. Schmidt Angew. Chemie £2 421 (1981)) oder durch Kombination einer amperometrischen Elektrode mit biologischen Systemen (z. B. DDR-Patent 153 437).

Hachteil der Verfahren mit lösliehen Enzymen ist der hohe Enzymverbrauch (z. B, bei Peroxidase 10 Einheiten je Messung) und bei den Zeil- oder Organellelektroden die langen Einstellzeiten bzw. bei chemisch modifizierten Elektroden die zeitliche Inkonstanz der Anzeige. Ausarbeiten zum Hechanismus der peroxidasekatalysierten aeroben Oxydation von IADH ist der' beschleunigende Einfluß von Cokatalysatoren bekannt .(T. Akazawa und E. E. Com J. Biol. Chem. 232 403 (1958)). Bei der analytischen Anwendung (Cheng und Christian s.o.) haben

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aber nur Mn -Salze einen deutlichen Effekt erbracht, dessen Höhe nicht ausreichte, um die Reaktion mit einer Enzymelekw trode messen zu können. Unter bestimmten Konzentrationsbedingungen bilden sich in dem System Sauerstoff, SAD(P)H, Peroxidase Instabilitäten aus, die zu. oszillierenden Reaktionsgeschwindigkeiten führen .und damit analytische Bestimmungen unmöglich machen (L. P. Olsen.. Biochim. Biopfoys. Acta 527 212 (1978); -.7. R. Fedkina T. ¥. Bronnikova, F. I. Ataullakhanov stadia biophys. 82 159 (1981)) - /

4 ü h 4

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung besteht darin, die Reaktionsgeschwindigkeit der peroxidasekatalysierten aeroben Oxydation von IAD(P)H so zu erhöhen, daß die Reaktion mit einer Peroxidase-Enzymelektrode gemessen werden kann. Die Bestimmung von KAD(P)H oder⁷von Enzymen oder deren Substraten, die an Reaktionen beteiligt sind, in denen UAD(P)H entsteht oder verbraucht wird, soll rationalisiert bzw. in Medien mit geringer optischer Transparenz durchgeführt werden.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren für die analytische Bestimmung von IAD(P)H mittels einer Peroxidase-Snzymelektrode zu entwickeln. Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß zxxx HAD(P)H-MeSsung der Lösung in einer Meßanordnung, bestehend aus Enzymelektrode und Meßzelle, eine Cokatalysatorkombination, bestehend aus Mangan-II-salzen in Konzentrationen von 0,03 bis 0,3 mmol/1, phenolischen Verbindungen von 2 bis 20 yumoi/1 und Redoxfarbstoffen von 1 · 10*" bis 3 ♦ 10· mol/1 und/oder Sulfitionen von 0,1 bis 3 · 10 ^J mol/1 bei einem pH-Wert von 6,0 bis 8,5 gesetzt wird (Vermeidung von Oszillationen). lach Einstellung eines konstanten Grundstromes am Meßgerät (Potentiostat) wird die zu analysierende Probe in die Meßzelle "injiziert. Als Meßsignal wird'der Stromabfall (Al) (Sauerstoffνerbrauch durch die Reaktion) oder aber günstiger das Minimum der dl/ dt-Kurve (t = Zeit) verwendet. Als phenolische Verbindungen werden zweckmäßigerweiseResorcin, 2,4-Dichlorphenol, 2-Chlor-4-phenylphenol, o-, m-, und ρ-Kresöl, p-Chlorthiophenol,öC-laphtol, 3,4-Dimethylphenol, Phenol, m-Hydrozybenzoesäure, Thyroxin und 4-Hydroxyzimtsäure benutzt.

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Als Redozfarbstoffe eignen sieh besonders Methylenblau, Kristallviolett und Malachitgrün.

Die C©katalysatoren können einzeln, vorwiegend aber in Kombination eingesetzt werden, wobei 3-fach Kombinationen den wesentlichen erfindungsgemäß beanspruchten synergistischen Effekt ergeben. Die Membran wird in bekannter Weise aus einer Peroxidase und aus membranbildenden Stoffen wie natürlichen oder, synthetischen Polymeren gegebenenfalls mit nachträglicher Vernetzung hergestellt. Diese wird dann zwischen MD(P)H-durehlässige Stützschichten z. B, Siebe,· Dialysemembranen und die Oberfläche einer Sauerstoffelektrode montiert.

Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens sind Möglichkeiten der Messung in getrübten lösungen und kurze Meßzeiten.

Ausführungsbeispiele .'.' ' _;

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Die Erfindung soll nachstehend an zwei Ausführungsbeispie-1en näher erläutert werden.

Beispiel 1

Eine Lösung von 10 mg Meerrettichperoxidase in 0,25 ml Wasser wird mit 0,25 ml einer 10 folgen, wäßrigen Gelatinelösung und 0,02^ ml einer 5 %igen Glutaraldehydlösung versetzt, vermischt, auf einer PVC-Platte auf eine Fläche von TO cm ausgestrichen und 12 - 24 h bei +4 C getrocknet. Der entstehende Film wird zerteilt und ein Stück davon mit Hilfe einer Dialysemembran auf eine Säuerstoffelektrode gespannt. Die Elektrode wird in eine. Meßzelle montiert und mit einem Polarographen verbunden. Die Polarisationsspannung wird auf -600 mV einge-

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stellt und die erste Ableitung des Stromes nach der Zeit (dl/dt) auf einem Schreiber als Punktion der Zeit registriert, In der Meßzelle befinden sich 2,0 ml einer Lösung folgender Zusammensetzung:

Iris-Zitratpaffer pH =8,0 0,1 mol/1 Mn^-chlorid 0,175 mmol/1, 2,4 Dichlorphenol 16 ,umol/1 Methylenblau 60 nmol/1.

Die Messung wird durch Injektion von 100 ,al .HADH-Lösüng gestartet.

Zwischen 2 · 10"^ mol/1 und mindestens 2 · 10"^ mol/1 IADH besteht Linearität zwischen dem dl/dt Minimum (da Konzentrationsabfall für ©2 gemessen wird) and der injizierten HADH-Menge. Die Empfindlichkeit der Messung beträgt ca. 25 nA/min für 10"⁴ mol/1 IiADH (Konz. in der Meßzelle).'..QIe untere Hachweisgrenze mit einem Tariationskoeffizient von 4 % (aus 10 Messungen) beträgt: 2 · 10 mol/1 HADH.

Beispiel 2 . ,

Eine Lösung von 10 mg Lactoperosidase in 0,25 mlPhosphatpuffer pH 6,0 (0,05 mol/1) und 0,25 ml einer 10 %igen wäßrigen Polyvinylalkdhollö'sung werden vermischt,und analog zu Beispiel 1 wird eine Enzymelektrode hergestellt. Die Apparatur ist ebenfalls identisch mit der in Beispiel 1. Als Meßlösung (Grundlösung) werden eingesetzt: Phosphatpaffer nach Sörensen pH 6,0, Ηη-Φ-chlorid 2,5 mmol/1, Thyroxin 20 /Umol/1, la-

—4 —4.

triumsulfit 10 ^ mol/1, Ethylendiamintetraacetat: 10 ^ mol/1.

Die Reaktion wird durch 100 ,ul lADFH-Lösung gestartet. Die leßempfindlichkeit beträgt 15 nA/min für 10"⁴* mol/1 HADPH. /

Claims (3)

1. Erfindungsanspruch - " , .

   1. Verfahren zur Bestimmung von reduzierten Pyridinphosphonukleotiden in Lösungen mittels einer amperometrischen Enzymelektrode, dadurch gekennzeichnet, daß der Lösung als Gokatalys§toren eine Kombination von j&angan-II-salzen in Konzentrationen von 0,03 bis 0,3 mmol/i, phenolischen Verbindungen von 2 bis 20 yumol/l und Redoxfarbstoffen von

   1 · 10"⁸ bis 3 ' 10"³ mol/1 und/oder Sulfitionen von 0,1 bis 3 · 10 mol/1 zugesetzt werden, worauf ein konstanter Grundstrom eingestellt und die zu untersuchende Probe eingebracht und abschließend der durch den Säuerstoffverbrauch der Reaktion verursachte Stromabfall A I bei einem pH-Wert von 6,0 bis 8,5 gemessen wird.
2. 2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß als phenolische Verbindungen Resorcin, 2,4-Dichlorphenol, 2-Chlor-4-phenylphenol, o-, m-, und p-Kresol, p-Chlorthiophenol,fi^-Iaphtol, 3,4-^Bimethylphenol, Phenol, m-Hydroxy-

   • benzoesäure, !Thyroxin und 4-Hydroxyzimtsäure eingesetzt werden.
3. 3. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Redoxfarbstoffe Methylenblau, Kristallviolett, Malachitgrün verwendet werden. .