DD207768A1

DD207768A1 - METHOD FOR DETERMINING REDUCED PYRIDINE PHOSPHONUCLEOTIDES IN SOLUTIONS

Info

Publication number: DD207768A1
Application number: DD24044282A
Authority: DD
Inventors: Dieter Kirstein; Frieder Scheller; Florian Schubert; Brigitte Dekowski; Helga Sens
Original assignee: Adw Ddr
Priority date: 1982-06-04
Filing date: 1982-06-04
Publication date: 1984-03-14

Abstract

DAS ZIEL UND DIE AUFGABE DER ERFINDUNG BESTEHEN DARIN, EIN VERFAHREN ZUR ANALYTISCHEN BESTIMMUNG REDUZIERTER PYRIDINPHOSPHONUKLEOTIDE ZU ENTWICKELN, BEI DEM EINE PEROXIDASE-ENZYMELEKTRODE BENUTZT WIRD. ERFINDUNGSGEMAESS WIRD DIE AUFGABE DADURCH GELOEST, DASS DIE AEROBE OXYDATION DER REDUZIERTEN PYRIDINPHOSPHONUKLEOTIDE, DIE IN GEGENWART VON PEROXIDASEN MIT SEHR GERINGER GESCHWINDIGKEIT ABLAEUFT, DURCH ZUSATZ VON COKATALYSATOREN SO STARK BESCHLEUNIGT WIRD, DASS DIESE REAKTION MIT ENZYMELEKTRODEN GEMESSEN WERDEN KANN. ALS COKATALYSATOREN WERDEN SALZE DES ZWEIWERTIGEN MANGANS IN VERBINDUNG MIT PHENOLISCHEN VERBINDUNGEN UND REDOXFARBSTOFFEN SOWIE SULFITIONEN EINGESETZT. DIE ERFINDUNG IST IN DER MEDIZINISCHEN DIAGNOSTIK UND IN DER PRODUKTIONSKONTROLLE EINSETZBAR.THE OBJECT AND OBJECT OF THE INVENTION ARE TO DEVELOP A METHOD FOR THE ANALYTICAL DETERMINATION OF REDUCED PYRIDINE PHOSPHONUCLEOTIDES WHERE A PEROXIDASE ENZYME ELECTRODE IS USED. IT IS ESTABLISHED BY THE INVENTION THAT THE AEROBIC OXYDATION OF REDUCED PYRIDINE PHOSPHONUCLEOTIDES, WHICH CARRY OUT AT VERY LOW SPEED IN THE PRESENCE OF PEROXIDASES, IS ACCELERATED THROUGH THE ADDITION OF COCATALYSTS SO THAT THIS RESPONSE CAN BE MEASURED WITH ENZYME ELECTRODES. SALTS OF THE TWIN-QUALITY MANGANE ARE USED AS COCATALYZERS IN CONJUNCTION WITH PHENOLIC COMPOUNDS AND REDOX DYES AND SULPHONES. THE INVENTION CAN BE USED IN MEDICAL DIAGNOSTICS AND PRODUCTION CONTROL.

Description

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Dr. D. KirsteinDr. D. Kirstein

Dr. F. Scheller Dr. F. Scheller

P. SchubertP. Schubert

B. Dekowski . :B. Dekowski. :

H. SensH. Sens

"Verfahren zur Bestimmung von reduzierten Pyridinphosphonukleotiden in Lösungen" ' "Method for the determination of reduced pyridine phosphonucleotides in solutions"'

Field of application of the invention

Die Erfindung betrifft ein qualitatives und quantitatives Bestimmungsverfahren für reduzierte Pyridinphosphonukleotide, 1,4-Dihydronikotinamidadenindinukleotid (HADH) und 1,4-Dihydronikotinamidadenindinukleotidphosphat (KADPH) mit Hilfe einer Perozldase-Enzymelektrode. Der Einsatz der Enzymelektrode ist in der medizinischen Diagnostik möglich, z. B. für die Bestimmung von freiem EfADH oder HADPH sowie zur Bestimmung von Enzymen und deren Substraten, die bei Reaktionen beteiligt sind, in deren Verlauf reduzierte Pyridinphosphonukleotide entstehen oder verbraucht werden.The invention relates to a qualitative and quantitative determination method for reduced Pyridinphosphonukleotide, 1,4-Dihydronikotinamidadenindinukleotid (HADH) and 1,4-Dihydronikotinamidadenindinukleotidphosphat (KADPH) using a perozldase enzyme electrode. The use of the enzyme electrode is possible in medical diagnostics, z. For example, for the determination of free EfADH or HADPH as well as for the determination of enzymes and their substrates, which are involved in reactions in the course of which reduced Pyridinphosphonukleotide arise or consumed.

Weiterhin ist der Einsatz in Laboratorien und in der Produktion für Meß- und Kontrollzwecke möglich.Furthermore, the use in laboratories and in production for measuring and control purposes is possible.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen Der nachweis und die Bestimmung von HADH und S^-ADPH (im folgenden als HAD(P)H zusammengefaßt) werden gegenwärtig durch Messung der optischen Dichte bei 340 nm durchgeführt. Diese Methode ist stark abhängig von der optischen Transparenz der zu untersuchenden Probe und liefert bei stärk getrübten lösungen bzw. bei Anwesenheit von Substanzen mit starker optischer Absorption bei der genannten Wellenlänge ungenaue Ergebnisse. Weiterhin sind Versuche bekannt, diesen Nachteil durch Anwendung elektrochemischer, insbesondere amperometri-,scher Methoden zu umgehen. Bei diesen Verfahren wird die Abnahme der Sauerstoffkonzentration in der Meßlösung bei der Characteristic of known technical solutions The detection and determination of HADH and S ^- ADPH (hereinafter summarized as HAD (P) H) are currently carried out by measuring the optical density at 340 nm. This method is highly dependent on the optical transparency of the sample to be examined and gives inaccurate results in strongly turbid solutions or in the presence of substances with strong optical absorption at the wavelength mentioned. Furthermore, attempts are known to circumvent this disadvantage by using electrochemical, in particular amperometric, shear methods. In these methods, the decrease of the oxygen concentration in the measuring solution in the

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ka.talytischen Oxydation von HAD(P)H bestimmt. Als Katalysatoren werden autoxidable chemische Verbindungen, z. B. Phenazinmethosulfat (Ä. A. Malinauskas und J. J. Kulys Biotechnol. Bioeng. 2^ 513 (1979)) oder Enzyme wie Diaphorase oder Peroxidase benatzt (F. S. Cheng and G. D. Christian Anal. Chem. 4£> 1785 (1977)). Die Säuerstoffmessung erfolgt mit Hilfe handelsüblicher amperometrischer Sauerstoffmeßgeräte über Sauerstoff elektroden.catalytic oxidation of HAD (P) H determined. As catalysts are autoxidable chemical compounds, eg. Phenazine methosulfate (A. A. Malinauskas and J.J. Kulys Biotechnol., Bioeng., 2: 513 (1979)) or enzymes such as diaphorase or peroxidase (F.S. Cheng and G. D. Christian Anal. Chem., 1785 (1977)). The Säutrstoffmessung takes place using commercially available amperometric Sauerstoffmeßgeräte electrodes via oxygen.

Ferner ist es bekannt, die HAD(P)H-Qxydation nicht in der gesamten Lösung, sondern nur an modifizierten Elektroden durchzuführen. Derartige Modifizierungen erfolgen durch Bindung bestimmter Chemikalien an die Elektrodenoberfläche (H. Huck und H. L. Schmidt Angew. Chemie £2 421 (1981)) oder durch Kombination einer amperometrischen Elektrode mit biologischen Systemen (z. B. DDR-Patent 153 437).Furthermore, it is known to carry out the HAD (P) H-oxidation not in the entire solution, but only on modified electrodes. Such modifications are made by binding certain chemicals to the electrode surface (H. Huck and H. L. Schmidt Angew. Chemistry £ 2 421 (1981)) or by combining an amperometric electrode with biological systems (eg DDR patent 153 437).

Hachteil der Verfahren mit lösliehen Enzymen ist der hohe Enzymverbrauch (z. B, bei Peroxidase 10 Einheiten je Messung) und bei den Zeil- oder Organellelektroden die langen Einstellzeiten bzw. bei chemisch modifizierten Elektroden die zeitliche Inkonstanz der Anzeige. Ausarbeiten zum Hechanismus der peroxidasekatalysierten aeroben Oxydation von IADH ist der' beschleunigende Einfluß von Cokatalysatoren bekannt .(T. Akazawa und E. E. Com J. Biol. Chem. 232 403 (1958)). Bei der analytischen Anwendung (Cheng und Christian s.o.) habenHachteil of the processes with soluble enzymes is the high enzyme consumption (eg, in peroxidase 10 units per measurement) and the cell or organelle electrodes, the long response times or chemically modified electrodes, the temporal inconstancy of the display. Elaboration on the mechanism of peroxidase-catalyzed aerobic oxidation of IADH is known to be the accelerating influence of cocatalysts (T Akazawa and EE Com J. Biol. Chem., 232, 403 (1958)). In the analytical application (Cheng and Christian so) have

Oj,Oj,

aber nur Mn -Salze einen deutlichen Effekt erbracht, dessen Höhe nicht ausreichte, um die Reaktion mit einer Enzymelekw trode messen zu können. Unter bestimmten Konzentrationsbedingungen bilden sich in dem System Sauerstoff, SAD(P)H, Peroxidase Instabilitäten aus, die zu. oszillierenden Reaktionsgeschwindigkeiten führen .und damit analytische Bestimmungen unmöglich machen (L. P. Olsen.. Biochim. Biopfoys. Acta 527 212 (1978); -.7. R. Fedkina T. ¥. Bronnikova, F. I. Ataullakhanov stadia biophys. 82 159 (1981)) - /but only Mn salts produced a marked effect, the level of which was insufficient to measure the reaction with an enzyme elec trode. Under certain concentration conditions, oxygen, SAD (P) H, peroxidase instabilities develop in the system. and thus make analytical determinations impossible (LP Olsen .. Biochim Bioboys Acta 527 212 (1978); -7. R. Fedkina T. ¥. Bronnikova, FI Ataullakhanov stadia biophys. 82 159 (1981)) - /

4 ü h 44 h 4

Object of the invention

Das Ziel der Erfindung besteht darin, die Reaktionsgeschwindigkeit der peroxidasekatalysierten aeroben Oxydation von IAD(P)H so zu erhöhen, daß die Reaktion mit einer Peroxidase-Enzymelektrode gemessen werden kann. Die Bestimmung von KAD(P)H oder⁷von Enzymen oder deren Substraten, die an Reaktionen beteiligt sind, in denen UAD(P)H entsteht oder verbraucht wird, soll rationalisiert bzw. in Medien mit geringer optischer Transparenz durchgeführt werden.The object of the invention is to increase the reaction rate of the peroxidase-catalyzed aerobic oxidation of IAD (P) H so that the reaction with a peroxidase enzyme electrode can be measured. The determination of KAD (P) H or ⁷ of enzymes or their substrates involved in reactions in which UAD (P) H is formed or consumed should be rationalized or carried out in media of low optical transparency.

Explanation of the essence of the invention

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren für die analytische Bestimmung von IAD(P)H mittels einer Peroxidase-Snzymelektrode zu entwickeln. Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß zxxx HAD(P)H-MeSsung der Lösung in einer Meßanordnung, bestehend aus Enzymelektrode und Meßzelle, eine Cokatalysatorkombination, bestehend aus Mangan-II-salzen in Konzentrationen von 0,03 bis 0,3 mmol/1, phenolischen Verbindungen von 2 bis 20 yumoi/1 und Redoxfarbstoffen von 1 · 10*" bis 3 ♦ 10· mol/1 und/oder Sulfitionen von 0,1 bis 3 · 10 ^J mol/1 bei einem pH-Wert von 6,0 bis 8,5 gesetzt wird (Vermeidung von Oszillationen). lach Einstellung eines konstanten Grundstromes am Meßgerät (Potentiostat) wird die zu analysierende Probe in die Meßzelle "injiziert. Als Meßsignal wird'der Stromabfall (Al) (Sauerstoffνerbrauch durch die Reaktion) oder aber günstiger das Minimum der dl/ dt-Kurve (t = Zeit) verwendet. Als phenolische Verbindungen werden zweckmäßigerweiseResorcin, 2,4-Dichlorphenol, 2-Chlor-4-phenylphenol, o-, m-, und ρ-Kresöl, p-Chlorthiophenol,öC-laphtol, 3,4-Dimethylphenol, Phenol, m-Hydrozybenzoesäure, Thyroxin und 4-Hydroxyzimtsäure benutzt.The invention has for its object to develop a method for the analytical determination of IAD (P) H by means of a peroxidase Snzymelektrode. The object is achieved in that zxxx HAD (P) H solution of the solution in a measuring arrangement consisting of enzyme electrode and measuring cell, a cocatalyst combination consisting of manganese salts in concentrations of 0.03 to 0.3 mmol / 1, phenolic compounds of 2 to 20 μmol / l and redox dyes of 1 x 10 -5 to 3 x 10 -5 mol / l and / or sulphite ions of 0.1 to 3 x 10 ^-5 mol / l at a pH of 6 , 0 to 8,5 (avoidance of oscillations) After setting a constant background current at the measuring instrument (potentiostat), the sample to be analyzed is injected into the measuring cell. The measurement signal used is the current drop (Al) (oxygen consumption by the reaction) or, more favorably, the minimum of the dl / dt curve (t = time). Desirably, phenolic compounds are resorcinol, 2,4-dichlorophenol, 2-chloro-4-phenylphenol, o-, m- and p-cresol, p-chlorothiophenol, α-C-laphtol, 3,4-dimethylphenol, phenol, m -hydrobenzoic acid , Thyroxine and 4-hydroxycinnamic acid.

LQLLl 2LQLLl 2

Als Redozfarbstoffe eignen sieh besonders Methylenblau, Kristallviolett und Malachitgrün.Particularly suitable as redox dyes are methylene blue, crystal violet and malachite green.

Die C©katalysatoren können einzeln, vorwiegend aber in Kombination eingesetzt werden, wobei 3-fach Kombinationen den wesentlichen erfindungsgemäß beanspruchten synergistischen Effekt ergeben. Die Membran wird in bekannter Weise aus einer Peroxidase und aus membranbildenden Stoffen wie natürlichen oder, synthetischen Polymeren gegebenenfalls mit nachträglicher Vernetzung hergestellt. Diese wird dann zwischen MD(P)H-durehlässige Stützschichten z. B, Siebe,· Dialysemembranen und die Oberfläche einer Sauerstoffelektrode montiert.The Catalysts can be used individually, but predominantly in combination, with triple combinations resulting in the essential synergistic effect claimed according to the invention. The membrane is prepared in known manner from a peroxidase and from membrane-forming substances such as natural or synthetic polymers optionally with subsequent crosslinking. This is then between MD (P) H-duroshaft supporting layers z. B, sieves, · dialysis membranes and the surface of an oxygen electrode mounted.

Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens sind Möglichkeiten der Messung in getrübten lösungen und kurze Meßzeiten.Advantages of the method according to the invention are possibilities of measurement in cloudy solutions and short measuring times.

Ausführungsbeispiele .'.' ' _; Exemplary embodiments . '_;

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Die Erfindung soll nachstehend an zwei Ausführungsbeispie-1en näher erläutert werden.The invention will be explained in more detail below with reference to two Ausführungsbeispie-1en.

example 1

Eine Lösung von 10 mg Meerrettichperoxidase in 0,25 ml Wasser wird mit 0,25 ml einer 10 folgen, wäßrigen Gelatinelösung und 0,02^ ml einer 5 %igen Glutaraldehydlösung versetzt, vermischt, auf einer PVC-Platte auf eine Fläche von TO cm ausgestrichen und 12 - 24 h bei +4 C getrocknet. Der entstehende Film wird zerteilt und ein Stück davon mit Hilfe einer Dialysemembran auf eine Säuerstoffelektrode gespannt. Die Elektrode wird in eine. Meßzelle montiert und mit einem Polarographen verbunden. Die Polarisationsspannung wird auf -600 mV einge-A solution of 10 mg of horseradish peroxidase in 0.25 ml of water followed by 0.25 mL of a 10 aqueous solution of gelatin and 0.02 ^ ml of a 5% glutaraldehyde solution was added, mixed on a PVC sheet on an area of TO cm spread out and dried at +4 C for 12-24 h. The resulting film is split and a piece of it stretched on a Sästoffstoffelektrode using a dialysis membrane. The electrode is in a. Measuring cell mounted and connected to a polarograph. The polarization voltage is set to -600 mV.

24 O 4 4 424 O 4 4 4

stellt und die erste Ableitung des Stromes nach der Zeit (dl/dt) auf einem Schreiber als Punktion der Zeit registriert, In der Meßzelle befinden sich 2,0 ml einer Lösung folgender Zusammensetzung:and the first derivative of the current after time (dl / dt) registered on a recorder as a puncture of time, in the measuring cell are 2.0 ml of a solution of the following composition:

Iris-Zitratpaffer pH =8,0 0,1 mol/1 Mn^-chlorid 0,175 mmol/1, 2,4 Dichlorphenol 16 ,umol/1 Methylenblau 60 nmol/1.Iris citrate pH = 8.0 0.1 mol / 1 Mn ^ chloride 0.175 mmol / l, 2,4-dichlorophenol 16, umol / l methylene blue 60 nmol / l.

Die Messung wird durch Injektion von 100 ,al .HADH-Lösüng gestartet.The measurement is started by injection of 100 , al. HADH solution.

Zwischen 2 · 10"^ mol/1 und mindestens 2 · 10"^ mol/1 IADH besteht Linearität zwischen dem dl/dt Minimum (da Konzentrationsabfall für ©2 gemessen wird) and der injizierten HADH-Menge. Die Empfindlichkeit der Messung beträgt ca. 25 nA/min für 10"⁴ mol/1 IiADH (Konz. in der Meßzelle).'..QIe untere Hachweisgrenze mit einem Tariationskoeffizient von 4 % (aus 10 Messungen) beträgt: 2 · 10 mol/1 HADH.There is linearity between the dl / dt minimum (as concentration drop is measured for © 2) and the amount of HADH injected between 2 x 10 -9 mol / l and at least 2x10 -10 mol / l of IADH. The sensitivity of the measurement is about 25 nA / min for 10 " ⁴ mol / 1 IiADH (conc. In the measuring cell). The lower limit of detection with a variation coefficient of 4 % (from 10 measurements) is: 2 x 10 mol / 1 HADH.

Beispiel 2Example 2 . ,, .

Eine Lösung von 10 mg Lactoperosidase in 0,25 mlPhosphatpuffer pH 6,0 (0,05 mol/1) und 0,25 ml einer 10 %igen wäßrigen Polyvinylalkdhollö'sung werden vermischt,und analog zu Beispiel 1 wird eine Enzymelektrode hergestellt. Die Apparatur ist ebenfalls identisch mit der in Beispiel 1. Als Meßlösung (Grundlösung) werden eingesetzt: Phosphatpaffer nach Sörensen pH 6,0, Ηη-Φ-chlorid 2,5 mmol/1, Thyroxin 20 /Umol/1, la-A solution of 10 mg lactoperosidase in 0.25 ml pH 6.0 phosphate buffer (0.05 mol / l) and 0.25 ml of a 10% polyvinyl alcohol aqueous solution are mixed, and an enzyme electrode is prepared analogously to Example 1. The apparatus is likewise identical to that in Example 1. The following are used as the measuring solution (basic solution): Phosphate gapers of Sörensen pH 6.0, Ηη-Φ-chloride 2.5 mmol / l, thyroxine 20 / Umol / l,

—4 —4.-4 -4.

triumsulfit 10 ^ mol/1, Ethylendiamintetraacetat: 10 ^ mol/1.Triumsulfit 10 ^ mol / 1, ethylenediaminetetraacetate: 10 ^ mol / 1.

Die Reaktion wird durch 100 ,ul lADFH-Lösung gestartet. Die leßempfindlichkeit beträgt 15 nA/min für 10"⁴* mol/1 HADPH. /The reaction is started through 100 μl of IADFH solution. The read sensitivity is 15 nA / min for 10 " ⁴ * mol / 1 HADPH. /

Claims

Invention claim - ",.

1. A method for the determination of reduced Pyridinphosphonukleotiden in solutions by means of an amperometric enzyme electrode, characterized in that the solution as Gokatalys§toren a combination of j & angegan-II salts in concentrations of 0.03 to 0.3 mmol / i, phenolic compounds of 2 to 20 yumol / l and redox dyes of

1 × 10 ^-8 to 3 × 10 ^-3 mol / l and / or sulphite ions from 0.1 to 3 × 10 -5 mol / l are added, whereupon a constant background stream is set and the sample to be investigated is introduced and finally the acidic material consumption of the Reaction caused current drop AI is measured at a pH of 6.0 to 8.5.

2. The method according to item 1, characterized in that as phenolic compounds resorcinol, 2,4-dichlorophenol, 2-chloro-4-phenylphenol, o-, m-, and p-cresol, p-chlorothiophenol, fi ^ -Ilphtol, 3,4- ^ Bimethylphenol, phenol, m-hydroxy

• benzoic acid,! Thyroxine and 4-hydroxycinnamic acid.

3. The method according to item 1, characterized in that are used as redox dyes methylene blue, crystal violet, malachite green. ,