DD205930A1 - Verfahren zur herstellung von oxytetracyclin - Google Patents

Abstract

DIE ERFINDUNG BETRIFFT DIE HERSTELLUNG VON OXYTETRACYCLIN AUF FERMENTATIVEN WEGE UNTER VERWENDUNG VON SACCHAROSE ALS SUBSTRAT. DER ZWECK DER ERFINDUNG BESTEHT DARIN, DIE AUSSCHLIESSLICHKEIT DER SUBSTRATABHAENGIGKEIT AUFZUHEBEN UND EINE OXYTETRACYCLINFERMENTATION MIT VERGLEICHBAREN LEISTUNGEN AUCH AUF EINEM ALTERNATIVSUBSTRAT ZU ERMOEGLICHEN. ERFINDUNGSGEMAESS WIRD DIE AUFGABE DADURCH GELOEST, DASS ALS SUBSTRAT SACCHAROSE EINGESETZT WIRD, DIE VORHER IN IHRE BESTANDTEILE FRUKTOSE UND GLUKOSE ZERLEGT WIRD.

Description

Die Erfindung "betrifft die Herstellung von Oxytetracyolin auf fermentativem Wege unter Verwendung von Saccharose als Substrat.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Die Herstellung von Oxytetracyclin erfolgt 'bekanntlich, durch Kultivierung von Streptomyces rimosus auf Nährmedien, die als Kohlenhydratquelle Stärke oder ein hydrolysiertes Produkt derselben enthalten. Dieses Substrat wird durch Enzyme, die von dem Stamm während der Kultivierung gebildet werden, aufgeschlossen und dem Stoffwechsel zugeführt. Bei Anwendung von -Amyläse mit einem Temperaturoptimum von mindestens 60 C lassen sich auoh hohe Stärkekonzentrationen im Medium verwenden, so daß Hoohleistungsstämme mit ausreichendem" Substrat versorgt werden können, ohne daß Viskositätsprobleme den Fermentationsprozeß erschweren. Das Prinzip der Fermentation auf Medium mit polymeren Kohlenhydratsubstraten beruht darauf, durch eine verzögerte Substratzuführung infolge des Aufschlusses den Stoffwechsel in Richtung einer intensiven Biosynthese des Antibiotikums zu lenken. Dies läßt sich in gleicher Weise durch eine suocesive Substratdosierung erreichen, erfordert jedooh eine mineralisohe oder enzymatisch^ Spaltung der Stärke außerhalb des Fermentationssystems.

-&JI1L1982*O2O8Ö2-.

241427 2

Der Wachteil des geschilderten Standes der Technik besteht darin, daß Stärke nativ oder in hydrolysierter Form zur Verfügung stehen muß, um eine Oxytetraoyclinherstellung vornehmen zu können.

Ziel der Erfindung

Der Zweok der Erfindung besteht darin, die Aussohließliohkeit der Substratabhängigkeit aufzuheben und eine Oxytetraoyolinfermentation mit vergleichbaren Leistungen auch auf einem Alternativsubstrat zu ermöglichen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Regime zu entwickeln, welches die Anwendung nioht stärkehaltiger Medien bei der Oxytetraoyclinfermentation erlaubt. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß als Substrat Saccharose eingesetzt wird, die vorher in ihre Bestandteile Fruktose und Glukose zerlegt wird. Es wurde überraschend gefunden, daß über die bekannte Verwertbarkeit der Fruktoso durch Streptomyoes rimosus hinaus während der Produktbildungsphase Fruktose und Glukose parallel verstoffwechselt werden und die Biosyntheseleistung auoh von Hoohleistungsstämmen keine Einschränkung erfährt. Bei der Anwendung der Saccharose ist es erforderlich, eine mineralische oder enzymatisch^ Hydrolyse der Fermentation vorzusohalten, wobei die angewandte Technologie den Möglichkeiten angepaßt sein muß. Stehen entsprechende korrosionsbeständige Behälter zur Verfugung, so wird eine 40#ige Saooharoselösung mit soviel Schwefelsäure versetzt, daß eine Konzentration von 0,5-1 N im Reaktionsansatz vorliegt, Duroh Stehenlassen bei Temperaturen von 20 bis 30 ⁰C wird das Substrat innerhalb von 24 Std. völlig in Glukose und Fruktose zerlegt. Das gleiohe Resultat wird erzielt, wenn die genannte Saooharoselösung über einen Rohrreaktor geschickt wird, welcher an einen Träger fixierte Invertase enthält. Die Invertase wird dabei in bekannter Weise gereinigt und mit Glutaraidehyd auf den Träger aufge-

24 142? 2

braolit. Das erhaltene Hydrolysat wird 30 min. bei 120 C sterilisiert und in einem ebenfalls sterilisierten Behälter bevorratet. Die Verwendung im Fermentationsprozeß erfolgt mit Hilfe eines Substratdosierungsregimes. Zu diesem Zwecke wird zwisohen dem Vorratsbehälter und dem Fermenter ein aseptisoh arbeitendes Pumpsystem eingefügt, dessen Förderleistung so bemessen ist, daß 0,5 bis 2,0 ml/h pro 1 1 des Reaktornutzvolumens dosiert werden können.

Die 2>osierrate wird dabei durch ein Programm festgelegt. Wenn im Medium keine Kohlenhydratquelle als Start substrat enthalten ist, beträgt die Zuführung 0,6 bis 0,8 ml/1 . h von Anfang bis Ende. Wird dagegen eine Konzentration von maximal 2 $ Stärke im Ansatz vorgelegt, so riohten sich Beginn und Intensität der Dosierung nach der pH-Bewegung des Fermentationsansatzes. Die Dosierung setzt mit einer Rate von 0,6 bis 0,8 ml/1 . h ein, sobald das Maximum der Mediumsalkalisierung überschritten ist. Sie wird auf 1,2 bis 1,7 ml/ 1 . h erhöht, wenn nach 72 Stunden im Medium analytisch keine freie Glukose nachgewiesen werden kann. Im Verlaufe der Fermentation erweist es sich als notwendig, die GelöstsauerstOffkonzentration zu registrieren und durch Veränderung der Luftmenge oder der Rührungsgesohwindigkeit zu gewährleisten, daß eine Geistsauerstoffkonzentration von 40 $ des Sättigungswertes nioht unterschritten wird. Unter diesen Bedingungen werden in 200 Stunden Fermentationszeit mindestens 14 000 IE/ml erreioht.

Die Ökonomie des Lösungsprinzipes ergibt sioh vor allem aus der Sicherung der Antibiotikumherstellung bei Ausfall von Stärke als Kohlenhydratrohstoff, ohne daß durch den Einsatz des Alternativsubstrates Saccharose, mit dessen Verwendung im herkömmlichen diskontinuierlichen Verfahren keine OTC-Biosynthese durchführbar wäre, eine Beeinträchtigung der Fermentationsergebnisse erfolgt.

2AU27 2

Ausführunffsbeispiele Beispiel 1

Ton einer Lyophilkonserve des Stammes Streptomyces rimosus werden submerse Anzuchtpassagen in Sohüttelkolben angelegt, die Medien mit Erdnußschrot, Stärke, anorganischen Salzen und CaCO,, in Leitungswasser enthalten. Nach der Kultivierung auf Rundsohwingtischen bei 28 ⁰C erfolgt zur 24. Stunde die Ernte und Übertragung auf eine zweite Impfpassage, die in einem gerührten Reaktor gezüohtet wird. Auch dieses Medium enthält Erdnußschrot und Stärke, sowie anorganische Salze und CaCO₅. Die Impfkultur ist nach 24· Stunden ausgereift und dient als Impfmaterial für die Hauptkultur. Diese wird in einem 2,5 1 Fermenter durchgeführt, der über eine Rührung (600 U/min), Belüftung (30 l/h) sowie pH- und Temperaturregelung verfügt. Das Startvolumen beträgt 1,8 1 Fermentationsmedium. Dieses besteht aus: (g/l) Erdnußschrot - 7jO, Maisquellwasser (100 # TS) - 2,3, (NH₄J₂SO₄ - 5,0, ZnSO₄ 0,025, MnSO₄ - 0,17, CaCO₅ -.5, Maiskeimöl - 0,9. Die Sterilisation beträgt 60 min bei 120 ⁰C, der pH-Wert nach der Sterilisation 7,0 bis 7,3.

Nach Übertragung der Impfkultur (200 ml) werden die Bedingungen am Fermenter eingestellt und die Fermentation durchgeführt. Die Saccharoselösung für die Dosierung wird wie folgt hergestellt:

500 g Saccharose in 500 ml 0,5n H₂SO₄ einbringen, Lösung 24 Stunden bei Raumtemperatur stehen lassen, Neutralisation mit fester NaOH und 3n NaOH und Auffülung auf 1,2 1. Sterilisation: 30 min bei 120 ⁰C. Der.Fermentationsverlauf sowie die Dosierraten sind in Tabelle 1 angegeben.

Beispiel 2

Die Anzucht des Stammaterials verläuft unter analogen Bedingungen zum Beispiel 1. Als Ferment ersystem wird ein 30 1-Reaktor eingesetzt, der mit 20 Nährmedium beschickt wird.

24142 7 2

Dieses "besteht aus (g/l): Erdnußsohrot - 21, Maisquellwasser (100 # TS) - 9,2, (NH₄)₂S0₄ - 10,0, ZnSO₄ - 0,05, MnSO₄

- 0,04, Maisstärke - 20,0, CaCO₅ — 12,0, Maiskeimöl - 0,9. Die Sterilisationsbedingungen lauten: 40 min bei 120 C (unter Anwendung von Direktdampf). Die Saooharoselösung wird mit Hilfe eines Enzymreaktors hergestellt, indem 50$ige Saccharoselösung über eine Säule gesohiokt wird, die mit käuflich erworbener oder selbst präparierter trägerfixierter Invertase gefüllt ist. Die Technik dieses iLrbeitssohrittes entspricht dem bekannten Stand der Technik. Das Saccharosehydrolysat wird 30 min bei 120 C sterilisiert. Die Fermentationsbedingungen und der Fermentationsverlauf sind in Tabelle 2 angegeben. Die Schaumbildung wird durch programmierte Zugabe von Maiskeimöl (5 ml/h) kontrolliert. Die Siehe-, rung der Gelöstsauerstoffkonzentration (40 fo der Sättigung) erfolgt über die Veränderung der Rührerdrehzahl gemäß folgender Zahlenwerte: 1. bis 16. h - 150 U/min, bis 40. h

- 200 U/min, bis 48. h - 300 ü/min, bis 96. h - 350 U/min und ab 97. Ii - 400 U/min.

Tabelle 1	Dosierung	PH	0	g/l	0,	Pi	Trockeniaasse	-.0,9	OTC	Rührung
t	ml/1 . h		0		0,	g/l	ε/ι		IE/nil	U/min
h	Saccharose-		0		0,			.m7,7
	hydrolysat 40?«ig		0	,99	0,			21,;
	0,60	6,5	0	»9<-·	0,	025		25,7		650
O	0,00	b,9	0	,97	0,	024		29,7		It
11	0,73	b, O	0	,80	0,	023		28,6		η
22	Il	6,7	0	,25	0,	022		32,7	4-00	ti
31	Il	6,4	0	,16	0,	0:8	34,7	1525	Il
46	Il	6,3	0	,'Il	0,	Ο16		£000	Il
55	Il	6,2	0	» ' i	0,	Ο16	3400	Il
70	It	6,3	0	,08	0,	0-.6	4000	Il
79	It	6,4	0	,07	0,	013	. 4C00	Il
95	Il	6,4		,08		013	5400	Il
103	Il	6,3		,08	Oi 3	69ΟΟ	Il
vi 8	"	6,4	,09	0i3	7200	I!
•30	Il	6,4		0,3	. 8_400 .	Il
.42

Tabelle 2	'	O	Dosierung	pH	°/aig	NIk-N	0	Pi	Trockenmasse	OTC	Bührung
t(h)	16	ml/1 . h		6,4	s/i	0	g/l	g/l	I E/ml	U/min
	40	Saccharose-		7,5		0
	48	hydro lys at 40	6,5
64	•	6,3	2,02		0,023			•öo
88		6,2	2,i5					200
Wc.		6,3	1,40			30,4	1000	300
136		6,4	0,67		,03	26,3	-	350
: 60	0,72	6,3	0,48		,03	27,3	GOOO	350
184	0,62	6,3	0,42	,02	29,1	7200	400
208	1,6 0	6,5	0,32		33,9	8400	400
	1,82	6,8	0,42		4i,7	10800	400
1,62		0,27		39,1	1:200	400
1,67	0,38		51,6	12800	400
1,82	0,73		50,9	14000	400

Claims (4)

1. Erfindungsanspruoh

   1. Verfahren zur Herstellung von Oxytetracyclin auf fermentativem Wege unter Verwendung von Streptomyceten, gekennzeichnet dadurch, daß als Kohlenhydratquelle ein
   Hydrolysat von Sacoharose eingesetzt wird und dessen
   Zuführung zum Fermentationsprozeß in Form einer programmierten Dosierung erfolgt.
2. 2. Verfahren naoh Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß bei kohlenhydratfreien Substraten vom Beginn Ms zum Ende
   der Fermentation 0,6 bis 0,8 ml hydrolysierte Saccharose/h . 1 Reaktornutzvolumen zugeführt werden.
3. 3.· Verfahren naoh Punkt 2, gekennzeichnet daduroh, daß bei Verwendung eines maximal 2 $ Kohlenhydrate enthaltenden . Substrates ab dem Zeitpunkt der maximalen Mediumsalkalysierung 0,6 bis 0,8 ml hydrolysierte Saccharose/h . 1 Reaktornutzvolumen und ab der 72. Stunde der Fermentationszeit bzw. ab dem Zeitpunkt des Fehlens freier Glukose 1,2 bis 1,7 ml/1 . h zugeführt werden«
4. 4. Verfahren.nach Punkt 1 und 2 bzw. 3, gekennzeichnet dadurch, daß unter Verwendung von trägerfixierter Invertase hydrolysierte Saccharose zugeführt wird.

   Hierzu. JL Seiten Tabellen