CZ68597A3 - Modified human c3 proteins - Google Patents

Description

Vynález se týká proteinu nativní komplementové dráhy, který je modifikovaný tak, že je schopen vytváření stabilní C3 konvertasy, DNA sekvence, kódující tento protein, jeho použití v terii, konjugátu, kde specifickou vazebnou kupinou je specifický vazebný protein, farmaceutické formulace, obsahující takový protein a způsobu redukce proteinů komplementové dráhy podáním takového proteinu savci.

Dosavadní stav techniky

Existuje několik vzácně se přirozeně vyskytujících podmínek, kdy normální regulace tekutinové fáze nemůže proběhnout a spontánní C3 konverze nakonec vede v generál izovanou depleci C3 z cirkulace: - (i) genetická deficience faktoru H nebo I (13), (ii) přítomnost protilátek (nefritických faktorů), které se váží na C3bBb a brání disociaci (4), a (iii) kontakt s proteinem kobřího jedu nazývaného faktor kobřího jedu (CVF), který se kombinuje s faktorem B a formuje C3 konvertasa enzym, který neobsahuje C3b a není ovlivněn faktory Hal (14). Toto ilustruje normální fyziologický význam down regulace komplementu za absence specifické aktivace.

Existují také okolnosti, kdy se specifická aktivace vyskytuje, ale je nežádoucí, zejmena je-li namířena proti tkáním hostitele (t.j. u poškození tkáně ischemií nebo chirurgií) nebo proti cizorodému materiálu úmyslně podanému za terapeutickým účelem (jako je xenograft, arteficiální orgán nebo dialyzační membrána). Aktivace komplementu vede k nežádoucímu ataku a dalšímu poškození, takže v těchto případech bude vhodné blokovat nebo inhibovat aktivaci a odpověď.

Existující přístupy k prevenci komplementem zprostředkovaného poškození jsou zaměřeny na užití down regulačních proteinů (CR1, MCP, DAF a faktorů H a I) k inhihici aktivace komplementu. Inhibitory komplementu jako faktor I, faktor H a solubilní deriváty membránových vazebných proteinů CR1, DAF, MCP suprivují kapalná-fáze amplifikační smyčky alternativní dráhy. Proto se zkoušelo užiti těchto molekul, zejmena CR1 (který se zdá být nejúčinnější) k redukci komplementem zprostředkovaného poškození na modelech fyziologických situací (10,18).

Faktor H je endogenně přítomen v krevní plasmě ve vysoké koncentraci (typicky 0,3 až 0,5 mg/ml), takže ačkoliv vysoké hladiny inhibitorů mírní reakci v kapalné fázi, jejich účinek je slabý, ačkoliv velké množství purifikovaných proteinů může být podáno in vivo (t.j. pravděpodobně až 5 mg/kg tělesné hmotnosti solubilního CR1). Navíc, alternativní dráha je aktivována povrchy, kde je efektu faktoru H již zabráněno. Zatímco toto ne nezbytně konkomitantně redukuje aktivity jiných inhibitorů, stejné faktory napovídají, že nejsou pravděpodobně kompletně nebo univerzálně efektivní.

Faktor kobřího jedu (CVF) způsobuje generování stabilní C3 konvertasy, která může být použita experimentálně k depleci komplementu u zvířat in vivo, a v jiných vzorcích (t.j. lidské krevní plasmě) in vitro. CVF je potentní (t.j. 40 pg/kg může zrušit aktivitu komplementu u myši (16)). Nicméně, jsou zde nevýhody, které mohou znemožnit jeho terapeutické užití u lidí.

Nejprve je získán z kobřího jedu (obtížný zdroj k získání a nebezpečný) a musí pak být pečlivě purifikován od neurotoxinů jedu. Je také samozřejmě obtížné získání zásob. Tento problém nemůže být snadno překonán klonováním a expresí genu ex vivo, jelikož existují posttranslační modifikace, které probíhají u hada (specifické proteolytické zpracování), které může být obtížné (nebo nemožné) reprodukovat in vitro. Navíc, enzymy a podmínky trávení vyžadované pro toto zpracování jsou dosud neznámé. Za druhé, protein je cizorodého původu (pro lidi) a proto je imunogenní. Toto vylučuje jeho opakované terapeutické užití, jak může být žádoucí pro dekomplementaci pacienta po mnoho týdnů (t.j. pro dovolení přežití xenograftu).

Ačkoliv má CVF některé strukturální a funkční homologie s lidským C3 (17), má také velkou odlišnost v některých ohledech (t.j. struktuře řetězce místě biosyntézy, insenzitivitě na regulátory komplementu, formování stabilní C3 konvertasy). Není derivován od kobřího C3 ekvivalentu, který je znám, byl klonován a sekvencován, a který se ve většině struktury a funkce podobá lidskému C3 více než CVF (8).

CVF je specifický produkt jedu zvířete velké evoluční odlišnosti od homo sapiens. Není proto možné užít genetické manipulace k modifikaci tohoto proteinu na produkt, který může být neimunogenicky použit u lidí.

Nyní byla vyvinuta alternativní strategie, spočívající v překlenutí fyziologické regulace a, místo inhibice aktivace komplementu, způsobuje super aktivaci systému. Má dvě aplikace. První, může být použita in vivo k aktivaci komplementu dokud není jedna nebo více komponent vyčerpána, což vede ke ztrátě schopnosti produkovat lokální odpověd na jakoukoliv další zátěž (jako je xenograft). Za druhé, neregulovaná superaktivace může být úmyslně lokalizována na jednotlivý cíl (t.j. virus nebo virem infikovanou buňku) ke zvýšení senzitivity tohoto cíle na komplementem zprostředkované destruktivní odpovědi.

Termín regulátory komplementové aktivace jak je zde použit, zahrnuje všechny proteiny, které inhibují amplifikaci C3 konverze, není omezen na ty proteiny, jejichž geny jsou umístěny v RCA genetické lokusu. Nemůže nicméně zahrnovat up-regulátory jako je properdin. C3 konverze je definována jako proteolytická konverze C3 na C3b a C3a, není-li jinak uvedeno, a C3 konvertasa (nebo jednoduše konvertasa) je definována jako enzym (typicky komplex dvou nebo více proteinových komponent, například C3bBb, C3iBb, CVFBb nebo C4b2a), který katalyzuje tuto reakci.

Podstata vynálezu

Tak, v prvním aspektu vynález poskytuje nativní protein komplementové dráhy tak, že tento protein je schopný vytvářet stabilní C3 konvertasu.

Nativním je míněno přirozeně se vyskytující, tzn. že ho lze získat v přírodě. Tak definice zahrnuje jakýkoliv přirozeně se vyskytující protein komplementové dráhy modifikovaný jak je definováno výše. Není úmyslem se omezovat na druhově specifické proteiny. Jinými slovy, modifikovaný .lidský protein může být například použit jako stabilní C3 konvertasa v jiných druzích savců. Typicky, budou použity modifikované proteiny komplementové dráhy ze stejného druhu.

Modifikace C3 DNA kódující sekvence, například užitím místně řízené mutagenese, může produkovat variantu C3, která je resistentní na komplement regulační proteiny, zatímco si udržuje pozitivní funkční vlastnosti (štěpení na C3b C3 konvertasou) a vlastnosti strukturální integrity (správná struktura řetězce, a přítomnost thiolesterové vazby). Zde popsaný vynález se týká geneticky modifikovaných forem nativních komplementových proteinů, například lidského C3, jehož C3b fragment získává vlastnosti rezistence na fyziologickou regulaci komplementu. Díky této rezistenci mohou tyto molekuly generovat stabilizované formy, korespondující C3 konvertasy, která produkuje amplifikovanou konverzi C3 na C3b, a později degradační produkty, ve fyziologickém prostředí (t.j. in vivo).

V preferovaném provedení poskytuje vynález modifikovaný C3 protein, který je rezistentní na štěpení faktorem I.

Tohoto může být dosaženo modifikací zbytků proteinu v proteolytických místech.

Zejména preferované provedení vynálezu se týká modifikovaného lidského C3 proteinu, kde protein je modifikován nahrazením bud Arg-1303, nebo Arg-1320 nebo obou jinou aminokyselinou. Jinou aminokyselinou může být tyrosin, cystin, tryptofan, glutamin, kyselina glutamová nebo glycin. Arg-1303 je preferovaně nahrazen glutamovou kyselinou nebo glycinem (méně výhodně glutaminem). Arg-1320 je preferovaně nahrazen glutaminem.

Jiné strategie pro produkci vhodných modifikovaných proteinů vynálezu zahrnují:

(i) Redukovanou citlivost na ínhibiční účinek faktoru H a příbuzných proteinů (tj. MCP, DAF, CR1). Například, lidské C3 zbytcích 767-776 a 1209-1271 byly implikovány ve vazbě faktoru H (20,24), a nahrazení jednoho nebo více těchto zbytků nebo jiných zbytků také asociované s akcí těchto proteinů by mohlo redukovat vazbu jednoho nebo více z těchto regulačních proteinů.

(i i) Redukovaná rychlost disociace C3bBb. Mohou být zavedeny mutace, které mohou posílit interakce mezi C3b a Bb. Toto může vést jak k redukci ve spontánní dekompozici enzymu, tak omezení efektivity faktoru H (a příbuzných regulátorů) ve vyjmutí Bb z C3b.

Tyto mutace jsou žádoucí k redukci stupně jak spontánní, tak faktorem H mediované dekompozice C3bBb. I za absence faktoru H má tekutá fáze C3bBb komplexu poločas pouze okolo 10 min při 37 °C za přítomnosti properdinu (6).

(iii) Lidské C3 residua 752-761 jsou implikovány ve vazbě faktoru B. Toto je vysoce konzervovaný region C3, a těsně příbuzná sekvence je nacházena v C4. Jak C4 váže faktor

B homolog C2, spolu s jeho vysokou konzervací v C3, silná similarita tohoto regionu mezi C3 a C4 dále podporuje jeho roli v C3 jako faktor B vazebné místo. Tak mohou mít změny v tomto regionu efekt na B afinitu a na stabilitu C3bBb.

(iv) Rezistence na jiné regulátory aktivace komplementu jako je CR1, DAF, a MCP mohou být také žádoucí. Způsob akce těchto regulátorů je podobný jako u faktoru -H, takže další mutagenese není nezbytně nutná. Podobně, některé patogenní organismy exprivují jejich vlastní inhibitory aktivace komplementu, které jsou často strukturálně a funkčně homologní faktoru H (t.j. Vaccinia virus sekretorní peptid) . Tyto molekuly chrání útočníka proti imunitní odpovědi, a mohlo by být výhodné, aby bylo možno je atakovat cílenými C3 konvertasa enzymy resistentními na tuto obranu.

(v) Mutace, které zvyšují stabilizaci C3 konvertasy properdinem. Aktivitou properdinu je stabilizovat C3bBb komplex, zpomalovat spontánní a na faktoru H závislou disociaci. Tato stabilizace je neúčinná v kapalné fázi, ale zdá se být významnější v amplifikačním procesu jednou nastartovaném vhodným aktivačním povrchem (5). Zvýšení jeho aktivity (zvýšením jeho afinity) může narušit rovnováhu v kapalné fázi, a tak započít spontánní C3 konverzi. Toto může být zejmena užitečné v kombinaci s jinými modifikacemi výše popsanými.

(vi) Mutace, které zabraňují C3bBb vykazovat C5 konvertasovou aktivitu. Při užití k depleci aktivního C3 z cirkulace může být nežádoucím vedlejším účinkem generace velkého množství anafylaktických peptidů. Nejpotentnějším z nich je C5a, který je štěpen z C5 některými C3 konvertasa enzymy. Tato reakce je prqavděpodobně závislá na na afinitě konvertasy k jiné molekule C3b (11), a tak může být subjektem pro supresi mutacemi C3, které odstraní tuto interakci.

(vii) Zlepšená aktivita C3 konvertasy. Aktivní místa C3bBb C3 konvertasa enzymu jsou umístěna v Bb části. C3b komponenta má předpokládané za funkci vytvoření aktivní konformace na Bb a/nebo vazbu a konformaci substrátu, který má být zpracován Bb. Toto není známé, ale v obou případech-zde může být možnost pro zvýšení aktivity konvertasy prostřednictvím mutací v C3.

(viii) Exprese ve funkční formě. Divoký typ C3 vyžaduje konverzi na C3b před tím, než může být kombinován do nového C3 konvertasa komplexu. Je-li použit in vivo, může požadavek na konverzi na C3b (ebo C3i) odložit akci modifikovaného C3. Bylo proto žádoucí bud podat protein ve formě schopné okamžitého formování konvertasy, nebo podat přeformované konvertasové komplexy. Je proto výhodné vytvářet funkční C3b-podobná činidla ex-vivo. Tohoto může být dosaženo in vitro (t.j. proteolýzou).

(ix) Modifikace nativního proteinu, které slouží k zavedení nových míst štěpení tak jako jsou peptidové regiony požadované pro faktor B vazbu ponechány a ty, které jsou požadovány exklusivně pro faktor H vazbu, mohou být specificky odstraněny. Například mohou být zavedena taková místa, že C3b-podobná forma modifikovaného C3 může být dále štěpena do formy, která stále váže faktor B, ale je méně citlivá na inaktivaci faktorem H a I.

(x) Modifikace v jiných regionech, které mohou ovlivňovat C3b interakce s faktorem B a/nebo faktorem H

Podstata vynálezu

Vynález je založen na obrácení klasického přístupu navozením C3 konverze k depleci C3 a tak vyřazení systému. Další aplikací vynálezu je potenciál k navození C3 konverze v jednotlivém místě, a tak získání komplement dependentních efektorových mechanismů k ovlivnění specifického cíle.

Proto posledním efektem bude zvýšení množství C3 konverze tehdy, je-li modifikovaný protein podán do fyziologického media (t.j. krve), obsahujícího regulátory komplementové aktivace. Tato aktivita pak může být použita bud k depleci nativního C3 media, nebo k lokalizaci C3 konverze do požadovaného místa.

Analog C3, jehož C3h-fragment je rezistentní na účinek faktoru I (t.j. deriváty popsané v příkladu 1) může vázat faktor B, který pak bude štěpen faktorem D a eventuálně disociován v inaktivní formě. Za absence inaktivace faktorem I, bude modifikovaný C3b schopný opakovaně vázat nové molekuly faktoru B a tak spustit jeho inaktivaci. Proto bude jinou potenciální aplikací modifikací popsaných v tomto vynálezu inaktivace alternativní dráhy konsumpcí aktivity faktoru B. Analogický přístup může také být použit k modifikaci C4 ke spuštění konsumce C2, a tak vyřazení klasické dráhy aktivace komplementu.

Vynález zahrnuje jakoukoliv jinou proteasu použitou analogickým způsobem k C3bBb enzymu, která vede ke štěpení C3 na C3b, navzdory přítomnosti regulátorů aktivace komplementu.

Vynález také zahrnuje DNA sekvence, které kódují protein vynálezu stejně jako DNA konstrukty obsahující takové DNA sekvence.

DNA sekvence zahrnují všechny další sekvence nukleových kyselin které, díky degeneraci genetického kódu, také kódují dané aminokyselinové sekvence, nebo které jsou v podstatě homologní k těmto sekvencím. Tyto sekvence jsou tak také zahrnuty v rozsahu vynálezu.

Sekvence nukleových kyselin, které jsou v podstatě homologní jsou také zahrnuty v rozsahu vynálezu. Podstatná homologie může být hodnocena na úrovni nukleových kyselin nebo na úrovni aminokyselin. Na úrovni nukleových kyselin mohou být za sekvence, mající podstatnou homologii považovány ty, které hybridizují se sekvencemi nukleových kyselin vynálezu za přísných podmínek (například, při 35 až 65 °C v solném roztoku asi 0,9M). Na aminokyselinové úrovni může být proteinová sekvence považována za podstatně homologní k jiné proteinové sekvenci, jestliže signifikantní množství přítomných aminokyselin vykazuje homologii. Alespoň 55%, 70%, 80%, 90%,

95% nebo 99%, ve zvyšujícím se stupni, aminokyselin může být homologní.

Jak bylo zmíněno výše, mohou být proteiny vynálezu použity k dosažení lokalizovaných efektů aktivace komplementu. Jednou cestou potvrzení tohoto je konjugace proteinu se skupinou, který se bude vázat na požadovaný cíl. Tak v dalším aspektu vynález poskytuje konjugát zahrnující protein vynálezu navázaný na specifickou vazebnou skupinu, například specifický vazebný protein. Příkladem takového proteinu může být protilátka nebo její antigen vazebný fragment.

Proteiny podle vynálezu jsou zamýšleny pro podání subjektům pro zvýšení žádoucího terapeutického efektu. Proto vynález také poskytuj e:

a) Protein podle vynálezu pro použití v terapii.

b) Užití proteinů nebo konjugátů podle vynálezu ve výrobě léčiv pro užití v depleci hladin proteinů komplementové dráhy, a zejmena pro užití v zabránění rejekce cizorodého materiálu.

c) Farmaceutickou formulaci, zahrnující jeden nebo více proteinů nebo konjugátů vynálezu společně s jedním nebo více farmaceuticky akceptovatelnými nosiči· a/nebo excipienty.

d) Metodu redukce proteinů komplementové dráhy u savců, která zahrnuje podání proteinu podle vynálezu savcům, výhodně ve formě farmaceutické formulace.

Farmaceutické formulace mohou být přítomny v jednotkové dávkové formě, obsahující předem určené množství aktivní složky na dávku. Taková jednotka může obsahovat minimum, například 1 mg aktivní přísady, a preferovaně 2 až 3 mg. Horní hranice, kterou taková jednotková dávka může obsahovat, bude záviset na množství faktorů jako jsou podmínky léčby, způsob podání a věk, hmotnost a stav pacienta stejně jako ekonomické úvahy. Například může jednotková dávková forma obsahovat 10 mg nebo až 100 mg aktivní přísady.

Proteiny podle vynálezu mohou být použity in vivo k vyřazení komplementového systému. Okolnosti, kdy toto může být žádoucí zahrnují následující:

a) Aby se zabránilo komplementem zprostředkované destrukci nebo poškození transplantátu, zejmena xenograftu (materiál transplantovaný od jiných druhů zvířat), a zejména nesouhlasného xenograftu (kde jsou druh dárce a příjemce nesouhlasné). Příjemce by měl být dekomplementován před operaci a udržován v tomto stavu dokud bude transplantát bud přijat, nebo nahrazen více kompatibilním orgánem.

Počáteční léčba bude provedena během několika dní před transplantací. Další dekomplementace může být žádoucí v období rejekční krize. Léčba může být spojena s užitím antihistaminik ke kontrole všeobecné zánětlivé odpovědi (t.j. vasodilatace), pravděpodobně jako odpovědi na generování C3a a/nebo C5a.

Dekomplementace může být také výhodná při použití arteficiálních orgánů nebo tkání (t.j. arteficiální ledvinové dialysační membrány), které aktivují komplementový systém. Jak je popsáno výše, může být protein podán v bud neaktivované formě, funkční C3b-podobné formě nebo jako předformovaná C3 konvertasa (jako C3bBb). Tyto mohou být podány jakoukoliv cestou, kde se aktivní konvertasa setká s cirkulujícím C3 (t.j. intravenosně, subkutánně atd.).

Jinou alternativou bude ex vivo léčba, například transfundováním oběhu přes matrici, nesoucí aktivní konvertasu.

Toto by mělo mít tu výhodu, že dovolí odstranění anafylaktických peptidú (C3a a C5a) a jiných zánětlivých mediátorů nízké molekulární hmotnosti (t.j. histamin a oxid dusný) před tím, než je dekomplementovaná krev (nebo plasma) vrácena pacientovi.

b) K zabránění komplementem zprostředkovaného poškození v důsledku většího chirurgického zákroku. Pacient by měl být dekomplementován, jak je popsáno výše, výhodně před operací (ale je-li to nutné po ní) a udržován v tomto stavu do té doby, než nebezpečí dalšího vnitřního poškození bude zmírněno díky na komplementu závislém imunitním ataku.

c) K minimalizaci komplementem zprostředkovaného poškození v důsledku nechirurgického poranění. V těchto případech musí být dekomplementace provedena po počátečním poškození, ale formulace a metody podání jsou jinak stejné jako ty, které jsou posány výše. Toto může být zejmena užitečné, když zotavení vyžaduje reperfuzi ischemické části cirkulací (t.j. ischemie myokardu, omrzliny, spáleniny atd.).

d) K minimalizaci komplementem zprostředkovaného poškození v důsledku interakce protilátka-antigen.· Komplementem zprostředkovaná obranná odpověď je zejmena nežádoucí u autoimunitních chorob, které mohou zahrnovat glomerulonefritidu, hemolytickou anemii, myastenii gravis a typ II kolagenem indukované artritidy. Vyřazení komplementového systému v průběhu některých epizod choroby může zmírnit příznaky.

e) K vytvoření specifického patogenního cíle více citlivého ke komplementem zprostředkovaným imunitním mechanismům. V tomto přístupu není cílem použít superaktivní C3 konvertasu k produkci generál izované deplece C3, ale místo toho použít použít konvertasu lokálně ke koncentraci C3 konverze do požadovaného cíle. Cílem může být patogenní organismus, jako je bakterie, virus nebo jiný parazit, nebo nadbytečná buňka nebo tkáň hostitele jako je nádorová buňka nebo virem infikovaná buňka. C3 konvertasa může být lokalizovaná na cíl bud lokálním podáním (t.j. přímou injekcí, pokud možno v mediu, které zpomaluje jeho uvolnění do systémové cirkulace), nebo kombinací s cílovou skupinou, t.j. protilátkou. Takto modifikovaný protein může být navázán na specifický imunoglobulin bud chemickým zesítěním proteinů, nebo připojením DNA kódující sekvence a expresí (t.j. v případě IgG může být těžký nebo lehký řetězec připojen k C3 a ko-exprivován s C3, nebo mohou být oba řetězce kombinovány v jednom kompletním fúzním polypeptidu nebo inkorporací specifické kódující sekvence (t.j. pro leucin-zipper- podobné domény) k DNA obou fúzních partnerů (t.j. modifikovaného C3 a specifické protilátky) tak, že exprivované produkty, jsou-li smíchány dohromady, samy asociují za vytváření stabilních konjugátů. Fúzní proteiny mohou pak být podány lokálně nebo do systémové cirkulace.

Liposomy (nesoucí protilátku na povrchu s modifikovaným proteinem bud na povrchu nebo uvnitř liposomu) a/nebo viriony (t.j. zpracované tak, aby exprivovaly proteiny na svém povrchu), mohou být také použity pro ko-dopravu protilátky a modifikovaného proteinu. Tato strategie může být použita přímo, samotná nebo v kombinaci s jinou léčbou, ve kterémkoliv stadiu chorobného procesu. Může být zejmena vhodná pro užití v eliminaci jakýchkoliv nádorových buněk, které zůstaly v cirkulaci po chirurgickém odstranění tumoru. Konjugáty protilátka-modifikovaný protein mohou být také použity ex vivo k eliminaci patogenní tkáně. Například pro usmrcení leukemických buněk z extrahované kostní dřeně a pak pro navrácení zbylých zdravých buněk pacientovi.

Alternativně mohou být eliminovány lymfocyty, které neodpovídají MHC typu příjemce, z kostní dřeně před transplantací. Také modifikovaný protein může být navázán na antigen, a tato kombinace může být použita, bud in vivo nebo ex vivo, k ovlivnění lymfocytú nežádoucí reaktivity (t.j. proti transplantátu nebo vlastní tkáni).

Stejná technologie může být použita k léčbě jiných druhů, použitím jak derivátů lidského modifikovaného proteinu, tak podobných analogů připravených pro ten který druh.

Preferované rysy každého aspektu vynálezu jsou pro každý další aspekt mutatis mutandis.

Vynález bude nyní popsán prostřednictvím následujících příkladů, které nejsou konstruovány jako omezení vynálezu.

Příklady se vztahují k připojeným obrázkům.

Popis obrázků na připojených výkresech

Obr.l: ukazuje předpokládanou proteinovou sekvenci lidského C3, jak je kódovaná v PC3, (užitím standartního jednopísmenného kódu aminokyselin)

Obr.2: ukazuje sekvenci cDNA v PC3, (užitím standartního jednopísmenného kódu pro deoxynukleotidy pro sense řetězec, psaný 5'—3’).

Obr.3:ukazuje vizualizaci modifikovaných proteinů podle vynálezu.

Obr.4: ukazuje efekt různých mutací lidského C3, které nahrazují Arg 1303 nebo Arg 1320, na faktorem I-léčené štěpení v těchto místech.

N.B.

1. (35S) - biosynteticky značené vzorky.

2. Reakce provedené při normálním iontové síle.

3. Imunoprecipitáce s anti-C3.

4. SDS-PAGE za redukčních podmínek.

5. Autoradiografie.

Obr.5: ukazuje zvýšenou rezistenci lidského C3 inkorporujíčího Arg 1303 -> Gin 1303 mutaci k inaktivaci faktory I a H.

Obr.6: ukazuje analýzu štěpení C3 konvertasy mutované v aminokyselinových zbytcích 752-754 a 758-760.

Toto je fotografie Western Blot vyvíjeného ze 7,5% polyakrylamidového SDS-PAGE gelu (redukční podmínky), po e1ektroforetickém transferu do nitrocelulosy, prohování ovčí anti-lidskou C3 protilátkou a vývoji s křenovou peroxidasou spojenou s anti-ovčí imunoglobulinovou protilátkou a metodou Enhanced ChemiLuminiscence (metoda a detekční reagens od Amersham, UK) zachycenou na rentgenovém filmu. Štěpící reakce a detekční procedura byly provedeny jak je popsáno v příkladu 4 s odkazem na výsledky ukázané na Obr.3.

Klíč:

Dráhy 1,5 Dráhy 2,6 Dráhy 3,7 Dráhy 4,8 žádná adice + CVFBb + faktory Η + I + CVFBb + faktory Η + I

Proužky označené šipkami jsou:

A: C3 alfa - řetězec

B: C3 alfa^ř - řetězec

C: C3 beta - řetězec

D: 68 kDa produkt štěpení C3 alfaF- řetězce

E: těžký řetězec IgG

Obr.7: ukazuje analýzu štěpení radioznačeného faktoru B faktorem D, za přítomnosti divokého typu C3 a mutantního C3 (C3i)

Je uvedena fotografie autoradiografu SDS-PAGE gelu. Všechny vzorky obsahují faktor D a ¹²⁵I-značený faktor B, a byly inkubovány po 3 hodiny při 37 °C.

Vzorky v číslovaných drahách také zahrnují :

1. Pufr samotný

2. 1/125 C3 divokého typu

3. 1/25 C3 divokého typu

4. 1/5 C3 divokého typu

5. 1/25 mutantního C3 (zbytky 1427 Gin, 1431 Asp a 1433 Gin)

6. 1/5 mutantního C3

7. neředěný mutantní C3

Proužky označené šipkou jsou :

A. Neštěpený ¹²⁵I-značený faktor B (93 kDa).

B. 60 kDa produkt štěpení (Bb)

C. 33 kDa produkt štěpení (Ba)

Obr. 8: ukazuje SDS-PAGE studii, ilustrující vytváření konjugátů mezi C3i a IgG.

Toto je Coomassie barvení 4% akrylamidového SDS-PAGE gelového průběhu za neredukujících podmínek. Počítané dráhy obsahují vzorky:

1. PDP-IgG

2. C3i

3. PDP-IgG + C3i reakční směs

Šipkou jsou označeny:

A. Pravděpodobný C3i-IgG konjugát (350 kDa)

B. C3i (200 kDa)

C. IgG (150 kDa)

Obr. 9: demonstruje, že konjugát zaměřuje C3 konvertasovou aktivitu proti ovčím erytrocytům. (Tento graf ukazuje % lýze ovčích erytrocytů po potažení roztokem bud C3i-IgG konjugátu, nebo PDP-IgG nebo C3i následovaným promytím, generací C3 konvertasy properdinem a faktory B a D, a závěrečným vývojem lýze NGPS v CFD/EDTA, jak je popsáno v metodách. Pouze konjugát produkuje lýzi a tato lýze je závislá na dávce.

Následující standardní metody a definice jsou aplikovatelné na všechny příklady.

Všechny zmiňované komponenty komplementu jsou lidského původu, pokud není jinak specifikováno, a je použito standardní terminologie pro všechny proteiny a jejich odvozené fragmenty (t.j. jak je obsaženo v odkazu (15)). Navíc termín C3i označuje jakoukoliv molekulární formu C3 bez intaktní thiolesterové vazby, ale zachovávající C3a polypeptid na alfa řetězci .

Lidská C3 cDNA a kódující sekvence jsou značeny jak ukazuje Obr.2, užitím značení užívaného v EMBL nukleotidové databáze (odvozené od odkazu (2)). Ukázaná sekvence je sekvencí našeho konstruktu (^r PC3^r ) , který postrádá prvních 11 nukleotidů z 5' netranslaťovaného regionu popsaného v odkazu (2), a proto je první báze značena 12. Putativní iniciační kodon jsou nukleotidy 61-63, kodon pro aminoterminální serinový zbytek beta řetězce jsou nukleotidy 127-129, a kodon pro aminoterminální serinový zbytek alfa řetězce jsou nukleotidy 2074-2076.

Proteinová sekvence je značena v souladu s prekurzorovou sekvencí jak je ukázáno na Obrázku 1, která je předpokládané translací DNA sekvence dodatku 1 (u aminokyselin 1-22 se očekává, že zahrnují signální sekvenci, která je odstraněna během biosyntesy, a u aminokyselin 668-671 se očekává, že jsou odstraněny, je-li prekurzor štěpen na alfa a beta řetězce).

Následující zkratky mají následující význam: CVF - faktor kobřího jedu, ELISA - enzymová vazebná imunoadsorbentní zkouška, E.coli - Escherichia coli, kb - kilobáze, HSV-1 - Herpes simplex virus typu 1, PBS - fosfátový pufrovací salinický roztok. COS-1 je buněčná linie odvozená od buněk opičích ledvin. Následující jsou restrikční endonukleasy: AflII, Dral, DralII, EcoRI, EcoPV, HindlII, Nael, Nhel, Xbal.

Standardní metody

Metody pro standardní biologické procedury jako je izolace plasmidů, gelová e1ektroforesa na agarose a DNA ligace mohou být nalezeny v odkazech (21). Dvouřetězcová DNA byla sekvenována užitím ^r Sequenase version 2.0( kitu poskytnutým 'United States Biochemi cal s^r . C3 exprese byla měřena ELISA plastických plátů předem potažených afinitně purifikovanou polyklonální ovčí anti- lidský C3 protilátkou, na které byly přidány vzorky supernatantu kultury. Vazba C3 byla detekována monoklonální krysí protilátkou k C3 konjugovanému s alkalickou fosfatasou, a chromogenímu substrátu, p-nitrofenol fosfátu. Zkoušky byly kalibrovány s purifikovaným C3 lidské plasmy.

Metody pro purifikaci proteinů komplementu a CVF, a pro přípravu afinitně purifikovaných anti-C3 protilátek užívaných v analýze mohou být nalezeny v odkaze (28). Ekvivalentní činidla mohou být také získána od Sigma Chemical Company LTD.

C3 cDNA kódující sekvence

Naše C3 cDNA kódující sekvence byly konstruovány ze dvou segmentů izolovaných z náhodně primed lidské jaterní cDNA knihovny nesené ve vektoru pGEM4 (Promega). Pět o 1 igodeoxynukleotidů, korespondujících známým segmentům v lidské C3 kódující sekvenci, bylo radioznačeno T4 polynukleotid kinasou a (gama-32P)ATP a užito ke zkoušení filtrových transferů knihovny z agarosových plátů. Byly izolovány dva klony obsahující inzerty přibližně 4 kb. Digesce restrikční endonukleasou, hybridizace na specifické o 1 igodeoxynukleotidové proby a částečná sekvenční analýza ukázaly, že jedna z nich (^rA13^F) zahrnuje 5'- konec 5,1 kb sekvence, zatímco druhá (F B44I ) dosahuje k 3'- konci.

Tyto inserty se proto přesahují přibližně o 3 kb, včetně jedinečného EcoRI místa pro restrikční enzym. Nekompletní 5' sekce A13 byla rozrušena EcoRI a Nhel, a nahrazena kompletním segmentem izolovaným z B44 digescí EcoRI a Xbal. Obě části byly purifikovány gelovou e1ektroforesou na agarose s nízkou teplotou tání před společnou ligací T4 DNA ligasou za vytvoření vektoru (fPGC3^r) obsahujícího 5,1 kb DNA, kódující celý C3 prekurzorový protein.

Linker sekvence 5' k C3 kódujícímu regionu obsahovaly dva ATG, které jsou potenciálními falešnými startovacími místy translace. Tyto byly proto odstraněny gapped - plasmid mutagenesí, jak je popsáno v metodě příkladu 1, užitím oligodeoxynukleotidu PL-ATC-3 (tagggagacc ggaagcttgc cctctccctc tgtccctctg t), který deletoval přibližně 50 párů bází 1inker/adaptor DNA, bez alterace C3 kódující sekvence. Tento mutovaný vektor, 7,7 kb obsahující 5,1 kb C3 cDNA sekvence plus 2,6 kb sekvence z PGEM4 vektoru (Promega) je označen jako PC3.

C3 kódující region PGC3 plasmidu byl kompletně sekvenován a vykazoval pouze čtyři odlišnosti od dříve publikované lidské C3 (S alela) cDNA sekvence (2).

(i) Změny C2481 ->G, a C2850 ->T nealterují kódování, (ii) T1001 ->C kóduje dříve popsanou HAV 4-1- (leucin 314 ->prolin) polymorfní formu (20), a (iii) G2716->A kóduje valin 886-> isoleucin, která nebyla dříve popsána v lidském C3, ačkoliv Ile je nacházen v této poloze u myšího a krysího C3.

Naše sekvence zahrnuje start a stop kodony, s kompletní signální sekvencí a měla by proto kodovat funkční C3.

Hladiny exprivovaného divokého typu C3 vyšší než 1,7 pg/ml supernatantu kultury COS-1 buněk (transfektovaných užitím 1ipofectaminu a pcDNA3 (Invitrogen) expresního vektoru) byly dfetekovány ELISA. Žádný detekovatelný C3 nebyl produkován buňkami transfektovanými samotným pcDNA3 vektorem. Navíc, analýza expresního produktu štěpícími reakcemi následovanými imunoprecipitací, SDS-PAGE a imunoblottingem demonstrovala, že (i) primární translační produkt byl správně zpracován do zralé dvouřetězcové formy, (ii) tento produkt byl, jako nativní C3, štěpitelný na C3b

C3 konvertasou (CVFBb), a (iii) exprivovaný protein nebyl, jako nativní C3, štěpitelný faktorem H plus I, ale stal se štěpitelným po konverzi na C3b enzymem C3 konvertasou. Toto potvrzuje, že náš počáteční plasmid může být translatován do funkčního C3.

Pro alternativní popis konstrukce a exprese C3 kódující sekvence viz odkaz (25).

Příklady provedení vynálezu

PŘÍKLAD 1: Produkce C3, který má argininové zbytky v obou štěpících místech faktoru I (aminokyselinová poloha 1303 a 1320) konvertována na glutaminové zbytky z důvodu zabránění štěpení C3b fragmentu faktorem I.

a) Mutagenese

Užité mutagenní oligodeoxynukleotidy byly QRI1 (caactgcccagccaaagctccaagatcacc), QRI2 (gccagcctcctgcaatcagaagagaccaag), a AFL4149 (taataaattcgaccttaaggtcaccataaaac), stejně jako korespondující antisense oligodeoxynukleotidy QRIln (ggtgatcttggagctttggctgggcagttg), QRI2n (cttggtctcttctgattgcaggaggctggc) a AFL4149n (gttttatggtgaccttaaggtcgatttatta).

QRI1 a QRI2 specificky nahrazují arginin glutaminem ve štěpících místech pro faktor I v aminokyselinovém zbytku 1303 v C3 prekurzorové sekvenci (změnou G3968C3969 na AA v cDNA sekvenci) a QRI2 a QRI2n uskutečňují stejnou substituci ve štěpícím místě pro faktor v aminokyselinovém zbytku 1320 (změnou nukleotidu G4019 na A).

AFL4149 a AFL4149n zavádí štěpící místo pro restrikční endonukleasu AflII v poloze 4149 do cDNA sekvence (změnou C4149 na T) bez alterace kódované aminokyselinové sekvence. Tyto dva primery byly použity jako markéry, které dovolují identifikaci úspěšné mutagenese na podkladě štěpení DNA produktu AflII.

Mutagenese byla uskutečněna gapped plasmid metodou. Dávka PGC3 (ΓUPGC3^r), obohacená uridinem v místě thymidinu, byla připravena růstem v E.coli kmenu CJ236 za přítomnosti 0,25 pg/ml uridinu. Tento plasmid byl tráven Smál a 7,2 kb produkt C US1F ) byl purifikován na agarosovém gelu pro odstranění 0,5 kb fragmentu z C3 sekvence (zbytky 1463-1947). Jiná komponenta gapped plasmidu (' DN2^r ) byla připravena trávením PGC3 DralII plus Nael a purifikací 5,1 kb části dvakrát na agarosové gelové elektroforese. 200 ng DN2 bylo smíseno s přibližně 500 ng US1 v 50 μΐ H2O, zahřáto na 100 °C a pomalu ochlazeno pod 50 °C před přidáním 20 μΐ až 25 μΐ 2XT7 pufru (lOOmM Tris/HCl/pH 7,4/ mM MgClž, 100 mM NaCI, 2mM dithiotrei tolu a lmM ATP, dATP, dCTP, dTTP, a dGTP) plus 10 nmol každého 5'- fosforylovaného mutagenního primeru (jedna reakce použila QRI1, QRI2 plus AFL4149, jiná reakce užila QRIln, QRI2n plus AFL4149n). Směs byla znovu zahřáta na 70 °C po 5 min a pomalu ochlazena (v průběhu 30 až 60 min) na 20 °C. Při 0 °C bylo přidáno 10 jednotek T7 DNA polymerasy plus 80 jednotek T4 DNA ligasy. Směs (celkový objem 50 μΐ) byla inkubována nejprve při 0 °C po 5 min, pak při pokojové teplotě po 5 min a nakonec při 37 °C po 3 h. 1 μΐ každé směsi byl použit pro transformaci 100 μΐ superkompetentní XL1 E.coli (Stratagene) podle instrukcí výrobce .

Ampicilin resistentní kolonie byly vyšetřovány na AflII štěpení a úspěšné mutanty byly kultivovány v 100 ml kultury, ze které byly izolovány a sekvenovány plasmidy (užitím sekvenčního primeru C3pa-3876, cttcatggtgttccaagcct, odpovídající nukleotidům 3876-3895 C3 cDNA) pro charakterizaci mutací ve štěpících místech pro faktor I.

Pro alternativní protokol pro gapped plasmid mutagenesi viz odkazy (26,27).

b) Transfer mutantní DNA do eukaryotního expresního vektoru.

C3 kódující fragment z mutantních plasmidů byl excidován dvojitou digescí HindlII a Nael. Dral byl také použit pro inkapacitaci reziduálního plasmidů. C3 kódující sekvence byla purifikována na agarosovém gelu a ligována do pcDNA3 vektoru (Invitrogen), který byl linearizován HindlII a EcoRV enzymy a defosforylován telecí střevní fosfory1asou. Ligační směs byla užita k transformaci superkompetentní XL1 E.coli, která byla pak umístěna na kultivační pláty obsahující ampicilin.

Náhodný výběr (tři nebo čtyři) ampicilin resistentních kolonií byl kultivován ve 2-3 ml kulturách za malé škály izolace plasmidové DNA. Plasmidy obsahující správný inzert byly identifikovány digescí plasmidové DNA restrikčními endonukleasami EcoRI, HindlII, a AflII. Korespondující kolonie byly kultivovány ve 100 ml kultury a plasmidy byly purifikovány standardní procedurou. Mutanty byly původně konstruovány z PGC3 a tak zachovávaly dva ATG 5' ke kódujícímu regionu. Tento region (plus 5' 3kb C3 kódující sekvence) byl proto excidován HindlII plus EcoRI a nahrazen ligací stejného segmentu vyříznutého z PC3. Tyto rekonstruované vektory byly připraveny standardními procedurami a užity pro transfekci COS buněk.

c) Exprese divokého typu C3 a mutantního C3.

Mutantní a divoký typ C3 byly transientně exprivovány plasmidy transfektovanými do COS-1 buněk užitím 1ipofectaminu (GIBCO) podle instrukcí výrobce. Typicky bylo transfektováno 1 až 1,5 x 10⁵ buněk na jamku standardního 6 jamkového kultivačního plátu 2-4 pg plasmidu za použití 9 pl

1ipofectaminového činidla. Supernatanty byly hodnoceny na C3 sekreci, a typicky bylo získáno 0,3 až 1,7 pg na ml 3-6 dní po trans f ekc i.

Výs1edky

a) Generace mutantů

Následující mutanty, pojmenované podle mutagenních oligonukleotidových sekvencí, které byly inkorporovány, byly dosud izolovány:(i) 3 mutanty s jak QRI1, tak QRI2 mutací plus AFL4149: C3M-26, C3M-58, a C3M-61, (ii) 1 mutant s jak QRI1, tak QRI2 mutací, ale bez AFL4149: C3M-8 (iii) 1 mutant s QRI2 a AFL4149, ale bez QRI1: C3M-51 (užitý v příkladu 1.

b) Potvrzení, že funkční efekty byly způsobeny mutacemi specificky zavedenými do faktor I štěpících míst.

Sekvenování potvrdilo nepřítomnost jiných alterací v 178-350 bázích okolo mutovaného regionu každého mutantu. Sekvence jednoho mutantu produkovaného tímto postupem, C3M-51 (viz příklad 3), byla analyzována pro celý gap (báze 2463-5067) užitý v mutagenesi, a žádné jiné odchylky od divokého typu sekvence nebyly nalezeny.

Navíc, reprezentativní sekvenování celkem 2922 bází ze všech mutantů neodhalilo žádnou jednobodovou mutaci, která by mohla být způsobena polymerasou zprostředkovanými chybami.

Exprivované mutanty všechny vykazovaly dvouřetězcovou strukturu a štěpení C3 konvertasou charakteristické pro nativní C3. Souhrnně, užité mutanty pravděpodobně neobsahují žádné nežádoucí změny, ačkoliv nebyly kompletně resekvenovány.

PŘÍKLAD 2: Produkce C3, který má argininový zbytek v jednom štěpícím místě faktoru I (aminokyselinová poloha 1303) konvertovaný na glutaminový zbytek

Byl sledován postup Příkladu 1 s tou výjimkou, že v mutagenesi byly použity pouze mutagenní oligonukleotidy AFL4149 plus QRI1 nebo AFL4149n plus QPIln (t.j. bez QRI2 nebo QPI2n).

Výs1edky

a) Získané mutanty:

Byly získány 2 mutanty s QPI1 a AFL4149, ale bez QRI2:-C3M-I23,27. Mutant C3M-I23 byl exprivován jak je popsáno v příkladu 1.

Tento protein byl štěpitelný CVFBb. C3-b podobný produkt byl relativně (ve srovnání s divokým typem) rezistentní na štěpení faktory I a H v pozici 1303, ale stále mohl být štěpen v poloze 1320. Tento C3b derivát je proto částečně rezistentní na faktor

I.

PŘÍKLAD 3: Produkce C3, který má argininový zbytek v jednom štěpícím místě faktoru I (aminokyselinová poloha 1320) konvertovaný na glutaminový zbytek

Byl sledován postup Příkladu 1 s tou výjimkou, že v mutagenezi byly použity pouze mutagenní oligonukleotidy AFL4149 plus QRI2 nebo AFL4149n plus QRI2n (t.j. bez QRI1 nebo QRIln).

Navíc, metoda použitá v příkladu 1 také produkovala jeden mutant s QRI2 a AFL4149, ale bez QRI1.

Výs1edky

a) Získané mutanty:

Byly izolovány 3 mutanty s QRI2 a AFL4149, ale bez QRI1:-C3M-51, C3M-Q2, C3M-Q13. Mutant C3M-51 byl exprivován jak je popsáno v příkladu 1. Tento protein byl štěpitelný CVFBb. C3-b podobná produkt nebyl snadno štěpen faktory I a H v poloze 1320, ale stále mohl být štěpen v poloze 1303. Tento C3b derivát je proto částečně rezistentní na faktor I.

PŘÍKLAD 4; Analýza funkčních efektů mutací

Supernatanty (100-400 μΐ) z transfektovaných COS buněk byly inkubovány při 37 °C po 2 h s:

COS buňky byly transfektovány pcDNA3 nesoucími inserty:1) nemutované C3 sekvence

2)	mutantní	C3M-I23	(kóduj ící	Arg1303	->Gln)
3)	mutantní	C3M-26	(kóduj ící	Argl303	->Gln, Argi320 ->Gln) a
4)	mutantní	C3M-51	(kóduj ící	Argi 3 2 0	->Gln)

200 μΐ supernatantů kultur, odebraných 3 dny po transfekci, bylo předošetřeno 2mM fenylmethanesulfonyl fluoridem (0 °C, 15 min) a pak inkubováno při 37 °C po 2 hodiny s následujícími:

A) žádná příměs

B) přeformovaná C3 konvertasa, CVFBb (10 μΐ z 200 μΐ obsahujících 6,6 pg CVF, 100 pg faktoru Ba 1,4 pg faktoru D ve fosfátovém pufrovacím salinickém roztoku (PBS) obsahujícím 10 mM MgCl2, preinkubovaném při 37 °C, 15 min),

C) faktory H (5 pg) a I (1 pg), a

D) CVFBb plus faktory Hal.

Tyto byly poté imunoprecipitovány přidáním 0,6 pg afinitně purifikovaného ovčího anti-1idského C3· imunoglobulinu při pokojové teplotě a po 1 hodině přidáním 20 pl 5% suspense promytých formalinem fixovaných buněk Streptococcus sp. skup. C (protein G) (Sigma). Po 45 min při pokojové teplotě byly částice jednou promyty v PBS, 5 mM NaN3, a jednou v 20 mM Tris/HCl, 137 mM NaCl, 0.1% (obj./obj.) Tween 20, pH 7.6, před eluací v 1% SDS/2% 2-merkaptoetanolu (90-100 °C, 5 min). Tyto eluáty byly separovány SDS-PAGE, elektroblotovány do nitrocelulosy a C3 proužek byl detekován probováním s afinitně purifikovaným ovčím anti-lidským imunoglobulinem následovaným křenová peroxidasa konjugovaným oslím anti-ovčím imunoglobulinem (Sigma) a detekcí užitím Enhanced

Chemiluminiscence substráty poskytnutými Amersham. Je ukázána fotografie 2 minutové expozice na rentgenový film. Viditelné C3-odvozené proužky jsou indikovány značenou šipkou, a jednotlivé vzorky (1-4, A-D) jsou ty, které byly právě popsány. (Prominentní proužek okolo 50 kDa (mezi 46-68 kDa proužky) přítomný ve všech vzorcích je těžký řetězec IgG užitý v imunoprecipitaci a detegovaný křenová peroxidasa

- konjugovaný oslí anti-ovčí imunoglobulin).

Výs1edky (viz Obrázek 3)

1. Všechny neošetřené vzorky (1-A, 2-A, 3-A, 4-A) obsahovaly proužky korektní migrace pro alfa a beta řetězce C3, indikujíc tak, že všechny mutanty jsou exprivovány, a posttranslačně zpracovány správně. Přítomnost 43 nebo 46 kDa proužků v těchto vzorcích indikuje přítomnost některé faktoru H + faktoru I-podobné aktivity v kultivačním mediu. Spontánní hydrolýza C3 během 3 denní biosyntetické periody produkuje C3i, který je štěpen touto aktivitou. V nemutovaném C3 toto generuje proužky 43 kDa a 75 kDa (75 kDa není viditelný, jelikož (i) je zakryt 75 kDa beta řetězcem, a (ii) protilátka použitá k vývoji Western blot má velmi malou aktivitu k této části C3 alfa řetězce:- jeho přítomnost byla následovně potvrzena reprobováním krysí monoklonální protilátkou, Clone-3, která je specifická pro tento region). Přidání faktorů Hal bez CVFBb (1-C, 2-C, 3-C, 4-C), neštěpilo zbývající C3 indikujíc tak, že tento reprezentuje aktivní C3 (thiolester intaktní).

2. Nemutovaný C3 (1) je štěpen CVFBb a C3b produkt je dále štěpen endogenními enzymy v 1-B nebo přidanými faktory H a I v 1-D. 43 k a proužek indikuje štěpení v Arg 1320, _a θβ kDa proužek (viditelný při delší expozici) indikuje štěpení v Arg1303,

3. Mutantní C3M-I23 (Arg¹³⁰³->Gln) byl štěpitelný CVFBb a produkt byl relativně rezistentní na endogenní aktivitu faktorů

H a I-podobná (2-B), s persi stujícím malým množstvím alfa řetězce (C3b), ale stále štěpitelný, pokud byl extra přidán faktor H a

I. 43 kDa produkt indikuje štěpení v Arg¹³²⁰, (slabý prožek 71 kDa representující jiný fragment alfa řetězce může být viditelný při delší expozici), ale nebyl přítomen žádný 68 kDa proužek, ukazujíc tak, že mutant je rezistentní na štěpení v mutovaném Gin¹³⁰³.

4. Mutant C3M-26 (Arg¹³⁰³->Gln, Arg¹³²°->Gln) byl štěpitelný CVFBb a C3b-podobná produkt (alfať) byl rezistentní na endogenní aktivitu faktoru Hal (3-B). Byl také velmi rezistentní na adiční faktory Hal (3-D) ve srovnání s nemutovaným C3 (1) a jinými mutanty (2 a 4). Bylo zde malé množství produktu o 46 kDa, což indikuje nějaké štěpení v mutovaném Gin¹³⁰³ (doprovázející 68 kDa fragment byl také viditelný při delší expozici). Byl zde málo nebo vůbec nedetegovatelný 43 kDa, který by korespondoval s jakýmkoliv štěpením v Gin¹³²⁰. Proto je Arg->Gln mutace v poloze 1303 méně efektivní než ta v poloze 1320 v zabránění štěpení faktorem I. (Toto malé reziduální štěpení se také může vyskytovat u mutantu C3M-I23 (Arg¹³⁰³->Gln), ale 46 kDa intermediát je pravděpodobně rychle zpracován na 43 kDa dalším štěpením v nemutovaném Arg¹³²⁰).

5. Mutant C3M-51 (Argi³²°->Gln) byl štěpitelný CVFBb a produkt byl štěpený endogenní aktivitou faktoru Hal (4-B), a adičními faktory Hal (4-D). 46 kDa produkt (a slabý 68 kDa proužek) indikují štěpení v Arg¹³⁰³. Nicméně, absence 43 kDa proužku indikuje, že není štěpen v mutovaném Gin¹³²⁰.

PŘIKLAD 5 Srovnání různých aminokyselinových substitucí v poloze 1303

1. Úvod

Předchozí příklady popisují mutace arg 1303 a arg 1320 na glutaminové zbytky. Obě mutace udělují rezistenci na štěpení faktorem I v těchto polohách. Nicméně, je zde malý, ale detegovatelný stupeň štěpení v gin 1303. Proto bylo provedeno množství jiných aminokyselinových substitucí v této poloze a testováno. Stepení se vyskytuje, s klesající účiností, je-li zbytek 1303: Arg > Tyr > (Cys nebo Trp) > Gin > (Glu nebo Gly). Tyto výsledky jsou neočekávané, jelikož (i) všechny známá přirozeně se vyskytující lidská faktorem I zprostředkovaná štěpení mají C-konec k argininovému zbytku, a tak bylo vydedukováno, že enzym má požadavek pro arginin, a (ii) jestliže bude štěpen v jiném zbytku lze předpokládat, že by mělo být elektrostaticky podobné argininu, t.j. bázick zbytek (Lys nebo His), (t.j. trypsin selektivně štěpí C-konec k arg, lys nebo his), a tak nemůžeme předpokládat štěpení tyrosinové substituce.

Proto je substituce arg 1303 glycinem nebo kyselinou glutamovou preferována za účelem vytvoření derivátu C3 rezistentního na inaktivaci faktorem I.

2. Metody

2.1 Mutagenese: degenerování použitých mutageních primerů bylo: caactgcccagc(gt)(ag)(cg)agctccaagatcacc (písmena v závorkách indikují směs bází v těchto pozicích). Mutanty byly konstruovány bud gapped plasmid metodou (jak byla popsána v dřívějších příkladech), nebo megaprimerovou metodou (V.Picard et al., Nuc Acid Res 22:2587-91, (1994)), ve které upstream primer byl caccaggaactgaatctagatgtgtccctc a downstream primer byl gttttatggtgaccttaaggtcgaatttatta. Všechny mutace byly provedeny na templátech, ve kterých C3- kódující DNA byla už mutovaná tak, že aminokyselinovým zbytkem 1320 byl glutamin, a restrikční místo pro AfIII bylo zavedeno do polohy 4149 (jak je popsáno v dřívějších příkladech) a toto bylo potvrzeno sekvencováním.

2.2 Exprese: mutanty byly exprivovány v COS buňkách užitím pcDNA3 vektoru jak je popsáno v dřívějších příkladech, biosynteticky značeny (³⁵S) methioninem v seru prostém mediu.

2.3 Zkouška: supernatanty byly ošetřeny CVFBb (vytvořeného reakcí CVF s faktory B a D v hořčík obsahujícím pufru) a faktory Hal následovanými imunoprecipitaci s anti-C3 a separací SDS-polyakrylamidovou gelovou elektroforesou provedenou za redukčních podmínek (jak je popsáno v dřívějších příkladech). Gel byl fixován, ošetřen Amersham Amplify činidly, sušen a exponován na autoradiografickém filmu za získání výsledků uvedených na obrázku.

3.Výs1edky

Faktorem I zprostředkované štěpení v poloze 1303 (místo 1), bez štěpení v 1320 (místo 2) (kde toto bylo mutováno na glutamin) produkovalo proužky 46 a 68 kDa. Může být pozorováno že se štěpení vyskytuje v pořadí: arg(R) > tyr(Y) > cys(C) > a trp(W) > gln(Q) > gly(G) a glu(E). Divoký typ (arginin v obou pozicích) je štěpen v obou polohách za produkce fragmentů 43 (příliš malý na to, aby byl viditelný na tomto gelu) a 68 kDa.

4. Obrázek

Výsledky jsou ukázány na Obrázku 4. Zbytky v místě 1 (poloha 1303) a místě 2 (1320) jsou indikovány nad příslušnými dráhami.

PŘÍKLAD 6 Demonstrace zvýšené rezistence na inaktivaci faktory I a H po mutaci arg 1303 na gin.

1. Úvod

Předchozí příklady demonstrují, že konverze bud arg 1303, nebo arg 1320 na glutamin učiní toto místo rezistentní na štěpení faktorem I. Mutace obou míst vytvoří molekulu, která je rezistentní na štěpení v obou místech. Zde dále demonstrujeme, že mutace arg 1303 na gin samotná (bez alterace arg 1320) vede ke srovnatelné resistenci, ve srovnání s divokým typem, na funkční inaktivaci faktory I a H.

2. Metoda

2.1 Exprese: Příprava arg 1303->gln mutace byla popsána v dřívějším příkladu. Tato byla transfektována do CHO (obecná laboratorní buněčná linie odvozená od ovariálních buněk čínského křečka) kalcium-fosfátovou metodou a stabilní transfektanty byly selektovány na podkladě rezistence na G418 (Geneticin dostupný u Sigma). Supernatanty buněčných kultur byly shromážděny a exprivovaný C3 byl částečně purifikován precipitací síranem sodným (10-20% (hmotn./obj.) frakce), a iontovou výměnou chromatografií na Q-sepharose a mono-Q-sepharose (A W Dodds Methods Enzymol 223:46 (1993)).

2.2 Zkouška: Ovčí erytrocyty byly potaženy S016 monoklonální protilátkou (R A Harrison a P J Lachmann, Handbook of

Experimental Immunology 4th Edition kap. 39 (1986)) a 4,4 ml 5% (obj/obj.) suspenze pak bylo inkubováno s přibližně 10 pg C2, 24 pg C4 a 1 pg Cl (purifikované lidské komponenty) po 10 min při 37 °C v CFD (R A Harrison and P J Lachman supra). 0,8 ml této směsi pak bylo inkubováno po 105 min s 0,25 ml obsahujícími semi-purifikovaný mutant nebo divoký typ C3 a EDTA do koncové koncentrace 12,5 mM. Buňky byly pak promývány v CFD a použity v CFD obsahující 0,1% (hmotn./obj.) želatiny (CFD-gel). Radioligand vázaný s (¹²⁵I) -značenou klon 4 monoklonální anti-C3 protilátkou byl použit pro potvrzení toho, že bylo deponováno stejné množství C3b divokého typu nebo mutantního C3b.

Pro zkoušku bylo rozpuštěno 40 pl 5% suspense buněk v 250 pl CFD-gelu a 50 pl aliquoty byly inkubovány s 50 pl CFD-gelu obsahujícího rozpuštěné faktory I a H v konečné koncentraci 100, 10, 1 a 0 1 pg/ml každého, při 37 °C po 30 min. 0,9 CFD pak bylo přidáno, buňky byly peletovány centrifugací a promyty dvakrát více než 1 ml CFD pokaždé. Buňky pak byly re suspendovány v 100 pl CFD-gelu obsahujícího 100 1 pg/ml faktoru B, 100 pg/ml properdinu, 1 pg/ml faktoru D a 0.3 mM NiCH. Po 10 minutách při 37 °C , 0.9 ml CFD obsahujícího 10 mM EDTA a 2% (obj./obj.) normálního morčecího séra. Po dalších 30 min při 37 °C byly nelyžované buňky peletovány centrifugací, a stupeň lýze byl určen měřením absorbance supernatantu při 412 nm. Absorbanční ekvivalent ke 100% lýze byl určen z aliquoty buněk lyžovaných ve vodě, a proto bylo kalkulováno procento lýzy.

Tato zkouška měří schopnost deponovaného C3b formovat funkční C3bBbP konvertasu. Konverze iC3b brání formování konvertasy a následné lýze v serum/EDTA.

3. Výsledky

Výsledky ukázané na obrázku indikují, že více než desetkrát více faktoru I a faktoru H je požadováno pro dosažení hemolytické aktivity argl303->gln mutantu ve srovnání s divokým typem. Tato mutace je proto výhodná pro vytvoření derivátu C3, jehož produkt C3b je rezistentní na inaktivaci faktory Hal. Efekt může být bud díky vyšší rezistenci na štěpení v poloze 1303 (je-li arg mutován na gin), nebo díky vyšší rezistenci na štěpení v poloze 1320, je-li štěpení nejprve umístěno v poloze 1303.

4. Obrázek

Výsledky jsou ukázány na Obrázku 5. X osa indikuje koncentraci faktorů H a I. Q1 representuje argl303->gln mutaci. % lýze je měřeno jak popisuje metoda.

Diskuse

Základní rysy lidského 03, s ohledem na modifikované varianty zde popsané, jsou:

(i) Molekula má funkční C3b-podobný derivát, ve kterém může být kombinován s funkčním aktivním lidským faktorem B, který pak může být štěpen lidským faktorem D za vytváření enzymu schopného štěpení lidského C3.

(ii) Aminokyselinová sekvence derivátů je více homologní k lidskému 03 než k C3 z jiných druhů, pro které je sekvence nyní známá, nebo jakékoliv jiné nyní známé proteinové sekvenci. Strukturální rysy C3 přítomné v divokém typu, ale ne nezbytně v modifikovaných derivátech, zahrnují následující:35

a) DNA kódující sekvence a sekvence trans laťovaného proteinu pro variantu lidského C3 užitého v příkladech vynálezu zde popsaných jsou dány v Obrázcích 2 a 1, v příslušném pořadí.

Tato proteinová sekvence se liší od publikované sekvence (2) v právě dvou aminokyselinách (detaily jsou dány v příkladech).

Bylo předpokládáno, že více variací je kompatibilních s C3 funkcí, třebaže většina není přítomná v populaci.

b) Primární translační produkt je proteolyticky zpracován do dvou disulfidicky vázaných řetězců, alfa (zbytky 672-1663) a beta (zbytky 23-667), s odstraněním signální sekvence (zbytky 1-22).

c) Zralý protein obsahuje thiolesterovou vazbu mezi zbytky CyslOlO a Gin 1013.

d) C3 konvertasa štěpí C3 za odstranění C3a (zbytky 672-748). Tato reakce je provázena rozbitím thio 1 esterové vazby.

e) Za přítomnosti faktoru H štěpí faktor I C3b mezi zbytky Arg 1303 a Ser 1304, a mezi Argl320 a Serl321.

Modifikace provedené na nativní C3 molekule

Nahrazení Argl303 Gin

Tato modifikace je v jednom místě štěpení C3b faktorem I. Efektem je redukce rychlosti štěpení faktorem I v této poloze. Změna na glutamin byla vybrána kvůli odstranění pozitivního náboje argininu, který je pravděpodobně důležitý pro serin proteasovou aktivitu faktoru I, protože udržuje hydrofilní charakter a podobnou velikost postraního řetězce, což může minimalizovat jakékoliv disrupce v terciální struktuře proteinu. Důkazem podporujícím tento předpoklad je to, že mutace nebrání zpracování do dvouřetězcové struktury, formování thiolesteru nebo štěpení C3 C3 konvertasou. Mutace Argl303 na jinou aminokyselinu může dosáhnout podobného nebo i vyššího efektu, jak je demonstrováno v příkladu 5.

Je také možné redukovat toto štěpení mutováním Serl304 (jiná strana štěpícího místa) nebo jiných zbytků zahrnutých v interakci enzym-substrát.

Nahrazení Argl320 Gin

Tato modifikace je v jiném místě štěpení C3b faktorem I. Efektem je drastická redukce (prakticky zrušení) stupně štěpení faktorem I v této poloze. Změna na glutamin byla provedena za stejných podmínek jako jsou popsány výše, a tato mutace také nebránila zpracování do dvouřetězcové struktury, formování thiolesteru nebo štěpení C3 C3 konvertasou. Opět, mutace jiné aminokyseliny může vést k stejnému efektu, jako například mutace Serl321 nebo jiných zbytků zahrnutých v interakci enzym-substrát.

Při kombinaci dvou mutací, Argl303->Gln a Arg1320->Gln, je předcházeno C3b inaktivaci a proto zachování jeho schopnosti vytvářet část aktivní C3bBb konvertasy. Jiné mutace (včetně kombinací mutací), které ruší obě štěpící reakce, mohou být také použity (například Argl303 Glu nebo Argl303 Gly může být použita v kombinaci s Arg 1320 Gin).

PŘÍKLAD 7 Různé mutace, které redukují interakce C3b/C3i faktorem H

7.1 úvod

Jiné laboratoře produkovaly důkazy založené bud na vlivu syntetických peptidů (Ganu, V.S. and Muller - Eberhard, H.J.,

1985, Complement 2:27, Becherer, J.D. et al., 1992,

Biochemistry 31:1787-1794), nebo limitované mutagenese (Taniguchi - Sidle, A. and Isenman, D.E., 1994, J.Immunol. 153: 5285 - 5302), které naznačují, že zbytky 752 - 761 v primární sekvenci C3 transkriptu (viz Obr. 1) mohou být zahrnuty v interakci s faktorem H. Nicméně, jiní publikovali důkazy, které naznačují, že v interakci s faktorem H jsou zahrnuty pouze zbytky 767-776, zatímco zbytky 752-761 jsou důležité pro interakci s faktorem B (Fishelson, 1991, Mol.Immunol. 28:545-552). Předpokládáme, že více extenzivní mutagenese tohoto regionu může redukovat afinitu pro faktor H a proto být žádoucí pro objektivní vytváření C3 derivátu, který je rezistentní na faktor H. Navíc se domníváme, že významnými zbytky pro mutaci mohou být prominentní kyselá residua (kyselina aspartová a glutamová) a že bude žádoucí změnit je na neutrální zbytky, které s menší pravděpodobností mediují silné interakce. V tomto příkladu jsme změnili zbytky 752-754 z Asp

- Glu - Asp na Gly - Ser - Gly, v kombinaci se změnou zbytků 758

- 760 z Glu - Glu - Asn na Gly - Ser - Gly. Produkt vykazoval redukované štěpící charakteristiky konzistentní s redukcí citlivosti na faktor H. Toto poskytuje důkaz, že C3 může být modifikován k redukci vazby faktoru H, a proto citlivosti na faktory Hal. Tyto modifikace jsou žádoucí pro vytvoření C3 konvertasy, která je stabilní za fyziologických podmínek.

7.2 Metoda

Metody mutagenese, exprese a analýzy byly popsány v dřívějších příkladech. Mutagenní oligonukleotid, který byl syntetizován, měl sekvenci :

agtaacctgggttcggggcatcattgcaggatcgggcatcgtttcc.

7.3 Výsledky

Výsledky štěpících reakcí jsou ukázány na Obr.6. Tyto indikují, že:

1. Adice CVFBb k divokému typu C3 vede k eliminaci alfa řetězce (dráha 2), jelikož C3b, který je formován, je citlivý na nízké koncentrace faktoru I a H v supernatantu kultury. C3i, který byl vytvořen během exprese nebo následné inkubace, byl rozrušen na iC3i stejným způsobem. Přidání exogenních faktorů I a H (dráhy 3 a 4) se zde neliší od drah 1 a 2, protože medium samo obsahuje dostatek aktivity faktoru H a I k efektu kompletního štěpení.

2. Oproti tomu ošetření mutantu C3 CVFBb (dráha 6) nevede k vymizení alfa řetězce. Je zde určité generování alfa, korespondujícího k C3b, ale některé z těchto všech zbývají, indikujíc tak, že perzistence alfa řetězce není jenom výsledkem selhání štěpení CVFBb. Zbývající neštěpený alfa řetězec v dráze 2 může proto reprezentovat C3i, který nebyl štěpen endogenní aktivitou faktorů Hal, ačkoliv je také možné, že některé z nich representují nativní C3 perzistující tehdy, je-li pro mutant požadována parciální rezistence na CVFBb. Přidání vysokých koncentrací exogenních faktorů Hal (dráha 7 a 8) produkuje depleci alfa a alfa' řetězců, což indikuje, že (i) mutant není kompletně rezistentní na tyto faktory a (ii) alfa řetězec neštěpený CVFBb v dráze 2 je predominantně odvozen od C3i (který je štěpitelný faktory H a I, ale ne CVFBb) než od nativního C3 (který je štěpitelný CVFBb, ale ne faktory H a I). Stále ještě není štěpen všechen alfa řetězec, jako ve dráze 8, pravděpodobně z důvodu rezistence na faktory Hal.

Proto mohou mutace zbytků 752-754 a zbytků 758-760 generovat C3 molekulu, která stále ještě může být štěpena C3 konvertasou, ale je parciálně rezistentní na účinek faktorů H a I. Ve světle nově publikovaných dat je toto pravděpodobně z důvodu mutací, které modifikovaly region, který je zahrnut v interakci s faktorem H a proto vedou k redukované afinitě k faktoru H.

PŘÍKLAD 8 Místo v C3, které může být mutováno pro modifikaci interakce C3i s faktorem B

8.1 úvod

Předchozí příklady demonstrovaly, že mutace C3 mohou modulovat interakce s faktory Hal. Pro objevení nových míst v C3, která mohou interagovat s faktorem B jsme srovnávali známé sekvence C3 molekuly od různých druhů, stejně jako dostupné sekvence pro C4 a jiné homologní proteiny. Identifikovali jsme region korespondující zbytkům 1427-1433 lidského C3, který může být zahrnut v C3 a C4 specifických funkcích. Tyto mohou zahrnovat interakce s faktorem B (nebo jeho homologem, C2, v případě C4), ale ne nezbytně, protože jiné potenciální funkce zahrnují formování thiolesteru, konverzi na C3h (nebo C4h formu), interakci se substrátem C3 a/nebo C5 v konvertasové aktivitě a interakci s faktorem I a jeho kofaktory. Proto byly selektované zbytky mutována do korespondujících zbytků (podle seřazení sekvence) nacházených v jiných homologních proteinech, v tomto případě lidském C5. Tak byl změněno zbytek 1427 z Arg na Gin, zbytek 1431 z Lys na Asp, a zbytek 1433 z Glu na Gin. Výsledný mutant byl shledán citl.ivým na štěpení C3 konvertasou (CVFBb) a C3b produkt byl štěpitelný faktory Hal. Nicméně, tento mutant nepodporoval konverzi faktoru B na Bh plus Ba, která je závislá na vazbě faktoru B na C3i (nebo C3b). Proto máme důkaz, že tento region má menší interakci s faktorem B. Zatímco je toto nežádoucí pro generování superaktivní C3 konvertasy, poskytuje to indikaci, že jiné modifikace tohoto regionu C3 budou také alterovat interakci s faktorem B, a některé z nich budou pravděpodobně zvyšovat afinitu. Následek takových mutací může také zvyšovat stabilitu a aktivitu biomo1ekulárního konvertasového enzymu C3bBb (nebo C3iBb).

8.2 Metody

Přehled ukázaný v Tabulce 1 dále dokládá, proč se domníváme, že tento region je kandidátem pro mutagenesi. Předpokládáme, že charakter jistých zbytků byl dobře konzervován v C3 a C4, ale mírně se lišil u obou proteinů. Zbytky 1427, 1431 a 1433 byly vybrány, jelikož jejich přirozený náboj může být ukazatelem skupiny zahrnuté v protein - protein interakcích. Byly provedeny změny ke korespondujícím zbytkům v lidském C5, protože vykazovaly velmi odlišné elektrostatické vlastnosti, ale v kontextu některých jiných konzervovaných zbytků, které mohou indikovat podobnou lokální strukturu.

TABULKA 1

Připojení sekvencí C3 a příbuzných molekul k regionu zbytků 1427-1435 lidského C3

Zbytek (člověk)

Protein	Druh	1427	1428	1429 1430 1431 1432 1433	1434	1435
C3	člověk	R	Y	I	s	K	Y	E	L	D
	myš	R	Y	I	s	K	Y	E	M	N
	krysa	R	Y	I	s	K	Y	E	M	D
	morče	R	Y	I	s	K	Y	E	L	D
	králík	R	Y	I	s	K	Y	E	L	N
	kobra	R	Y	I	s	K	F	E	I	D
	Xenopus	K	Y	I	s	K	Y	E	V	N
	pstruh	R	Y	I	E	K	F	E	M	D
C4	člověk	R	Y	v	s	H	F	E	T	E
	myš	R	Y	v	s	H	F	E	T	D
Slp	myš	R	Y	v	s	H	F	E	T	D
C3/C4-	haglish	N	Y	I	v	Q	Y	E	I	R
podobný	mihule	K	Y	I	s	N	Y	E	I	T
C5	člověk	Q	L	F ·	T	D	Y	Q	I	K
	myš	Q	L	L	T	D	Y	Q	I	K
A2M	člověk	P	T	V	K	M	L	E	R	s
	myš	P	S	v	K	R	L	Q	D	Q
	krysa	P	T	v	K	M	L	E	R	s
PZP	člověk	P	T	v	K	M	L	E	R	s
Murinoglobulin	myš	P	T	v	K	K	L	E	R	L
A1M	krysa	P	s	v	K	K	L	Q	D	Q
A1M	g.křeček	P	T	v	K	K	L	E	R	s
A1I3	krysa	P	T	v	K	K	L	E	R	L

Metody mutagenese, exprese a analýzy C3 štěpících reakcí byly stejné, jako jsou popsány v předcházejících příkladech (Příklady 1-4). Mutagení oligonukleotid byl syntetizován se sekvencí: tggtgttgaccaatacatctccgactatcagctggacaa.

Zkouška pro obrat faktoru B

Exprivovaný produkt byl purifikován z media COS buněk afinitní purifikací na koloně Cloně - 3 - Sepharose jak popisuje Příklad 9. Tato metoda vedla ke značné konverzi thiolester rozrušené formy C3i. Divoký typ C3 byl izolován stejnou procedurou. Diluovaný divoký typ C3 (1/5, 1/25 a 1/125) byl zpracován na SDS-PAGE gelu (redukční podmínky) spolu s mutantním C3, a barvení stříbrem indikovalo, že mutant byl přítomen v koncentraci ekvivalentní k o něco méně než 1/25, ale o něco více než 1/125 ředění divokého typu. Stejná ředění byla použita ve zkoušce na obrat faktoru B. 5 μΐ těchto C3 bylo inkubováno s 25 μΐ CFD-G obsahujícího 5 μg/ml faktoru D a přibližně 1.6 pg/ml ¹²⁵I-značeného faktoru B (přibližně 1000 2000 dpm/μΐ) po 3 h při 37 °C. Vzorky pak byly analyzovány SDS-PAGE (redukční podmínky) s autioradiografií sušeného gelu. Výsledky jsou ukázány na Obr. 7.

8.3 Výsledky

Jak ukazuje Obr.7, zřetelné štěpení faktoru BV se vyskytuje ještě ve 1/125 ředění divokého typu C3 (C3i). Oproti tomu, žádné signifikantní štěpení nebylo pozorováno v přítomnosti mutantního C3, ani neředěného, který byl v koncentracích vyšších než 1/125 vzorek divokého typu.

U tohoto mutantu se proto jeví, že má porušenou schopnost podporovat štěpení faktoru B, nejpravděpodobněji redukci afinity vazby pro faktor B. Z tohoto důvodu je toto region C3, který může být mutován pro modulaci interakce mezi C3i (nebo C3b) a faktorem B a také snad stabilitu konvertasy (C3iBb nebo C3bBb).

PŘÍKLAD 9 Purifikace exprivovaných C3 mutantních molekul

9.1 úvod

Tento příklad demonstruje, jak mohou být mutantní C3 molekuly izolovány z expresního media, jako je kultivační medium transfektovaných eukaryotických buněk. Jednoduchou afinitní purifikací jsou C3 molekuly získány v čistotě dostatečné pro funkční testy a pro konjugaci s protilátkou metodou popsanou v příkladu 10. Ačkoliv eluce z protilátky je spojena s hydrolýzou značné části vnitřních thiolesterů je C3i produkt stále ještě vhodným prekursorem pro generaci aktivní C3 konvertasy, stejně jako pro produkci C3i-proti látkových konjugátů. Tento přístup je také pravděpodobně využitelný jako část přípravy vyžadované pro in vivo užití.

9.2 Metoda

Afinitní purifikace na Cloně - 3 - Sepharose

Cloně - 3 je krysí monoklonální protilátka, která je specifická pro C3 a jeho deriváty, včetně C3b a C3i (Lachmann, P.J. et al., 1980, J.Immunol. 41:503-515). Jsou dosažitelné jiné monoklonální protilátky proti C3 a v některých případech byly úspěšně použity v izolování C3 z malých množství lidské plasmy (Dodds, A.W., 1993,Methods Enzymol. 223:46-61) a jsou proto také pravděpodobně aplikovatelné pro izolování molekul exprivovaných ex vivo. IgG frakce byla spojena na Sepharosa CL-4B užitím kyanobromid (metodologie může být nalezena v Harrison and Lachmann, 1986, Handbook of Experimental

Immunology, 4. vyd., vyd. Weir, Herzenberg, Blackwell and Herzenberg, Blackwell, Oxford). Supernatanty kultur byly bud přímo vloženy do kolon této pryskyřice (re-cirkulované), nebo nejprve koncentrovány precipitací s 25% (hmotn./obj.) Na2SC>4, a resolubi1izací a dialýzou do PBS, 5 mM NaN3· Kolony pak byly promývány postupně (i) PBS, 5 mM NaN3 a (ii) PBS obsahujícím 1M NaCl. Vazba C3 se eluuje s 50 mM boritanu sodného pufrem, pH 10,5, a je okamžitě neutralizována odebíráním 0,9 ml frakcí do 0,1 ml 1M Tris/HCl pH 7. Materiál je pak dialyzován do PBS, 5mM NaN3.

Příprava C3 nesoucího His - Tag

His - Tag je vlákno histidinových zbytků, které vykazuje afinitu pro kolony nesoucí ionty niklu. Tato metoda byla využita pro izolaci exprivovaných proteinů. Domnívali jsme se, že může být užitečná pro izolaci exprivovaných mutantních C3 molekul a tak jsme užili insertní mutagenese pro vytvoření plasmidu kódujícího C3 s připojenými 6 histidinovými zbytky na karboxy konci (přímo na karboxy konec ke zbytku 1663). Toto umístění pro His - Tag bylo vybráno tak, aby minimalizovalo interferenci se syntézou, skládáním, zpracováním a tvorbou disulfidových vazeb nascentní C3. Zbytek 1661 je cysteinový zbytek, který je zahrnut v disulfidové vazbě na zbytek v sekveci dřívější (pravděpodobně Cys 1537, Dolmer , K. and Sottrup - Jensen, L., 1993, FEBS-Lett 315: 85-90) a proto se zdá být opatrné udělat inzerci za tímto strukturálním rysem. Mutace byly zavedeny použitím gapped plasmid techniky užité v Příkladu 1, užitím syntetizovaného mutageního oligonukleotidu se sekvencí: tgggtgccccaaccatcatcatcatcatcattgaccacaccccc.

Inkorporace korektní sekvence byla potvrzena DNA sekvenováním. Tato DNA sekvence může nyní být transferována do expresního vektoru. Po transfekci eukaryotních buněk by mělo být možné izolovat exprivovaný C3 díky afinitě pro kolonu nesoucí ionty niklu, nebo jakoukoliv jinou matrici se specifickou afinitou pro His - Tag.

9.3 Výsledky

Množství mutantního C3 bylo purifikováno na Cloně - 3 Sepharose, včetně těch, které jsou popsané v Příkladu 1 a 2 a jsou exprivovány v CHO buňkách. Produkty si uchovávají schopnost podporovat štěpení faktoru B faktorem D. Stejná metoda byla použita k izolaci mutantů popsaných v příkladu B2, exprivovaných v COS buňkách. Barvení stříbrem SDS-PAGE gelů indikovalo, že izolované produkty nebyly 100% čisté, ale obvykle se zdály být více než nebo alespoň 50% čisté. Toto vychází z počátečních materiálů obyčejně obsahujících méně než 10 pg/ml C3 v 10% (obj./obj.) fetálním telecím seru plus jiné celulární proteiny. Navíc nebyly C3 degradovány v průběhu izolace a aktivita endogeních faktorů H a I se zdála být odstraněna.

Purifikace pomocí His - Tag vyžaduje mírnější eluční podmínky z kolon nesoucích ionty niklu. Například byla použita EDTA. Aplikace této metody na C3 může proto dovolit izolaci bez porušení vnitřní thiolesterové vazby.

PPíKLAD 10 Konjugace C3i protilátky a užití k cílené aktivitě C3 konvertásy proti jednotlivým buňkám

10.I úvod

Jedním aspektem vynálezu je, že stabilní C3 konvertásy odvozené od mutantních C3 molekul budou zvyšovat konverzi C3, která, je-li lokalizovaná na určité cílové místo, nastartuje na komplementu závislý útok na tento cíl. Upřednostňovaný přístup pro zacílení odpovědi je spojení mutantní C3 molekuly, bud C3i nebo C3b derivátu, s protilátkou specifickou pro žádoucí cíl. V tomto příkladě demonstrujeme pracovní metodologii pro vytváření takových konjugátů, která je aplikovatelná na mutantní C3i nebo C3b molekuly a muže být použita na materiálu afinitně purifikovaném z expresního systému, když byl thiolester C3 porušen při zpracování. Spojením C3i s protilátkou, která se specificky váže na ovčí erytrocyty jsme dále ukázali, že konjugát fixuje C3i na povrch erytrocytu tak, že může být formována konvertasa, C3iBbP, která iniciuje lýzu těchto buněk, když jsou jiné komponenty komplementu poskytnuty ve formě normálního morčecího séra ( v EDTA kvůli zabránění de novo formaci C3 konvertasy). Proto může být konjugovaná protilátka použita k zaměření C3 molekuly pro iniciaci komplement dependentního ataku jednotlivých typů buněk. Tento příklad využívá divoké formy C3i, z lidské plasmy, který formuje C3 konvertasu in vitro. In vivo je divoký typ C3i a C3b porušen faktory Hal. Proto může být v tomto kontextu výhodné použití mutantního C3, konstruovaného podle plánu tohoto patentu tak, aby byl resistentní na faktory Hala proto vytvářel stabilní C3 konvertasu.

10.2 Metoda (i) Generování a purifikace C3i - protilátka konjugátu

Užitou protilátkou byla IgG frakce izolováná od po 1yk1oná1 ní ho králičího anti-ovčí erytrocyt antisera. 1.1 mg bylo inkubováno s 75 nmol SPDP v konjugačním pufru, pH 7,5 (20 mM KH2PO4, 60 mM Na2HPOz,, 0,12 M NaCl) po 2 h při pokojové teplotě. PDP-IgG byl purifikován gelovou filtrací na Superose 6 koloně (Pharmacia) (ve fosfátovém pufru, pH 7,4, obsahujícím 0,5 M NaCl). Redukce vzorku dithiotreitolem byla užita k hodnocení 4 PDP skupin připojených na molekulu IgG. C3i byl připraven ošetřením purifikovaného C3 0,1 M methylaminu, pH 7,2 (2h při 37 °C). Přebytečný methylamin byl odstraněn gelovou filtrací následovanou dialýzou do konjugačního pufru. 18 nmol C3i bylo smíseno s 1,7 nmol PDP-IgG v 1,26 ml konjugačního pufru a inkubováno po 1 den při pokojové teplotě a potom po 1,5 dne při 4 °C. Obrázek 8 ukazuje Coomassie Blue barvený SDS-PAGE gel konjugační reakční směsi, vykazující přítomnost druhu o přibližně 350 kDa, který nebyl přítomen ani v PDP-IgG, ani v C3i. Tento druh byl parciálně purifikován gelovou filtrací na Superose - 6 koloně ve fosfátovém pufru, pH 7,4, obsahujícím 0,5 M NaCl a pak dialyzován do PBS. Tento se eluuje před C3, v objemu, ze kterého může být hodnocena molekulární hmotnost 300 - 400 kDa kalibrací s globulárními standardy molekulární hmotnosti. Koncentrace konjugátu, volné protilátky a nenavázaného C3 byly hodnoceny z Coomassie - barveného SDS-PAGE gelu (neredukující podmínky). Dvoudimensionální SDS-PAGE (první dimense neredukovaná, druhá dimense redukovaná) odhalil vzorky kompatibilní s 1 : 1 konjugátem mezi IgG a C3i.

(ii) Demonstrace toho že C3i - protilátka konjugát může být použit k zaměření aktivity konvertasy proti jednotlivým buňkám.

μΐ rozpuštěného konjugátu (0 (bez konjugátu), 1/100,

1/50, 1/10) bylo inkubováno se 100 μΐ přibližně 1% (obj./obj.) ovčích erytrocytů (předem promytých v CFD) po 1 h při 37 °C. Paralelní inkubace byly provedeny s ekvivalentním množstvím PDP-IgG (bez C3) a s C3 samotným. Buňky pak byly 4 krát promývány v CFD a resuspendovány do 100 μΐ v CFD-G. 50 μΐ z nich bylo lysováno s 150 μΐ H2O, po které následovalo přidání 800 μΐ CFD obsahujícího 10 mM EDTA a 2% (obj./obj.) NGPS.

Dalšíh 50 μΐ konjugátem potažených buněk bylo inkubováno po 15 min při 37 °C s 50 μΐ CFD-G obsahujícího 190 pg/ml faktoru B, pg/ml faktoru D, 20 pg/ml properdinu a 0.6 mM N1CI2, a potom následovala lýsa 900 μΐ CFD obsahujícího 10 mM EDTA a 2% (obj./obj.) NGPS. Po 30 min při 37 °C byly buňky peletovány centrifugací (2000 x g, asi 3 min) a byla měřena optická absorbance supernatantu při 412 nm. Užitím H2O ošetřených vzorků jako 100% lýzy a čistého pufru postrádajícího buňky, bylo kalkulováno % lýze, jak ukazuje Obr. 9. Konjugát produkoval lýzu dependentní na dávce, zatímco ani PDP-IgG, ani C3i sám negeneroval žádnou lýzu signifikantně vyšší než byla pozorována za absence jakéhokoliv ošetření.

10.3 Souhrn výsledků

Použitá metoda se ukázala být úspěšnou pro spojení C3i s IgG jak je ukázáno:

1. Formováním proužku vhodné velikosti (okolo 350 kDa) pro 1 : 1 C3 :IgG konjugát ukázaný SDS-PAGE na Obr. 8.

2. Dvoudimensionálním SDS-PAGE (první dimense neredukovaná, druhá dimense redukovaná) indikujícím, že tento druh obsahoval jak IgG, tak C3i.

3. Eluční charakteristika tohoto druhu na gelové filtraci je opět konsistentní s molekulou okolo 350 kDa.

4. Konjugát vykazuje hemolytickou aktivitu, která není vykazována ani PDP-IgG, ani C3i (Obr.9).

Hemolytická zkouška (Obr. 9) dále demonstrovala, že:

1. Specifická anti- ovčí erytrocyt protilátka lokalizovala C3i na membránu cílové buňky (ovčího erytrocytu), a tak zabránila jeho odstranění promýváním (oproti volnému C3i).

2. Konjugát udržoval aktivitu C3i ve které byl stále ještě schopen vytvářet C3 konvertasu reakcí s properdinem a faktory B a D.

3. Tato konvertasa může iniciovat komplement - dependentní atak na cíl, v tomto případě aktivací dráhy lýzy (C5-9) k lýze erytrocytů.

Další data z jiných laboratoří ukazují, že faktor kobřího jedu může být připojen na protilátku a že tento konjugát může namířit aktivaci komplementu na jednotlivé typy buněk (Vogel, 1988, Targeted. Diagn. Ther., 1:191-224, Muller, B. and Muller - Puchholtz, W. , 1987, Leuk. Pes, 1 1:461 - 468, Parker, C.J., White, V.F. and Falk, P.J., 1986, Complement 3:223 - 235, Petrella, E.C. et al., 1987, J.Immunol. Methods 104:159-172). Tato data podporují tvrzení, že C3 modifikovaný tak, že je schopný vytvářet stabilní C3 konvertasu, jako faktor kobřího jedu, může být užit k zacílení komplementem zprostředkované odpovědi, jak je zdůrazněno v tomto vynálezu.

PPíKLAD 11 Demonstrace toho, že mutantní molekuly C3 indukují obrat faktoru B v normálním lidském séru.

11.1 úvod

Hlavním účelem zde popsaného vynálezu je konsumpční deplece aktivity komplementu z biologických tekutin. Vynález popisuje metody pro výrobu C3 molekul, které jsou rezistentní na down regulaci faktory H a I. V tomto stavu budou vázat faktor B a generovat aktivní C3 konvertasy. Aktivita těchto konvertas je demonstrována hemolytickou zkouškou využitou v Příkladu 6. Taková konvertasa bude proto konzumovat C3. Jestliže je konvertasa nestabilní, bude disociovat bez velké C3 konverze. Nicméně dovolí vazbu čerstvého faktoru B, a jeho konverzi na Bb a Ba. Tak mutantní C3 započne konsumpci faktoru B, vedoucí nakonec k vyřazení alternativní dráhy, a znemožnění amplifikace stimulace klasickou dráhou. Jestliže je vytvořena stabilní C3 konvertasa, bude obrat faktoru B redukován, ale konsumpce C3 bude zvýšena. Obě situace mohou proto být žádoucí. V tomto příkladu demonstrujeme, že mutantní C3 molekuly, které jsou modifikovány k rezistenci na faktor I, ale bez jakékoliv modifikace k ovlivnění stability konvertasy, započnou akcelerovaný obrat faktoru B v lidském séru. Oproti tomu divoký typ C3 nezpůsobuje žádný signifikantní obrat, pravděpodobně díky tomu, že divoký typ C3i je rychle degradován faktory H a

I.

II. 2 Metoda

Připravené mutanty jsou následující:

Q1R2	Arg1303	zaměněn	za	Gin (Příklad 2)
Q1Q2	Argl303	zaměněn	za	Gin, plus Arg1320	zaměněn	za Gin
(Příklad	1)
E1Q2	Argl303	zaměněn	za	Glu, plus Argl320	zaměněn	za Gin
(Příklad	5)
Tyto	mutanty byly všechny	exprivovány v CHO	buňkách	a pak

purifikovány precipitací s Na2S0«, pak následovala afinitní purifikace na Cloně - 3 - Sepharose, .jak popisuje Příklad B3. Divoký typ C3 (R1R2) byl izolován podobně. Podle SDS-PAGE s barvením stříbrem byla koncentrace 01 mezi 1/5 a 1/25 divokého typu, a koncentrace Q1Q2 byla 1/ divokého typu, a koncentrace E1Q2 byla mezi 1/25 a 1/125 divokého typu. Všechny preparáty pravděpodobně obsahovaly většinu molekul s rozrušeným thiolesterem (C3i).

μΐ těchto C3 preparátů bylo inkubováno s 10 μΐ roztoku 20% (obj./obj.) normálního lidského séra v PBS obsahujícím 1 mM MgCl2 a přibližně 300 ng ¹²⁵I-značeného faktoru B (přibližně

- 300 00 dpm) po 1 hodinu při 37 °C. 5 pl bylo pak analyzováno SDS-PAGE (redukční podmínky). Sušený gel byl exponován na autoradiografickém filmu pro indikaci pozice proužků korespondující s intaktním faktorem B a jeho produkty štěpení. Tyto pak byly excidovány a pečlivě zkoumány pro určení stupně štěpení. Hodnoty získané v pufru samotném byly odečteny jako pozadí (zahrnujíc nejenom pozadí štěpení, ale také degradační produkty a jiné nečistoty přítomné v přípravě radioligandu) .

11.3 Výs1edky

Výsledné stupně štěpení faktoru B jsou ukázány níže:

1/25 Divoký typ 1,49% 1/5 Divoký typ 2,74% Q1R1 6,19% Q1Q2 7,41% E1Q2 6,42%

Podle toho všechny faktor I rezistentní mutanty produkovaly vyšší úrovně štěpení faktoru B než ekvivalentní množství divokého typu C3 (C3i) . Při vyšších dávkách nebo delší inkubaci může být výsledkem kompletní inkapacitace alternativní dráhy.

Zkratky použité v předešlých příkladech zahrnují:

CFD - komplement fixační rozpouštědlo (definované Harrison and Lachmann, 1986, Handbook of Experimental Immunology, 4th edn., Ed.s Weir, Herzenberg, Blackwell and Herzenberg, Blackwell, Oxford), CFD-G, CFD obsahující 0,1% (hmotn./obj.) želatinu, PBS fosfátový pufrovací salinický roztok, NGPS, normální morčecí sérum, SDS-PAGE SDS-polyakrylamid gelová e1ektroforesa, SPDP N - Succimidyl - 3 - (2

-pyridyldi thi o)propionat.

Odkazy:

1. Bergmann,M. & Fruton.J.S. (1941) Adv. Enzymol., 1:63-98.

2. de Bruijn,M.H. & Fey,G.H. (1985), Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 82:708-712

3. Crawford-MH et al. (1988) Circulation. 78:1449-58

4. Daha,M.R. & van Es,L.A. (1982) Immunol. 43:33-38.

5. Farries,TC; Lachmann,PJ & Harrison,RA (1988)

Biochem. J. 252:47-54

6. Farries,TC; Lachmann,PJ St Harrison, RA (1988)

Biochem. J. 253:667-75

7. Fořty,J; Hasan,R; Cary,N; White,DJ & Wallwork,J (1992) Transplant. Proč. 24:488-9

8. Fritzinger,D.C. et al. (1992) J. Immunol.

149:3554-3562

9. Harrison,R.A. í Lachmann, P. J. (1980) Mol. Immunol.

17:9-20.

10. Kalii,K.R., Hsu,P. & Fearon,D.T. (1994) Springer Semin. Immunopathol. 15:417-431.

11. Kinoshita,T; Takata,Y; Κοζοηο,Η; Takeda,J; Hong,KS &. Inoue,K (1988) J. Immunol. 141:3895-901

12. McNearney,TA; Oděli,C; Holers,VM; Spear,PG; Atkinson,JP (1987) J. Exp. Med. .166:1525-35

13. Nicol,P.A.E. & Lachmann,P.J. (1973) Immunol.

24:259-275

14. Pangburn,MK í Muller-Eberhard, HJ (1984) Springer Semin. Immunopathol. 7:163-92

15. Rother,K. & Till.G.O. (eds) (1988) The complement System (Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Germany)

16. Van den Berg,C.W., Aerts,P.C. & Van Dijk,H. (1991)

J. Immunol. Methods 136:287-294.

17. Vogel,CW; Smith,CA & Muller-Eberhard,'HJ (1984) J. Immunol. 133:3235-41

18. Weisman,HF et al. (1990) Science 249:146-51.

19. Wu,R. (ed.) (1993) Methods Enzymol. 217: ch.s 12-14 (Academie Press, San Diego, U.S.A.)

20. Fong,K.Y., So,A.K., Koch,C. & Walport,M.J. (1990) J. Exp. Med. 172:1011-7

21. Sambrook,J., Fritsch,E.F. & Maniatis,T. (1989) Molecular Cloning. A Laboratory Manual second edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press)

22. Fishelson,Z.(1991) Mol. Immunol. 28:545-52.

23. Taniguchi-Sidle, A & Isenman,D.E. (1993) Mol. Immunol. 30:54.

24. Lambris,J.D.,Avi1 a,D.,Becherer,J.D. &

Muller,Eberhard,H.J. (1988) J. Biol. Chem. 263:12147-50.

25. Taniguchi-Sidle, A. and Isenman, D.E. (1992) J. Biol. Chem. 267:635-643.

26. Hofer, B. and Kuhlein, B. (1993) Methods Enzymol. 217:173-189.

27. Morinaga, Y., Franceschini, T., Inouye, S. and Inouye, M. (1984) Bio-technology 2:636-639 .

28. Harrison, R.A. and Lachmann, P.J. (1986) Handbook of Experimental Immunology (eds Weir, Herzenberg, Blackwell and Herzenberg;Blackwell, Oxford) 4th ed.,

29. Kotwal, G., J., and Moss, B., Nátuře (1988) 335 (6186) :176-8.

Claims (7)

1. Protein nativní komplementové dráhy modifikovaný tak, že tento protein je schopen vytváření stabilní C3 konvertasy.

2. Protein, podle nároku 1, který je modifikovaným lidským proteinem.

3. Protein, podle nároku 1 nebo nároku 2, který je více rezistentní na štěpení faktorem I než nativní protein.

4. Protein, podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, který je modifikovaným C3 proteinem.

5. Protein, podle nároku 5, kde je protein modifikován nahrazením bud Arg-1303, Arg-1320 nebo obou, jinou aminokyselinou.

6. Protein, podle nároku 5, kde Arg-1303 nebo Arg-1320 nebo oba jsou nahrazeny glutaminem, tyrosinem, cystinem, tryptofanem, glutamovou kyselinou nebo glycinem.

7. Protein, pod 1 e nároku 6, kde Arg-1320 je nahrazen glutaminem. 8. Protein, podle nároku 6 nebo 7, kde Arg- 1303

je nahrazen glutamovou kyselinou, glycinem nebo glutaminem.

9. Protein, podle kteréhokoliv z předchozích nároků, který má redukovanou citlivost na faktor H a/nebo faktor I vzhledem k nativní lidské C3 konvertase, kde zmíněný protein má jednu nebo více aminokyselinových změn vzhledem k nativní lidské C3 konvertase v regionu korespondujícímu aminozbytkum 752 - 754 a/nebo zbytkům 758 - 780 nativní lidské C3 konvertasy.

10. Protein podle nároku 9, kde jednou nebo více aminokyselinovými změnami jsou změny z kyselých aminokyselinových zbytků na neutrální aminokyselinové zbytky.

11. Protein podle nároku 9 nebo nároku 10, kde změny aminokyselinových zbytků jsou změny z Asp - Glu - Asp na Gly Ser - Gly.

12. Protein, podle kteréhokoliv z předchozích nároků, který má aminokyselinové změny vzhledem k nativní C3 konvertase v aminokyselinových zbytcích, korespondujících zbytkům 1427, 1431 a/nebo 1433 nativní lidské C3 konvertasy.

13. DNA sekvence kódující protein, jak je nárokován kterýmkoliv z nároků 1 až 12.

14. DNA konstrukt (t.j. vektor) obsahující DNA sekvenci jak je definována v nároku 13.

15. Protein, jak je definován kterýmkoliv z nároků 1 až 12, pro použití v terapii.

16. Konjugát obsahující protein, jak je definován v kterémkoliv z nároků 1 až 12, navázaný na specifickou vazebnou skupinu.

17. Konjugát podle nároku 16, kde specifickou vazebnou skupinou je specifický vazebný protein.

18 Konjugát podle nároku 17, kde specifickým vazebným proteinem je protilátka nebo její antigen vazebný fragment.

19. Použití proteinu, jak je definován kterýmkoliv z nároků 1 až 12 nebo konjugátu, jak je definován kterýmkoliv z nároků 16 až 18 k výrobě léčiv pro použití v depleci hladin proteinů komplementové dráhy.

20. Použití podle nároku 19, kde je léčivo použito v prevenci rejekce cizorodého materiálu.

21. Použití podle nároku 19, kde je léčivo použito pro lokalizaci a/nebo amplifikaci endogenní konverze proteinů komplementu a depozici ve specifickém místě.

22. Farmaceutická formulace zahrnující jeden nebo více proteinů, jak jsou definovány v kterémkoliv z nároků 1 až 12 nebo konjugátů, jak jsou definovány v kterémkoliv z nároků 16 až 18 dohromady s jedním nebo více farmaceuticky přijatelnými nosiči nebo excipienty.

23. Farmaceutická formulace podle nároku 22, pro použití v depleci hladin proteinů komplementové dráhy.

24. Farmaceutická formulace podle nároku 23, pro použití v prevenci rejekce cizorodého materiálu.

25. Farmaceutická formulace podle nároku 22, pro použití v lokalizaci a/nebo amplifikaci endogenní konverze proteinů komplementu a depozici ve specifickém místě ůsob r ce protXinů kpmpTementQvé djJtfry u sáXců, ^erý zahrnuje podání proteinu definovaného^ nároků 1 až 12s-aycúm.

Zrnko 1 i v z

27. Způsj/ť-pxrdTe^ nároku 25, kde prhťeiivj^e podán ve foxfiťě^Tarmaceutické formulace podle nároku 22.

Obrázek 1 1/13 10 MGPTSGPSLL 20 LLLLTHLPLA 1 30 LGSPMYSIIT 40 PNILRLESEE 50 TMVLEAHDAQ 60 GDVPVTVTVH 70 DFPGKKLVLS 80 SEKTVLTPAT 90 NHMGNVTFTI 100 PANREFKSEK 110 GRNKFVTVQA 120 TFGTQWEKV 130 VLVSLQSGYL 140 FIQTDKTIYT 150 PGSTVLYRIF 160 TVNHKLLPVG 170 RTVMVNIENP 180 EGIPVKQDSL 190 SSQNQLGVLP 200 LSWDIPELVN 210 MGQWKIRAYY 220 ENSPQQVFST 230 EFEVKEYVLP 240 SFEVIVEPTE 250 KFYYIYNEKG 260 LEVTITARFL 270 YGKKVEGTAF 280 VIFGIQDGEQ 290 RISLPESLKR 300 IPIEDGSGEV 310 VLSRKVLLDG 320 VQNPRAEDLV 330 GKSLYVSATV 340 ILHSGSDMVQ 350 AERSGIPIVT 360 SPYQIHFTKT 370 PKYFKPGMPF 380 DLMVFVTNPD 390 GSPAYRVPVA 400 VQGEDTVQSL 410 TQGDGVAKLS 420 INTHPSQKPL 430 SITVRTKKQE 440 LSEAEQATRT 450 MQALPYSTVG 460 NSNNYLHLSV 470 LRTELRPGET 480 LNVNFLLRMD 490 RAKEAKIRYY 500 TYLIMNKGRL 510 LKAGRQVREP 520 GQDLWLPLS 530 ITTDFIPSFR 540 LVAYYTLIGA 550 SGQREWADS 560 VWVDVKDSCV 570 GSLWKSGQS 580 EDRQPVPGQQ 590 MTLKIEGDHG 600 ARWLVAVDK 610 GVFVLNKKNK 620 LTQSKIWDW 630 EKADIGCTPG 640 SGKDYAGVFS 650 DAGLTFTSSS 660 GQQTAQRAEL 670 QCPQPAARRR 680 RSVQLTEKRM 690 DKVGKYPKEL 700 RKCCEDGMRE 710 NPMRFSCQRR 720 TRFISLGEAC 730 KKVFLDCCNY 740 ITELRRQHAR 750 ASHLGLARSN 760 LDEDIIAEEN 770 IVSRSEFPES 780 WLWNVEDLKE 790 PPKNGISTKL 800 MNIFLKDSIT 810 TWEILAVSMS 820 DKKGICVAD? 830 FEVTVMQDFF 840 IDLRLPYSW 850 RNEQVEIRAV 860 LYNYRQNQEL 870 KVRVELLHNP 880 AFCSLATTKR 890 RHQQTITIPP 900 KSSLSVPYVI 910 VPLKTGLQEV 920 EVKAAVYHHF 930 ISDGVRKSLK 940 WPEGIRMNK 950 TVAVRTLDFE 960 RLGREGVQKE 970 DIPPADL3DQ 980 VPDTESETRI 990 LLQGTPVAQM 1000 TEDAVDAERL 1010 KHLIVTPSGC 1020 GEQNMIGMTP 1030 TVIAVKYLDE 1040 TEQWEKFGLE 1050 KRQGALELIK 1060 KGYTQQLAFR 1070 Q?3 SAFAAFV 1080 KRAPSTWLTA 1090 YWKVFSLAV 1100 NLIAIDSQVL 1110 CGAVKWLILE * - Z u KQKPDGVFQE 1130 DAPVIHQEMI 1140 GGLRNNNEKD 1150 MALTAFVLIS 1160 LQEAKDICEE 1170 QVNSLPGSIT 1180 KAGDFLEAKY 1190 MNLQRSYTVA 1200 IAGYALAQMG

2/13

1-2

1210 RLKGPLLNKF 1220 LTTAKDKNRW 1230 EDPGKQLYNV 1240 EATSYALLAL 1250 LQLKDFDFVP 1260 PWRWLNEQR 1270 YYGGGYGSTQ 1280 ATFMVFQALA 1290 QYQKDAPDHQ 1300 ELNLDVSLQL 1310 PSRSSKITHR 1320 IHWESASLLR 1330 SEETKENEGF 1340 TVTAEGKGQG 1350 TLSWTMYHA 1360 KAKDQLTCNK 1370 FDLKVTIKPA 1380 PETEKRPQDA 1390 KNTMILEICT 1400 RYRGDQDATM 1410 SILDISMMTG 1420 FAPDTDDLKQ 1430 LANGVDRYIS 1440 KYELDKAFSD 1450 RNTLIIYLDK 1460 VSHSEDDCLA 1470 FKVHQYFNVE 1480 LIQPGAVKVY 1490 AYYNLEESCT 1500 RFYHPEKEDG 1510 KLNKLCRDEL 1520 CRCAEENCFI 1530 QKSDDKVTLE 1540 ERLDKACEPG 1550 VDYVYKTRLV 1560 KVQLSNDFDE 1570 YIMAIEQTIK 1580 SGSDEVQVGQ 1590 QRTFISPIKC 1600 REALKLEEKK 1610 HYLMWGLSSD 1620 FWGEKPNLSY 1630 IIGKDTWVEH 1640 WPEEDECQDE 1650 ENQKQCQDLG 1660 AFTESMWFG CPN

3/13

Obrázek 2 tcccagcacc 60 cctctccct 12 20 ctgtccctct 30 gtccctctga 40 ccctgcactg 50 atgggaccca 70 cctcaggtcc 80 cagcctgctg 90 ctcctgctac 100 taacccacct 110 ccccctggct 120 ctggggagtc 130 ccatgtactc 140 tatcatcacc 150 cccaacatct 160 tgcggctgga 170 gagcgaggag 180 accatggtgc 190 tggaggccca 200 cgacgcgcaa 210 ggggatgttc 220 cagtcactgt 230 tactgtccac 240 gacttcccag 250 gcaaaaaact 260 agtgctgtcc 270 agtgagaaga 280 ctgtgctgac 290 ccctgccacc 300 aaccacatgg 310 gcaacgtcac 320 cttcacgatc 330 ccagccaaca 340 gggagttcaa 350 gtcagaaaag 360 gggcgcaaca 370 agttcgtgac 380 cgtgcaggcc 390 accttcggga 400 cccaagtggt. 410 ggagaaggtg 420 gtgctggtca 430 gcctgcagag 440 cgggtacctc 450 ttcatccaga 460 cagacaagac 470 catctacacc 480 cctggctcca 490 cagttctcta 500 tcggatcttc 510 accgtcaacc 520 acaagctgct 530 acccgtgggc 540 cggacggtca 550 tggtcaacat 560 tgagaacccg 570 gaaggcatcc 580 cggtcaagca 590 ggactccttg 600 tcttctcaga 610 accagcttgg 620 cgtcttgccc 630 ttgtcttggg 640 acattccgga 650 actcgtcaac 660 atgggccact 670 ggaagatccg 680 agcctactat 690 gaaaactcac 700 cacagcaggt 710 cttctccact 720 gagtttgagg 730 tgaaggagta 740 cgtgctgccc 750 agtttcgagg 760 tcatagtgga 770 gcctacagag 780 aaattctact 790 acatctataa 800 cgagaagggc 810 ctggaggtca 820 ccatcaccgc 830 caggttectc 840 tacgggaaga 850 aagtggaagg 860 aactgccttt 870 gtcatcttcg 880 ggatccagga 890 tggcgaacag 900 aggatttccc 910 tgcctgaatc 920 cctcaagcgc 930 attccgattg 940 aggatggctc 950 gggggaggtt 960 gtgctgagcc 970 ggaaggtact 980 gctggacggg 990 gtgcagaacc '1000 cccgagcaga 1010 agacctggtg 1020 gggaagtctt 1030 tgtacgtctc 1040 tgccaccgtc 1050 atcttgcact 1060 caggcagtga 1070 catggtgcag 1080 gcagagcgca 1090 gcgggatccc 1100 catcgtgacc Í110 tctccctacc 1120 aacctcatgg 1180 gtccagggcg 1240 agatccactt 1130 tgttcgtgac 1190 caccaagaca 1140 gaaccctgat 1200 gcagtctcta 1260 cccaagtact 1150 1160 1170 ggctctccag 1210 1220 1230 1250

4/13

2-2

acccagggag 1270 atggcgtggc 1280 caaactcagc 1290 atcaacacac 1300 accccagcca 1310 gaagcccttg 1320 agcatcacgg 1330 tgcgcacgaa 1340 gaagcaggag 1350 ctctcggagg 1360 cagagcaggc 1370 taccaggacc 1380 atgcaggctc 1390 tgccctacag 1400 caccgtgggc 1410 aactccaaca 1420 attacctgca 1430 tctctcagtg 1440 ctacgtacag 1450 agctcagacc 1460 cggggagacc 1470 ctcaacgtca 1480 acttcctcct 1490 gcgaatggac 1500 cgcgcccacg 1510 aggccaagat 1520 ccgctactac 1530 acctacctga 1540 tcatgaacaa 1550 gggcaggctg 1560 ttgaaggcgg 1570 gacgccaggt 1580 gcgagagccc 1590 ggccaggacc 1600 tggtggtgct 1610 gcccctgtcc 1620 atcaccaccg 1630 acttcatccc 1640 ttccttccgc 1650 ctggtggcgt 1660 actacacgct 1670 gatcggtgcc 1680 agcggccaga 1690 gggaggtggt 1700 ggccgactcc 1710 gtgtgggtgg 1720 acgtcaagga 1730 ctcctgcgtg 1740 ggctcgctgg 1750 tggtaaaaag 1760 cggccagtca 1770 gaagaccggc 1780 agcctgtacc 1790 tgggcagcag 1800 atgaccctga 1810 agatagaggg 1820 tgaccacggg 1830 gcccgggtgg 1840 tactggtggc 1850 cgtggacaag 1860 ggcgtgttcg 1870 tgctgaataa 1880 gaagaacaaa 1890 ctgacgcaga 1900 gtaagatctg 1910 ggacgtggtg 1920 gagaaggcag *1930 acatcggctg 1940 caccccgggc 1950 agtgggaagg 1960 attacgccgg 1970 tgtcttctcc 1980 gacgcagggc 1990 tgaccttcac 2000 gagcagcagt 2010 ggccagcaga *2020 ccgcccacag 2Ó30 ggcaaaactt 2040 cagtgcccgc 2050 agccagccgc 2060 ccgccgacgc 2070 cgttccgtgc 2080 agctcacgga 2090 gaagcgaatg 2100 gacaaagtcg 2110 gcaagtaccc 2120 caaggagctg 2130 cgcaagtgct 2140 gcgaggacgg 2150 catgcgggag 2160 aaccccatga 2170 ggttctcgtg 2180 ccagcgccgg 2190 acccgtttca 2200 tctccctggg 2210 cgaggcgtgc 2220 aagaaggtct *2230 tcctggactg 2240 ctgcaactac 2250 atcacagagc 2260 tgcggcggca 2270 gcacgcgcgg 2280 gccagccacc 2290 tgggcctggc 2300 caggagtaac 2310 ctggatgagg 2320 acatcattgc 2330 aaaacaaaac 2340 atcgtttccc 2350 gaagtgagtt 2360 cccagagagc 2370 * C( C u m * w G 3 *2380 acgttgagga 2390 cttgaaagag 2400 ccaccgaaaa *2410 atggaatctc 2420 taccaagctc 2430 atgaatatat 2440 ttttgaaaaa 2450 ctccatcacc 2460 acgtgggaga **2470 ttctggctgt 2480 gagcatgtcg 2490 gacaagaaag *2500 ggatctgtgt 2510 ggcagacccc 2520 ttcgaggtca 2530 cagtaatgca 2540 ggacttcttc -! c, ς λ 0 3 v 3uC§3C —’mC 2560 ggctacccta 2570 2580

5/13

cgaaacgagc aggtggaaat ccgagccgtt ctctacaatt accggcagaa ccaagagctc 2590 2600 2610 2620 2630 2640 aaggcgaggg tgoaactact ccacaatcca gccttctgca gcctggccac caccaagagg 2650 2660 2670 26B0 2690 2700 cgtcaccagc agaccataac catccccccc aagtcctcgt tgtccgttcc atatgtcatc 2710 2720 2730 2740 2750 2760 gtgccgctaa agaccggcct gcaggaagtg gaagtcaagg ctgctgtcta ccatcatttc 2770 2780 2790 2800 2810 2820 atcagtgacg gtgtcaggaa gtccctgaag gtcgtgccgg aaggaatcag aatgaacaaa 2830 2840 2850 2860 2870 2880 actgtggctg ttcgcaccct ggatccagaa cgcctgggcc gtgaaggagt gcagaaagag 2890 2900 2910 2920 2930 2940 gacatcccac ctgcagacct cagtgaccaa gtcccggaca ccgagtctga gaccagaatt 2950 2960 2970 2980 2990 3000 ctcctgcaag ggaccccagt ggcccagatg acagaggatg ccgtcgacgc ggaacagctg 3010 3020 3030 3040 3050 *3060 aagcacctca ttgtgacccc ctcgggctgc ggggaacaga acatgatcgg catgacgccc 3070 3080 3090 3100 3110 3120 acggtcatcg ctgtgcatta cctggatgaa acggagcagt gggagaagtt cggcctagag 3130 3140 3150 3160 3Í70 3180 aagcggcagg gggccttgga gctcatcaag aaggggtaca cccagcagct ggccttcaga 3190 3200 3210 3220 3230 3240 caacccagct ctgcctttgc ggccttcgtg aaacgggcac ccagcacctg gctgaccgcc 3250 3260 3270 3280 3290 3300 tacgtggtca aggtcttctc tctggctgtc aacctcatca ccatcgactc ccaagtcctc 3310 3320 3330 3340 3350 3360 tgcggggctg ttaaatggct gatcctggag aagcagaagc ccgacggggt cttccaggag 3370 3380 3390 *3400 3410 3420 gatgcgcccg tgatacacca agaaatgatt ggtggattac ggaacaacaa cgagaaagae 3430 3440 3450 3460 34-70 3480 atggccctca cggcctttgt tctcatctcg ctgcaggagg ctaaagatat ttgcgaggag 3490 3500 3510 *3520 3530 3540 caggtcaaca gcctgccagg cagcatcact aaagcaggag acttccttga agccaactac 3550 3560 3570 358Ó 3590 3600 atgaacctac acagatccta cactgtggcc attgctggct atgctctggc ccagatgggc 3610 3620 3630 3640 3650 3660 aggctgaagg CZZZZZZZZZ taacaaattt ctgaccacag ccaaagataa gaaccgctgg '3670 3680 3690 370Ó 3710 3720 gaggaccctg gtaagcagct ctacaacgtg gaggccacat cctatgccct cttggcccta 3730 3740 3750 3760 3770 3780 ctgcagctaa aagactttga ctttgtgcct cccgtcgtct gttggctcaa tgaacagaga 3790 3800 3810 3820 3830 3840 tactaccgtg zzzzzzazzg ctctacccag cccaccttca tagtgttcca agccttggct 3850 3860 3870 388 '* 3990 3900

6/13

2-4

caataccaaa 3910 aggacgcccc 3920 tgaccaccag 3930 gaactgaacc '3940 ttgacgcgtc 3950 cctccaactg 3960 cccagccgca 3970 gctccaagat 3980 cacccaccgt 3990 atccactggg 4000 aatctgccag 4010 cctcctgcga 4020 tcagaagaga 4030 ccaaggaaaa 4040 tgagggtttc 4050 acagtcacag 4060 ctgaaggaaa 4070 aggccaaggc 4080 accttgtcgg 4090 tggtgacaat 4100 gtaccatgct 4110 aaggccaaag 4120 atcaactcac 4130 ctgtaataaa 4140 ttcgacctca 4150 aggtcaccat 4160 aaaaccagca 4170 ccggaaacag 4180 aaaagaggcc 4190 tcaggatgcc 4200 aagaacacta 4210 tgatccttga 4220 gatctgtacc 4230 aggtaccggg 4240 gagaccagga 4250 tgccactatg 4260 tctatattgg 4270 acatatccat 4280 gatgactggc 4290 tttgctccag 4300 acacagatga 4310 cctgaagcag 4320 ctggccaatg 4330 gtgttgacag 4340 atacatctcc 4350 aagtatgagc 4360 tggacaaagc 4370 cttctccgat 4380 aggaacaccc 4390 tcatcatcta 4400 cctggacaag 4410 gtctcacact 4420 ctgaggatga '4430 ctgtctagct 4440 ttcaaagttc 4450 accaatactt 4460 taatgtagag 4470 cttatccagc 4480 ctggagcagt 4490 caaggtctac 4500 gcctattaca 4510 acctggagga 4520 aagctgtacc 4530 cggttctacc 4540 atccggaaaa 4550 ggaggatgga 4560 aagctgaaca 4570 agctctgccg 4580 tgatgaactg 4590 tgccgctgtg 4600 ctgaggagaa 4610 ttgcttcata 4620 caaaagtcgg 4630 atgacaaggt 4640 caccctggaa 4650 gaacggctgg 4660 acaaggcctg 4670 tgagccagga 4680 gtggactatg 4690 tgtacaagac 4700 ccgactggtc 4710 aaggttcagc 4720 tgtccaatga 4730 ctttgacgag 4740 tacatcatgg 4750 ccattgagca 4760 gaccatcaag 4770 tcaggctcgg 4780 atgaggtgca 4790 ggttggacag 4800 cagcgcacgt 4810 tcatcagccc 4820 catcaagtoc 4830 agagaagccc 4340 tgaacctgga 4850 ggagaagaaa 4860 cactacctca 4870 zgzggggzzz 4880 ctcctccgat 4890 ttctcogaag ””•4900 agaagcccaa 4913 cctcagctac 4920 atcatcggga 4930 aggacacttg 4940 ggtggagcac 4950 tggcctcagg 4960 agaacgaacg 4 97·ό ccaacacgaa 4980 gagaaccaga 4990 aacaatgcca 500C ggacctcggc 5010 gzzzzcaccg 5020 agagcarggc 5030 zgzzzzzggg 5040 tgccccaact 5050 gaccacaccc 5060 ccattcc

7/13