CZ40394A3 - Anti-microbial proteins - Google Patents

Anti-microbial proteins Download PDF

Info

Publication number
CZ40394A3
CZ40394A3 CZ94403A CZ40394A CZ40394A3 CZ 40394 A3 CZ40394 A3 CZ 40394A3 CZ 94403 A CZ94403 A CZ 94403A CZ 40394 A CZ40394 A CZ 40394A CZ 40394 A3 CZ40394 A3 CZ 40394A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
proteins
protein
seq
recombinant dna
ala
Prior art date
Application number
CZ94403A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ289646B6 (cs
Inventor
Kirsten Bojsen
Karsten M Kragh
Jorn Dalgaard Mikkelsen
Klaus K Nielsen
John E Nielsen
Original Assignee
Sandoz Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sandoz Ag filed Critical Sandoz Ag
Publication of CZ40394A3 publication Critical patent/CZ40394A3/cs
Publication of CZ289646B6 publication Critical patent/CZ289646B6/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N65/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing material from algae, lichens, bryophyta, multi-cellular fungi or plants, or extracts thereof
    • A01N65/08—Magnoliopsida [dicotyledons]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8282—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for fungal resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01014—Chitinase (3.2.1.14)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Description

Vynále2 se týká antimikrobiálních proteinů izolovaných z cukrové řepy.
Dosavadní stav techniky
Mezi antimikrobiální proteiny patří proteiny (samotné nebo v kombinaci s jiným materiálem), které jsou toxické nebo působí inhibici růstu libovolného mikroorganismu, včetně bakterií, virů a zejména hub, za libovolných podmínek. Mezi takové antimikrobiální proteiny patří proteiny, které vykazují antimikrobiální aktivitu při kontaktu s mikroorganismem a·. proteiny, které působí antimikrobiálně v důsledku jejich., asimilace nebo respirace.
Podstata vynálezu
Vynález popisuje antimikrobiální proteiny izolované z cukrové řepy, s výjimkou chitinas a glukanas.
Je výhodné, aby byla cukrová řepa infikována houbou rodu Cercospora, a zejména je výhodné, aby byly proteiny izolovány z listů cukrové řepy infikované Cercospora beticola.
Vynález též zahrnuje, čisté proteiny vybrané ze skupiny zahrnující proteiny zobrazené v sekvencích SEQ ID č. 2,5 a 8, a jejich funkčně ekvivalentní analogy, ve kterých byla jedna nebo několik aminokyselin přidána, nahrazena nebo odstraněna, aniž by došlo k podstatnému snížení antimikrobiální aktivity proteinu, a směsi těchto proteinů či analogů.
Vynález též zahrnuje čisté proteiny tvořené zbytky 80 - 111 v sekvenci SEQ ID č. 8, nebo zbytky 29 - 74 bud v sekvenci SEQ ID č. 2 nebo v sekvenci SEQ ID č. 5, a jejich funkčně ekvivalentní analogy, ve kterých byla jedna nebo několik aminokyselin přidána, nahrazena nebo odstraněna, aniž by došlo k podstatnému snížení antimikrobiální aktivity proteinu, a směsi těchto proteinů čí analogů. Proteiny, které mají sekvence aminokyselin tvořené zbytky 29 - 74 v sekvencích SEQ ID č. 2 a 5 jsou zde dále označovány jako AX1, respektive AX2, a protein, který má sekvenci aminokyselin tvořenou zbytky 80 - 111 v sekvenci SEQ ID č. 8 je zde dále označován jako AX3,1.
Infekce rostlin houbovými, nebo virovými patogeny může ve vegetativních tkáních indukovat syntézu, přibližně deseti rodin homologních proteinů souvisejících s patogenezi (PR-proteinů). Tyto PR-proteiny. byly rozděleny do pěti skupin. Proteiny PR-2, P3-3 a PR-5 jsou beta-1,3-glukanasa, chitinasy, respektive proteiny podobné thaumatinu. U skupin proteinů PR-1 a PR-4 nebyly určeny specifické funkce.. Proteiny PR-4 jsou podobné C-koncovým doménám proheveinu a předpokládaným zraněním indukovaným proteinům WIN bramboru, postrádají tedy N-koncovou heveinovou doménu. Mezi bazické doplňky skupiny 4 kyselých proteinů souvisejících s -pa-togene-z-í-ϊ—{-^basic—counter—par-t_O-f^-the_aei.dic_p.athcLgenes_is^. -related 4 group of proteins) tedy patří bazické doplňky proteinů podobných C-koncovým doménám proheveinu a předpokládaným zraněním indukovaným proteinům WIN bramboru.
Výhodně je proteinem, který je bazickým doplňkem těchto proteinů souvisejících s patogenezi, protein WIN vázající chitin, nejvýhodněji takový, který lze izolovat ze zrna ječmene nebo z listu ječmene vystaveného stresu.
Výhodným provedením vynálezu je jeden nebo více těchto proteinů nebo analogů v kombinaci s proteinem, který je bazickým doplňkem skupiny 4 kyselých proteinů souvisejících s patogenezí,. a. zejména s proteinem. WIN vázajícím, chitin obsahujícím sekvenci aminokyselin znázorněnou v sekvenci SEQ
ID č. 11, nebo s jeho funkčně ekvivalentním analogem, ve kterém byla jedna nebo několik aminokyselin přidána, nahrazena nebo odstraněna, aniž by došlo k podstatnému snížení antimikrobiální aktivity nebo/a aktivity při vazbě chitinu _ proteinu.
Vynález dále zahrnuje výše uvedené proteiny, které byly syntetizovány in vitro na základě znalosti jejich aminokyselinových sekvencí.
Vynález dále zahrnuje čisté proteiny, které mají sekvenci aminokyselin, která je alespoň z 55 % podobná sekvenci:/; jednoho z proteinů AX podle vynálezu. Výhodně činí stupeň! .
podobnosti alespoň 60 %, výhodněji činí stupeň podobnosti^ /£ alespoň 70 % a ještě výhodněji činí stupeň podobnosti alespoň 80 %.
Τ·*'’
V kontextu vynálezu jsou dvě 'sekvence aminokyselin, které si jsou alespoň z 55 % podobné definovány tak, Že majr při optimálním porovnání alespoň 55 % identických nebo podobných aminokyselinových zbytků ve stejné poloze, s tím, že se připouští až 4 mezery, s tou podmínkou, že celkově není ovlivněno více než 10 aminokyselinových zbytků.
Pro účely vynálezu platí, že:
alanín, serin a threonin jsou si podobné, kyselina glutamová a kyselina asparagová jsou si podobné,
-asparag-ín—a—g-l-utami-n-g-sou^s-i—podobné-,--arginin a lysin jsou si podobné, isoleucin, leucin, methionin a valin jsou si podobné, a ťenylalanin, tyrosin a tryptofan jsou si podobné.
Vynález dále zahrnuje rekombinantní DNA obsahující sekvenci, například jednu ze sekvencí vybranou ze skupiny zahrnující sekvence znázorněné v SEQ ID č. 1, 3, 4, 6, 7 a 9, která kóduje jednu nebo několik shora uvedených antimikrobiálních proteinů nebo jejich analogů. Rekombinantní sekvence DNA může popřípadě obsahovat sekvenci kódující protein, který je bazickým doplňkem skupiny 4 kyselých proteinů souvisejících s patogenezí, jak je popsáno výše.
Vynález zahrnuje též sekvenci DNA, která hybridizuje za přísných hybridizačních podmínek s rekombinantní sekvencí DNA popsanou v bezprostředně předcházejícím odstavci. Termín přísné hybridizační podmínky“ označuje podmínky, kdy je hybridizace prováděna při teplotě mezi 50 a 60 °C v 2X citrátovém pufru s chloridem.sodným (SSC) obsahujícím 0,1 % dodecylsulfátu . sodného (SDS) s následným několikanásobným promytím při stjené teplotě, ale v pufru se sníženou koncentrací SSC, která neovlivňuje hybridizaci, která proběhla. Takovou.sníženou koncentrací pufru je (a) 1 x SSC, 0,1 % SDS,. nebo. (b) 0,5 x SSC, 0,1 % SDS, respektive (c) 0,1.x. SSC, 0,1 % SDS.
Vynález dále zahrnuje vektor obsahující shora uvedené rekombinantní sekvence DNA. Tyto sekvence jsou řízeny vhodným promotorem a terminátorem, včetně takových, které řídí transkripci proteinů tepelného Šoku.
Vynález dále zahrnuje biologický systém, zejména rostlinu nebo mikroorganismus, který obsahuje a umožňuje expresi výše uvedené rekombinantní DNA.
Vynález dále zahrnuje rostliny transformované pomocí výše zmíněné rekombinantní DNA.
Tyto rostliny lze vytvořit pomocí o sobě známých způsobů, které zahrnují regeneraci roslinných buněk nebo protoplastú transformovaných DNA podle vynálezu za pomoci řady o sobě známých postupů {Ti a Ri plazmidy Agrobacteria, elektroporace, mikroinjektáž, vstřelování mikroprojektilú (micro-projectile gun) atd.). Transformované buňky mohou být ve vhodných případech regenerovány do celých rostlin, ve kterých je rekombinantni DNA stabilně začleněna do genomu. Tímto způsobem lze získat jak jednoděložné tak dvouděložné rostliny, ačkoli v pos1edně uvedeném případě je regenerace obecně snazší.
Příklady geneticky modifikovaných rostlin podle vynálezu zahrnují: ovocné plodiny , včetně rajčete, mangovníku, broskvoně, jabloně, hrušně, jahodníku, banánovníku a melounu, polní plodiny jako je řepka a řepice typu canola, slunečnice, tabák, cukrová řepa, drobnozrnné obilniny jako je pšenice, ječmen a rýže, kukuřice a bavlník, a zeleniny jako je brambor, mrkev, salát, břukev zelná a cibule.
Zejména výhodnými rostlinami jsou cukrová řepa a kukuřice.
Rostliny lze transformovat pomocí rekombinantni sekvence DNA obsahující část kódující protein AX1 (zbytky 29 - 74 v sekvenci SEQ ID Č. 2) nebo jeho funkčně ekvivalentní analog, ve kterém byla jedna nebo několik aminokyselin přidána, nahrazena nebo odstraněna, aniž by došlo k podstatnému snížení antimikrobiální aktivity, nebo pomocí rekombinantni sekvence DNA obsahující Část kódující protein AX2 (zbytky 29 - 74 v sekvenci SEQ ID č. 5) nebo jeho funkčně ekvivalentní analog, ve kterém byla jedna nebo několik aminokyselin přidána, nahrazena nebo odstraněna, aniž by došlo k podstatnému snížení antimikrobiální aktivity, nebo
-pomocí—rekombinantn-í—sekvence—DNA—obsa-huj-í-c-í—část—k-ódu-j-í-e-íprotein AX3,1 (zbytky 80 - 111 v sekvenci SEQ ID č. 8) nebo jeho funkčně ekvivalentní analog, ve kterém byla jedna nebo několik aminokyselin přidána, nahrazena nebo odstraněna, aniž by došlo k podstatnému snížení antimikrobiální aktivity, nebo ··.··&/
WV,' pomocí sekvence DNA obsahující část kódující kombinaci dvou nebo více těchto proteinů AX nebo jejich analogu.
Vynález též zahrnuje rostliny transformované pomocí shora uvedené rekombinantní sekvence DNA, kdy tato sekvence DNA dále kóduje protein, který je bazickým doplňkem skupiny 4 kyselých proteinů souvisejících s patogenezí, zejména protein WIN vázající chitin (zbytky 22 - 146 v sekvenci SEQ ID Č. 11) , který lze izolovat ze zrna ječmene nebo listu ječmene vystaveného stresu.
Vynález dále zahrnuje potomstvo takto transformovaných rostlin/ kteréžto potomstvo exprimuje shora uvedené rekombinantní sekvence DNA, stejně jako semena takových rostlin a potomstva.
Vynález dále zahrnuje protein získaný expresí výše uvedené rekombinantní DNA, včetně antimikrobiálního proteinu, vytvořeného pomocí exprese rekombinantní DNA ve shora uvedených rostlinách.
Vynález dále zahrnuje antimikrobiální prostředek obsahující jeden nebo více těchto antimikrobiálních proteinů.
Vynález též zahrnuje způsob boje proti houbám nebo bakteriím, do kterého patří jejich vystavení antimikrobiálním -probei-núm-nebo-pr-ostř.edkúm,_kt.er.é_4_e_o.b.s.a.hují„.__
Vynález dále zahrnuje způsob extrakce pro získání antimikrobiálních proteinů z organického materiálu, který je obsahuje, a zejména způsob, který zahrnuje podrobení materiálu maceraoi a extrakci pomocí rozpouštědel, Antimikrobiální proteiny mohou být následně vyčištěny pomocí centrifugace a chromatografických postupů vybraných ze skupiny zahrnující hydrofobní interakci, výměnu aniontú, výměnu kationtů, gelovou filtraci a chromatografií na reverzní fázi.
Výhodně se tento extrakční postup provádí na organické hmotě, která obsahuje listy .cukrové řepy infikované Cerco-......
spora beticola, nebo mikroorganismus ve kterém je přítomna rekombinantní DNA obsahující sekvenci kódující antimikrogiální protein nebo jeho analog podle vynálezu, nebo taková rekombinantní sekvence DNA, která dále obsahuje sekvenci DNA kódující protein, který je bazickým doplňkem skupiny 4 kyselých proteinů souvisejících s patogenezí. Je vhodné, aby antimikrobiální protein vykazoval malý, pokud vůbec nějaký, antimikrobiální účinek na mikroorganismus, který je zdrojem organické hmoty uvedené v předchozí větě.
Vynález dále ilustrují následující příklady včetně znázorněných sekvencí a obrázků. '
Popis obrázků
V·
Obrázek 1 znázorňuje vymývání proteinů AX1, AX2 a AX3 z katexové kolony Mono Ξ se zvyšující se koncentrací chloridu sodného (tečkovaná čára). Symbol t představuje čas v minutách, a symbol A absorbanci při 280 nm.
Obrázek 2 zobrazuje polyakrylamidový gel obarvený stříbrem, ria kterém byla prováděna elektroforesa purifikovaných proteinů AXl, AX2, AX3 a WIN v přítomnosti dodecylsulfátu sodného (SDS) a redukčního Činidla dithiothreitolu (DTT). Markerové proteiny o nízké molekulové hmotnosti lze vidět v nejvíce pravé a nejvíce levé dráze gelu. Protein WIN je izolován ze zrna ječmene. Symbol MW znamená molekulovou hmotnost, symbol LMW std. představuje standardy proteinů o nízké molekulové hmotnosti.
Obrázky 3A a 3B znázorňují antifungální aktivitu proteinů AXl, AX3 a AX2, přičemž je každý z těchto proteinů popřípadě v kombinaci s proteinem WIN izolovaným ze zrna ječmene. Symbol t představuje čas v hodinách, symbol’ A absorbanci při 620 nm a symbol k znamená kontrola.
Obrázek 4 zobrazuje morfologii Cercospora beticola, která je následkem ošetření proteinem WIN v dávce 28 zug / ml (obrázek Β), proteinem AX2 v dávce 8 ,ug / ml (obrázek C) a kombinací proteinu AX2 v dávce 8 ,ug / ml a proteinu WIN v dávce 28 ,ug / ml (obrázek D) , Obrázek 4A znázorňuje morfologii Cercospora beticola rostoucí v nepřítomnosti proteinů WIN a AX2.
Obrázek 5 znázorňuje polyakrylamidový gel obarvený stříbrem, na kterém byla prováděna elektroforesa purifikovaných proteinů AX1, AX2 a AX3 v přítomnosti ,SDS a v přítomnosti nebo za nepřítomnosti redukčního činidla dithiothreitolu (DTT), V protikladu, k proteinům AX1 a AX2 je elektroforetická pohyblivost dvou isoform AX3, AX3,1 a AX3,2 silně ovlivněna přítomností DTT, coš svědčí o tom, že AX3,1 a AX3,2 pravděpodobně existují jako dimery, ne-li jako trimery. Relativně vysoké zbarvení pozadí v gelu, které lze vidět v blízkosti proteinových pásů jako zřejmé rozmazání, je způsobeno oxidací proteinu během elektroforesy, zatímco, zbarvení pozadí na hořejší části gelů je způsobeno zbarvením DTT. Lehký posun v patrné molekulové hmotnosti proteinů AX1 a AX2 v přítomnosti DTT je pravděpodobně způsoben rozvolněním struktury způsobeným rozpadem intramolekulárníčh díšullfi“ dických můstků, coš vede k zesílené vazbě SDS ve srovnání se stejnými proteiny děnaturovánými pomocí SDS v nepřítomnosti DTT. Stěně jako na obrázku 2 jsou v gelu přítomny markerové proteiny o nízké molekulové hmotnosti (označené v obrázku LMW Std.). Symbol MW znamená molekulovou hmotnost.
Popis.sekvencí
Sekvence SEQ ID č. 1 zobrazuje sekvenci cDNA vytvořené pomocí polymerásové řetězové reakce (PCR), která kóduje protein AXl společně s jeho signálním peptidem. Startovací kodón signálního peptidu tvoří nukleotidy v poloze 40 - 42 a terminační kodón proteinu AXl se nachází v poloze 262 - 264.
1 Sekvence SEQ ID č. 2 znázorňuje aminokyselinovou ί sekvenci proteinu AXl společně s jéhó signálním peptidem.
·
Signální peptid sestává ze zbytků 1 - 28 a maturovaný protein ze zbytků 29-74.
Sekvence SEQ ID č. 3 zobrazuje sekvenci cDNA vytvořené pomocí polymerásové řetězové reakce, která obsahuje sekvenci . SEQ ID č. 1, s tím rozdílem, že před startovací kodón.
(nukleotidy 82 - 84), pokud se týká signálního peptidu, je ’ J umístěn fragment zesilující translaci (tvořený nukleotidy 13 - 79) , Sekvence obsahuje restrikční místo Pstl tvořené
-w.
nukleotidy 1 - 6 a místo BamHl tvořené nukleotidy 7 - 12.1 .
Nukleotidy 80 - 86 tvoří místo Ncol. Terminační kodón, pokud se týká proteinu AXl, je tvořen nukleotidy 304 - 306.’
Restrikční místa Sall a Sphl jsou přítomna v poloze 338 - 343, respektive 344 - 349.
Sekvence SEQ ID č. 4 zobrazuje sekvenci cDNA vytvořené pomocí polymerásové řetězové reakce (PCR), která kóduje protein AX2 společně s jeho signálním peptidem. Startovací ’ kodón signálního peptidu tvoří nukleotidy v poloze 53 - 55 a * terminační kodón proteinu AX2 se nachází v poloze 275 - 277.
Sekvence SEQ ID č. 5 znázorňuje aminokyselinovou sekvenci proteinu AX2 společně-š jeho signálním peptidem.
Signální peptid sestává ze zbytků 1 - 28 a maturovaný protein ze zbytků 29 - 74.
Sekvence SEQ ID č. 6 zobrazuje sekvenci cDNA vytvořené pomocí polymerasové řetězové reakce, která obsahuje sekvenci SEQ ID č. 4, s tím rozdílem, že před startovací kodón (nukleotidy 82 - 84), pokud se týká signálního' peptidů, je umístěn fragment zesilující translaci (tvořený nukleotidy 13 - 79). Sekvence obsahuje restrikční místo Pstl tvořené nukleotidy 1 - 6 a místo BamHl tvořené nukleotidy 7-12. Nukleotidy 80 - 86 tvoří místo Ncol, Terminační kodón, pokud ϊ
se týká proteinu AX2, je tvořen nukleotidy 304 - 306.
Restrikční místa Sall a Sphl jsou přítomna v poloze j
352 - 357, respektive 358 - 363.
Sekvence SEQ ID č. 7 zobrazuje sekvenci cDNA vytvořené pomocí polymerasové řetězové reakce (PCR), která kóduje , protein AX3,1 společně.. .s jeho předpokládaným signálním peptidem. Startovací kodón signálního peptidů tvoří nukleotidy v poloze 23 - 25 a terminační kodón proteinu AX3,1 se nachází v poloze 356 - 358.
Sekvence SEQ ID č. 8 znázorňuje aminokyselinovou sekvenci nepřipraveného translačního produktu kódovaného cDNA uvedenou - v sekvenci SEQ ID č.. 7. Tento předpokládaný preprotein zahrnuje maturovaný protein AX3,1 tvořený zbytky 80 - 111.
__:_Sekvence SEQ ID č. 9 zobrazuje sekvenci cDNA vytvořené_ pomocí polymerasové řetězové reakce, která obsahuje sekvenci SEQ ID č. 7, s tím rozdílem, že před startovací kodón *
(nukleotidy 82 - 84), pokud se týká signálního peptidů, je | umístěn fragment zesilující translaci (tvořený nukleotidy j
- 79) . Sekvence obsahuje restrikční místo Pstl tvořené nukleotidy 1 - 6 a místo BamHl tvořené nukleotidy 7-12.
Nukleotidy 80 - 86 tvoří místo Ncol. Terminační kodón, pokud se týká proteinu AX3,1, je tvořen nukleotidy 415 - 417.
.0 i
tt
Restrikční místa Sall a Sphl jsou přítomna v poloze
473 - 478, respektive 479 - 484.
Sekvence SEQ ID č. 10 znázorňuje cDNA obsahující gen, který kóduje protein WIN ječmene.
Sekvence SEQ ID č. 11 znázorňuje aminokyselinovou sekvenci proteinu WIN ječmene společně s jeho signálním peptidem. Signální peptid sestává ze zbytků 1 - 21 a maturovaný protein ze zbytků 22 - 146.
Sekvence SEQ ID Č. 12 zobrazuje nukleotidovou sekvenci, která kóduje protein WIN ječmene, vytvořenou pomocí polymerasové řetězové reakce. 5'-oblast sekvence obsahuje restrikční místa Pstl, BamHl a Ncol. Nukleotidem v poloze 62 ’ .
byl v původním klonu C místo G, jak je uvedeno nyní. Změna Č' .77 na G nemění aminokyselinovou sekvenci proteinu a byla 7“ provedena proto, aby bylo v této poloze odstraněno místo . .
Ncol. Startovací kodón, pokud jde o protein WIN, tvoří nukleotidy 12 - 14 a terminační kodón nukleotidy 450 - 452. ra
-š
Sekvence SEQ ID Č. 13 znázorňuje v podstatě
Ato nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID č. 12, s tím rozdílem, že je před startovací kodón genu WIN (nukleotidy
- 84) umístěn fragment zesilující transalci (tvořený v sekvenci SEQ ID Č. 13 nukleotidy 13 - 79). Terminační kodón je tvořen nukleotidy 520 - 522.
«*
Příklady provedení vynálezu
Purifikace proteinů ΑΧ 1 - 3 z listů cukrové řepy infikované
Cercospora beticola
Proteiny ΑΧ 1 - 3 se izolují z listové hmoty cukrové řepy, odrůdy Turbo nebo Rhizor, přirozeně infikované Cercospora beticola. Listy nesoucí padesát nebo více nekrotických lézí byly sebrány na poli v Itálii a skladovány až do extrakce při teplotě 4 “C. Všechny kroky se provádějí při 4 °C. Centrifugace během postupu purifikace se provádějí při 20 000 g po dobu 20 minut na centrifuze Centrikon typ
H-401B.
Příprava bezbuněČných extraktů kg listu cukrové řepy infikované Cercospora beticola se homogenizují ve 4 litrech natriumcitrátového pufru o pH 5,0 obsahujícího dithiothreitol (1 mM), benzamidin (1 mM) (výchozí pufr) a 200 g iontoměniče Dowex 1x2 (100 zum) . Homogenát se před centrifugací prolisuje přes dvojitou vrstvu nylonové gázy o velikosti ok 31 ,um.
Srážení teplem a síranem· amonným Supernatant získaný po centrifugaci se zahřívá po dobu 20 minut na teplotu 50 ŮC a po ochlazení na 4 °C se oddělí centrifugací a odstraní. sraženina. K supernatantu se přidá pevný síran amonný až do dosažení ,90% nasycení. Po centrifugaci se vysrážené proteiny rozpustí ve výchozím pufru v množství 1 ml pufru na 10 g výchozího materiálu.
-Protei-ny—AX-1--AX2—a—AX3—se—získaj-í—pur-i-f ikací-—z proteinové frakce vysrážené síranem amonným, po solubilizaci se proteinový roztok dialyzuje proti lOmM Tris-pufru o pH 8,0 obsahujícímu dithiothreitol (1 mM) a benzamidin (1 mM) . Denaturované proteiny se odstraní pomocí centrifugace a supernatant se nanese ná kolonu 50 ml Fast Flow Sepharose Q a na chitinovou . kolonu (připravenou jak je popsáno v WO92/17591), přičemž jsou tyto kolony zapojeny v sériích. Kolony se před nanesením supernatantu ekvilibrují s Tris-pufrem.
Nenavázané proteiny se vymyjí pomocí- rozsáhlého promývání Tris-pufrem. Frakce nenavázaných proteinů (200 ml na kg extrahovaného rostlinného materiálu) se doplní tak, že obsahuje pufr H tvořený 1M síranem amonným s 10 % glycerolu (objem / objem), lmM dithiothreitolem a O,1M dihydrogenfosforečnanem draselným, pH 7,5. Proteinový roztok se inkubuje s 50 ml Pheny1 Sepharosy (Pharmacia) v pufru H po dobu 2 hodin při teplotě místnosti. Suspenze se nanese na vršek kolony připravené s dalšími 50 ml Phenyl Sepharosy ekvilibrované s pufrem H. Bylo zjištěno, že eluát z kolony vykazuje antifungální aktivitu, zatímco proteiny vymyté z kolony pufrem H bez síranu amonného tuto antifungální aktivitu nevykazují. Všechny části purifikace. se provádějí při teplotě 4 °C, s výjimkou stupňů s Phenyl Sepharosou.
Eluát z kolony s Phenyl Sepharosou (400 ml) se intenzivně dialyzuje proti 20mM octanu sodnému s lmM dithiothreitolem, pH 5,0 a poté se nanese na kolonu CM-CL6B Sepharose (Pharmacia). Tato kolona se promyje pufrem I, který obsahuje 50mM octan sodný s 10 % glycerolu (objem / objem) a. lmM dithiothreitolem, pH 5,0, a na závěr se vymyje 0,25M. chloridem sodným v pufru I. Frakce obsahující protein se spojí a polovina takto spojené frakce se podrobí gelové filtraci na koloně G-75 Sephadex (Pharmacia, 2,5 x 70 cm), ekvilibrované s 50mM morfolinethansulfonovou kyselinou (MES), pH 6,0. Odebírají se frakce o objemu 10 ml. Frakce 26 - 30 vykazují vysokou antifungální aktivitu a doplní se tak, že obsahují 5 % betainu (hmotnost / objem).
Frakce 26 - 30 z kolony G-75 Sephadex se podrobí vysoceúčiné kapalinové chromatografii (FPLC) s výměnou iontů na katexové koloně Mono S (H/R 5/5, Pharmacia) ekvilibrované' s pufrem A tvořeným 50mM MES o pH 6,0 obsahující 5 % betainu (hmotnost / objem). Navázané proteiny se vymyjí za použití gradientu 0 - 0,3 M chloridu sodného v 15 ml pufru A. Vymyjí se tři hlavní proteinové píky, přičemž všechny z nich vykazují antifungální aktivitu (obrázek 1) . Tyto píky jsou postupně označeny AX1, AX2 a AX3.
Purifikace proteinů WIN z ječmene
Protein WIN (WIN N) se získá purifikací ze zrna ječmene nebo listu ječmene vystaveného stresu, jak popsali Kragh a kol. (Plant Sci. 71, 65 - 68 (1990)) nebo Hegaard a kol. (Febs Letters, 307, 389 - 3.92 (1992)). .
Obrázek 2 znázorňuje stříbrem obarvený polyakrylamidový gel s SDS proteinu. WIN-N izolovaného ze zrna ječmene, společně s proteiny AX1, AX2 a AX3 vymytými z kolony Monos S. Každý z proteinů AX se vymyje jako frakce, která při elektroforese poskytuje jediný pás (i když v případěAX3 je lehce rozmazaný).
Sekvenování proteinů AX
Každý z proteinů AX se karboxy-methylu je a podrobí se kapalinové chromatografii s vysokou rozlišovací schopností (HPLC) na reverzní fázi na koloně Progel TSK Octadecyl-4PW (Supelco lne, 150 x 4,6 mm). Rozpouštědlový systém tvoří A:
-Q—l-%—.kysel-ina_t-ri-fluorocto.vá_v.e—v.odě__a_B_:_O.,J_%__kyselina trifluoroctové v acetonitrilu. AX1 a AX2 se vymyjí jako jediné symetrické .píky, a AX3 se vymyje jako dva píky, přičemž hlavní pík je brzy následován menším pikem, což svědčí o tom, že existují dvě formy, označené AX3,1 a AX3,2. Proteiny AX1, AX2 a AX3,1 se poté sekvenují za použití standardních o sobě známých postupů.
Antimikrobiální aktivita AX1 - AX3
Inhibice růstu hub se měří na mikrotitračních destičkách s 96 jamkami při 620 nm, v podstatě jak je popsáno ve WO 92/17591.
Proteiny AX1, AX2 a AX3, se bud samotné nebo v
-------kombinaci^s—WTN—N-^(-kťerý_se~získá“_purifi'kací_’z'e'^zrna*_jeČmerie nebo listu ječmene vystaveného stresu, jak popsali Hejgaard a j kol. (FEBS Letters, 307, 389 - 392 (1992)) inkubují se sporami Cercospora beticola. Testovaná směs o objemu 240 nebo 260 ,ul obsahuje 100 ,ul bramborové dextrosy (potato dextrose broth, Difco) , 40 nebo 60 ,ul vzorku proteinu (nebo pufru jako kontroly)ve lOOmM Tris-pufru a 20mM chloridu sodném (pH 8,0) a. přibližně 400 spor ve 100 ,ul vody. MikrotitraČnú destičky se uzavřou páskou, aby se zabránilo odpařování a kontaminaci a následně sě inkubují při teplotě místnosti na třepačce s 200 otáčkami za minutu. Jak je znázorněno na obrázku 33, měří se každý den po dobu'osmi dnů absorbance při 620 nm a vytvoří se graf závislosti absorbance na Čase pro každou 'koncentraci proteinu. Stanoví se koncentrace (v ,ug proteinu / ml výsledné testované směsi), která má za následek
50% inhibici růstu po 72 hodinách a označí se Iso.
Jak je vidět z obrázků 3A a 33, každý z proteinů AX in vitro výrazně snižuje růst Cercospora beticola. Zejména výrazná je antifungální aktivita proteinu AX2, v jehož případě stačí 2 zug / ml (přibližně 0,5 ,uM) na 50% inhibici růstu (Iso) po 72 hodinách inkubace. Samotný protein WIN N vykazuje mírnou antifungální aktivitu, na 50% inhibici Cercospora beticola po 72 ' hodinách je nutná koncentrace 160 ,ug / ml (přibližně 11 ,uM) (údaje nejsou uvedeny). Kombinace AX2 a WIN N má za následek podstatně zesílené a prodloužené omezení růstu houby. Jak je zřejmé z obrázku 3A, je růstově inhibiční potenciál AX2 vůči Cercospora beticola větší než potenciál ΆΧ1.
Zdá se, že AX2 a WIN N nevykazují fungicidní aktivitu vůči Cercospora beticola, ale spíše ve srovnání s kontrolami pronikavě snižují rychlost prodlužování houbových hyf. Jako následek ošetření AX2 nebo/a WIN N se též zřetelně změní morfologie houby (viz obrázek 4) .
Proteiny AX1, AX2 a AX3 (a jejich směsi), popřípadě v přítomnosti WIN N, dále vykazují při aplikaci v koncentracích, které jsou účinné proti Cercospora beticola, malý, pokud vůbec nějaký, škodlivý vliv na klíčení pylu cukrové řepy, což svědčí o tom, že nejsou toxické pro rostlinné buňky.
Antifungální aktivita proteinů AX proti patogenům kukuřice
U proteinů AX podle vynálezu byla testována jejich antifungální aktivita proti řadě patogenů kukuřice. Pokud se týká výsledků uvedených v tabulkách 1 a 2, provede se test proteinů AX, s ohledem na patogeny kukuřice,, následovně. 5 ,ul roztoku obsahujícího proteiny v uvedených koncentracích se asepticky přenese do jamky sterilní mikrotitrační destičky se zaobleným dnem. Všechna ošetření se jednou opakují. Jako kontroly jsou do pokusu v souladu s běžnou praxí zahrnuty neinokulovaná a inokulovaná kultivační média bez testovaného proteinu. Ke každému vzorku se asepticky přidá 100 - 150 spor v 5,0 ,ul dvojnásobně koncentrované bramborové dextrosy (PDB) .
Po mírném třepání z důvodů promíchání vzorku proteinu a suspenze spor se spojení víčka a destičky obalí dvojitou vrstvou fólie, aby se minimalizovalo vysoušení, a takto obalená mikrotitraČní destička se inkubuje při teplotě 19 ± 0,2 °c s fotoperiodou 16 hodin......
Každých 24 hodin se v jednotlivých jamkách vyhodnocuje klíčení spor a růst mycelia. Po 120 hodinách se stanoví úroveň antifungální aktivity. Výsledky jsou uvedeny v tabulkách 1 a 2. Tabulka 1 udává minimální koncentraci
... -----„-protei-nu^nutnou— pro—dosa-ž-en-í—růstově—i-nh-i-b-i-Ční-ho—úč-i-nku—nahouby a tabulka 2 udává koncentraci proteinu, která způsobuje 50% inhibici růstu vé srovnání s kontrolními kulturami, ve bJ kterých jsou houby pěstovány za nepřítomnosti testovaných proteinů.
Tabulka 1
Antifungální aktivita AX1, AX2 a WIN N proti vybraným patogenum kukuřice
Minimální koncentrace způsobující inhibici (,ug i ml)
Patogen WIN N AX1 AX2
w, Bioplaris maydis Cercospora zeae maydis ni 20 30
Λ Colletotrichum graminicola ni 50 50
Diplodia maydis 64 11 ni
Exserohilum turcicum kmen 1 . ni 11 98
Exserohilum turcicum kmen 2 193 33 ni
pokračování Tabulky 1
Minimální koncentrace způsobující inhibici (,ug / ml)
Patogen WIN N AX1 AX2
Fusarium graminearum ni 33 33 *
Fusarium moniliformě ni ni ni
Gibberella zeae ni ni ni
Legenda:
ni znamená, že proteiny neinhibují růst houby
Pokud se týká výsledků uvedených v se test proteinů AX a WIN N vůči tabulce uvedeným 3, provede patogenům
následovně. Mycelium uvedených hub se disperguje v kapce tekutého agaru, který se poté nechá ztuhnout. Kapičky pevného .agar.u_obsahuj-ící opouzdřené mycelium se. poté pokryjí testovaným proteinem v specifikovaném množství. Po inkubaci po dobu 5 dnů za vlhka se stanoví rozsah růstu mycelia v porovnání s kontrolami, ve kterých kapičky agaru obsahující houbové mycelium nejsou pokryty testovaným proteinem. Výsledky uvedené v tabulce 3 udávají množství proteinu nutné k dosažení 50% inhibice růstu houbových patogenů.
Tabulka 2
Množství proteinu nutné k dosažení 50% inhibice růstu houbových patogenú uvedených v tabulce 1
Patogen AXl AX2 WIN N (Koncentrace proteinu v ,ug/ml způsobující více než 50% inhibici růstu)
Colletotrichum graminicola 50 50 ni
Fusarium moniliforme ni ni ni
Fusarium graminearum 33 33 ni
Gibberella zeae ni ni ni
Diplodia maydis 11 ni 64
Bipolaris maydis 20 33 ni
Exserohilum turcicum 33 ni 193
Legenda:
ni” znamená, že proteiny neinhibují růst houby
Tabulka 3
Procento inhibice růstu hub týkající se dalších patogenů specifikovanými koncentracemi proteinu
Patogen Koncentrace proteinu (/Ug/ml)
AXl AX2 WIN N
20 20 40 20 40
Inhibice růstu (%)
Monilinia fructigena 80 80 ni
Cochliobolus sativus 30 30 ni
Pseudocercosporella
herpotrichoides 30 30 30
Pyriculari.a oryzae ni 20 ni
Thizoctonia solani ni 10 ni
Fusarium culmorum ni 10 ni
-L ep to s p ha er-i-a-nodo rum-· ní 10 ni
Botrytis cinerea ni 10 ni
Legenda:
ni1' znamená, že proteiny v testovaných koncentracích neinhibují růst houby
Jak je zřejmé z obrázků 3A, 3B a 4 A - D, a z tabulek 1 - 3, působí proteiny AXl, AX2 a AX3, popřípadě v kombinaci s WIN N, fungiostaticky. V důsledku toho jsou schopné dodávat rostlinám, zejména cukrové řepě a kukuřici, vysoce zlepšenou rezistenci vůči chorobám (zejména houbovým infekcím), včetně chorob, které způsobuje Cercospora beticola a řada patogenú kukuřice.
Sekvence proteinů
Sekvence SEQ ID Č. 2, 5 a 8 znázorňují sekvence aminokyselin proteinů AXl, AX2, respektive AX3,1. Tyto sekvence zahrnují příslušné signální peptidy..V případě AXl a AX2 jsou signální peptidy tvořeny zbytky 1 - 28 a maturované proteiny zbytky 29 - 74. V případě AX3,1 je v předpokládaném preproteinu obsažen maturovaný protein AX3,1 tvořený zbytky 80 - 111. Sekvence SEQ ID č. 11 zobrazuje sekvenci aminokyselin proteinu WIN ječmene společně s, jeho signálním peptidem.
Ze sekvencí aminokyselin proteinů AXl a AX2 je· jasné, že se jedná o příbuzné proteiny, přičemž každý z nich obsahuje 46 aminokyselin.
Ze sekvence SEQ ID Č. 2 je sekvence proteinu AXl bez jeho signálního peptidu:
Ala Ile Cys Lys Lys Pro Ser Lys Phe Phe Lys Gly Ala Cys
Gly Arg Asp Ala Asp Cys Glu Lys Ala Cys Asp Gin Glu Asn
Trp Pro Gly Gly Val Cys Val Pro Phe Leu Arg Cys Glu Cys
Gin Arg Ser Cys
Ze sekvence SEQ ID č. 5 je sekvence proteinu AX2 bez jeho signálního peptidu:
Ala Thr Cys Arg Lys Pro Ser Phe Ser Asp Thr Asn Cys Gin Trp Pro Asn Gly Lys Cys Leu Met Tyr Phe Ser Gly Ala Cys Lys Ala Cys Asn Arg Glu Asp
Val Gly Phe Lys Cys Glu Cys
Gin Arg Pro Cys
Ze sekvence SEQ ID č. 8 je sekvence proteinu AX3,1 bez
jeho signálního peptidů:
Arg Cys Ile Pro Cys Gly Gin Asp Cys Ile Ser Ser Arg Asn
Cys Cys Ser Pro Cys Lys Cys Asn Phe Gly Pro Pro Val Pro
Arg Cys Thr Asn
Prvních 45 zbytku z N-konce každého proteinu bylo stanoveno pomocí sekvenování aminokyselin. 46. zbytek jak AXl tak AX2 byl identifikován jako cystein na základě sekvenování nukleotidů příslušných cDNA {sekvence SEQ ID č. 1, respektive 4) získaných pomocí polymerasové řetězové reakce, přičemž byla brána v úvahu též homologie s příbuznými proteiny z jiných rostlin. Protein AX3,1, který je bazickým proteinem, obsahuje 32 aminokyselin, jejichž sekvence je v souladu s cDNA, jak byla získána pomocí polymerasové řetězové reakce (viz sekvence SEQ ID č. 7).
Údaje o sekvenci aminokyselin proteinů AX byla kromě toho—opodstatněna—pomocí—anaiýzy—am-inoky-sel-i-nového—s-ložen-í příslušných proteinů (víz tabulka 4) , stejně jako pomocí hmotové spektrometrie čistých proteinů porovnávané s jejích molekulovou hmotností odvozenou z genů, které je kódují (viz tabulka 5) . Překvapivě se na základě analýzy pomocí hmotové spektrometrie zdá, že je AX2 (pravděpodobně v něm přítomný zbytek methioninu) oxidován. Taková oxidace může být důsledkem uvedené hmotnové spektrometrie.
Proteiny AXl a AX2 vykazují určitou podobnost sekvence s gama-thioniny z pšenice a ječmene, s předpokládanými inhibitory alfa-amylasy hmyzu z čiroku a s antifungálními proteiny izolovanými ze semen ředkve. Je známo, že proteiny ředkve jsou silnými antifungálními proteiny a předpokládá se, že ihibují růst hub narušováním signalizace pomocí iontů vápníku. Proteiny AX1 a AX2 však vykazují malou podobnost sekvence s těmito proteiny ředkve. Tyto proteiny ředkve jsou navíc aktivní převážně v oligomerní formě (jako trimery nebo tetramery), zatímco gelová filtrace a elektroforesa za použití- dodecylsulfátu sodného za nepřítomnosti dithiothreitolu či merkaptoethanolu svědčí o tom, že proteiny
AX1 a AX2 jsou monomerní (viz například obrázek 5) . Protein
AX3,1 nevykazuje podstatnou sekvenční homologii s jinými proteiny.
< 7
-Vr
Tabulka 4
Aminokyselinové složení proteinů ΑΧ i
Zbytek AX1 AX2 AX3
Asp 4,0 5,0 4,1
Thr 0,1 2,0 1/0
Ser 2,1 3,1 3,0
Glx 5,7 4,4 1,1
Pro 3,2 3,2 5,1
Gly 4,3 ' 3,2 . 2,1
Pokračování Tabulky 4
Zbytek AXl AX2 AX3
Ala 4,1 3,1 0,0
Cys 6,9 6,9 6,2
Val 2,0 1,1 1,0
Met 0,0 0,9 0,0
Ile 1,0 0,1 2,0 .
Leu 1,1 1,1 0,0
Tyr 0,0 0,9 0,0
Phe 3,1 3,0 1,0
His 0,0 0,0 0,0
Lys 5,1 4,0 1,0
Arg 3,2 3,1 3,2
Trp nes.tano.veno nestanoveno nestanoveno
Tabulka 5
Molekulové hmotnosti AXl, AX2 a AX3,1 stanovené hmotovou spektrometrií (ES-MS) a odvozené z genu, které je kódují
Protein Molekulová hmotnost (Da)
ES-MS Odvozeno z cDNA (-8H”)
AXl 5 078,1 . 5086 - 8 = 5078
AX2 5 193,4 5185 -8 + 16 = 5193
AX3,1 3 452,5 3460 - 8 . = 3452
Tvorba transformovaných rostlin
Geny kódující proteiny AX se introdukují do rostlin' Na základě genově specifických primerů jsou z odpovídající mRNA za použití polymerasové řetězové reakce, konkrétně pomocí rychlé amplifikace 3'-konců cDNA (3'-RACE) následované rychlou amplifikaci 51-konců cDNA (5'-RACE), syntetizovány kódující oblasti genů kódujících AXl, AX2 a AX3,1. Po přidání vhodného promotorové sekvence(jako je 35S) a terminátorové sekvence (jako je 35S), se geny kódující progeiny AX introdukují do vektoru pro transformaci rostlin. Je výhodné introdukovat sekvenci zesilující translaci do vektoru do polohy 5' od oblasti kódující protein (viz například sekvence SEQ ID č. 3, 6 a 9). Vektor též óbsahu±e_v.hodné—o_sobě—známémarkerové geny. Vektor popřípadě obsahuje gen kódující protein WIN, jako je získán z listu ječmene vystaveného stresu nebo ze zrna ječmene (pokud je to žádoucí společně se sekvencí zesilující translaci, viz například sekvenci SEQ ID
č. 13), nebo/a gen kódující chitinasu nebo/a glukanasu. Výhodnou chitinasou je chitinasa 4 popsaná v přihlášce vynálezu PCT/DK92/00108 (zveřejněné pod číslem WO/92/17591). Těmito vektory lze transformovat například Agrobacterium tumefaciens. Takto transformované Agrobacterium se poté nechá působit na rostlinné buňky, a z tímto způsobem transformovaných rostlinných buněk se regenerací získají celé rostliny, ve kterých je nový materiál v jádře stabilně začleněn do genomu. Je však třeba vzít v úvahu, že DNA kódující protein AX (nebo kombinaci těchto proteinů), a popřípadě dále kódující protein WIN nebo/a chitinasu nebo/a glukanasu (nebo kombinaci takových proteinů), lze introdukovat do rostlinných buněk pomocí jiných známých postupů, včetně použití vstřelování mikroprojektilů (micro-projectile gun) , . elektróporace, elektrotransformace, mikroinjektáže atd., a že regenerace transformovaných rostlinných buněk se provádí za použití o sobě známých postupů, včetně ošetření buněk cytokininy v případě, že je to nutné nebo žádoucí z důvodů zlepšení regenerační frekvence.
Takto byl vytvořen brambor a cukrová řepa transgenické co se týká proteinů AX. Rekombinantní sekvence DNA obsahující například sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence SEQ ID č. 3, 6 a 9, se introdukují za použití o sobě známých postupů—(včetně—-kot-rans-formace)—do—bramboru—nebo—cukrové řepy. Je třeba vzít v úvahu, že alternativně' lze použít rekombinantní DNA obsahující sekvence znázorněné v SEQ ID č. 1, 4 nebo 7, ačkoli tyto sekvence postrádají prvek zesilující translaci v poloze 5' vůči startovacímu kodónu kódující oblasti signálních peptidů různých proteinů AX. Exprese genu kódujícího například AX2 se zjistí pomocí identifikace transkripčního produktu genu AX2. Přítomnost proteinu- v rostlině se dále prokáže imunochemicxy za použití protilátek vytvořených proti autentickému vzorku proteinu. Z důvodů zvýšení imunogenicity proteinů lze tyto proteiny před injekcí do králíků navázat jako na nosič na toxoid záškrtu nebo spo.jit s poly-lysinem... ...... ..... ......
Vytvoří se extrakty transgenického bramboru a cukrové řepy, částečně se purifikují a v souladu s výše popsaným mikrotitračním testem se testuje . jejich schopnost inhibovat růst Cercospory.
Extrakty získané z rostlin transgenických pokud jde o protein AX podstatně inhibují .růst houby ve srovnání s podobnými extrakty získanými z kontrolních netransgenických brambor a cukrové řepy.
Kromě toho lze vhodné mikroorganismy (t.j. takové, ve kterých není produkce proteinů AX podstatně toxická) transformovat vektorem obsahujícím gen (nebo geny) kódující' protein AX (nebo kombinaci proteinů AX) tak, že transformovaný mikroorganismus produkuje tento protein. Mikroorganismy mohou dále obsahovat gen kódující jiné proteiny, jako je protein WIN podobný proteinu znázorněnému v sekvenci SEQ ID Č. 11 nebo/a různé chitinasy nebo/a glukanasy. Je zejména- výhodné, pokud je takovýmto jiným proteinem chitinasa 4, jak je popsána v přihlášce vynálezu PCT/DK92/00108 “ (zveřejněné pod číslem WQ92/17591).
Tyto mikroorganismy lze poté použít k potírání rostlinných patogenů. Například lze transformované mikroorganismy vysušit a aplikovat ve formě spraye na infikované rostliny nebo na rostliny v nebezpečí infekce.
Zobrazení sekvencí
Informace o sekvenci SEQ ID č. 1:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 437 párů bází (B) typ : nukleová kyselina (C) počet řetězců : dvouřetězcová (D) topologie : neznámá (ii) typ molekuly: cDNA (iii) není hypotetická (iii) není anti-sense (vi) původní zdroj:
(A) organismus: Beta vulgaris (ix) vlastnosti:
(A) jméno / klíč: CDS (B) lokace: 40..264 (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 1:
ATACGCATTT GTTTCAAAGT TCAAACAAAG ACCAAAAAA ATG GAG AAG AAA TTC 54
--— -----:-:_Met_Glu_Lys_Lys_Phe_ _
5
TTT GGG CTT TTG CTT TTG CTA CTC TTC GTA TTT GCT TCT GAG' ATG AAT 102
Phe Gly Leu Leu Leu 10 Leu Leu Leu Phe val 15 Phe Ala Ser Glu Met 20 Asn
ATT GTG ACT AAG GTT GAT GGT GCA ATA TGC AAG AAA CCA AGT AAG TTC 150
Ile Val Thr Lys Val Asp Gly Ala Ile Cys Lys Lys Pro Ser Lys Phe
25 30 35
TTC AAA GGT GCT TGC GGT AGA GAT GCC GAT TGT GAG AAG GCT TGT GAT 198
Phe Lys Gly Ala Cys Gly Arg Asp Ala Asp Cys Glu Lys Ala Cys Asp
40 45 50
CAA GAG AAT TGG CCT GGC GGA GTT TGT GTA CCC TTT CTC AGA TGT GAA 245
Gin Glu Asn Trp Pro Gly Gly Val Cys Val Pro Phe Leu Arg Cys Glu
55 50 65
TGT CAG AGG TCT TGC TAAGCACTGC AAGCCACGGA CGATAAAAAG AAGTACTTGT 301
Cys Gin Arg Ser Cys. ... ... .......... .......
75
AATGAAGCTA TGGGTCAATA TTTTTCAATC CTATAATATT AAATAAATTG TTGTAACTAT 361
TTTAAGTGTG TAATAAATCT ACGTGGGTTT AAACTCCACA ATTGCTTTTG AAATAATGAT 421 '
TTACATATAA GTTTCA 437
Informace o sekvenci SEQ ID č, 2:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 74 aminokyselin (B) typ : aminokyselinová (D) topologie : lineární (ii) typ molekuly: protein (xi) znázornění sekvence SEQ ID Č. 2:
Met 1 Glu Lys Lys Phe 5 Phe Gly Leu Leu Leu 10 Leu Leu Leu Phe Val 15 Phe
Ala Ser Glu Met 20 Asn Ile Val Thr Lys 25 Val Asp Gly Ala Ile 30 Cys Lys
Lys Pro Ser 35 Lys Phe Phe Lys Gly 40 Ala Cys Gly Arg Asp 45 Ala Asp Cys
Glu Lys 50 Ala Cys Asp Gin Glu 55 Asn Trp Pro Gly Gly 60 Val Cys Val Pro
Phe Leu Arg Cys Glu Cys Gin Arg Ser Cys 65 70
Informace o sekvenci SEQ ID č. 3:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 349 párů bází (B) typ : nukleová kyselina (C) počet řetězců : dvouřetězcová (D) topologie : neznámá (ii) typ molekuly: cDNA (iii) není hypotetická (iii) není anti-sense (vi) původní zdroj:
(A) organismus: Beta vulgaris (xi) znázornění sekvence.SEQ ID č. 3:.
CTGCAGGGAT CCTATTTTTA CAACAATTAC CAACAACAAC AAACAACAAA CAACATTACA
ATTACTATTT ACAATTACAC. CATGGAGAAG.AAATTCTTTG. GGCTTTTGCT“.T.TTGCTACTC'
TTCGTATTTGCTTCTGAGAT GAATATTGTGACTAAGGTTG: .ATGGTGCAAT:ATGCAAGAAA.
CCAAGTAAGT TCTTCAAAGG TGCTTGCGGT AGAGATGCCG ATTGTGAGAA GGCTTGTGAT
CAAGAGAATT GGCCTGGCGG AGTTTGTGTA CCCTTTCTCA GATGTGAATG TCAGAGGTCT
TGCTAAGCAC TGCAAGCCAC GGACGATAAA AAGAAGCGTC GACGCATGC
120
180
240
300
349
Informace o sekvenci SEQ ID č. 4:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 492 párů bází (3).typ : nukleová kyselina (C) počet .řetězců : dvouřetězcová (D) topologie : neznámá (ii) typ molekuly: cDNA (iii) není hypotetická (iii) není anti-sense (vi) původní zdroj:
(A) organismus: Beta vulgaris (ix) vlastnosti:
(A) jméno / klíč: CDS (B) lokace: 53..277 (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 4:
CCATACATTA TATACGTATT TGTTTCAAAG TTCAAACAAA GACAAAACAA AA ATG 55
Met
GAG AAA AAA TTC TTT Phe GGG CTŤ Gly Leu TTG CTT TTG CTA CTC TTC GTA TTT GCT 103
Glu Lys Lys Phe 5 Leu Leu 10 Leu Leu Leu Phe Val 15 Phe Ala
TCT GAG CTG AAC ATG GTG GCT GAG GTT CAA GGT GCC ACT TGT AGA AAA 151
Ser Glu Leu Asn Met Val. Ala Glu- Val Gin Gly Ala Thr Cys Arg Lys
20 25 30 —
CCA AGT ATG TAT TTC AGC GGC GCT TGC TTT TCT GAT ACG AAT TGT CAG 199
Pro Ser Met Tyr Phe Ser Gly Ala Cys Phe Ser Asp Thr Asn Cys Gin
35 40 45
AAA GCT TGT AAT CGA GAG GAT TGG CCT AAT GGG AAA TGC TTA GTC GGT 247
Lys Ala Cys Asn Arg Glu Asp Trp Pro Asn Gly Lys Cys Leu Val Gly
50 55 60 65
TTC AAA TGT GAA TGT CAA AGG CCT TGT TAAGTGGTGC CTGTGTCCTC 294
Phe Lys Cys Glu Cys Gin Arg Pro Cys
70 75
AATTACGGCC TACGAGCCTT TCAGGTACCT ATGTGGCCGA GTATGGCTAA ATTGGTAATA 354
GTACAŤAGCA GTGGTAATAT GAATAAACGA TŤCACTCTTG TAAGATGTAT TATGTTTTGT 414
TTGTGCŤGTG GTTTCCAGTT GCTTTTGAAA ATAATGATTT TCATATAAAT CGGACCTTTT 474
492
ATTCTGATAA AAAAAAAA
Informace o sekvenci SEQ ID č. 5:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 74 aminokyselin (B) typ : aminokyselinová CD) topologie : lineární (ii) typ molekuly: protein (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 5:
Met Glu Lys Lys Phe Phe Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Phe Val Phe
1 5 10 15
Ala Ser Glu Leu Asn Met Val Ala Glu Val Gin Giy Ala Thr Cys Arg
20 25 30
Lys Pro Ser Met Tyr Phe Ser Gly Ala Cys Phe Ser Asp Thr Asn Cys
3.5 40 45
Gin Lys Ala Cys Asn Arg Glu Asp Trp Pro Asn Gly Lys Cys Leu Val
50 55 60
Gly Phe Lys Cys Glu Cys Gin Arg Pro Cys •
65 70
Informace o sekvenci SEQ ID Č. 6:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 363 párů bází (B) typ : nukleová kyselina (C) počet řetězců : dvouřetězcová (D) topologie : neznámá (ii) typ molekuly: cDNA (iii) není hypotetická (iii) není anti-sense (vi) původní zdroj:
(A) organismus: Beta vulgaris (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 6:
CTGCAGGGAT CCTATTTTTA CAACAATTAC CAACAACAAC AAACAACAAA CAACATTACA 60 _ATTACTATTT_ACAATTACAC_CATGGAGAAA_.AAATTC.TTTG._GGCT.T.T.TGCT^.T.T.TGC.TACTC^„___120
TTCGTATTTG CTTCTGAGCT GAACATGGTG GCTGAGGTTC AAGGTGCCAC TTGTAGAAAA 180
CCAAGTATGT ATTTCAGCGG CGCTŤGCTTT TCTGATACGA ATTGTCAGAA ÁGCTTGTAAT 240
CGAGAGGATT GGCCTAATGG GAAATGCTTA GTCGGTTTCA AATGTGAATG TCAAAGGCCT 300
TGTTAAGTGG TGCCTGTGTC CTCAATTACG GCCTACGAGC CTTTCAGGTA CGTCGACGCA 360
TGC 363
Informace o sekvenci SEQ ID č. 7:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 596 párů bází (B) typ : nukleová kyselina (C) počet řetězců : dvouřetězcová ‘(D) topologie : neznámá (ii) typ molekuly: cDNA (iii) není hypotetická (iii) není anti-sense (vi) původní zdroj:
(A) organismus: Beta vulgaris (ix) vlastnosti:
(A) jméno / klíč: CDS (B) lokace: 23..358 (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 7:
ATTCAACCCA ATAGAAACAA TC ATG GCA AGG AAC TCA TTC AAC TTC CTC ATT- 52
Met Ala Arg Asn Ser Phe Asn Phe Leu Ile
10
ATC Ile ATG GTC ATT TCA GCA CTG CTT TTG CTC CCT GGA TCA CGT GCA AGC 100
Met Val Ile Ser Ala 15 Leu Leu Leu Leu 20 Pro Gly Ser Arg Ala 25 Ser
TTT CAG GAA AAG ATA ACT ATG AAC ATA GAA GAT GGA CGC GAA AGC GGC 148
Phe Gin Glu Lys 30 Ile Thr Met Asn Ile 35 Glu Asp Gly Arg Glu Ser 40 Gly
ATA GCA AAG GAA ATA GTT GAG GCA GAA GCA GAA GCA GAA GCA TTA TTA 196
Ile Ala Lys 45 Glu Ile Val Glu Ala Glu 50 Ala Glu Ala Glu 55 Ala Leu Leu
CGC GTT GGT GAG CAA GCT ATG CTG GAA CAA GTA ATG ACA AGA GGC TTA 244
Arg Val 60 Gly Glu Gin Ala Met Leu Glu 65 Gin Val Met 70 Thr Arg Gly Leu
GCA GAT AAC CTT AAG AGG TGT ATA CCA TGT GGT CAA GAC TGC ATT TCC’ 292
Ala 75 Asp Asn Leu Lys Arg 80 Cys. Ile Pro Cys Gly 85 Gin Asp Cys Ile Ser 90
TCA AGA AAC TGT TGC TCA CCT TGC AAA TGC AAC TTC GGG CCA CCG GTT 340
Ser Arg Asn Cys Cys Ser 95 Pro Cys Lys Cys 100 Asn Phe Gly Pro Pro 10.5 Val
CCA Pro AGG Arg TGT Cys ACT Thr 110 AAT TGAATGCTTA GCTTGCTGCT'TAGTGCTAAA TGCTAAGCGC' Asn 395
TACGCTTGCT AGTATGŤGCA CGATCCGCTC TATCTCTTTA TATGCACCTA'AGTCCTTTCA 455
TCTCGACTGT GTTGTTTGTG TGTAAAATAA AGTCTTGGTT TTCCAAGACT ACTAGTTTAG 515
TTACTGGCTT ATGTTTTTCG GAATCTTGAT ATATAAATAA GACAAGGAGA CCTATTTCTT 575
GCT-TTGCTTA-AAAAAAAAAA-A-,-:;_._S96
Informace o sekvenci SEQ. ID č. 8:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 111 aminokyselin (B) typ : aminokyselinová (D) topologie : neznámá (ii) typ molekuly: protein (iii) není hypotetická -.......(xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 8:
Met _ I. Ala Arg Asn Ser 5 Phe Asn Phe Leu Ile 10 Ile Met Val Ile Ser 15 Ala
Leu Leu Leu Leu 20 Pro Gly Ser Arg Ala 25 Ser Phe Gin Glu Lys 30 Ile Thr
Met Asn Ile 35 Glu Asp Gly Arg Glu 40 Ser Gly Ile Ala Lys 45 Glu Ile Val
Glu Ala 50 Glu Ala Glu Ais. Glu 55 Ala Leu Leu Arg Val 60 Gly Glu Gin Ala
Met 65 Leu Glu Gin Val Met Thr 70 · Arg Gly Leu Ala 75 Asp Asn Leu Lys Arg 80
Cys Ile Pro Cys Gly 85 Gin Asp Cys Ile Ser 90 Ser Arg Asn Cys Cys 95 Ser
Pro Cys Lys Cys 100 Asn Phe Gly Pro Pro 105 Val Pro Arg Cys Thr 110 Asn
— * -íAi
*...
Informace o sekvenci SEQ ID č. 9: v (i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 484 párů bází (B) typ : nukleová kyselina (C) počet řetězců : dvouřetězcová (D) topologie : neznámá (ii) typ molekuly: cDNA (iii) není hypotetická (iii) není anti-sense (vi) původní zdroj:
(A) organismus: Beta vulgaris (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 9:
CTGCAGGGAT CCTATTTTTA CAACAATTAC CAACAACAAC AAACAACAAA CAACATTACA . 60
ATTACTATTT ACAATTACAC CATGGCAAGG AACTCATTCA ACTTCCTCAT TATCATGGTC 120
ATTTCAGCAC TGCTTTTGCT CCCTGGATCA CGTGCAAGCT TTCAGGAAAA GATAACTATG 180
AACATAGAAG ATGGACGCGA AAGCGGCATA GCAAAGGAAA TAGTTGAGGC AGAAGCAGAA 240
GCAGAAGCAT TATTACGCGT TGGTGAGCAA GCTATGCTGG AACAAGTAAT GACAAGAGGC 300
TTAGCAGATA ACCTTAAGAG GTGTATACCA TGTGGTCAAG ACTGCATTTC CTCAAGAAAC 360
TGTTGCTCAC CTTGCAAATG CAACTTCGGG CCACCGGTTC CAAGGTGTAC TAATTGAATG . 420
CTTAGCTTGC TGCTTAGTGC TAAATGCTAA GCGCTACGCT TGCTAGTATG TGGTCGACGC 480
ATGC 484
Informace o sekvenci SEQ ID č. 10 r.
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 504 párů bází (B) typ : nukleová kyselina (C) počet řetězců : dvouřetězcová.
(D) topologie : neznámá:
(ii) typ molekuly: cDNA (iii) není hypotetická (iii) není anti-sense (vi) původní zdroj:
(A) organismus: Hordeum vulgare (ix) vlastnosti:
(A) jméno i klíč: CDS (3) lokace: 1..441' (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 10:
ATG GCG GCA CGC CTG ATG CTG GTG GCG GCG CTG CTG TGC GCG GCG GCG Met Ala Ala Arg Leu Met Leu Val Ala Ala Leu Leu Cys Ala Ala Ala 43
1 5 10 15
GCC ATG GCC ACG GCG CAG CAG GCG AAC AAC GTC CGG GCG ACG TAC CAC 96
Ala Met Ala Thr Ala Gin Gin Ala Asn Asn Val Arg Ala Thr Tyr His
20 25 30
• 1 ·. . „ . U l. . .....
TAC TAC CGG CCG GCG CAG AAC AAC TGG GAC CTG GGC GCG CCC GCC GTG 144
Tyr Tyr Arg Pro Ala Gin Asn Asn Trp Asp Leu Gly Ala Pro Ala Val
35 40 45
AGC GCC TAC TGC GCG ACC TGG GAC GCC AGC AAG CCG CTG TCG TGG CGG 192
Ser Ala Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Ala Ser Lys Pro Leu Ser Trp Arg
50 55 60
TCC AAG TAC GGC TGG ACG GCG TTC TGC GGC CCC GCC GGC CCC CGC GGG 240
Ser Lys Tyr Gly Trp Thr Ala Phe Cys Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly
65 70 75 80
CAG GCG GCC TGC GGC AAG TGC CTC CGG GTG ACC AAC CCG GCG ACG GGG 283
Gin Ala Ala Cys Gly Lys Cys Leu Arg Val Thr Asn Pro Ala Thr Gly
85 90 95
GCG CAG ATC ACG GCG AGG ATC GTG GAC CAG TGC GCC AAC GGC GGG CTC 336
Ala Gin Ile Thr Ale Arg Ile Val Asp Gin Cys Ala Asn Gly Gly Leu
100 105 110
GAC CTC GAC TGG GAC ACC GTC TTC ACC AAG ATC GAC ACC AAC GGG ATT 384
Asp Leu Asp Trp Asp Thr Val Phe Thr Lys Ile Asp Thr Asn Gly Ile
.115 120 125
GGG TAC CAG CAG GGC CAC CTC AAC GTC AAC TAC CAG TTC GTC GAC TGC 432
Gly Tyr Gin Gin Gly His Leu Asn Val Asn Tyr Gin Phe Val Asp cys
130 135 140
CGC GAC TAGATTGTCT GTGGATCCAA GGCTAGCTAA GAATAAAAGG CTAGCTAAGC 488
Arg Asp *
145
TATGAGTGAG CAGCTG 504
Informace o sekvenci SEQ ID č. 11:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 146 aminokyselin (B) typ : aminokyselinová (D) topologie : lineární (ii) typ molekuly: protein (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 11:
Met 1 Ala Ala Arg Leu 5 Met Leu Val Ala Ala 10 Leu Leu Cys Ala Ala 15 Ala
Ala Met Ala Thr 20 Ala Gin Gin Ala Asn 25 Asn Val Arg Ala Thr 30 Tyr His
Tyr Tyr Arg 35 Pro Ala Gin Asn Asn 40 Trp Asp Leu Gly Ala 45 Pro Ala Val
Ser Ala 50 Tyr Cys Ala Thr Trp 55 Asp Ala Ser Lys Pro 60 Leu Ser Trp Arg
Ser 65 Lys Tyr Gly Trp Thr 70 Ala Phe Cys Gly Pro , 75 Ala Gly Pro Arg Gly 80
Gin Ala Ala .Cys Gly. 85 Lys. Cys Leu Arg Val 90 Thr Asn Pro Ala Thr 95 Gly
Ala Gin Ile Thr 100 Ala Arg Ile Val Asp 105 Gin Cys Ala Asn Gly Gly 110 Leu
Asp Leu Asp 115 Trp Asp Thr Val' Phe 120 Thr Lys Ile Asp Thr 125 Asn Gly Ile
Gly Tyr 130 Gin Gin Gly His Leu 135 Asn Val Asn Tyr Gin 140 Phe Val Asp Cys
Arg Asp 145
Informace o sekvenci SEQ ID č. 12:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 515 páru bází (B) typ : nukleová kyselina (C) počet řetězců : dvouřetězcová (D) topologie : neznámá (ii) typ molekuly: cDNA (iii) není hypotetická (iii) není anti-sense .............
(vi) původní zdroj:
(A) organismus: Hordeum vulgare (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 12:
CTGCAGGATC CATGGCGGCA CGCCTGATGC TGGTGGCGGC GCTGCTGTGC GCGGCGGCGG 60
CGATGGCCAC GGCGCAGCAG GCGAACAACG TCCGGGCGAC GTACCACTAC TACCGGCCGG 120
CGCAGAACAA CTGGGACCTG GGCGCGCCCG CCGTGAGCGC CTACTGCGCG ACCTGGGACG 180
CCAGCAAGCC GCTGTCGTGG CGGTCCAAGT ACGGCTGGAC GGCGTTCTGC GGCCCCGCCG 240
GCCCCCGCGG GCAGGCGGCC TGCGGCAAGT GCCTCCGGGT GACCAACCCG GCGACGGGGG 300
CGCAGATCAC GGCGAGGATC GTGGACCAGT GCGCCAACGG CGGGCTCGAC CTCGACTGGG 360}
ACACCGTCTT CACCAAGATC GACACCAACG GGATTGGGTA CCAGCAGGGC CACCTCAACG 420
TCAACTACCA GTTCGTCGAC TGCCGCGACT AGATTGTCTG TGGATCCAAG GCTAGCTAAG 480'
AATAAAAGGC TAGCTAAGCT ATGAGTGAGC AGCTG 515
Informace o sekvenci SEQ ID č. 13:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 585 párů bází (B) typ : nukleová kyselina (C) počet řetězců : dvouřetězcová (D) topologie : neznámá (ii) typ molekuly: cDNA (iii) není hypotetická (iii) není anti-sense (vi) původní zdroj:
(A) organismus: Hordeum vulgare (xi) znázornění sekvence SEQ ID Č. 13:
CTGCAGGGAT CCTATTTTTA CAACAATTAC CAACAACAAC AAACAACAAA CAACATTACA 60
ATTACTATTT ACAATTACAC CATGGCGGCA CGCCTGATGC TGGTGGCGGC GCTGCTGTGC 120
GCGGCGGCGG CGATGGCCAC GGCGCAGCAG GCGAACAACG TCCGGGCGAC GTACCACTAC 180
TACCGGCCGG CGCAGAACAA CTGGGACCTG GGCGCGCCCG CCGTGAGCGC CTACTGCGCG 240
ACCTGGGACG CCAGCAAGCC GCTGTCGTGG CGGTCCAAGT ACGGCTGGAC GGCGTTCTGC 300
GGCCCCGCCG GCCCCCGCGG GCAGGCGGCC TGCGGCAAGT GCCTCCGGGT GACCAACCCG 360
GCGACGGGGG CGCAGATCAC GGCGAGGATC GTGGACCAGT GCGCCAACGG CGGGCTCGAC . 420
CTCGACTGGG ACACCGTCTT CACCAAGATC GACACCAACG GGATTGGGTA CCAGCAGGGC 480
CACCTCAACG TCAACTACCA GTTCGTCGAC TGCCGCGACT AGATTGTCTG TGGATCCAAG ' 540
GCTAGCTAAG AATAAAAGGC TAGCTAAGCT ATGAGTGAGC. AGCTG ' 585
Výše popsaný vynález je shrnut v následujících bodech označených čísly 1 - 37 a definován dále uvedenými patentovými nároky 1-20.
1. Antimikrobiální proteiny izolované z cukrové řepy, s výjimkou chitinas a glukanas.
2. Antimikrobiální proteiny podle bodu 1, izolované z cukrové řepy, která byla infikována houbou rodu Cercospora.
3. Antimikrobiální proteiny podle libovolného z bodů 1 nebo 2, izolované z listů cukrové řepy infikované Cercospora beticola.
4. Čisté proteiny, které mají aminokyselinové sekvence':' proteinů popsané v libovolném z bodů 1 až 3.
5. Čistý protein AX1,, nebo jeho funkčně ekvivalentní analog, ve kterém byla jedna nebo více aminokyselin přidána, nahrazena nebo odstraněna, aniž by došlo k podstatnému, snížení antimikrobiální aktivity proteinu.
6. Čistý protein AX2, nebo jeho funkčně ekvivalentní analog, ve kterém byla jedna nebo více aminokyselin přidána, nahrazena nebo odstraněna, aniž by došlo k podstatnému snížení antimikrobiální aktivity proteinu.
7. Čistý protein AX3,1, nebo jeho funkčně ekvivalentní analog, ve kterém byla jedna nebo více aminokyselin přidána, nahrazena nebo odstraněna, aniž by došlo k podstatnému snížení antimikrobiá1ηí aktivity.proteínu.
8. Čisté proteiny nebo jejich funkční analogy podle libovolného z bodů 1 až 7, chemicky syntetizované in vitro na základě znalosti jejich aminokyselinových sekvencí.
9. Čisté proteiny, které jsou alespoň z 55 % podobné proteinům podle libovolného z bodů 1 až 8.
10. Čisté proteiny podle libovolného z bodů 5 až 9, v kombinaci s proteinem, který je bazickým doplňkem skupiny 4 kyselých proteinů souvisejících s patogenezí.
11. Čisté proteiny podle bodu 10, kde je proteinem, který je bazickým doplňkem uvedených proteinů souvisejících s patogenezí, protein WIN vázající chitin.
12. Čisté proteiny podle bodu 11, kde byl protein WIN izolován ze zrna ječmene nebo z listu ječmene vystaveného stresu.
13. Rekombinantní DNA obsahující sekvenci, která kóduje protein, jak je popsán v libovolném z bodů..1 až. 9.
14. Rekombinantní DNA podle bodu 13 obsahující sekvenci, která kóduje protein jak je popsán v libovolném z bodů' 1 až 9, vybraná ze skupiny zahrnující sekvence znázorněné v SEQ ID č. 2, 5 a 8.
15. Rekombinantní sekvence DNA podle libovolného z bodů 13 nebo 14, která dále obsahuje sekvenci DNA kódující protein, který je bazickým doplňkem skupiny 4 kyselých proteinů souvisejících s patogenezí, jak je popsán v libovolném z bodů 10 až 12.
15. Sekvence DNA, která hybridizuje za přísných hybridizačních podmínek se sekvencí DNA podle libovolného z bodů 13 až 15.
17. Vektor obsahující sekvencí DNA, jak je popsána v libovolném z bodů 13 až 16.
18. Vektor, jak je popsán v bodu 17, který obsahuje sekvenci DNA izolovanou z rostlinného genomu.
19. Biologický systém obsahující DNA jak je popsána v libovolném z bodů 13 až 16, kterýžto systém umožňuje expresi této DNA.
20. Biologický systém podle bodu 19, kterým je mikroorganismus.
21. Biologický systém podle bodu 19, kterým je rostlina.
22. Rostliny transformované rekombinantní DNA jak jď' popsána v libovolném z bodů 13 až 16.
23. Rostliny transformované rekombinantní sekvencí DNA obsahující část, která kóduje protein AXl, nebo jeho funkčně ekvivalentní analog, ve kterém byla jedna nebo více aminokyselin přidána, nahrazena nebo odstraněna, aniž by došlo k podstatnému ' snížení antimikrobiální aktivity proteinu.
24. Rostliny transformované rekombinantní sekvencí DNA obsahující Část, která kóduje protein AX2, nebo jeho funkčně ekvivalentní analog, ve kterém byla jedna nebo více aminokyselin přidána, nahrazena nebo odstraněna, aniž by došlo k podstatnému snížení antimikrobiální aktivity proteinu.
25. Rostliny transformované rekombinantní sekvencí DNA obsahující část, která kóduje protein AX3,1, nebo jeho funkčně ekvivalentní analog, ve kterém byla jedna nebo více aminokyselin přidána, nahrazena nebo odstraněna, aniž by došlo k podstatnému snížení antimikrobiální aktivity proteinu.
26. Rostliny transformované podle libovolného z bodu 23 až 25, kde sekvence DNA dále kóduje protein, který je bazickým doplňkem skupiny 4 kyselých proteinů souvisejících s patogenezí, jak je popsán v libovolném z bodů 10 až 12.
27. Potomstvo rostlin podle libovolného z bodů 23 až 26, kteréžto potomstvo exprimuje shora uvedené rekombinantní sekvence DNA.
28. Semena rostlin podle libovolného z bodů 22 až 26 nebo potomstva podle bodu 27.
29. Protein získaný expresí DNA, jak je popsána v libovolném z bodů 13 až 16.
30. Antimikrobiální protein produkovaný expresí rekombinantní DNA v rostlinách, jak jsou popsány v libovolném z bodu 22 až 27.
31. Antimikrobiální prostředek obsahující, jeden nebo více proteinů, jak jsou popsány v libovolném z bodů 1 až 12 a 29 až 30.
32, Způsob boje proti houbám či bakteriím, který zahrnuje jejich vystavení proteinům nebo prostředkům, jak jsou popsány v libovolném z bodů 1 až 12 a 29 až 31.
33. Postup extrakce pro získání antimikrobiálních proteinů, jak jsou popsány v libovolném z bodů 1 až 12 nebo 29 až 31, z organického materiálu, který je obsahuje.
34. Postup ' extrakce podle bodu 33, který zahrnuje podrobení materiálu maceraci. a extrakci rozpouštědlem.
35. Postup extrakce, jak je popsán v bodu 34, kdy je protein následně purifikován pomocí centrifugace a chromatografie, vybrané ze skupiny zahrnující hydrofobní interakci, výměnu iontů, výměnu kationtů, gelovou filtraci a chromatografii na reverzní fázi.
36. Postup extrakce, jak je popsán v libovolném z bodů 33 až 35, kde organická hmota obsahuje listy cukrové řepy,, která je infikována Cercospora beticola.
37. Postup extrakce podle libovolného- z bodů 33 až 35, kde organická hmota obsahuje mikroorganismus, jak je popsán v bodu 2 0.

Claims (20)

1. Antimikrobiální proteiny, vyznačuj ící se t í m , že jsou izolované z cukrové řepy, s výjimkou chitinas a glukanas.
2. Antimikrobiální proteiny podle nároku 1, vyznačující se tím, že jsou izolované z cukrové řepy, která byla infikována houbou rodu Cercospora.
3. Čistý protein vybraný ze skupiny zahrnující proteiny znázorněné v sekvencích SEQ ID č. 2, 5 a 8, nebo jeho funkčně ekvivalentní analog, ve kterém byla jedna nebo více aminokyselin přidána, nahrazena nebo odstraněna, aniž by došlo k podstatnému . snížení antimikrobiální aktivity proteinu, a směsi těchto proteinů nebo analogů.
4. Čistý protein tvořený zbytky 80 - 111 v sekvenci SEQ ID č.. 8, nebo zbytky 2 9 - 74 v sekvenci SEQ ID č. 2 nebo v sekvenci SEQ ID č.
5, nebo. jeho funkčně ekvivalentní analog, ve kterém byla jedna nebo více aminokyselin přidána, nahrazena nebo odstraněna, aniž by došlo k podstatnému snížení antimikrobiální aktivity proteinu, a směsi těchto proteinů nebo analogů.
'5. Čisté proteiny, vyznačující se tím, že mají sekvence aminokyselin, které jsou alespoň z 55 % podobné sekvencím proteinů podle libovolného z nároků 1 až 4.
6. Čisté proteiny podle libovolného z nároků 1 až 5, v. kombinaci s proteinem, který je bazickým doplňkem skupiny 4 kyselých proteinů souvisejících s patogenezí nebo/a chitinasou nebo/a glukanasou.
7. Čisté proteiny podle nároku 6, kde je proteinem, který je bazickým doplňkem shora uvedených proteinů souvisejících s patogenezí, protein WIN vázající chitin obsahující sekvenci aminokyselin znázorněnou v sekvenci SEQ ID či 11, nebo jeho funkčně ekvivalentní analog, ve kterém byla jedna nebo více aminokyselin přidána, nahrazena nebo odstraněna, aniž by došlo k podstatnému snížení antimikrobiální ~liktivity protei nu —nebo a ktfvitý proteinu’ p ř’i' vazbě na chitin.
8. Rekombinantní DNA, vyznačující se tím, že obsahuje sekvenci kódující protein, jak je popsáno v libovolném z nároků 1 až 5.
9. Rekombinantní DNA podle nároku 8, vy značující se tím, že obsahuje nukleotidovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence znázorněné v SEQ ID Č. 1, 3, 4, 6, 7a 9.
10. Rekombinantní sekvence DNA podle libovolného z. nároků 8 nebo 9, vyznačující se tím , že. dále obsahuje sekvenci DNA kódující protein, který je bazickým doplňkem skupiny 4 kyselých proteinů souvisejících s patogenezí, jak je popsán v libovolném z nároků 6 nebo 7, nebo/a chitinasu nebo/a glukanasu.
11. Rekombinantní sekvence DNA podle libovolného z nároků 8 až 10, vyznačující se tím, že je modifikována tak, že jsou použity kodóny, které jsou preferovány organismem, do kterého má být rekombinantní DNA inzertována, takže se expresí takto moďffíkované~DNA v shora uvedeném organismu získá v podstatě podobný protein jako expresí nemodifikované rekombinantní DNA v organismu, ve kterém jsou komponenty rekombinantní DNA, které kódují protein, endogenní.
12. Sekvence DNA, vyznačující se tím, že hybridizuje za přísných podmínek se sekvencí DNA podle libovolného z nároků 8 až 11.
13. Vektor, vyznačující se tím , že obsahuje sekvenci DNA podle libovolného z nároků 8 až 12.
14. Biologický systém vybraný ze skupiny zahrnující rostliny a mikroorganismy, kterýžto systém obsahuje a umožňuje expresi DNA, jak je popsána v libovolném z nároků 8 až 12.
15. Rostliny, zejména kukuřice nebo cukrová řepa, transformované rekombinantní DNA, jak je popsána v libovolném z nároků 8 až 12.
16. Potomstvo a semena rostlin podle nároku 15, a semena takového potomstva, kteréžto potomstvo exprimuje shora uvedenou rekombinantní DNA.
17. Protein získaný expresí DNA, jak je popsána v libovolném z nároků 8 až 12.
18. Antimikrobiální protein vytvořený pomocí exprese rekombinantní DNA v rostlinách, jak jsou popsány v libovolném z nároků 15 nebo 16.
19. Antimikrobiální prostředek, vyznačuj ící se tím, že obsahuje jeden nebo více proteinů, jak jsou popsány v libovolném z nároků 1 až 7, 16 a 18.
20. Způsob boje proti houbám či bakteriím, vyznačující se tím , že zahrnuje jejich vystavení proteinům nebo prostředkům podle' libovolného z' nároků 1 až 7 a 16 až 19.
CZ1994403A 1993-02-24 1994-02-22 Antimikrobiální proteiny, rekombinantní DNA, které je kódují, antimikrobiální prostředek, který je obsahuje, a způsob boje proti houbám či bakteriím CZ289646B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB939303725A GB9303725D0 (en) 1993-02-24 1993-02-24 Improvements in or relating to organic compounds

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ40394A3 true CZ40394A3 (en) 1994-09-14
CZ289646B6 CZ289646B6 (cs) 2002-03-13

Family

ID=10730963

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ1994403A CZ289646B6 (cs) 1993-02-24 1994-02-22 Antimikrobiální proteiny, rekombinantní DNA, které je kódují, antimikrobiální prostředek, který je obsahuje, a způsob boje proti houbám či bakteriím

Country Status (15)

Country Link
US (2) US5608151A (cs)
EP (1) EP0612847A3 (cs)
JP (1) JPH06340696A (cs)
KR (1) KR100346928B1 (cs)
AU (1) AU682483B2 (cs)
CA (1) CA2116201A1 (cs)
CZ (1) CZ289646B6 (cs)
GB (1) GB9303725D0 (cs)
HU (1) HU218110B (cs)
IL (1) IL108727A0 (cs)
PL (1) PL179726B1 (cs)
SK (1) SK20594A3 (cs)
TR (1) TR27243A (cs)
UA (1) UA41278C2 (cs)
ZA (1) ZA941282B (cs)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5521153A (en) * 1987-10-02 1996-05-28 Ciba-Geigy Corporation Synergistic antifungal protein and compositions containing same
US5530187A (en) * 1993-07-16 1996-06-25 The Salk Institute For Biological Studies Transgenic plants containing multiple disease resistance genes
GB9526238D0 (en) * 1995-12-21 1996-02-21 Sandoz Ltd Improvements in or relating to organic compounds
US6121436A (en) 1996-12-13 2000-09-19 Monsanto Company Antifungal polypeptide and methods for controlling plant pathogenic fungi
US6875903B2 (en) * 1998-06-22 2005-04-05 University Of Vermont Treatment of Staphylococcus infections
US7091332B1 (en) 1998-06-22 2006-08-15 University Of Vermont Treatment of staphylococcus infections
AU4706799A (en) * 1998-06-22 2000-01-10 University Of Vermont And State Agricultural College, The Treatment of (staphylococcus) infections
EP2270188A3 (en) * 2001-06-22 2011-09-07 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Defensin polynucleotides and methods of use

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK61691D0 (da) * 1991-04-08 1991-04-08 Danisco Genetiske konstruktioner
NZ244091A (en) * 1991-08-29 1994-10-26 Zeneca Ltd Biocidal proteins derived from plants, their manufacture, coding sequences and uses

Also Published As

Publication number Publication date
US5607919A (en) 1997-03-04
GB9303725D0 (en) 1993-04-14
EP0612847A3 (en) 1995-01-11
ZA941282B (en) 1995-08-24
US5608151A (en) 1997-03-04
SK20594A3 (en) 1994-09-07
KR940019722A (ko) 1994-09-14
HUT68522A (en) 1995-06-28
KR100346928B1 (ko) 2002-11-13
JPH06340696A (ja) 1994-12-13
HU218110B (hu) 2000-06-28
TR27243A (tr) 1994-12-21
UA41278C2 (uk) 2001-09-17
AU682483B2 (en) 1997-10-09
PL179726B1 (pl) 2000-10-31
PL302321A1 (en) 1994-09-05
AU5635494A (en) 1994-09-01
IL108727A0 (en) 1994-05-30
CZ289646B6 (cs) 2002-03-13
HU9400526D0 (en) 1994-05-30
CA2116201A1 (en) 1994-08-25
EP0612847A2 (en) 1994-08-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2158762C2 (ru) Антимикробные белки
EP0603216B1 (en) Biocidal proteins
US6187904B1 (en) Biocidal proteins
AU655186B2 (en) New antifungal preparations, process for making such preparations, process for obtaining plants with decreased susceptibility to fungi
IL97480A (en) Preparations with pathogenic activity, containing lithium peptides and hydrolytic enzymes
US5942663A (en) Biocidal proteins
US6521590B1 (en) Biocidal proteins
US5750504A (en) Antimicrobial proteins
CZ40394A3 (en) Anti-microbial proteins
JPH08505048A (ja) 殺生物性のキチン結合性蛋白質
EP0540709A1 (en) Novel antipathogenic peptides and compositions containing same
JPH07502976A (ja) 殺生物性蛋白質
WO2006066355A1 (en) Chitin-binding peptides
El-Habbak Overexpression/silencing of selected soybean genes alters resistance to pathogens
HU219505B (hu) Eljárás növényből származó intracelluláris fehérjék extracelluláris térbe való irányítására és patogénellenes hatásuk fokozására
KR20050114013A (ko) 고추 유래의 ＣａＯＤＣ1 유전자 도입 재조합 벡터 및이를 이용하여 형질전환된 식물병 저항성 향상 담배 변종식물체

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20030222