KR20050114013A - 고추 유래의 ＣａＯＤＣ1 유전자 도입 재조합 벡터 및이를 이용하여 형질전환된 식물병 저항성 향상 담배 변종식물체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 고추 유래의 CaODC1 유전자 도입 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 식물병 저항성 향상 담배 변종 식물체에 관한 것으로, 고추로부터 식물 병원균, 특히 잔토모나스 캄페스트리스 및 담배 모자이크 바이러스에 의한 병저항성 반응시 그 발현이 특이적으로 증가하는 신규한 오르니틴 디카르복실레이즈 유전자를 분리하여 이를 포함하는 식물 발현 재조합 벡터를 제작하고, 상기 재조합 벡터로 형질전환됨으로써 식물 병원균 및 환경 스트레스에 대한 저항성이 향상된 담배 변종 식물체를 제공하는 뛰어난 효과가 있으므로, 국민기호산업 및 식물종자산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Description

고추 유래의 ＣａＯＤＣ1 유전자 도입 재조합 벡터 및 이를 이용하여 형질전환된 식물병 저항성 향상 담배 변종 식물체{Novel recombinant vector introduced with CaODC1 gene from hot pepper and pathogen-resistant transgenic tabacco using thereof}

본 발명은 고추 유래의 CaODC1 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 이를 이용한 담배 변종 식물체에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 고추로부터 분리된 식물 병원균 저항성 발현 오르니틴 디카르복실레이즈 유전자(ornithine decarboxylase gene)를 포함하는 식물 발현 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터를 이용하여 형질전환된 식물 병원균 및 환경적 스트레스에 대한 저항성 향상 담배 변종 식물체에 관한 것이다.

유해한 해충 및 병원균에 의한 농작물의 침해로 인한 식량난으로 인류는 생존까지도 위협받고 있다. 이러한 문제를 해결하고 나날이 진화되어 새롭게 등장하고 있는 병원균으로부터 식물체를 보호하기 위한 다양한 방제법 중 가장 쉽고 간편한 식물병 방제법은 농약을 살포하는 것인데, 이는 맹독성이므로 유해 병원균 뿐만 아니라 주변 생태계 생물까지도 살상함으로써 생태계를 파괴시키고 토양 및 수질을 산성화시키는 등의 폐해가 있었다. 그에 따라 농약 살포 등의 화학적 방제수단 뿐만 아니라 식물의 환경 및 조건을 고려하여 물리적, 생물학적 방제법을 적용하여 저항성을 보유하는 식물 품종의 개발 및 육종에 의한 재배가 요구되어지고 있다.

이에 따라, 다양한 작물-병원균 상호작용을 응용한 병 저항성 작물의 육성 프로그램들이 진행되어 왔다. 집중적으로 연구되고 있는 작물로는 담배, 토마토 및 벼가 그 대표 사례라 할 수 있으며, 잡초의 일종인 애기장대풀은 식물병 저항성 연구를 위한 모델 식물로서 세계적으로 사용되고 있다. 담배, 토마토와 함께 가지과 식물인 고추는 우리나라에서 오랫동안 향신료, 양념 등으로 사용되어져 벼, 배추와 함께 우리나라 국민의 식단을 이루는 주된 작물 중의 하나이다. 고추 재배 중에 보고된 우리나라에서의 병 발생은 난균류에 의한 역병과 진균에 의한 탄저병, 세균에 의한 세균성 점무늬병 등이 보고되어 왔다. 이러한 현실에도 고추식물의 병 저항성 기작을 포함한 방어반응 및 환경적인 스트레스에 대한 반응에 대한 연구는 미비한 실정이다.

한편, 동물과 곰팡이에 있어서, 오르니틴 디카르복실레이즈(ornithine decarboxylase, 이하 ODC라 함)는 폴리아민 생합성 과정 중 첫번째 속도 제한 단계를 촉진시키는 피리독살 5'포스페이트 의존성 효소로서, 이 때, 폴리아민 생합성은 어디에나 존재하는 필수적 세포 생장 요소인 디아민 푸트레신(diamine putrescine)을 오르니틴으로부터 직접 생산하는 과정을 말하며(Jackson et al., 2000), 푸트레신은 폴리아민인 스페르미딘(spermidine)과 스페르민(spermine)의 전구체에 해당한다. 식물은 ODC의 역할과 폴리아민을 조사하는데 대한 흥미로운 진핵계를 제공하는데, 상기 식물계에는 중간생성물 아그마틴(agmatine)과 N-카르바모일푸트레신(N-carbamoylputrescine)의 생성을 수반하는 푸트레신 아르기닌 디카르복실레이즈(putrescine via arginine decarboxylase, 이하 ADC라 함)라는 또 다른 경로가 존재하기 때문이다(Walters, 2000). 상기 ODC 또는 ADC 경로에 의해 형성된 푸트레신은 스페르민과 스페르미딘 신세이즈에 의해 촉진되는 고분자 폴리아민(higher polyamines), 즉 스페르민과 스페르미딘의 생합성 과정에서 전구체로 작용하며, 상기 물질들은 니코틴산 또는 그것의 유도체로 응축되어 니코틴을 형성한다(Hashimoto and Yamada, 1994). 상기 디아민 푸트레신은 칼륨 부족, 낮은 pH, 제초제 처리 조건 하에서 마이크로몰 농도에서 밀리몰 농도까지 축적되는 것으로 알려져 있다. 상기 트리아민 스페르미딘과 테트라민 스페르민은 식물 세포에 편재해 있으며, 특히, 스페르민 처리는 산성 단백질 PR-1 뿐만 아니라 PR-2, PR-3 및 PR-5의 sccumulation을 증가시켰으나, 내생적인 SA 수준은 변화되지 않았다(Yamakawa et al., 1998).

폴리아민은 박테리아부터 식물 및 동물에 이르기까지 넓은 범위의 생물체에서 발견되는데, 특히 증식하는 세포에서 발견된다. 폴리아민은 핵산 합성을 활성화시킴으로써 세포의 생장 및 발달을 촉진시키는 것으로 생각되는 기초적이고 작은 분자로서(Walden et al., 1997), 높은 삼투압, 낮은 온도 및 낮은 pH 등 환경적 스트레스에 의해 내생적인 폴리아민이 증가된다고 보고된 바 있다(Tiburcio et al., 1986). 니코틴과 다른 알칼로이드의 합성 및 축적은 다양한 발달상의, 환경적, 화학적 신호에 의해 조절된다고 알려져 있다(Hashimoto and Yamada, 1994; Chou and Kutchan, 1998). 초식동물, 곤충 섭식, 다양한 미생물 및 진균 병원균에 의한 공격과 같은 생물적 요소 뿐만 아니라 상처, 가뭄 스트레스, pH 불균형과 같은 다양한 비생물적 요소도 담배 식물에서 니코틴과 다른 알칼로이드의 생산 증가를 유도하는 것으로 알려져 있다(Baldwin, 1989; Baldwin and Prestin, 1999).

또 한편, 식물은 재빠른 방어 반응, 이른바 과민성 반응(HR)을 유도함으로써 많은 식물병원균의 침입을 인식하고 이에 대해 저항하는데, 상기 과민성 반응은 감염 부위에서 국부적인 세포 및 조직의 사멸을 이끌어 냄으로써 감염의 확산을 저지시킨다. 최근의 증거는 이러한 세포 사멸이 종종 예정되어 있고 기주식물의 활발한 작용에 의해 비롯된다는 사실을 제시한다(Lam et al., 2001; Kuriyama and Fukuda, 2002). 상기 국부적인 반응은 종종 식물 전체를 통하여 비특이적인 저항성, 즉 전신 획득 저항성(systemic acquired resistance: SAR)으로 알려져 있는 현상을 유발시킨다. SAR은 비록 기본적인 메커니즘은 다르지만, 어떤 의미로는 포유동물에서의 면역에 비교될 수 있는 광범위한 미생물에 대한 정량적인 보호를 일컫는다(Sticher et al., 1997). 병원균의 공격에 대한 식물의 반응에는 활성산소종(reactive oxygen species) 및 항균성 2차 대사산물의 합성, 기주식물 세포벽의 목질화, 글루카이네이즈(glucanases), 키티네이즈(chitinases), 시오닌(thionins), 디펜신(defensins), 글루타치온-에스-트랜스퍼레이즈(glutathione-s-transferase), 리폭시게네이즈(lipoxygenases), 페니알라닌(phenyalanines), 암모니아라이에이즈(ammonialyases) 및 2차 대사 효소를 포함하는 수많은 유전자의 활성 등이 포함된다(Hammond-Kosack and Jones, 1996).

따라서, 본 발명자들은 TMV-P₀를 감염시킨 고추식물(hot pepper cv. Bugang)로부터 방어-관련 유전자를 동정하여 이를 이용하고자 하였으며, 이를 위해 감별법(differential screening)을 이용하여 방어-관련 단백질을 암호화하는 cDNA를 분리하고(Shin et al., 2001) 노던 블롯 분석을 통해 바이러스 또는 박테리아 병원균의 감염에 대한 저항성의 조건하에서 특이적으로 유도되는 오르니틴 디카르복실레이즈 유전자를 선별한 다음, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제작하고, 다시 상기 재조합 벡터를 이용하여 생물적 또는 환경적 스트레스에 대해 저항성이 향상된 형질전환 담배 식물체를 제공하고자 하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 고추식물로부터 식물병원균에 의한 저항성 반응시 그 발현이 특이적으로 증가하는 신규한 오르니틴 디카르복실레이즈 유전자를 분리하여, 이를 포함하는 식물 발현 재조합 벡터를 제공함에 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 생물적 또는 환경적 스트레스 저항성 향상 담배 변종 식물체를 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위해 본 발명은, 고추 유래의 오르니틴 디카르복실레이즈 유전자, CaODC1 유전자를 포함하는 재조합 벡터 pCAMBIA2300-CaODC1 및 상기 벡터로 형질전환된 담배 변종 식물체를 제공한다.

본 발명에서, CaODC1 유전자를 얻기 위한 고추 cDNA 라이브러리는 TMV-P₀를 접종한 잎으로부터 분리된 폴리(A)⁺ RNA로부터 구축하였는데, 여기서, 상기 고추는 TMV-P₀ 접종에 대해 과민성 반응(hypersensitive reaction)을 보이는 것으로, 결국 상기 라이브러리는 기주식물인 고추의 TMV 저항성 반응 동안 특이적으로 발현되는 유전자를 대표하는 mRNA로 가득차 있다. 상기 cDNA 라이브러리로부터 분리된 본 발명 고추 CaODC1 유전자는 436개의 아미노산 잔기를 암호화하며, 단백질의 위치를 지시하는 아미노 종결 시그널 펩티드를 갖고 있지 않은 것으로 추정된다. 한편, ODC를 암호화하는 유전자는 종종 여러 종에서 발견되는데, 그 유전자 계통은 정말로 복잡하다. 그러한 복잡성은 서던 블롯 분석에 의해 확인되었으며, 상기 블롯 결과는 몇몇 ODC 유전자, 적어도 토마토에서 2개 내지 4개(Alabadi et al., 2000), 산사나무 열매(thorn apple)에서 1개 이상(Michael et al., 1996), 그리고 보리에서 5개 내지 7개(Wang et al., 2000) 유전자의 존재를 보여주고 있다. 높은 스트린전시 컨디션(high stringency condition)에서, total genomic DNA를 겔 블롯한 결과 1개 또는 2개의 주요 밴드 및 몇 개의 작은 밴드를 탐지하였는데, 이러한 결과는 상기 CaODC1 유전자가 고추 게놈에서 적어도 2개 또는 3개의 카피로 존재함을 암시한다. 그러나, 낮은 스트린전시 컨디션(low stringency condition)에서의 혼성화는 상기 CaODC1 서열에 결합되어 있는 몇 개의 추가적인 genomic DNA를 더 밝혀내었으며, 상기 결과는 고추 게놈에 CaODC1과 멀리 관련되어 있는 추가적인 유전자 구성요소가 존재함을 제시한다(데이터 미제시).

다양한 식물 ODC 유전자에 대해 보고된 발현 양상은 굉장히 복잡한 양상을 띠며, 시간적, 공간적으로 조절되는 특징을 가진다. 예를 들어 ODC를 암호화하는 전사체는 식물의 뿌리부분에서는 높게 발현되나 꽃부분에서는 적은 양으로 존재한다고 밝혀져 있다(Alabadi and Carbonell, 1998). 이와 관련하여 본 발명의 CaODC1 유전자의 발현은 노던 블롯 분석결과 기관-특이적인 것으로 나타났다. 즉, 상기 CaODC1 유전자의 전사체는 고추식물의 줄기, 뿌리, 나이든 잎, 어린 잎에서는 존재하지 않거나 매우 낮은 수준으로 축적되었으나 꽃과 녹색 과일에서는 굉장히 높은 수준으로 탐지되었다.

본 발명에서는 접종된 식물에서 상기 전사체의 축적이 과민성 반응(HR) 동안의 특이한 병저항성 반응과 관련되는 것인지를 알아보기 위해, 과민성 반응을 보이는 식물과 그렇지 않은 식물에서 상기 전사체의 발현을 조사하였다. 그 결과 본 발명의 CaODC1 유전자는 TMV-P₀ 접종에 대한 과민성 반응 동안에 특이적으로 유도된다는 사실이 입증되었다. ODC의 활성은 20℃에서 TMV로 접종한 후 담배(Nicotina tabacum cv. Xanthi n.c.) 잎에서 20배 증가되었으며, 최대 활성의 출현은 국부적으로 괴사된 부분의 것과 유사하였다(Negrel et al., 1984).

한편, 식물 방어 유전자 발현은 개개의 신호전달경로에 의해 조절되며, 때때로 서로 다른 경로간의 크로스 토크(cross talk)에 의해 조절되기도 한다. 많은 유도 방어 유전자의 발현은 낮은 분자 질량을 갖는 적은 수의 신호 전달물질, 즉 자스몬산(jasmonic acid: JA), SA, 에틸렌 및 과산화수소(H₂O₂)에 의해 조절된다(Durner et al., 1997; Lamb and Dixon, 1997; Willmann, 2002; Overmyer et al., 2003). 담배에서, 몇몇 병생성 관련 단백질(pathogenesis related protein)을 암호화하는 유전자는 MeJA 및 에테폰(ethephon) 또는 MeJA 및 SA의 조합에 의해 상승적으로 유도된다(Xu et al., 1994; Biondi et al., 2001). 실험 결과, 본 발명 CaODC1 유전자의 전사체는 SA로 처리한 식물에서는 유도되지 않았다. 그러나 에테폰 및 MeJA 처리는 CaODC1 전사수준을 몇 배로 증가시켰다. 이상의 결과들은 본 발명의 CaODC1 유전자가 바이러스의 공격 뿐만 아니라 식물 호르몬 조절인자에 의해서도 유도될 수 있음을 암시한다. 담배 세포에서 MeJA는 ODC를 코딩하는 mRNA를 재빨리 유도하였다(Imanishi et al., 1998). CaODC1 유전자는 JA-의존적 신호전달경로와 에틸렌-의존적 신호전달경로 간의 크로스 토크(cross talk)에 관련되어 있는 유전자 중 하나에 의해 조절될 수도 있다. 종래 몇몇 연구는 방어 유전자의 발현 및 일부 병원균에 대한 저항을 이끌어내는 SA-독립적, JA-및/또는 에틸렌-의존적 신호전달경로의 존재를 밝힌 바 있다(Dong, 1998; Pieterse et al., 1998).

전신획득저항성(systemic acquired resistance:SAR)은 식물에서 병원균에 의해 유도되는 방어 메커니즘이다(Sticher et al., 1997). 주로 상기 저항적인 상태는 SA의 내생적 축적에 의존하며, 이른바 SAR 유전자라 불리우는 구성요소들의 활성화에 의해 특징지어진다. 상기 SAR 유전자는 병생성-관련(PR) 단백질을 암호화하는 유전자를 포함한다(Pieterse et al., 1996). 병원균에 의해 유도되는 SAR의 중요한 특징은 처리되지 않은 잎에서도 PR 유전자 발현이 활성화된다는 것이다(Uknes et al., 1993). 이와 관련하여 본 발명 CaODC1 유전자의 전신발현양상은 TMV-P₀ 접종 후 유도된 식물의 처리되지 않은 상부 잎에서 연구되었다. 상기 CaODC1 전사체의 접종 처리되지 않은 잎에서의 전신 축적은 접종 후 6일째부터 10일동안 유지되었다. 상기 발현 양상은 SAR 마커(marker)로 사용되는 PR-1 유전자의 발현양상과 유사하다(Pieterse et al., 1996). 이상의 결과들은 SA 처리에 의해 CaODC1 유전자가 유도되지 않는다는 사실과 함께, 스페르민(spermine)에 의한 산성 PR 단백질의 유도는 SA에 독립적이며, 상기 CaODC1 유전자의 발현은 신호로서의 스페르민을 통하여 바이러스에 대한 식물의 방어 메커니즘의 일부분으로 SAR에서 촉진됨을 제시한다.

상기 CaODC1 전사체는 또한 상처 처리(wounding treatment)에 의해 축적되었다. 그러나 흥미롭게도 이 상처 신호는 식물의 처리되지 않은 부분으로 전이되지 않았다. 식물에 상처가 생겼을 때, H₂O₂ 및 NO와 같은 ROS는 식물의 방어 시스템을 조정하기 위하여 생산되었다(Jih et al., 2003). PR-1 발현은 ROS 생산에서 세포내 변화 뿐만 아니라 세포외 변화에도 민감한 반면, ODC는 세포내 ROS 수준에 대해서만 민감한 것으로 제시되었다(Benaviades et al., 2000). 이러한 가능성은, ROS가 담배의 경우 세포외 메커니즘 뿐만 아니라 세포내 메커니즘을 통해서도 생산될 수 있음이 발견되었다는 점에서 흥미로운 것이다(Allan and Fluhr, 1997). 세포내 ROS 수준을 증가시키기 위하여 고추식물에 메틸 비올로겐(MV)를 처리하였다(Iturbe-Ormaetxe et al., 1998). 이러한 실험 조건 하에서, 상기 CaODC1 전사체는 매우 재빨리 유도되었다. 프리 폴리아민(free polyamine)과 접합 폴리아민(conjugated polyamine) 간의 교환이 있고, 상기 폴리아민의 접합(conjugation)은 식물세포에서 프리 폴리아민을 조절하는 수단이 될 것이다. 폴리아민 접합(polyamine conjugates)은 담배의 잎세포에서 페록시데이즈(peroxidase)에 대한 좋은 기질이 될 것으로 보여졌으며, 그러한 활성은 잎의 아포플라스트(apoplast)에서 과산화수소(H₂O₂)를 제거할 것이다. 슈퍼옥시데이즈(superoxidase)에 의해 발생되는 손상에 대한 외생적 폴리아민(exogenous polyamine)의 보호적인 효과는 상기 폴리아민의 접합하기 전 conversion에 의존한다(Hachiya et al., 1995). 이상의 결과들은 폴리아민이 식물에서의 상처, 소금, 삼투압, 가뭄 및 산화 스트레스에 관여하며(Flores, 1991), CaODC1 유전자가 또한 세포내 ROS에 의해 고추에서 유도됨을 제시한다.

폴리아민 농도와 오르니틴 및 아르기닌 디카르복실레이즈의 활성은 줄기녹병균(stem rust fungus)에 감염된 밀에서 증가되었다(Forster and Walters, 1992). 상기 TMV에 의해 유도되는 CaODC1 유전자가 다른 병원균에 대한 방어에도 관여하는지 여부를 알아보기 위해 고추식물을 병원성 박테리아 잔토모나스 캄페스트리스(Xanthomonas campestris)로 실험하였다(Ciardi et al., 2000; Gassmann et al., 2000). 잔토모나스 캄페스트리스에 대해 저항성인 고추 품종 20R(Capsicum annuum cv. 20R ECW)에서 상기 CaODC1 전사체는 CaPR1 전사체보다 훨씬 빨리 유도되었다. 상기 결과는 CaODC1 단백질이 일부 폴리아민의 축적에 의해 박테리아 병원균에 대한 저항성에 관여할지도 모른다는 사실을 암시한다.

유전자 발현 현상의 낮/밤 주기 패턴은 소위 낮주기(diurnal rhythm)라 불리우며, 주로 2개의 메커니즘에 의해 달성되는데, 첫째는 빛에 의해서고, 둘째는 프리-런닝 체내 주기 시계(free-running internal circadian clock)에 의해서이다(Schaffer et al., 2001; Yoo et al., 2002). 식물에서 생리적인 항상성은 일반적으로 특별한 단백질 또는 다른 물질의 주기 시계(circadian clock) 조절에 의해 유지된다. 상기 CaODC1 유전자는 또한 외부 스트레스로부터 식물을 보호하기 위하여 발현 수준을 유지하는 주기 시계 시스템(circadian clock system)에서 조절되는 것 같다.

ODC의 세포내 위치(subcellular localization)는 세포 유형-특이적으로 알려져 있고/있거나 세포의 생리학적 상태(생장, 분화, 악성 종양화(malignant transformation), 아포토시스(apoptosis))에 의존한다(Schipper and Verhofstad, 2002). 서로 다른 조직 유형에서 관찰되는 다양한 ODC의 분배 양상은 세포대사 및 생장에 있어서의 폴리아민의 다양한 역할에 의해 설명될 수 있을 것 같다. 비록 이러한 분배 양상은 다양하더라도, ODC의 세포화학적 위치는 대부분 세포질에 위치하는 것으로 보여졌다. 세포질에 있어서 상기 ODC/폴리아민의 상세한 기능적 역할은 여전히 해명되어야 할 필요가 있으나, 많은 연구결과는 폴리아민이 단백질 생합성 과정에서 필수적인 역할을 함을 제시한다. In vivo 타겟팅 실험은 CaODC1이 아라비돕시스(Arabidopsis) 원형질체 세포에서 사이토졸(cytosol)에 분포되어 있음을 보여주었다. 다른 ODCs와 마찬가지로 CaODC1의 세포내 위치는 고정적이지 않고 매우 유동적인 과정에 종속되어 있었다(Schipper and Verhofastad, 202). 상기 ODCs의 위치 및 조절의 복잡성을 밝히기 위해서는 살아있는 세포에서의 좀 더 많은 연구가 필요하다고 생각된다.

최근, 박테리아 또는 곰팡이 감염에 대한 식물의 방어를 조정하는 ODCs의 기능적 역할을 뒷받침하는 증거가 축적되어 왔다. 모델 시스템으로 고추를 사용함으로써 상기 유전자가 병원균에 대한 식물 방어에 기여하는 메커니즘이 밝혀질 것으로 기대된다. 본 발명의 CaODC1 유전자는 고추식물과 바이러스 또는 박테리아와의 불친화적 상호작용에 의해 특이적으로 유도되며, 따라서 적어도 바이러스 또는 박테리아 병원균에 대한 방어 반응경로에 관여함이 분명한 것으로 생각된다.

본 발명에서 담배의 형질전환에 사용되는 재조합 벡터는, 상기와 같은 특징을 갖는 CaODC1의 센스 및 안티센스 방향(sense and antisense orientation)으로 제작되는데, CaODC1 cDNA의 전체 서열을 pBluescript SK(-)로 삽입시키고 그 벡터를 다시 바이너리 벡터인 식물체 발현벡터 pCAMBIA2300(CAMBIA, USA)의 폴리링커 부위(polylinker site)로 서브클로닝함으로써 제작된다.

또한 상기 구조물을 아그로박테리움-매개 방법[Agrobacterium-mediated transformation method]을 이용하여 담배(Nicotiana tabacum cv. Samsun NN) 안으로 도입시킴으로써 담배 변종 식물체를 제조하며(Hoekema A, Hirsch P, Hooykaas PJJ, Schilperoort R, Nature, 303, 179-180(1983)), 이 때, 상기 아그로박테리움은 아그로박테리움 LBA4404, GV3101, A105 등을 이용할 수 있다.

본 발명 담배 변종 식물체의 무성번식 변종식물은 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환하여 획득한 담배 형질전환체의 종자로부터 공지의 방법에 따라 신초를 유기하거나 영양체로부터 캘러스를 형성함으로써 대량생산할 수 있다.

이하, 본 발명의 구성을 실시예를 들어 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 권리범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1: 고추 유래의 CaODC1 유전자의 분리 및 특성 조사]

제1단계. 식물 준비 및 병원균 접종

담배 모자이크 바이러스(TMV)의 P₀ 병원형에는 저항성을 가지나 P_1,2 병원형에 대해서는 감수성인 고추(Capsicum annuum L. cv. Bugang)를 본 발명의 식물재료로 사용하였다. 모든 식물은 25℃의 식물생장기(growth chamber) 또는 온실에서 1일 16시간 명조건, 8시간 암조건의 광주기 싸이클로 생장시켰다. 2달된 식물로부터 건강하고 잘 발달된 잎을 채취하여 병원균을 감염시키고 핵산을 추출하는데 이용하였다.

CaCl₂ 가 함유된 페트리디쉬 안의 감염된 담배잎(Nicotiana tabacum cv. Burley 21)으로부터 TMV-P₀ 스트레인을 유지시켰다. TMV-P₀ 에 감염된 상기 담배 잎에 인산 완충액(0.25M Na₂HPO₄, 5Mm EDTA)을 섞어준 후 갈아서 TMV-P₀를 함유하는 식물체의 수액(sap)을 준비하였다. 식물체에 접종하기 위하여 준비된 상기 수액을 50mM 인산 완충액(pH 7.0)이 포함된 카보런덤[carborundum; Hayashi Chemical, Japan]을 사용하여 고추식물의 잎표면에 도말하였다. 대조군 식물체에는 인산 완충액만을 도말하였다.

제2단계. DNA 및 RNA 분리 및 분석

Ausubel의 방법(1995)에 따라 고추 잎으로부터 게놈 DNA를 분리하였다. 서던 블롯을 수행하기 위하여, 상기 게놈 DNA 15㎍을 50 유닛의 제한효소와 하룻밤 동안 반응시켜 절단하였다. 상기 게놈 DNA의 절단을 위해 XbaⅠ, HindⅢ 및 EcoRⅠ 제한 효소가 사용되었으며, 제한 효소 반응은 37℃, 게놈 DNA, 5㎕의 10ⅹ반응 버퍼 및 적당한 제한 효소를 포함하는 50㎕의 혼합액에서 수행되었다. 절단된 상기 DNA 절편을 1ⅹTBE 버퍼에서 0.8% 아가로스 겔 전기영동한 후 10ⅹSSC의 나이트란 플러스 멤브레인(Nytran plus membrane)(Schleicher & Schuell, Germany)으로 전이시켰다. 게놈 DNA의 크기는 λ HindⅢ 마커를 분자 크기 표준으로 이용하여 측정하였다.

상기 Ausubel의 방법(1995)에 따라 두달 된 고추잎으로부터 총 RNA를 분리하였다. 노던 블롯 분석(Northern blot analysis)을 수행하기 위하여, 상기 총 RNA의 15㎍을 MOPS 버퍼(pH 7.0)에서 6% 포름알데히드를 포함한 1.0% 아가로스 겔 전기영동하고 나이트란 플러스 멤브레인으로 전이시켰다. 멤브레인 필터를 Church 버퍼(1% BSA, 0.25M disodium phosphate, pH 7.2, 1 mM EDTA, pH 8.0, 7% SDS) 조건 하의 하이브리드 튜브(hybrid tubes)에서 65℃, 3시간 동안 전혼성화(prehybridization) 하였으며, 혼성화 반응은 방사성 동위원소로 표지된 탐침을 이용하여 65℃에서 16시간 동안 수행하였다. 혼성화 반응 후, 그 멤브레인을 2ⅹSSC로 상온에서 15분, 0.1% SDS를 포함하는 0.2ⅹSSC로 상온에서 15분간 2회, 0.1% SDS를 포함하는 0.1ⅹSSC로 10분간 1회 세척하였다. 상기 멤브레인을 건조시킨 후 X-선 필름에 노출시키거나, BAS-2500 포르포르이메이저[phosphorimager; Fuji Photo Film, Japan]로 직접 관찰하였다.

전체 cDNA 또는 CaODC1-특이적 3'UTR 클론을 탐침으로 사용하였다. 탐침 준비를 위해, PCR 라벨링(PCR labeling) 또는 랜덤 라벨링(random labeling)을 사용하였다. 전형적인 PCR 라벨링 반응(labeling reaction) 혼합물에는 주형(100ng), 250μM dATP, dGTP 및 dTTP, 50μΜ dCTP, T7 프라이머(10 pmol), [α-³²P]-dCTP(3000 Ci/mmol)(Amersham Pharmacia Biotech, UK) 및 Taq 폴리머레이즈(Bioneer, Korea)가 포함되어 있다. 랜덤 라벨링(random labeling)의 주형은 10분 동안 열을 가한 후 재빨리 얼음에 방치하였다. Klenow 폴리머레이즈(Boerhinger Mannheim, Germany)를 제외한 모든 구성성분은 37℃에서 5분간 예열하였다. 예열 후, Klenow 폴리머라제를 상기 혼합물에 첨가하여 37℃ 인큐베이터에서 30분간 방치하였다. 상기 방사성 동위원소로 표지된 탐침은 QIAquick 뉴클레오티드 제거 키트(QIAquick nucleotide removal kit)(QIAGEN, USA)을 이용하여 세척하였다.

종래에 고추로부터 분리된 PinⅡ 탐침(designated CaPinⅡ, a 760 bp-length cDNA clone), 고추(Capsium annuum) 병생성-관련 유전자 1(designated CaPR-1, a 399 bp-length cDNA clone), 캅사이쿰 안늄 아스코르베이트 페록시데이즈 1(Capsium annuum ascorbate peroxidase 1)(designated CaAPX1, a 750 bp-length cDNA clone) 및 캅사이쿰 안늄 병생성-관련 유전자 4(Capsium annuum pathogenesis-related gene 4)(designated CaPR-4, a 697 bp-length cDNA clone)를 PCR에 의해 증폭시켰다(Lee et al., 2001; Park et al., 2001; Yoo et al., 2002).

여기에서, 상기 유전자들의 진뱅크 등록번호(GenBank accession number)는 각각 AF221097, AF244122, AY078080, AF053343이다. 탐침은 PCR 라벨링(PCR labeling)을 이용하여 [α-³²P]-dCTP로 표지되었다.

제3단계. 본 발명 CaODC1 유전자의 분리 및 특성 조사

1. 감별법(differential screening)에 의한 유전자 분리 및 cDNA 서열분석

본 발명자들은 전의 연구에서, TMV의 P_1,2 병원형에는 감수성이나 P₀ 병원형에는 저항성인 고추잎을 TMV-P₀로 감염시키고 그에 대한 저항성 반응(hypersensitive reaction: HR) 동안 높게 또는 낮게 조절되는 다양한 유전자의 cDNA를 감별법(differential screening)에 의해 분리한 바 있다(Shin et al., 2001). 상기 cDNA들 중 오르니틴 디카르복실레이즈 추정체를 암호화하는 유전자의 cDNA를 분리하여 CaODC1 이라 명명하였다. 상기 cDNA의 전체 핵산 서열을 모델 ABI 3700 자동 DNA 시퀀서(PE Biosystem, USA)에 의해 결정하였으며, DNA 서열 데이터는 레이저진 바이오컴퓨팅 소프트웨어(Lasergene Biocomputing Software)(DNASTAR, USA) 및 벡터 NTI 분석 프로그램(Informax, USA)를 이용하여 조합하였다. 데이터베이스 서치는 NCBI BLAST 및 PSI-BLAST 프로그램을 이용하여 수행되었다(Altschul et al., 1990 and 1997).

2. 분자모델링

모델 개발(model development) 및 개량(refinement) 연구는 Accelrys 사(USA)의 인사이트 Ⅱ 수트(Insight Ⅱ suite)를 이용하여 수행하였다. 분자 역학 계산(molecular mechanics calculations)은 디스커버 모듈(Discover module) 및 CFF 파라미터 세트의 변형된 버전을 이용하여 수행하였다. 상기 CaODC1 모델은 기존에 개발된 Trypanosome Brucei 오르니틴 디카르복실레이즈 모델(1F3T and 2TOD)을 주형으로 이용하는 상동 모듈(Homology module)에서의 상동 모델링 테크닉(homology modeling techniques)을 이용하여 개발되었다(Grishin et al., 1999; Jackson et al., 2000). 첫번째 단계에서, 상기 CaDOC1 염기서열은 쉽게 정렬되었는데, 이는 ODCs를 교차하여 고도로 보존되는 각 나선형(helix)에서의 잔기의 존재 때문이다. 두번째 단계에서, 상기 좌표는 동일한 잔기의 전체 주사슬(mainchain) 및 곁사슬(sidechain)에 대해 동일하게 전이되었다. 상기 서로 다른 잔기의 곁사슬(sidechain)은 나선형 환경(helical environment)에서 주사슬(mainchain)을 위한 저에너지 회전이성질체(rotamer) 라이브러리로부터 구축되었다. 주사슬은 고정시킨 상태에서 곁사슬을 최소화시킴으로써 최종 모델을 얻었다. Clustal W 알고리즘을 이용한 서열 분석(Thompson et al, 1994)은 상기 CaODC1과 TbODC 간에 40%의 서열 상동성과 58%의 서열 유사성이 있음을 밝혀내었다.

본 발명 CaODC1 cDNA 클론의 핵산서열 및 아미노산 서열, 그리고 CaODC의 리본 다이어그램(ribbon diagram)을 도 1에 나타내었다. 도 1에서, 상기 CaODC1 유전자는 약 47.9 kDa의 분자질량을 갖는 436개 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드를 암호화하는 1308 bp 길이의 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을 포함하고 있었다(도 1A 참조). 또한, ATG 코돈(tccgaatggc) 주변에 -1, +1, +2 위치의 염기는 식물에서 시작 코돈(start codon)을 둘러싸고 있는 보존서열과 일치하였다(Joshi et al., 1997). 상기 cDNA의 5'UTR은 40 bp 길이였으며, 3'UTR은 82 bp 길이였다. 상기 CaODC1 단량체(monomer)는 두개의 도메인, 즉 N-종결 β/α-배럴 도메인(N-terminal β/α-barrel domain) 및 C-종결 변형 그리크 키 β-시트 도메인(C-terminal modified Greek key β-sheet domain)으로 구성되어 있었다(도 1B 참조). K98에 의해 대표되는 라이신 잔기는 보존서열 FYAVKC에서 보조인자로서 PLP와 함께 쉬프-베이스(Schiff-base)를 형성하고 있었다(도 1B, C 참조). ODC에서 촉매자리 내부에 기질 특이성 루프(substrate specificity loop)의 일부분을 형성하는 시스테인(C380)은 보존서열 FGPTCDALD에서 380번 자리에 위치하고 있었다(Poulin et al., 1992; Jackson et al., 2000). 상기 보존잔기 리신 및 시스테인은 CaODC1가 ODC의 푸트레신 특이성을 나타내는데 있어서 중요하다.

한편, 본 발명 CaODC1 cDNA의 아미노산 서열과 다른 식물종으로부터 분리한 ODC 유전자들의 아미노산 서열을 비교한 결과, 성숙한 단백질에서 높은 아미노산 동일성을 보였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에서 아미노산 서열을 비교하는데 쓰인 다른 종의 ODC 서열은 독말풀(jimsonweed; S64704), 토마토(Lycopersicon esculentum; AAC61845), 담배(Nicotiana tabacum; BAA14049), 담배(Nicotiana glutinosa; AAG45222), 사람(human; DCHUO) 유래의 ODC 서열을 준비하였으며(이 때, 보존영역은 박스로 표시함), 정렬은 DNASTAR의 레이저진 소프트웨어(Lasergene software)의 클러스탈 방법(clustal method)을 이용하여 수행하였다.

본 발명 유전자는 아미노산 서열 수준에서 토마토의 ODC 유전자(GenBank accession number X81376)에 86%의 전체 서열 동일성을 보였으며, 담배의 ODC 유전자(GenBank accession number U15933)에는 74%의 서열 동일성을 보였다. 인간의 클론과는 더 낮은 동일성이 관찰되었다(Hickok et al., 1987).

제4단계. 본 발명 CaODC1 의 게놈 조직 및 기관-특이적 발현 조사

(1) 고추(Capsicum annuum cv. Bugang)로부터 분리한 게놈 DNA를 XbaⅠ(X), HindⅢ(H), EcoRⅠ(E)의 각 제한효소로 절단한 후 상기 절편들을 아가로스 겔에서 분리하였다. 서던 블롯 분석을 위해 상기 DNA 절편을 나일론 멤브레인에 전이시킨 후 60℃ 조건하에서 ³²P 표지된 CaODC1 전체 탐침(full-length CaODC1 probe)으로 혼성화를 수행하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었는바, 도 3에서 이동 위치의 DNA 크기 기준은 왼쪽에 표시하였다. 60℃의 높은 스트린전시 조건(stringency condition) 하에서 실험한 결과, 1개 또는 2개의 주요 밴드 및 몇 개의 작은 밴드를 탐지하였는데, 이러한 결과는 상기 CaODC1 유전자가 고추 게놈에서 적어도 2개 또는 3개의 카피로 존재함을 암시하였다. 그러나, 낮은 스트린전시 컨디션(low stringency condition)에서의 혼성화는 상기 CaODC1 서열에 결합되어 있는 몇 개의 추가적인 genomic DNA를 더 밝혀내었으며, 상기 결과는 고추 게놈에 CaODC1과 멀리 관련되어 있는 추가적인 유전자 구성요소가 존재함을 제시하였다(데이터 미제시).

(2) 다양한 식물 기관 및 조직에서의 CaDOC1 유전자의 고정된 상태에서의 발현(steady state expression)을 조사하기 위하여, 고추식물의 푸른 고추(익지 않은 고추), 빨간 고추(다 익은 고추), 꽃, 어린 잎, 나이든 잎, 뿌리 및 줄기로부터 총 RNA를 추출하여 노던 블롯 분석을 수행하였다. 상기 RNA를 겔-블롯팅한 후 특이적 탐침으로 ³²P 표지된 CaODC1 cDNA의 3' UTR을 이용하여 혼성화하였다. 그 결과를 도 3B에 나타내었다. 도 3B에서, F는 꽃기관, S는 줄기, R은 뿌리, RF는 붉은 고추(다 익은 고추), GF는 푸른 고추(익지 않은 고추), OL은 나이든 잎, YL은 어린 잎을 의미하며, 에티디움 브로마이드 염색된 겔에서의 rRNA 밴드를 로딩 컨트롤(loading control)로써 나타내었다. 상기 CaODC1 전사체는 꽃과 고추에서 풍부하게 축적되었으며, 특히 다 익은 빨간 고추보다 익지 않은 푸른 고추에서 그 수준이 더 높았다. 상기의 결과는 분석된 모든 조직 및 기관에서 그 발현이 탐지되고 특히 뿌리에서 가장 높은 발현이 탐지되는 다른 식물 ODCs의 발현양상과는 다소 차이가 있는 결과였다(Michael et al., 1996; Alabadi and Carbonell 1998; Wang et al., 2000).

제5단계. 과민성 반응 동안 CaODC1 유전자의 차별적 발현양상 조사

1. TMV-P ₀ 또는 TMV-P _1,2 접종에 의한 본 발명 CaODC1 유전자의 발현양상

TMV-P_1,2 감염에 대해 감수성인 고추식물(Capsicum annuum cv. Bugang)을 TMV-P₀ 또는 TMV-P_1,2 로 접종한 후 본 발명 CaODC1 유전자의 발현양상을 조사하였다. 고추 잎을 TMV-P₀ 또는 TMV-P_1,2 수액으로 접종한 후 0시간, 1시간, 6시간, 24시간, 48시간, 72시간 및 96시간이 되었을 때 감염된 고추 잎으로부터 총 RNA를 추출하여 노던 블럿 분석을 수행하였다. 종래 상처가 일부 방어 관련 유전자를 유도함이 보고된 바 있으므로, 카보런덤(carborundum)을 사용하여 도말하는 과정에서 상처에 의해 CaODC1 유전자가 유도 발현되는 가능성을 제거하기 위해 인산완충액만으로 도말한 무처리 대조군으로 준비하였다. 양성 대조군으로는 CaPR-1 유전자를 사용하였다. 그 결과를 도 4A에 나타내었다. TMV-P₀ 접종에 대한 고추식물의 증상발달은 이미 입증된 바 있는데(Shin et al., 2001), 그와 같이 CaODC1 전사체는 TMV-P_1,2로 접종한 잎에서는 접종 후 24시간째에 축적되기 시작해서 96시간이 될 때까지 높은 수준으로 유지되었다. 한편, 양성 대조군인 CaPR-1 유전자의 경우에도 강한 유도는 접종 후 24시간째에 시작되었는데, 이러한 결과는 TMV-P₀ 접종처리가 유도인자의 역할을 하였고, 본 발명 CaODC1이 CaPR-1과 동일한 과민성 반응 특이적 발현 양상을 보여줌을 암시하였다.

2. 전신 유도 여부

과민성 반응 및 전신획득저항성(systemic acquired resistance: SAR)은 식물에서 병원균에 의해 유도될 수 있는 방어 메커니즘이다(Sticher et al., 1997). 병원균에 의해 유도되는 SAR의 중요한 특징은 처리되지 않은 잎에서도 PR 유전자의 발현이 활성화된다는 것이다(Uknes et al., 1993). 이에 본 발명 CaODC1 유전자의 유도가 전신적으로 일어나는지 여부를 조사하기 위해, 고추식물의 하부잎 2장을 TMV-P₀ 수액으로 접종한 다음 접종 후 0일, 3일, 6일, 9일 및 15일째에 상기 고추식물의 상부잎을 떼어내어 그로부터 총 RNA를 추출하였다. 이 때, CaPR-1 유전자를 양성 대조군으로 하여 같이 조사하였다. 노던 블롯 분석 결과를 도 4B에 나타내었다. 도 4B에서, CaODC1 유전자는 멀리 떨어진 잎에서 접종 후 6일째에 최대 발현수준을 보여주었으며, 상기 CaODC1의 유도는 접종후 9일째까지 계속되었다. 이러한 CaODC1 유전자의 시간경과에 따른 전신적 유도양상은, 많은 병원균에 의해 전신적으로 유도되는 것으로 알려져 있는 PR-1 계 유전자에 속하는 CaPR-1 유전자의 양상과 거의 동일한 것이었다(Penninckx et al., 1996).

3. 박테리아 병원균의 접종에 대한 CaODC1 유전자의 발현양상

고추품종 ECW 20R은, 또다른 근연-유전자형인 ECW(Early Calwonder) 계통이 잔토모나스 캄페스트리스 3(X. campestris pv. vesicatoria race 3)에 대해 완전히 감수성인데 반해, 그에 대한 저항성 유전자 Bs2를 운반한다(Ciardi et al., 2000). 식물에서 TMV-P₀에 의해 유도될 수 있는 CaODC1 유전자가 다른 병원균에 대한 방어 반응에도 관여하는지 여부를 조사하기 위해, 고추잎을 병원성 박테리아 잔토모나스 캄페스트리스(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria(Xcv))로 실험하였다. 잔토모나스 캄페스트리스에 저항성인 고추품종(ECW 20R)과 감수성인 고추품종(ECW)에 상기 Xcv 배양액을 침투시키고, 접종 후 0시간, 4시간, 8시간, 12시간, 24시간 및 36시간이 되었을 때마다 각각 감염된 잎으로부터 총 RNA를 추출하였다. 상기 RNA를 포름알데히드-아가로스 겔에서 분리한 후 ³²P-표지된 3'CaODC1-특이적 cDNA 탐침으로 혼성화 반응을 수행하였다. CaPR-1 유전자를 상기 Xcv-접종에 대한 양성대조군으로 사용하였으며, 에티디움 브로마이드 염색된 겔에서의 rRNA 밴드를 로딩 컨트롤로써 나타내었다. 그 결과를 도 4C에 표시하였다. 상기 노던 블롯 분석은 상기 고추 CaODC1 유전자에 상응하는 전사체가 20R 품종의 잎에서 우선적으로 축적됨을 보여주었고, 상기 박테리아 감염 동안 과민성 세포사멸을 보여주었다. 상기 CaODC1 전사체는 감염후 4시간째에 축적되기 시작했으며 8시간째까지 계속적으로 증가하였다. CaODC1의 유도가 박테리아 증식으로 인해 생기는 세포 사멸의 직접적인 결과인지의 여부는 밝혀져야 할 과제로 남아 있으나, 상기의 데이터는 CaODC1 유전자가 바이러스 및 박테리아를 포함하는 넓은 범위의 병원균에 대한 과민성 반응에 관여할 것이라는 가정을 뒷받침한다. 비슷하지만 좀 더 늦은 유도양상이 CaPR-1 유전자에서도 관찰되었다.

제6단계. 다양한 화학물 및 상처 처리에 의한 CaODC1 유전자의 발현양상 조사

본 발명 CaODC1 유전자를 유도하는 신호전달경로를 이해하기 위해서, 고추 잎을 다양한 화학적 유도인자로 처리하고 지정된 시간마다 상기 고추잎으로부터 RNA를 추출하여 노던 블럿 분석을 수행하였다. 모든 노던 블럿 분석에 있어서, RNA는 포름알데히드-아가로스 겔에서 분리하였으며, ³²P-표지된 3' CaODC1-특이적 탐침으로 혼성화 반응을 수행하였다. 에티디움 브로마이드 염색된 겔에서의 rRNA를 로딩 컨트롤로써 나타내었으며, 모든 실험은 3번씩 반복 수행되었다.

1. 에테폰(ethephon) 처리

대략 두달 된 고추식물의 잎에 10mM 에테폰 용액을 처리하고, 총 RNA 추출을 위해 지정된 시간마다 상기 고추를 추수하여 재빨리 질소용액으로 동결시켰다. 상기 고추는 -80℃에서 저장하였다. 다른 식물체 대조군에는 dH₂O로 유사하게 처리하였으며, 상기 에테폰 처리에 대한 양성 대조군으로는 CaPR-1 유전자를 사용하였다.

그 결과를 도 5A에 나타내었다. 도 5A에서, CaODC1 발현은 에테폰 처리 후 2시간째부터 증가하였으며, 4시간째에 최대 수준에 도달하였다. 그에 반해 CaPR-1 유전자 발현은 18시간째부터 증가하여 36시간째에 최대 수준에 도달하였다. 이러한 결과는 CaODC1 전사체가 양성 대조군으로 사용된 CaPR-1과 마찬가지로 에테폰 처리에 의해 축적됨을 나타내는 것이다.

2. 메틸자스몬산(MeJA) 처리

CaODC1 유전자가 메틸 자스몬산 처리에 의해 유도되는지를 조사하기 위해, 50μM 메틸자스몬산을 상기와 동일한 방법으로 처리하였다. 양성 대조군으로는 메틸자스몬산 처리에 의해 유도되는 것으로 보고된 바 있는(Lee et al., 2001; Park et al., 2001) CaPR-4 유전자를 사용하였다. 그 결과를 도 5B에 나타내었다. 이 경우에도, CaODC1 유전자의 발현은 재빨리 탐지되었으며, 처리 후 4시간째에 최대 수준에 도달하였다.

3. 메틸 비올로겐(MV) 처리

활성 산소종(reactive oxygen species: ROS) 또한 식물 방어 반응에 있어서 신호물질로 작용한다고 알려져 있으므로(Mittler et al., 1999), CaODC1 발현에 대한 활성 산소종의 영향을 조사하기 위하여, 고추식물에 활성 산소종을 생성하는 것으로 알려져 있는 메틸 비올로겐(MV)를 처리하였다(Iturbe-Ormaetxe et al., 1998). 0.5mM 메틸 비올로겐 용액에 뿌리째 뽑은 고추식물을 흠뻑 적신 후, 총 RNA를 추출하기 전 다양한 시간 동안 동일한 용액을 이용하여 상기 고추잎에 도말하였다. 무처리 대조군은 추출 버퍼(extraction buffer)으로 유사하게 처리하였으며, 양성 대조군으로는 CaAPX1 유전자를 사용하였다. 그 결과를 도 5C에 나타내었는바, 상기 CaODC1 전사체 발현은 메틸 비올로겐 처리 후 6시간째에 유도되어서 36시간이 될 때까지 지속되었다.

4. 절개 상처 처리(incision-wounding treatment)

본 발명 CaODC1 유전자가 상처 처리에 의해 국부적으로 또는 전신적으로 유도되는지를 조사하기 위해, 고추식물의 하부잎을 가위로 절개한 후 각각 0시간, 3시간, 6시간, 12시간, 24시간, 48시간, 72시간이 되었을 때마다 동일한 고추식물의 상처처리되지 않은 상부잎을 떼어내었다. 무처리 대조군은 추출 버퍼(extraction buffer)로 유사하게 처리하였으며, 양성 대조군으로는 국부적 및 전신적 상처에 의해 유도되는 것으로 알려져 있는 프로테아제 저해제 Ⅱ(CaPinⅡ)를 사용하였다.

노던 블럿 분석 결과, 도 5D에 나타낸 바와 같이, 상기 CaODC1의 유도는 상처 처리 후 3시간째에 현저히 축적되어 12시간이 될 때까지 계속되었다. 그러나, 이러한 상처 신호는 식물의 상처 처리되지 않은 부위로까지 전이되지는 않는 것으로 판단되었다.

5. 살리실산(SA) 처리

최근의 연구결과에 따르면, 살리실산(SA) 처리는 산화 스트레스의 원인이 되고, 그에 따라 항산화효소의 발현을 유도한다고 한다(Fodor et al., 1997). 살리실산(SA)은 병원균의 공격에 대한 식물의 방어 기작을 활성화시키는 일련의 신호전달체계의 중요한 구성요소 중 하나이다(Durner et al., 1997). 또한, SA 처리는 다양한 식물에 있어서, PR-1 유전자를 포함한 많은 방어 유전자의 발현을 유도하는데 효과적인 방법이다(Penninckx et al., 1996; Yang et al., 1997). 따라서, CaODC1 유전자가 살리실산 처리에 의해 유도되는지를 조사하기 위해, 고추잎에 5mM 살리실산 용액을 상기 1단계에서와 동일한 방법으로 처리하였다. 이에 대한 양성대조군으로는 CaPR-1 유전자를 사용하였다. 노던 블럿 분석결과, 본 발명 CaODC1 전사체는 도 5E에서 알 수 있듯이 살리실산 처리에 의해서는 유도되지 않았다.

6. 앱시스산(ABA) 및 염화나트륨(NaCl) 처리

본 발명 CaODC1 유전자가 앱시스산(abscisic acid: ABA) 또는 염화나트륨(NaCl)에 의한 가뭄 스트레스 또는 염스트레스에 반응하는지를 조사하기 위해, 고추 식물을 10μM 앱시스산 또는 250mM 염화나트륨으로 처리하였다. 무처리 대조군에는 dH₂O를 유사하게 처리하였으며, 염스트레스에 대한 ABA-의존성 저항반응에 관여하는 것으로 알려져 있는(Savoure et al., 1997; Strizhov et al., 1997) AtP5CS 탐침을 상기 염처리에 대한 양성 대조군으로 사용하였다. 그러나, 상기 CaODC1 전사체는 ABA 또는 NaCl 처리에 의하여 유도되지 않았다(데이터 미제시).

제7단계. 일주기성 조절(circadian regulation)에 의한 낮동안 CaODC1 유전자의 발현양상 조사

노던 블롯 분석에 있어서, CaODC1 전사체는 대부분의 경우 심지어 처리되지 않은 고추잎에서도 처리 후 6시간째가 되면 발현되는 경향이 있었다. 따라서, 상기 CaODC1 유전자가 하루주기 동안 일주기성 조절하에 있는지를 알아보기 위해, 고추식물을 25℃ 온실에서 1일 16시간 명조건/8시간 암조건의 광주기로 생장시킨 후 0시간부터 48시간까지 2시간 간격으로 추수하여 총 RNA를 추출하였다. 상기 RNA를 포름알데히드-아가로스 겔에서 분리한 후 ³²P-표지된 3' CaODC1-특이적 탐침을 혼성화하여 RNA 블럿 분석을 수행하였다. 에티디움 브로마이드 염색된 겔에서의 rRNA 밴드를 로딩 컨트롤로써 나타내었으며, 아라비돕시스의 cAPX 전사체와 유사하게 아침에 유도되는 CaAPX1 유전자를 양성 대조군으로 사용하였다(Schaffer et al., 2001; Yoo et al., 2002).

그 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6을 보면, 본 발명 CaODC1 mRNA의 일주기성 변동은 낮시간 동안 12시부터 22시까지 고추식물의 잎으로부터 탐지되었다. 반면 양성 대조군으로 사용된 CaAPX1 전사체는 낮시간 동안 10시부터 12시까지 유도되었다.

제8단계. CaODC1::smGFP 융합 단백질의 세포내 위치(subcellular localization) 탐색

연구되는 세포 또는 조직의 종류에 의존하는 세포 수준에서의 ODCs의 서로 다른 위치 양상은 이미 보고된 바 있다(Schipper and Verhofstad, 2002). 상기 양상들은 오직 세포질에만 위치하는 경우부터 세포질 및 핵 모두에 위치하는 경우까지 다양했다. 따라서 CaODC1의 세포내 위치를 조사하기 위해, CaODC1::smGFP 융합 단백질을 이용한 in vivo 타겟팅 실험을 수행하였다. 이 때, 대조군으로는 smGFP 단백질의 형광성을 사용하였다.

1. In vivo 타겟팅 실험을 위한 CaODC1::smGFP 융합 단백질의 제조

먼저, CaODC1 cDNA의 종결 코돈을 하기의 유전자-특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용한 PCR을 수행함으로써 얻을 수 있었다.

5'-ggatccatggccggccaaacagttattgtttccgg-3'

5'-cctaggacttggataagcataagcaaggtga-3'

상기 종결 코돈이 없는 PCR-증폭 산물(CaODC1 코딩 영역)을 smGFP 코딩 영역의 C 말단과 인-프레임(in-frame) 융합하여 CaODC1::smGFP 융합 구조물을 제작하였다(Park et al., 2002). 상기 CaODC1::smGFP 융합 구조물을 35S-CaMV 프로모터 및 Nos-ter(nopaline synthease terminator)의 조절하에 pCAMBIA2300 벡터(CAMBIA, USA) 안으로 도입하였다. 그 개략도를 도 7A에 나타내었다.

2. 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol)-매개 원형질체 형질전환 및 일시적 발현분석

플라스미드 DNA를 제조자의 지시에 따라 플라스미드 맥시 키트(Plasmid Maxi Kit)(QIAGEN, USA)를 이용하여 정제하였다. 상기 CaODC1::smGFP 융합 구조물을 폴리에틸렌 글리콜-매개 형질전환 과정(Jin et al., 2001)에 의해 모든 종자로부터 준비된 아라비돕시스(Arabidopsis) 원형질체에 도입하였다. 간단하게 말하면, 온실안 토양에서 생장한 3 내지 4주된 아라비돕시스 식물의 잎조직 5g을 면도칼을 이용하여 5~10mm² 크기로 작게 절단한 다음 50㎖의 효소용액[0.25% Macerozyme(Yakult Honsha Co., Japan), 0.1% Cellulase(Ykult Honsha Co., Ltd.), 400mM 만니톨(mannitol), 8mM CaCl₂, and 5mM Mes-KOH, pH 5.6]으로 22℃에서 5시간 동안 50~75rpm으로 배양하였다. 배양 후 상기 원형질체 현탁액을 100nm 메쉬로 여과한 다음 5분 동안 46g에서 원심분리하였다. 상기 과정에 의해 침전된 원형질체를 5-10 ㎖의 W5 용액(154 mM NaCl, 125mM CaCl₂, 5mM KCl, 5mM 글루코스 및 1.5mM Mes-KOH, pH 5.6)에서 재현탁한 후 20㎖의 21% 수크로스 위에 주입하고 78g에서 10분동안 원심분리하였다. 경계면의 손상되지 않은 원형질체를 W5 용액 20㎖가 함유된 새 팰콘 튜브(Falcon tube)로 전이시켰다. 상기 원형질체를 다시 55g에서 5분 동안 원심분리하여 침전시킨 후, 20㎖의 W5 용액에서 재현탁하였다. 그 다음 상기 원형질체를 얼음에서 30분 동안 방치하였다. DNA를 원형질체 안으로 형질전환하기 위해, 원형질체를 46g에서 5분 동안 다시 침전시킨 후 MaMg 용액(400mM 만니톨, 15mM MgCl₂, 5mM Mes-KOH, pH 5.6)에서 5ⅹ10⁶ 원형질체/㎖ 의 밀도로 재현탁하였다. 플라스미드 DNA(2㎎/㎖의 농도에서 총 20-50㎍)를 300㎕의 원형질체 현탁액에 첨가한 후 325㎕의 PEG 용액(400mM 만니톨, 100mM Ca(NO₃)₂, 40% 폴리에틸렌 글리콜 4000)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 부드럽게 휘저은 후, 실온에서 30분간 방치하였다. 그 다음 상기 혼합물을 10㎖의 W5 용액으로 희석하였다. 원형질체를 50g에서 5분간 원심분리하여 재생시킨 후, 3㎖의 W5 용액에서 재현탁시키고, 22℃의 암조건에서 방치하였다. 상기 융합 구조물의 발현을 형질전환 후 다양한 시간대마다 Zeiss Axioplan 형광현미경(Jean, Germany)를 이용하여 조사하였으며, 그 이미지는 CCD 카메라(cooled charge-coupled device camera)를 이용하여 촬영하였다. 필터 셋트는 녹색 형광 단백질 및 자기형광 엽록소(autofluorescence of chlorophyll)에 대해 각각 XF116(exciter, 474F20; dichroic, 500DRLP; emitter, 510AF23) 및 XF137(exciter, 540AF30; dichroic, 570DRLP; emitter, 585ALP)(omefa Inc., USA)를 사용하였다.

그 결과를 도 7B에 나타내었다. 도 7B에서, a 및 e는 명시야상(bright-field images: Birght), b 및 f는 엽록소(chlorophyll:red), c 및 g는 형질전환된 원형질체에서 GFP, d와 h는 GFP(green) 및 엽록소(red)의 겹친 부분을 보여주는 것으로서, 이들 데이터는 형질전환 후 24시간째에 상기 융합 단백질이 발현된 원형질체의 대표적인 데이터이다. 도 7B에서 보여지듯이, 상기 CaODC1::smGFP의 녹색 형광 신호는 아라비돕시스 원형질체에서 사이토졸에 분포하였으며, 대부분의 녹색 형광 신호는 엽록체에서 빽빽하게 중첩되었다. 그러나 흥미롭게도, 대부분의 CaODC1 녹색 형광 신호와 smGFP의 녹색 형광 신호는 세포 막에서는 중첩되지 않았다.

[실시예 2: CaODC1 을 삽입한 식물 발현 재조합 벡터의 제조]

본 목적을 위하여, 상기 실시예 1에서 얻은 CaODC1 cDNA의 전체 서열을 CaMV35S 프로모터의 조절 하에서 pBluescript SK(-)로 삽입시키고 그 벡터를 다시 바이너리 벡터(binary vector)인 식물체 발현 벡터 pCAMBIA2300(CAMBIA, USA)의 폴리링커 부위(polylinker site)로 서브클론하였다. pCAMBIA2300 벡터를 SmaⅠ으로 절단하여 CaODC1 cDNA를 SmaⅠ으로 절단한 절편과 접합시킨 후 EcoRⅠ으로 절단하여 상기 재조합 플라스미드의 orientation을 결정하고 pCAMBIA2300-CaODC1으로 명명한 후 그 개열지도를 도 9에 나타내었다.

[실시예 3: 본 발명 담배 변종 식물체의 제조 및 무성번식]

상기 실시예 2에서 제작한 재조합 벡터 pCAMBIA2300-CaODC1을, 동결-해동법(freeze-thaw method; An, G. et al., (eds) Plant Molecular Biology Manual, pp. A3/1-A3/19, Kliwer Academic Publishers, Dordrecht(1998))에 따라 이원 Ti 플라스미드 pAL4404(Hoekema A, Hirsch P, Hooykaas PJJ, Schilperoort R, Nature, 303, 179-180(1983))를 포함하는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404에 전이시킨 다음(Hoekema A, Hirsch P, Hooykaas PJJ, Schilperoort R, Nature, 303, 179-180(1983)), 상기 전이된 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA4404를 이용하여 식물체의 재분화를 유도하는 방법으로 담배 변종 식물체를 제조하였다.

제한 효소는 Promega사로부터 구입하였고, Taq DNA 폴리머라제는 바이오니어(Bioneer)에서, 항생제는 Duchefa, 나머지 것들은 전부 Sigma 제품을 사용하였다.

제1단계. 담배식물의 준비

담배(Nicotiana tabacum cv. Samsun NN) 종자를 100% 에탄올로 1분간 2번 소독, 멸균 증류수로 2번 세척, 2% 하이드로클로라이드(hydrochloride)로 5분간 소독 후 증류수로 4회 세척하여 사용하였다. 상기 소독한 종자를 MS 염 4.3g/L, 3% 수크로스 30g/L, 비타민 B₅ (×1000) 1㎖ 및 0.4% 파이타젤(phytagel) 4g/L를 첨가한 MS 배지에서 발아시켰다. 이 때, 25℃에서 16시간 동안 조도 2,000Lux로 광조사하였다. 첫잎이 나기 전 11일된 유묘에서 절단한 자엽 이식편(Cotyledon explant)을 실험에 사용하였다.

제2단계. 아그로박테리움을 이용한 담배식물의 형질전환

상기 실시예 2에서 제작한 재조합 벡터 pCAMBIA2300-CaODC1을, 동결-해동법(freeze-thaw method; An, G. et al., (eds) Plant Molecular Biology Manual, pp. A3/1-A3/19, Kliwer Academic Publishers, Dordrecht(1998))에 따라 이원 Ti 플라스미드 pAL4404(Hoekema A, Hirsch P, Hooykaas PJJ, Schilperoort R, Nature, 303, 179-180(1983))를 포함하는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404에 전이시킨 다음(Hoekema A, Hirsch P, Hooykaas PJJ, Schilperoort R, Nature, 303, 179-180(1983)), 상기 전이된 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA4404를 상기 제1단계에서 사용했던 배지 조성에 가나마이신을 더 첨가한 배지에서 2일 동안 배양하여 준비하였다.

상기 제1단계에서 얻은 자엽 이식편을 4주 배양한 결과 정상적인 신초와 눈이 발생하였으며, 이것을 다시 빈 플레이트에 MS 염, 2% 자당, 비타민 B₅, NAA 및 BAP를 첨가한 신초성장배지(가나마이신은 첨가하지 않음)에 2일간 치상하고 2일간 전배양한 후 상기 배양한 아그로박테리움 형질전환균주를 접종시켜 2일간 동시배양을 수행하였다.

치상된 신초들을 멸균수로 3회 헹궈 200㎎/L의 가나마이신, 250㎎/L의 카르베니실린(carbenicillin) 및 파이타젤 4g/L가 함유된 재분화 배지에서 재분화시켰다. 3주후 재분화되어 생겨난 신초를 잘라 근유기배지(50㎎/L 가나마이신, IBA, 비타민 B₅, 3% 수크로스, MS 염 함유)에 이식시켜 뿌리를 유도시켰으며, 그 결과 뿌리가 유도된 식물체들은 온실에서 재배하였다.

상기 T₀ 식물체들의 형질전환 유무 확인을 위하여 PCR을 수행하였다. 이를 위해 각각의 식물체로부터 genomic DNA 샘플을 분리한 후, 이를 NPTⅡ transgene에 대한 주형으로 사용하였다. 이 때, 양성 대조군(+C)으로 CaMV35S 프로모터 및 NOS-ter(nopaline synthase terminator)를 함유하는 식물 발현 벡터 pCAMBIA2300를 이용하였으며, 음성 대조군(-C)으로는 형질전환하지 않은 보통 담배 식물체로부터 분리한 genomic DNA를 사용하였다.

그 결과를 도 10 및 도 11에 나타내었다. 상기 도 10에서, PCR 수행 결과 총 6개의 형질전환 식물체를 얻을 수 있었으며, 그 중 하나의 형질전환체를 보통 식물체와 비교해 보았더니 보통 식물체보다 키가 상당히 작아지는 특성을 보이고 있었다.

제3단계. 본 발명 담배 변종 식물체의 대량생산

상기 제2단계로부터 얻은 T₀ 담배 변종 식물체의 종자로부터 상기와 동일한 과정을 반복적으로 수행함으로써 본 발명 형질전환체의 무성번식 변종식물을 계속적으로 대량생산하였다.

이상의 실시예를 통하여 명백한 바와 같이, 본 발명에서 이용하는 고추 유래의 CaODC1 유전자는 식물 병원균, 특히 TMV 및 잔토모나스 캄페스트리스와 같은 박테리이아에 의한 감염시 그 발현이 특이적으로 증가하여 고추 식물의 방어기작에 관여하는 유전자로서 본 발명자들이 최초로 분리해낸 신규한 방어-관련 유전자이다. 따라서, 본 발명은 상기와 같은 유전자를 이용하여 이를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 식물 병원균 및 환경적 스트레스에 대한 저항성 향상 담배 변종 식물체를 제공하는 뛰어난 효과가 있으므로 국민기호산업 및 식물종자산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

도 1은 본 발명 CaODC1 cDNA 클론의 개략도 및 리본 다이어그램을 나타낸다. 여기에서, 도 1A는 본 발명 CaODC1 cDNA 클론의 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸다. 여기에서 아미노산 375번부터 384번 위치의 활성부위는 밑줄로 처리하였다. 도 1B는 본 발명 CaODC1의 리본 다이어그램(ribbon diagram)을 보여준다. 도 1C는 본 발명 CaODC1 β-배럴(barrel) 도메인의 중심지역(core region)을 보여준다.

도 2는 본 발명 CaODC1 cDNA의 아미노산 서열과 다른 종 유래 ODC들의 아미노산 서열을 비교하여 나타낸 것이다.

도 3은 본 발명 CaODC1 유전자의 DNA 겔 블롯 분석결과와 발현양상을 나타낸다. 여기에서, 도 3A는 CaODC1 유전자의 DNA 겔 블롯 분석 결과를 나타내며, 도 3B는 다양한 식물 기관에서의 CaODC1 유전자의 발현 양상을 나타낸 것이다.

도 4는 TMV-P₀, TMV-P_1,2 또는 잔토모나스 캄페스트리스(Xanthomonas campestris) 접종에 대한 본 발명 CaODC1의 발현 양상을 나타낸 것이다. 여기에서, 도 4A는 TMV-P₀ 또는 TMV-P_1,2 접종에 대한 CaODC1 유전자의 차별적 발현 양상을 나타내며, 도 4B는 TMV-P₀에 대한 전신 획득 저항성 동안 CaODC1 유전자의 발현 양상을 나타낸다. 또한, 도 4C는 박테리아 병원균과의 친화적, 불친화적 상호작용에서의 CaODC1 유전자의 발현을 분석한 결과이다.

도 5A는 에테폰 처리에 대한 CaODC1 유전자의 발현 양상을 나타낸 것이다.

도 5B는 메틸 자스몬산(MeJA) 처리에 대한 CaODC1 유전자의 발현 양상을 나타낸 것이다.

도 5C는 메틸 비올로겐(MV) 처리에 대한 CaODC1 유전자의 발현 양상을 나타낸 것이다.

도 5D는 절개-상처 처리에 대한 CaODC1 유전자의 발현 양상을 나타낸 것이다.

도 5E는 살리실산(SA) 처리에 대한 CaODC1 유전자의 발현 양상을 나타낸 것이다.

도 6은 하루주기(dairy cycle) 동안 일주기성 조절(circadian regulation)에 의한 본 발명 CaODC1 유전자의 발현 양상을 나타낸 것이다.

도 7은 아라비돕시스(Arabidopsis) 원형질체에서 CaODC1::smGFP의 in vivo 타겟팅한 결과를 나타낸 것이다.

도 8은 본 발명의 재조합 벡터를 구축하기 위해 사용된 pCAMBIA2300 벡터의 개열지도를 나타낸 것이다.

도 9는 본 발명 CaODC1 유전자를 pCAMBIA2300 벡터에 삽입시켜 구축한 재조합 벡터의 개열지도를 나타낸 것이다.

도 10은 본 발명의 재조합 벡터를 이용하여 형질전환된 담배 식물체(T₀ 식물체)에서 그 형질전환 유무 확인을 위해 PCR 해본 결과이다. 여기에서 숫자는 형질전환된 각각의 식물을 의미한다.

도 11은 본 발명의 CaODC1 유전자를 포함하는 담배 형질전환 식물체를 나타낸 것이다. 여기에서, 왼쪽 식물은 담배의 대조군 식물체(SAMSUN NN control plant), 오른쪽은 본 발명의 CaODC1 유전자를 포함하는 담배 형질전환 식물체(CaODC1 sense/SAMSUN NN transgenic line)이다.

<110> Korea University <120> Novel recombinant vector introduced with CaODC1 gene from hot pepper and pathogen-resistant transgenic tabacco using thereof <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1430 <212> DNA <213> Capsicum annuum <220> <221> CDS <222> (41)..(1345) <400> 1 ttgaattctt attttctctg tttccctttg agtcctccga atg gcc ggc caa aca 55 Met Ala Gly Gln Thr 1 5 gtt att gtt tcc ggg tta aac ccg gcg gcc att ctt cag tca aca atc 103 Val Ile Val Ser Gly Leu Asn Pro Ala Ala Ile Leu Gln Ser Thr Ile 10 15 20 ggc gga gct cct cct tct acc gcc gca gct gcg gcg gag aac ggt gac 151 Gly Gly Ala Pro Pro Ser Thr Ala Ala Ala Ala Ala Glu Asn Gly Asp 25 30 35 acc acc aga aaa gtt gtt cct cta tca aaa gat gcc ctt cag gat ttc 199 Thr Thr Arg Lys Val Val Pro Leu Ser Lys Asp Ala Leu Gln Asp Phe 40 45 50 atg gtt tcc atc ata acc cag aag tta caa ggt aaa aag aag ccg ttt 247 Met Val Ser Ile Ile Thr Gln Lys Leu Gln Gly Lys Lys Lys Pro Phe 55 60 65 tat gtg tta gat ttg ggg gaa gtt gtt tcc ctg atg gat caa tgg aac 295 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Claims (2)

1. 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 고추(Capsicum annuum L. cv. Bugang) 유래의 식물병 저항성 발현 유전자 CaODC1을 pCAMBIA2300 벡터에 삽입하여 구축함을 특징으로 하는, 도 9의 개열지도로 표시되는 식물 발현 벡터 pCAMBIA2300-CaODC1.
2. 서열번호 1의 CaODC1 유전자를 포함하는 제1항의 벡터를 아그로박테리움-매개 형질전환 방법을 이용하여 담배 품종(Nicotiana tabacum cv. Samsun NN)에 도입함으로써 형질전환됨을 특징으로 하며, 조직배양을 통해 무성번식됨을 특징으로 하는 바이러스 및 박테리아를 포함하는 식물 병원균 저항성 향상 담배 변종 식물체.