CZ401697A3 - Modifikovaná molekula typu avidin vázající biotin, její použití, nitro-tyrosinový přírodní avidin a způsob jeho výroby, bakteriální streptavidin, kolona pro imobolizaci biotinylovaného ligandu a způsob získání avidinové kolony nebo biotinylovaného ligandu - Google Patents
Modifikovaná molekula typu avidin vázající biotin, její použití, nitro-tyrosinový přírodní avidin a způsob jeho výroby, bakteriální streptavidin, kolona pro imobolizaci biotinylovaného ligandu a způsob získání avidinové kolony nebo biotinylovaného ligandu Download PDFInfo
- Publication number
- CZ401697A3 CZ401697A3 CZ974016A CZ401697A CZ401697A3 CZ 401697 A3 CZ401697 A3 CZ 401697A3 CZ 974016 A CZ974016 A CZ 974016A CZ 401697 A CZ401697 A CZ 401697A CZ 401697 A3 CZ401697 A3 CZ 401697A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- avidin
- modified
- column
- biotin
- type molecule
- Prior art date
Links
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 title claims abstract description 143
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 title claims abstract description 141
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 title claims abstract description 94
- 239000011616 biotin Substances 0.000 title claims abstract description 94
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 title claims abstract description 72
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 title claims abstract description 57
- 230000027455 binding Effects 0.000 title claims abstract description 57
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 title claims abstract description 11
- 239000003446 ligand Substances 0.000 title claims description 65
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 60
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 16
- GIANIJCPTPUNBA-QMMMGPOBSA-N (2s)-3-(4-hydroxyphenyl)-2-nitramidopropanoic acid Chemical compound [O-][N+](=O)N[C@H](C(=O)O)CC1=CC=C(O)C=C1 GIANIJCPTPUNBA-QMMMGPOBSA-N 0.000 title claims description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 title description 5
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims abstract description 36
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims abstract description 17
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 claims abstract description 7
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 5
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 claims abstract description 5
- 125000000751 azo group Chemical group [*]N=N[*] 0.000 claims abstract 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 claims description 33
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 29
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 29
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 21
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 21
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 8
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 7
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims description 7
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 6
- 150000001615 biotins Chemical class 0.000 claims description 6
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 6
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 6
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- -1 microtiter plate Substances 0.000 claims description 5
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 claims description 4
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 claims description 4
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 claims description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 4
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M Thiocyanate anion Chemical compound [S-]C#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 3
- 230000032823 cell division Effects 0.000 claims description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 3
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 3
- 125000004435 hydrogen atom Chemical class [H]* 0.000 claims description 3
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N hydrogen thiocyanate Natural products SC#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000000269 nucleophilic effect Effects 0.000 claims description 3
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 2
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000011630 iodine Substances 0.000 claims description 2
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 claims description 2
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 claims description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims 2
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 claims 2
- 125000001589 carboacyl group Chemical group 0.000 claims 1
- BSOLAQMZTBVZLA-UHFFFAOYSA-N tyrosinyl radical Chemical compound OC(=O)C(N)CC1=CC=C([O])C=C1 BSOLAQMZTBVZLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 abstract description 8
- 238000012986 modification Methods 0.000 abstract description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 7
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 abstract description 5
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 abstract 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 abstract 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 43
- 108010043595 captavidin Proteins 0.000 description 32
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 29
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 28
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 28
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 22
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 20
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 20
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 18
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 18
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 108091006004 biotinylated proteins Proteins 0.000 description 13
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- NYTOUQBROMCLBJ-UHFFFAOYSA-N Tetranitromethane Chemical compound [O-][N+](=O)C([N+]([O-])=O)([N+]([O-])=O)[N+]([O-])=O NYTOUQBROMCLBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 8
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 238000006396 nitration reaction Methods 0.000 description 7
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 7
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- HVBSAKJJOYLTQU-UHFFFAOYSA-N 4-aminobenzenesulfonic acid Chemical compound NC1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1 HVBSAKJJOYLTQU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 5
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 5
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 5
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 5
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- 230000026045 iodination Effects 0.000 description 4
- 238000006192 iodination reaction Methods 0.000 description 4
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 4
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 4
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 3
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- XKNKHVGWJDPIRJ-UHFFFAOYSA-N arsanilic acid Chemical compound NC1=CC=C([As](O)(O)=O)C=C1 XKNKHVGWJDPIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 3
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 description 3
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 description 3
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 3
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 3
- 125000003588 lysine group Chemical class [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 229950000244 sulfanilic acid Drugs 0.000 description 3
- ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 4-aminobenzoic acid Chemical compound NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000186983 Streptomyces avidinii Species 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000011149 active material Substances 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- RWZYAGGXGHYGMB-UHFFFAOYSA-N anthranilic acid Chemical compound NC1=CC=CC=C1C(O)=O RWZYAGGXGHYGMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N chloramine T Chemical compound [Na+].CC1=CC=C(S(=O)(=O)[N-]Cl)C=C1 VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 2
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- LPXPTNMVRIOKMN-UHFFFAOYSA-M sodium nitrite Chemical compound [Na+].[O-]N=O LPXPTNMVRIOKMN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 description 2
- BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N trisodium borate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]B([O-])[O-] BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NQPDZGIKBAWPEJ-UHFFFAOYSA-N valeric acid Chemical compound CCCCC(O)=O NQPDZGIKBAWPEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- KYRUKRFVOACELK-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-(4-hydroxyphenyl)propanoate Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1CCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O KYRUKRFVOACELK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RVHSTXJKKZWWDQ-UHFFFAOYSA-N 1,1,1,2-tetrabromoethane Chemical compound BrCC(Br)(Br)Br RVHSTXJKKZWWDQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 16-Epiaffinine Natural products C1C(C2=CC=CC=C2N2)=C2C(=O)CC2C(=CC)CN(C)C1C2CO PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WIFSDCDETBPLOR-UHFFFAOYSA-N 2-aminobenzoic acid Chemical compound NC1=CC=CC=C1C(O)=O.NC1=CC=CC=C1C(O)=O WIFSDCDETBPLOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004080 3-carboxypropanoyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C(O[H])=O 0.000 description 1
- HQFLTUZKIRYQSP-UHFFFAOYSA-N 3-ethyl-2h-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C1=CC=C2N(CC)CSC2=C1 HQFLTUZKIRYQSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N Aniline Chemical class NC1=CC=CC=C1 PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 241000724791 Filamentous phage Species 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 125000003047 N-acetyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 102000000447 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Human genes 0.000 description 1
- 108010055817 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282941 Rangifer tarandus Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- DZHDVYLBNKMLMB-ZFWWWQNUSA-N Trp-Lys Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O)=CNC2=C1 DZHDVYLBNKMLMB-ZFWWWQNUSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 238000005576 amination reaction Methods 0.000 description 1
- 229960004050 aminobenzoic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052785 arsenic Inorganic materials 0.000 description 1
- RQNWIZPPADIBDY-UHFFFAOYSA-N arsenic atom Chemical compound [As] RQNWIZPPADIBDY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 125000001584 benzyloxycarbonyl group Chemical group C(=O)(OCC1=CC=CC=C1)* 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- RONNRWUMUHMWOH-UHFFFAOYSA-N bromo cyanate Chemical compound BrOC#N RONNRWUMUHMWOH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000004063 butyryl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000112 colonic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 239000011243 crosslinked material Substances 0.000 description 1
- 230000022811 deglycosylation Effects 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 239000012954 diazonium Substances 0.000 description 1
- 150000001989 diazonium salts Chemical class 0.000 description 1
- ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N diethanolamine Chemical compound OCCNCCO ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JAZCSWFKVAHBLR-UHFFFAOYSA-N dihydrogen phosphate;phenylazanium Chemical compound OP(O)(O)=O.NC1=CC=CC=C1 JAZCSWFKVAHBLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- SDCJMBBHNJPYGW-UHFFFAOYSA-L disodium;hydrogen carbonate;chloride Chemical compound [Na+].[Na+].Cl.[O-]C([O-])=O SDCJMBBHNJPYGW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 150000002270 gangliosides Chemical class 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000026030 halogenation Effects 0.000 description 1
- 238000005658 halogenation reaction Methods 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 125000004051 hexyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N iodine Chemical compound II PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 150000002828 nitro derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000002347 octyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Polymers 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000013110 organic ligand Substances 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N periodic acid Chemical compound OI(=O)(=O)=O KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N phenylmethyl ester of formic acid Natural products O=COCC1=CC=CC=C1 UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 125000001501 propionyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 125000006853 reporter group Chemical group 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 229910052594 sapphire Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010980 sapphire Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- HRZFUMHJMZEROT-UHFFFAOYSA-L sodium disulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S(=O)S([O-])(=O)=O HRZFUMHJMZEROT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000010262 sodium metabisulphite Nutrition 0.000 description 1
- 239000004296 sodium metabisulphite Substances 0.000 description 1
- 235000010288 sodium nitrite Nutrition 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000009987 spinning Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004434 sulfur atom Chemical group 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 125000000430 tryptophan group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C12 0.000 description 1
- 229940005605 valeric acid Drugs 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/76—Albumins
- C07K14/77—Ovalbumin
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54353—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand attached to the carrier via a chemical coupling agent
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/36—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Actinomyces; from Streptomyces (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/465—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from birds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
(57) Anotace:
Modifikovaná molekula typu avidin vázající biotin, která Je vybrána z molekul zahrnujících přírodní avidin z vaječného bílku, rekombinantní avidin, deglykosylované formy avldinu, bakteriální streptavidin, rekombinantní streptavidin, upravený streptavidin a jejich deriváty, které jsou modifikovány v jiných místech než jsou podstatné tyrosinové zbytky, přičemž podstatný tyrosinový zbytek v místě vázajícím biotin je modifikován tak, že jeho pKa je při srovnání s pKa nemodifikovaného tyrosinového zbytku sníženo. Nitro-tyrosínový přírodní avidin a způsob jeho výroby. Kolona pro imobilizaci biotinylovaného ligandu, která obsahuje modifikovanou molekulu typu avidinu připojenou na pryskyřici, a způN sob získání buď avidinové kolony nebo biotio nylového ligandu. Použití modifikované mole1 • 0 0 0 00 00 0- 00 00 000 00 00 0000
000 00 0 0000
000 0 0 0 0000 0
0000 00 0 ·00
Modifikovaná molekula typu ávidintf vázající biotin, její použití, nitro-tyrosinový přírodní avidin a způsob jeho výroby, bakteriální streptavidin, kolona přo imobilizači biotinylováného ligandu a způsob získání avidinové kolony nebo biotinylovaného ligandu
Oblast techniky
Předložený vynález se týká modifikované molekuly typu avidinu-váza jící _biotin“jejího použití, nitro-tyrosinového přírodního avidinu a způsobu jéhó výroby, bakteriálního streptavidinu, kolony pro imobilizači’ biotihýlóvánélío ligandů a způsobu získání avidinové kolony nebo biotinylovaného ligandu. Předložený vynález se tedy týká molekuly typu avidinu, který je modifikován-v místě vázajícím tyrosinóvý zbytek/ o němž je známo, že je rozhodujícím pro navázání biotinu. Modifikovaný avidin je ještě schopen vázat biotin nebo biotinylovaný ligand za spěčifiókých podmínek, ale po změně těchto podmínek, například vysokým pH nebo kompetici s biotinem, se navázaná biotinová část nebo biotinylovaný ligand odstraní. Tento vynález tedy poskytuje reveřsibilni formu avidinu přo použití v technologii avidin-biotih, čímž se opravuje” jedna z hlavních nevýhod molekuly avidinu pro různé aplikační účely, tj. extrémní děnaturující podmínky potřebné pro rozrušení komplexu avidin-biotin. Drastické podmínky nutné přo disociaci komplexu avidin-biotin obvykle irreversibilně deaktivují biologickou aktivitu biotinylované složky a tak způsobují, že je nevhodná přo následující použití.
Dosavadní stav techniký
Avidin (z vaječného bliku) a streptavidin (ze Štreptomyces avidin) jsou dva příbuzné přo.teiny, které vážou biotin podobnými disociačními konstantami kolem 10“15 M [Green N.M.: Adv. Protein Chem. 29, 85 (1975).]. Vedle navázání biotinu jsou mnohé jejich fyzikální vlastnosti zcela podobné. Oba jsou například zkonstruovány ze čtyř nékovalentně připojených identických ♦Af· ··
··· · A « · * A A
AA AAA A · * ··«· * • AAA AAA A A · podjednotek, každá 2 nich nese. jedno místo vázající biotin. Hodnoty podjednotky Mr jsou také velmi podobné i Navíc je v sekvencích těchto dvou proteinů zachováno několik krátkých prodloužení, zvláště dvě prodloužení trp-Lys, která se vyskytují v přibližně podobných polohách [Argarana C.E., Kuntz I.D., Birken S., Axel R. a Cantor C.R.: Nucl. Acids Reš. 14. 1871 (1986).].
Již dříve jsme ukázali [Gitlin G., Bayer E.A. á Wilchek M.: Biochem. J. 242. 923 (1987) a Gitlin G., Bayer E.A. a Wilchek
M.: Biochem. J. 250. 291 (1988)], že některé lysinóvé a tryptofanové~zbytky~se— účastní~návázání_ Bíoťxnu-v~obou přdtěiňečlT [Gitlin G., Bayer E.A. a Wilchek M.: Biochem. J. 256. 279
- (1988).]. Nedávno byloukázáno, že jak biotin tak streptavidin vykazují stejný trojrozměrný sklad a že většina zbytků míst navázání je identickýchnebo podobných [Weber P.C., Ohlendorf
.......* D.H., WendolskyJ. J. a’ Salemme F;R.: Science 243 / 85‘f 1989 V. T.
Geometrie místa navázání a vytvořené vazby mezi oběma proteiny š molekulou biotinu jsou skutečně velmi podobné.
Přes tyto podobnosti existuje mezi těmito dvěma proteiny několik rozdílů, Avidin je glykoprotein s di sulfidovým můstkem, který obsahu je dva methioninové zbytky/ zatímco streptavidin není glykosylován a je zbaveni postraníchřetězců aminokyselin obsahujících atom síry. Jiným významným rozdílem je obsah tyrosinu. Avidin má pouze jeden tyrosinový zbytek (Tyr-33), zatímco streptavidin má šest tyrosinových zbytků v polohách 22, 43, 54, 60, 83 a 96. Je zajímavé, že jediný tyrosinový zbytek.avidinu je umístěn v oblasti, která obsahuje sekvenci identickou s jednou sekvencí tyrosinových zbytků streptavidinu (Tyr-43 v prodloužení Thr-Gly-Thr-Tyr) . Tento tyrosinový zbytek zaujímá prominentní polohu v místě vázajícím biotin a chemická modifikace tyros i nové hydroxy lové skupiny vede k irreversibilní deaktivaci molekuly avidinu [Gitlin G.·, Bayer E.A. a Wilchek M.: Biochem.
J. 269. 527 (1990).].
Každý monomer avidinu váže jednu molekulu biotinu. Jedinečným znakem tohoto navázání je ovšem pevnost a specifičnost tvorby komplexu avidin-biotin. Výsledná afí ni tni konstanta, vy······ 0 0 · ·· ti ·· · * ··· .· · · · ·· 0 ·0 '00 0· · 0 0 0 « · · · · · · • ••* 00 0 ··· hodnocená jako 1,6.1015 M_1 pro ávidin á 2,5.1013 M1 pro streptavidin [Green N.řl.: Méthods Enzymol. 184. 51 (1990).] je nejvyšší známou hodnotou pro protein a organický ligand. Je tak pevné, že biotin se z vazebného místa nemůže uvolnit, i když je tento komplex podroben rozmanitým drastickým podmínkám, jako jsou vysoké koncentrace děnaturu jí cích činidel za.teploty mísťí nosti, např. 6M guanidiniumhydťochlorid, 3M guanidiniumthiokyanát, 8M močovina, 10% (hmotn.) β-merkaptoethanol nebo 10% (hmotn.) dodecylsulfát sodný. Při kombinovaném působení -1 guanidiniumhydrochlbridir^př^JTízkěiF^H (Γ75) za žahřívání^V °C) v přítomnosti děnaturujících činidel nebo deteřgentů še protein denaturuje a biotin sé ž prasklého vazebného místa uvolní. >
- Avidin rozpoznává biotin hlavně na úřěidóvém'’(podobném močovině) kruhu molekuly, interakce mezi vazebným místem avidinu a kruhem obsahu jícím atom šírý postranního řetězce kyseliny valérové vitaminu je mnohem méně pevná. Relativně slabá interakce mezi postranním řetězcem biotinu obsahujícím karboxyskupinu a avidinem znamená, že první z uvedených lze chemicky modifikovat a připojit na rozmanitý biologicky aktivní materiál. Biotinová část výsledného derivátu nebo,konjugátu je stále ještě dostupná pro interakci s avidinem. A naopak, avidin může být derivatizován mnohá jinými molekulami, zvláště sondami nebo reportérovými skupinami různých typů.
To je problém technologie avidin-biotin [Wilchek M. a Bayer E.A. (red.): Avidin-Biotih Technology, Methods in Enzymoloqy 184, Academie Press, lne., San Diego 1990.]. Biologicky aktivní cílová molekula v experimentálním systému může být tedy ožnačená biotinylóvanoů protičástí (vazebná část) a produkt lze pak podrobit interakci s avidinem, buS derivátizováným nebo konjugovaným s příslušnou sondou.
Použiti avidinu Z vaječného bílků v technologii avidin
-biotin je někdy omezeno vzhledem k vysoké bazicitě (pí kolem
10,5) a přítomnosti cukerných Částí na molekule avidinu, které • v ·· ř 1 • * mohou vést k nespecifickým nebo jinak nežádoucím reakcím. V nedávných letech býl ve většině aplikací technologie avidin-biotin avidin z vaječného bílku nahrazen bakteriálním proteinem, streptavidinem. Problémy se streptavidinem (vysoká cena a ná biotinunezávislé navázání buněk) vedly k obnovenému zájmu o avidin z vaječného bílku jako standardu pro technologii, avidin-biotin. Pro tyto účely byly připraveny modifikované avidiny vykazující zlepšené molekulární vlastnosti při srovnání s oběma přírodními proteiny (a jejich předcházejícími deriváty), stejně —jakó^při—srovnání^se^sťreptavUdinemý^jako- jsou^N-acyl-avidiny ~ např. Ν-formyl-, N-acetyl- a N-sukcinyl-avidiny. Tyto deriváty aýidiriu snižují náboj proteinu, ale všechny se připravují kovalentním připo jením na dostupné lysiny avidinu. Následující blokování volných aminových skupin brání následné přípravě jiných typů konjugátů (konkrétně konjugátu typuprotein-protein, jakó’ jsou avidin-značené enzymy), které se často připravují zesilováním lysinovými zbytky použitím dvoj funkčních reakčních činidel (např. glutaraldehydu). ,
Užitečnější a účinnější alternativou k modifikaci lysinu je modifikace argininu. V tomto případě je pí proteinu účinně sníženo a lysiny jsou ještě dostupné přo následující interakci. Komerčně jsou dostupné dva různé deriváty avidinu, které jsou modifikovány tímto způsobem. Jeden, ExtrAvidin<R), lze získat v různě funkčně derivatizovaných nebo konjugovaných formách ód Sigma Chemical Company (St. Louis, Mo.). Druhý, NeutraLite Avidin™ (produkt firmy Bélovo Chemicals, Bastogne, Belgie) je dále modifikován a může být získán ve velkých množstvích.
I když snížení pí avidinu z vaječného bílku řeší jeden z problémů, přítomnost oligosacharidového zbytku zůstává vážným zdrojem nespecifické (na biotinu nezávislé) interakce, která omezuje jeho aplikaci. Návrat avidinu z vaječného bílkú jako standardu pro technologii avidin-biotin je možný po odstranění jeho cukrů.
Možnosti odstranění cukru z glykoproteinu jsou zcela ome• 0
0« 00
0 0 ·
0 0·
0**0 · • 0 * »»·» 0 0• 0 0 • 00 ♦ · 0 0 « 0 0
zeny; je móžné to udělat buá chemicky nebo enzymaticky. Běžně dostupné chemické způsoby, např. použití HF nebo oxidace jodistanem, jsou buá destruktivní nebo neúčinné. Dobře známý enzymatický způsob, který používá N-glykanázu [Tarentiňo a spol., 1984.], je obvykle velmi drahý a není ú avidinu velmi účinný, jestliže se používá konvenční metodologie. Byl však získán životaschopný postup deglykosylace a výsledný produkt byl postupně chemicky modifikován přes arijiniňy. Výsledek je znám pod obchodním označením NeutraLite Avidin™ (Bélovo Chemicals).
Přes všechna táto zlepšení je jedním z hlavních problémů v několika aplikacích technologie ávidin-Kiótin nedostatekreversibility navázání a obtíže oddělení avidinové a biotinové části na konci procesu bez děnáturaee avidinú nebo poškození nebo deaktivace biologického- materiálu, ’který má být připojěn biotinovým můstkem. Bylo by také výhodné (zvláště pro průmyslové použití) odstranit poškozený nebo deaktivovaný materiál z avidinové kolony a ták rekonstituovat tuto kolonu pro připojení nového vzorku biotinylované složky.
Předmětem předloženého vynálezu je získat modifikovaný avidin, který ještě stále váže biotin á je výhodně používán ve způsobech používajících technologii avidin-biótin> při které je žádoucí nebo je výhodná reversibilita způsobu.
Byla popsána nitrace tyrosinových zbytků v modelových peptidech a proteinech použitím tetranitromethanu [Riordan J.F., Sokolovsky M. a ValleeB.L.: J. Amer. Chem. Soc. 88, 4104 (1966) a Sokolovsky Μ., Riordan J.F. a Vallee B.L.: Biochim. Biophys. Res. Communic. 27-, 20,(1967).]. V předcházející práci autorů předloženého vynálezu [Gitlin G., Khaiy I., Bayer E.A., Wilchek M. a Muszkat K.A;: Biochem. J. 259. 493 (1989).] byl připraven nitrotyrosinový derivát avidinu nitrací avidinu z vaječného bliku v 9M močovině tetranitromethanem (TNM). Výsledný nitro-avidinový preparát byl neaktivní, tj. Selhal při vázání bíotinu, protože nitrace bylá provedena na denaturované formě avidinu (v přítomnosti močoviny). Takto připravený nitro-avidin φφφ • φ je zcela neadekvátní pró použití v technologii avidin-biotin.
φφφφ φφ φφ • φφ φφ φφ ' φ φ φ · • * V ΦΦ • φ φφφφ φ φ - .· ·
Pro analytické účely byl připraven avidin a streptavidin, oba označené 12SI. Jediný tyrosinový zbytek každé avidinové podjednotky není jodací snadno dostupný. Avidin je citlivý na jodaci (způsob s čhloraminém T) zavedením 3-(p-hydroxyfenyl)propionylových skupin. Byl tedy připraven avidin označený 125I obsahující uvedené skupiny. K označení avidinu lze použít také Bolton-Hunterovo reakční činidlo značené 125I [Finn F.M. a Hófmariň^KTHrKMěthodg^EnzvinormogTriÍIB^f igssiVl—Jodóváriíiirsťiép^7 tavidinu Na125I jodogenovým způsobem fSuter M., Cazin J., jr., Butler J.E. a MockD.M.: J. Immunol·. Meth. 113. 83 ί19881.Γ bvl vyroben 12SI-strěptavidin. Neznačený jodovaný avidin ani streptavidin nebyly dosud popsány.
V literatuře je popsána ázotizace a amiňace tyrosinových zbytků v modelových peptiděch a proteinech, např. ribonukleáse Á [Gorecki M,, Wilchek M. a Patčhornik A.: Biochem. Bióphys. Acta 229. 590 (1971) a Sokolovský M., Riordan J.F. a Vallee B. L.: Biochim. Bióphys. Res. Communic. 27, 20 (1967)-].
Podstata vynálezu
Předložený vynález se týká modifikované molekuly typu avidinu vázající biotin, která jě vybrána ze skupiny molekul zahrnujících: i) přírodní avidin 2 vaječného bílku, ii) rekombinantní avidin, iii) deglykosylované formy avidinu, xv) bakteriální streptavidin, v) rekombinantní streptavidin, vi) upravený streptavidin a vii) deriváty ad i) až ad vi), které jsou modifikovány v jiných místech než je podstatný tyrosinový zbytek, a která se vyznačuje tím, žě její podstatný tyrosinový zbytek v místě vázajícím biotin je modifikován takovým způsobém, že jeho pKa je sníženo při srovnání s pKa nemodifikovaného tyrosinového zbytku v odpovídající nemodifikované molekule typu avidinu.
Modifikovaná molekula typu avidinu podle vynálezu má jednu
0000 00
I I
4 « « » 4· I •4 44 nebo více elektrofilních a/nebo ňukleofilních skupin na podstatném tyrosinověn zbytku molekuly typu avidinu. Příkladem jsou sloučeniny, v nichž modifikovaný tyrosin znamená skupinu obecného vzorce
v němž Xi i X3 znamená skupinu vybranou z nitróskupiný, atomu halogenu, skupiny NR,R2.a -N=NR3> v nichž Rx i R2 je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, alkylu s 1 až 8 atomy uhlíku á' karboxy iového áčýlus I á2’ '6 áťómý uhlíku aR, znamená a- ryl substituovaný kyselinovou skupinou.
Ve výhodném provedení podlé vynálezu je molekula typu avidinu modifikována přidáním jedné nebo více elektrofilních skupin na tyrosinový zbytek. Například avidin nebo streptavidin mohou být modifikovány nitrací nebo halogenací, s výhodou jodací, tyrosinového zbytku, jak je uvedeno ňa obrázku 1 (Xx a/nebo X2 znamená nitroskupinu nebo atom halogenu, s výhodou atom jodu) , čímž se sníží pKa tyrosinového zbytku v místě vázajícím biotin z 10,5 aŽ 12,5 na 6,5 až 8,5, s výhodou ria 7,0.
Tato modifikace tyrosinového zbytku v molekule typu avidinu zahrhu je přidání jedné nebo více elektrof ilních skupin v ortho poloze (polohách) (přilehlých k hydroxylové skupině) na tyřosinovém kruhu. Jako příklad tohoto typu modifikovaného avidinu byla použita nitrace týrosinového zbytku použitím tetránitromethanu (TNM). Výsledný avidin a streptavidin obsahu jící nittotyrosin, zde dále označované jako nitro-avidin'* a nitro-stréptavidin ·, byly podrobně studovány, aby se definovaly relativně mírné podmínky uvolňování biotmové části nebo biotinylovahého ligandů, např. biotinylované protilátky, enzymu, nukleové kyseliny nebo buňky.
• tttttttt ·« · φ · ftt ··* ·*·· tttttt »·· · * · tttt·· · ···· tttttt tt·* • ♦ «· tttt tttttt tttt ··
Podlé předloženého vynálezu se nitrače avidinu provádí zá nedenaturujících podmínek. 0 výsledném nitro-avidinu a nitro-streptavidinu bylo ukázáno, že při pH 4 účinně a pevně vážou biotinylovaný ligand. Když bylo pH zvýšeno na 8, biotinylovaný ligand byl stále ještě kolonou zadržován. Když však bylo pH zvýšeno na 10, biotinylovaný ligand byl uvolněn. Biotinylovaný ligand může být uvolněn výměnou použitím volného biotiríu také při nižším pH (např. mezi pH 4 až 8). Tyto vlastnosti nitró-avidinu a nitro-streptavidinu poskytují takové formy ávidinu a streptavidinu/které^jsou vhodné pro rozmanité aplikace.. Tyto materiály byly použity podlé předloženého, vynálezu pro navázání á následněuvolnění několika přikládůvbiotiríylováriýčh'ligandů na nitro-avidin á nitro-streptavidin imóbilizovaný na Sepharošu stejně jako přo připojení a uvolnění biotinylováných ligandů : na’ nitro-ávidin a nitřó-štřěpťávidin adsorbovaný nď mikrótitrovací desky.
V jiném provedeni Se předložený vynález týká halogenovaného, výhodněji neznačeného jodem, avidinu nebo streptavidinu. Jodace tyrosinové části v avidinu nebo streptavidinu postupem s KI a chloraminem Tposkytuje mono- a/nebo di-jodtyrosin-avidin nebo -streptavidin, o nichž bylo. také ukázáno, Že jsou; účinně reversibilními formami ávidinu.
Další provederíí vynálezu se týká molekul typu avidinu modifikovaných na podstatné tyrosinové skupině jednou nebo více nukleofilními skupinami vybranými z NR,R2 a -M=NR3.
V azó-derivátech podle vynálezu, tj. sloučeninách, v nichž Xx a/nebo X2 znamená N=NR3, R3 znamená aryl, s výhodou karbocyklický aryl, nejvýhodněji fenyl, substituovaný kyselinovou skupinou vybranou z karboxylu a zbytku anorganické kyseliny, jako je kyselina fosforečná, arsenová nebo sulfonová.
Azoďeriváty podle vynálezu se vyrábějí z odpovídajících p-amino-derivátů, např. p-arsinilové kyseliny, kyseliny anthranilové, p-aminobenzoové, sulfanilové a p-aminofosforečné,
Mil ·* * v «· «« « 4 · *
4*11 4 4 diazoťací dusitanem sodným a reakcí výsledné diazonióvé soli se zvolenou molekulou typu avidinu.
V aminoderiváteeh podle vynálezu, tj. sloučeninách, v nichž Xx a/nebo X2 znamená NRXR2, Rx a i R2 jsóu vybrány z atomu vodíku, alkylu a acylu. Alkylová skupina s výhodou znamená přímý nebo rozvětvený alkyl s 1 až 3 atomy uhlíku, příklady jsou methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, hexyl a óktyl. Acylová skupina s výhodou znamená karbocyklický acyl s 1 až 6 atomy uhlíku, jáko je acetyl, propionyl, butýryl, Sukcinyl nebo benzyloxykarbonyl.
Aminoderiváty podle vynálezu se mohou vyrábět redukcí odpovídajících azoderivátů dithioničitahem sodným Na2S8O4 nebo redukcí odpovídá jících ňiťřóděrivátů di'thidhičitáňem 'sodným, a, jestliže je tó Žádoucí, aminoskupina se dále alkyluje nebo acyluje standardními způsoby.
Modifikované molekuly typu avidinu podle předloženého vynálezu se mohou používat ve velmi mnoha aplikacích technologie avidin-biotin · i
V následující Části spisu jsou popsány připojené obrázky.
1 * 1
Obrázek 1 ukazuje reakční Schéma přípravy molekuly typu avidinu modifikované tyrosinem podle vynálezu a její použití v reversibilriím Způsobu použitím technologie avidin-biotin.
Obrázek 2 ukazuje Stupeň (% hmotn.) nitráee avidinu jako funkce koncentrace (mM) tetranitróméthanu (TNM), jak je popsáno v příkladu l(i).
Obrázek 3 ukazuje účinek pH na navázáni biotinylovaného hovězího sérového albuminu (BSA) na pryskyřici Sepharosa-nitro-avidin, jak je popsáno v příkladu 2(i).
Obrázek 4 ukazuje účinek pH na navázáni biotinylóvané al0 00 *0 0 0 0 0
0 0 0 0
0 «00 0 0 • 0 0 0 • ·0 00 00 • ••0 *0 0«
0 · · 0 • · * 0 0 • · 0 0 0 · · 0 · 0· ·· 0« 00
0' kaličké fosfatázy na mikrotitróvácí desky obsahující nitro-avidin, jak je popsáno v příkladu 2(ií).
Obrázek 5 ukazuje srovnání vazebné aktivity avidinu (plná kolečka) a nitro-avidinu (prázdná kolečka) na biotin, jak je popsáno v přikladu 2,(iii). '.··'
Obrázek 6 ukazuje uvolnění biotinylovaného BSA z pryskyřice Sepharosa-nitro-avidin indukované pH, jak je popsáno v příkladu 3(i)“ ~~ ~ ' 7^
Obrázek 7 ukazuje uvolněni biotinylovaného BSA z pryskyřice Sepharósa-nitro-streptavidin indukované pH, jak je popsáno v příkladu 3(ii). ......
Obrázek 8 ukazu je uvolnění biotinylovaného BSA z pryskyři-: ce Sepharosa-nitro-avidin kompetici s volným biotinem, jak je popsáno v příkladu 3(iii).
Obrázek 9 ukazuje biotinem indukovanou eluci biotinylovaného BŠA jako funkci pH, jak je popsáno v příkladu 3 (iv). Volný biotin byl rozpuštěn v pufrech o různém pH, v rozmezí.od 4 do 10. Eluce při pH 10 v nepřítomnosti biotinu je uvedena pro srovnání .
Obrázek 10 ukazu je uvolněni biotinu z biotinem blokovaných míst nitro-avidinu, jak je popsáno v příkladů 4.
Obrázky 11A až 11B Ukazují výsledky opakovaného naneseni a eluování biotinylovaného BSA z kolony nitro-avidin-Sepharosa, jak je popsáno v příkladu 5. Ná .obrázku 11A byly identické vzorky biotinylovaného BSA aplikovány postupně (při pH 4 š použitím pufru A) na kolonu obsahující Sépharosu-nitro-avidin a eluovány (při pH 10 použitím pufru C). obrázek 11B ukazuje, že akumulace eluovaných frakcí poskytuje v podstatě stejné hladiny proteinu eluovaného a navázaného v jednom cyklu.
• Φ
Obrázek 12 ukazuje uvolnění biotinylovaného proteinu A z kolony obsahující Sépharosu-nitro-avidin po vyčištění imunoglóbulinu z celého králičího séra, jak je popsáno v příkladu
6.
• ΦΦΦ Φ» * Φ · « « • · · ♦ t • · · · · « • Φ · · ♦ · *· ΦΦ ΦΦ
Φ
Φ
Φ • ΦΦ . ·· Φ» • · > Φ ♦ · ·Φ • ΦΦ Φ Φ
Φ · Φ • Φ «Φ
Obrázek 13 ukazuje SDS-PAGE profil vzorků z kolony ha obrázku 12;· pás A: celé králičí sérum (aplikovaná frakce)> pás B: eluent kolony, pás C: maximum eluované pufrem A, pH 4, pás D: maximum eluované pufrem C: pH 10, pás E: komerční přípravek králičilib^iinunoglobnrinu, páš^Ft^taňdard bibtinylovaného proteinu A.
Obrázek 14 ukazuje účinek pH na uvolnění biotinyloyané křenové peróxidážy z mikrotitřovacích destiček obsahujících ' adsorbovaný' jodovaný avidin, jak je popsáno v příkladu 7 . '
J ' '! ' '
Pojem molekula typu avidinú, jak sé zde tento pojem používá, zriaméhá přírodní glykoproteinový avidin z vaječného bilku, deglykosylované formy avidinu, bakteriální streptavidiny produkované vybranými kmeny Streptomyces, např. Streptomyces avidinii, upravené streptavidiny a rekombinantní avidin a streptavidin, stejně jako deriváty přírodního, deglykosylovaného a rekombinantního avidinu a přírodního, rekombinantního a upraveného streptavidiny, které jsou modifikovány v jiných místech než v podstatném tyrosinu, například N-acyl-avidiny, např. N-acetyl, Ň-ftalyl a N-sukcinyl-avidin, a komerční výrobky ExtrAvidin™ a Neutralitě Avidin™.
Všechny formy molekul typu avidinu jsou zahrnuty v předloženém vynálezu, jak přírodní a rekombinantní avidin a střeptavidin, tak detivatizováné molekuly, např. neglykosylované avidiny, N-acyl-ávidiny a upravené streptavidiny. Některé z těchto materiálů jsou komerčně dostupně, např. přírodní avidin a streptávidin, neglykosylované avidiny, N-acyl-avidiny a upravený streptavidin, nebo se mohou vyrábět dobře známými způsoby [viz Green N.M.: Methods Enzymol. 184. 51 (1990) pro přípravu avidinu a streptavidinu, Hiller Y., Bayer E.A. a wilchek *4 4 4 4 4» 4 44 .4
444 4 4 4 4*44 4
4444 444 444
44 44 444 44 44
Μ.: Methods Enzymol. 184. 68 (1990) pro přípravu negiykosýlovaného avidinu a Bayer E.A. a Wilchek M: Methods Enzymol. 184. 80 (1990) pro přípravu strěptavidinu a upraveného streptavidinu]. Rekombinantní avidin a streptavidin se mohou vyrábět standardními technikami rekombinantní DNA, např. jak popisují Chandra G. á Gray G.: Methods Enzymol. 184. 70 (1990) pro rekombinantni avidin a Atgarana C.E., Kuntz ,I.Ď^, Birken S., Axel R. a Cantor C.R.: Nucl. Acids Res. .14. 1871 (1986) pro rekombinantni streptavidin.
Biotinylované ligandy’1, které se mohou používat s modif ikovanými avidiny podle vynálezu ve způsobech aplikace technologie biotin-avidin, jsou biotinylovanými formami žádaných ligandů, jako jsou proteiny, např. protilátky, enzymy, lektiny nebo sacharidy a glukókórijugátý, ňapř. glýkopřoteiny, gángliosidý, heparin, polysacharidy nebo nukleové kyseliny, tj. DNA a RNA, nebo fágy, viry, bakterie a další butiky, v nichž jsou tyto ligandy kovalentně vázány na biotin nebo na jehoi homólog, analog nebo derivát. Mnohé biotinylované ligandy jsou komerčně dostupné nebo se mohou připravovat standardními způsoby [viz například Bayer E.A. a Wilchek M.: Methods in Molec. Biology 10, 137 (1992).].
Modifikované molekuly typu avidinu podle vynálezu, hlavně avidinové a streptavidinové deriváty modifikované v jedné nebo v obou ortho-polohách vazebného místa tyrosinóvé skupiny (viz obr. 1) jsou vhodné pro reversibilní interakci s biotinovóu částí a představují tedy nový nástroj technologie avidin-biótin.
Tyto modifikované molekuly typu avidinu umožňují odstranit, ža mírných podmínek, volný biotin a/nebo biotinylované ligandy, např. biotinylované enzymy a další biotinylované biologicky aktivní materiály, z imobilizovaných ortho-feňólem modifikovaných molekul typu avidinu nebo z rozpustných komplexů, které obsahují modifikovaný avidin spolu s biotinylovaným ligandem v roztoku. Tyto mírné podmínky mohou spočívat v nad9 * · 9 9
9 · 9 «
9 9 > 9 9
9 9 9 9 ' 9
99 9 9
9* 9**9
9 9 9 9 • 9 9999-9
9' 9 9 9
99« «9 99 bytku koncentrace biotinu, vysokém pH, ňapř. pH 10, relativně nízkých nedenaturujících koncentrací ch močoviny, guanidinu nebo thiokyanátu, tepla a/nebo je jich kombinacích. V jednom výhodném provedení se odstranění biotinu nebo biotinýloyáné části z imobilizovaného modifikovaného avidinu provádí změnou pH, například zvýšením pH na 10. V jiném výhodném provedení se odstranění provádí přidáním nadbytku biotinu, například roztok 0,6mM biotinu se nechá procházet kolonou modifikovaného avidinu, aby se nahradila biotihylovahá složka.
Modifikované molekuly typy avidinu podle vynálezu' jsou vhodné pro použití v jákěinkóliv způsobu používajícím tédhňológii ávidin-biotin, zvláště v těch způsobech, při nichž jé výhodou reversibilitanavázání avidin-biotin, například jako rever- * sibilhí imóbiliŽačhí kólóňý přo použití při' á“f initní“chrómatograf i i pro odstranění af initní ch ligandů, přo odstranění zmobilizovaných enzymů, čímž se vytvoří reversibilní enzymový reaktor i pro rozpad rozpustných biologických komplexů v roztoku sestávajícím z biotinyiovaného materiálu zesítovaného avidinovým můstkem, pro výrobu vysokoafinitních fágových knihoven a pro použití pro.dělení buněk, čímž se usnadňuje uvolněni životaschopných nebo neporušených buněk spolu s rozpoznávací, složkou nebo ligandem, např. protilátkou, z pryskyřice, nebo působí proti aglutinaci těchto buněk disociací avidinového můstku.
Tento vynález se také týká modifikované molekuly typu ávidinu podle vynálezu připojené na pevný nosič nebo matrici. Vhodný je jakýkoliv pevný nosič používaný v oblasti techniky, jako jsou, ale bez omezení na ně, pryskyřice, mikrotitrovací destičky, skleněné perličky, magnetické perličky a podobné. Připojení avidinu na pevný nosič může být kovalentní nebo nekovalentnía provádí se standardními způsoby. V jednom výhodném provedení še modifikovaná molekula typu avidinu imobilizuje na pryskyřici, s výhodou Sepharose, a takto získaná afinitní pryskyřice Sepharosa-nitro-avidin se může nalít na kolonu pro isolační postupy [Bayer E.A. a Wilčhek M.: Methods in Molec. Biology IQ. 137 (1992).]. Při popisu zde bude pojem avidin
-Sepharosová kolona” používán pro takovou kolonu, která obsahuje modifikovanou molekulu typu avidinu podlevynálezu imobiližóvanou na Sepharose. Tyto kolony jsou zvláště vhodné pro postupy dělení.
- V jiném provedení podle vynálezu še modifikovaná molekula “ typu avidinu napojí na jamky mikrotitřovacích destiček.
Při dobře známém postupu afinitní chromatografie, který je prototypem všech afinitiních metod, se vázací ligand, např. protilátka nebo receptor, připojí na pevný nosič, jako je Sepharosa. To lze provést biótinyiací uvedeného liganďu a následující imobilizací na Sepharose aviďinovým nebo streptavidinovým můstkem. Výsledná avidin-Sépharosová kolona se pak použije jako zařízení próisolaci a vyčištění materiálu, který interaguje s uvedeným biotinylovaným ligandem. V mnoha případech by bylo výhodné oddělit biotinylovaný ligand od avidin-Sepharosové kolony, bud pro isolaci ligandů samotného, který může být přesný nebo delikátní, nebo pro rekonstituování kolony pro alternativní použití. To se může provést použitím kolony> která obsahuje modifikovanou molekulu typu avidinu podle předloženého vynálezu prú imobilizací biotinylovaného ligandů, který může být eventuelně uvolněn z kolony přidáním bud alaklických roztoků (např. pufr. C, pH 10) nebo přidáním nadbytku biotinu (např. 0,6mM při jakémkoliv pH). Pro rekonstituování avidinové kolony se může použít bud nový typ biotinylovaného ligandů nebo, čerstvá dávka stejného biotinylovaného ligandů.
Systém biotin-avidin byl použit pro děleni buněk různými způsoby. Jedním přístupem je použít biotinylovaný ligand (např. protilátku), který rozpoznává molekulu buněčného povrchu (např. povrchový antigen). Biotinylovaný ligand může být navázán na kolonu nebo jiný typ matrice, jako jsou magnetické perličky, avidinóvým nebo streptavidinovým můstkem. Také sě může suspenze směsné populace buněk nechat zreagovat s biotinylovaným ligandem a buňky nesoucí interagující povrchovou molekulu se mohou aglutinovat avidinem v roztoku. Tento přístup se obvykle pouφφ φ »· φ • ·«»«· «φ · * * '· · · φφφφ φφφ · t · ' « « ·· · * 44 φφφ ΦΦ Φ žívá jednoduše pro selektivní odstranění děné populace buněk ze směsné populace. Jakmile se jednou naváže na matrici nebo aglutinuje avidinem, nelze snadno afinitní interakce (tj. mezi biotinýlovaným ligandem a povrchovou molekulou a mezi avidinem a biotiněm) přerušit způsobem, který by zachoval integritu nebo životaschopnost buněk. Například rozbití interakce mezi protilátkou a antigenem obvykle vyžaduje takové podmínky, jako je nízké pH, které poškozuje většinu buněk. Neinteragující buňky však mohou být isolovány. Aby šě isolovala navázaná buněčná populace, může se použít kolona Obsahuj ící modifikovanou molekulu typu avidinu podle předloženého vynálezu a pro uvolnění buněk (společně š biótinylováným ligandem) ž kolony se může použít roztok obsahující biotin (např. 0,6mM biotin za isotoniekých podmínek, např. 0,15M NaCl při pH 7, nebo nadbytečná kónčéntřáčé' biotlnu' ve vhodném mediu pro kultivaci tkání) * nebo. šě mohou aglutinované buňky dispergovat použitím stejného roztoku, který obsahuje biotin.
Imobilizované enzymy se,většinou používají v potravinářském, farmaceutickém a chemickém průmyslu [Katchalski-Kat2ir É.: TIBTECH 471 (1993)Jedním problémem imobi1izovaných enzymů pro použití v enzymových reaktorových systémech je to, že enzym nebo jeho matrice podléhá procesu stárnutí. Například enzymy jsou notoricky citlivé proteiny, čašto mají určitý poločas života a během této doby mohou být deaktivovány buň během použití nebo během skladováni. Pro průmyslové použití by bylo tedy výhodné znovu použít imobilizující matrici, jakmile se navázaný enzym stane neužitečným. Enzymový reaktor sestávající z biotinylovaného enzymu navázaného ha kolonu obsahující modifikovanou molekulu typu avidinu podle předloženého vynálezu se tedy může rekonstituci vát odstraněnímdeaktivovaného biotinylovaného enzymu přidáním bůá alkalických roztoků (např. pufru C, pH 10) nebo přidáním nadbytku biotinu (např. Ó,6mM při jakémkoliv pH). Pro rekonstituování kolony s modifikovným avidinem se pak může přidat čerstvá dávka biotinylovaného enzymu.
Podobně se mohou buňky imobilizovat na koloně módifiková• * «0 0 ·♦ 00 • 0 · 0 ·. 0 0 0 • 0 · 0 0 0 0 · 0000 0 0·· »0 0 0*0
0· 0· 0« 000 00 00 ného avidinu a použít se jako reaktorový systém na bázi buněk. Buňky mohou být uvolněny roztokem obsahujícím biotin (např. 0,6mM biotinem 2a išotonických podmínek, např. 0,15M NaCl při pH 7, nebo nadbytkem koncentrací biotinu ve vhodném mediu pro tkáňové kultury) a kolona s modifikovaným avidinem může být tedy rekonstituována.
Při technice používající fágovou knihovnu se vázající ligand (např. protilátka, receptor) připojí na pevný nosič, jako _jé mikřotitrovací deska. To se často dosáhne biotinylácí ligandu a následu jící imobilizaci ná desce streptavidinovým můstkem. Potom se přidá jí'vláknité bakteriofágy (např. M13) a tyto fágy, které obsahuji povrchové peptidy, které jsou schopny interagovat š imobilizovaným ligandem, se tedy navážou na desku. Nespecifický navázané fágy se'odstraní' promýváním nízkými kóncentracemi neutrálních detergentních činidel, jako je Tween 204 Navázané fágy se pak následně uvolní z desky, obvykle snížením pH, kterým se přeruší interakce mezi imobilizovaným ligandem a povrchovými peptidy na fágu. Jedním 2 potenciálních problémů při tomto postupu je to, že některé fágy mohou být stále ještě navázány na desku velmi silnými afinitnírai interakcemi. Tyto fágy by bylý zajímavé vzhledem ke vysoké afinitě jejich peptidů na biotinylovaný ligand. Použitím modifikovaného avidinu nebo streptavidinu podle předloženého vynálezu se tedy mohou z mikrótitróvacíčh destiček spolus biotinýlovánýra ligandem uvolnit vysokoafinitní fágy přidáním buá alkalických roztoků (např. pufr C, pH 10) nebo přidáním nadbytku biotinu (např. 0,6mM při jakémkoliv pH). Isolované vysokoafinitní peptidy navázané na fág mohou být pak obohaceny následnou infekcí bakterie a postupy používající vytvořenou fágovou knihovnu [viz například Scott J.R.: TIBS 17, 241 (1992)].
Genové obohacení a isolace DNA se může dosáhnout komplexováním biotinylované DNA modifikovanou molekulou typu avidinu nebo kolonou modifikovaného avidinu podle předloženého vynálezu známými způsoby [Wilchek M a Bayér E.A.: Analytical Biochemistry 171, 1 (1988). ]. V minulé době byly pro štěpení avidinu poII 4
4 4 4
44
4 4 4 * 4 « 4
4444' 4
4 4
4 4 4
4 4
4» užívány proteolytické enzymy, jako je proteináza K, aby se uvolnila biotinylovaná DNA z komplexu. Použitím modifikované molekuly typu avidinu podle předloženého vynálezu se může biotinylovaná DNA uvolnit alkalickými roztoky (např. pufrem C, pH 10) nebo přidáním nadbytku biotihu (mapř. 0,6mM při jakémkoliv pHj. —Biosensory sestávají z biologicky citlivého prvku, který uděluje specifičnost a funkci transdukce (tj. elektrochemickou, optickou, kalorimetrickou nebo akustickou), která mění biologickou událost na odpověá, kterou lze dále zpracovávat a kvantifikovat . Biologický ligand může být 'bučí katalytický (ňapř. enzymy, bakteriální buňky> tkáně) nebo nékatalytický (ňapř. protilátky, receptory, DNA). Tyto detektory spoléhají riá imobi'lizáči jedné ž. Ínťeřagujících složek ňa šeňsófickěra povrchu. Výsledné složky kompletovaného biosensorického zařízení jsou pozoruhodně drahé. Systém avidin-biotin byl v minulosti používán jako obecný způsob imobilizování takových ligandů na bioserisorech. Schopnost nahradit přírodní avidin nebo streptavidin modifikovanými avidiny podle předloženého vynálezu by poskytla řeversibilní biosensor, který by byl výhodný, pokud jde o cenu a vhodnost. Biotinylovný ligand může být imobilizován na biosensoru modifikovaným avidinem nebo streptavidinem a, jestliže jě to žádoucí, biotinylovaný ligandmůže být uvolněn alkalickými roztoky ( riapř . pufrem C, pH 10) nebo přidáním nadbytku biotinu (ňapř. 0,6mM biotinu při jakémkoliv žádaném pH, podmínkách iontové síly atd.). Modifikovaná molekula typu avidinu biosensorů může být potom nabita buá stejným nebo jiným biotinylovaným ligandem.
Předložený vynález také poskytuje způsob získání buá avidinové kolony nebo biotinylováného ligandu způsobem používajícím technologii avidin-biotin, která Zahrnuje následující stupně: i) imobilizuje se biotinylovaný ligand na koloně obsahující modifikovanou, molekulu typu avidinu podle vynálezu připojenou na pryskyřici, ii) provede se žádaná reakce nebo postup dělení s takto imobilizovaným biotinylovaným ligandem, * 4 · ···· ·· 4 0
0 0 0 004 0
0 0 Φ· iii) odstraní se biotinylovaný ligand z kolony ;s imobi li z ováným modifikovaným avidinem Změnou podmínek a iv) isoluje se biotinylovaný ligand a/nebo kolona s modif ikovaným avidinem pro další použití. Biotinylovaný ligand sě odstraní Z kolony s zmobilizovaným modifikovaným avidinem zvýšením pH, zahřátím, přidáním nadbytečných množství biotinu nebo malých množství močoviny, guánidinu nebo thiokyanátu a/nebo jejich kombinacemi. Ve výhodných provedeních se biotinylovaný ligand odstraní z kolony s zmobilizovaným modifikovaným avidinem zvýšením pH na 10 něbó přidáním 0,6mM biotinu.
Tento vynález je dále ilustrován nášíedujícími neomezujícími příklady.
......... ·* ' ' J .... · - .
Příklady přóvédění vynálezu ..............
V příkladech budou používány následující materiály a způ-:
soby.
Materiály: Avidin z vaječného bliku byl získán od STC labs (Wiňnipeg, Kanada) nebo od Bélovo Chemicals (Bastogne, Belgie). Stréptavidin byl vyčištěn z kultivačních filtrátů Streptomyces· avidinii použitím zlepšené iminobiotin-Šepharosové kolony, jak dříve popsáno [Báyeř E.A. a Wilchek M.: Methods Enzymol. 184, 80 (1990).]. Sepharosa4B CL byla od firmy Pharmacia (Uppsala, Švédsko). Tetranitromethan byl od firmy Fluka. Protein A hovězí sérový albumin (BSA) byl od Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo. USA).
Pufry: Pufr A: 50mM citrát-fosfprečnan, pH 3 až 6, pufr B: 50mM Tris-HCl, pH 7 až 9, a pufr C: 50mM uhličitan sodný-HCl, pH 10.
Postup biotinyláce: proteiny a enzymy použité v příkladech byly biotiřiylovány konvenčními způsoby biotinyláce použitím bzótinyl-N-hydroxysukcinimidového esteru (BNHS), jak dříve popsáno [Bayer E.A. a Wilchek M.: Methods Enzymol. 184. 80 • · * ·
(1990).].
Iraobilizace avidinu a streptavidinu na Sepharose byla prováděna způsobem s bromkyanern, jak bylo dříve popsáno [Kohn J. a Wilchek M.: Appl. Biochem. Biotechnol. <), 285 (1984).].
Testování enzymů:
a) Aktivita křenové peroxidázy. Peroxidázová aktivita bylá stanovena použitím 2,2* 1 -azino-bis( 3-ethylbenz-thiazolin-6-sulfdnové kyseliny) (ABTS) jako substrátu. Roztok.substrátu obsahoval 2,5 mg substrátu na 10 ml pufru A, pH 5, k němuž, bylo přidáno 10μΐ 30% (hmotn.) péroxiodu vodíku. Vznik bařvy byl měřen při 420 nm.
b) Aktivita alkalické fošfatázy byla stanovena použitím p-hitrofěnýlfdsfáťu' jako substrátu. Roztók substrátu obsahoval 10 mg substrátu rozpuštěného v 10 ml IM diéthanolaminóvého pufru (pH 9,8) obsahu jícího 0,5mM MgCl2. Vznik barvy byl měřen při .410 nm.
Protein byl stanoven způsobem podle Bradforda bud použitím avidinu nebo použitím streptavidinu (podlé, toho, co je vhodné) nebo BSA jako standardu.
Příklad 1
Příprava nitro-ávidinu, nitro-streptavidinu a jejich imobilizace na Sepharose
i) Příprava nitro-ávidinu
Vzorky (5 mg v 1 ml 5OmM Třis-pufru, pH 8, nebo jak shora uvedeno) avidinu z vaječného bílku se nechají reagovat s různými koncentracemi tetranitromethanu (TNM) (0,5 až 5 μΐ odpovídající 5 až 50 mM) 30 minut při 23 °C. Tyto vzorky se dialyzují přes noc, jednou proti IM NaCl a dvakrát proti dvakrát předestilované vodě. Množství modifikovaného tyrosinu ve vzorku bylo stanoveno aminokyselinovou analýzou. Jak je uvedeno na obrázku • · · «· · fefe «· · · · · ·· · fefe * «fe · · · fe fe fe fefefefe fe fefefe fefefe fefefe
2, za podmínek modifikace se maximálního množství modifikace (kolem '70 %) dosáhne použitím větší než 20mM koncentrace reakčního činidla, tj. průměrně tři ze Čtyř pod jednotek avidinového
T .
tetrameru byly modifikovány. V následujících pokusech byl připravený nitro-avidin používán v množství 2 pl.
ii) Příprava nitro-streptavidinu _Streptavidin (2,5 mg na 1 ml pufru) byl podroben ňitraci použitím vyšších množství tetranitromethanu (6 pl odpovídajících 50 mM) vzhledem k Většímu počtu tyrosinových skupin na .. podjednotku molekuly streptavidinu.
iii) Příprava nitro-avidinu a nitro-streptavidinu imobilibovaného na Sepharose
a) Aktivace Sepharosy 4b CL břomkyanem g odkapané Sepharosy 4B CL bylo promyto nejdříve vodou, potom 30% (obj.) acetonem a nakonec 60% (obj.) acetonem. Pryskyřice byla resuspendována v 6 ml 60% acetonu a ochlazena na 0 až 4 °C. Za míchání magnetickým míchadlem se přidá 6 ml roztoku CNBr (10 g/100 ml acetonu), následuje přikapáni stejného objemu roztoku triethylaminu (TÉA) (15,2 g/100 ml acetonu) během 1 až 2 minut . Aktivovaná pryskyřice byla zfiltrována a promyta 0,IM hydrogenuhličitaném sodným.
b) Xmobiližáce na Sepharose
Navázání nitro-avidinu a nitro-streptavidinu na aktivované Sepharose 4B CL bylo provedeno 0,lM roztokem hydrogenuhličitanu 16 h při 4 °C.
iv) Nitrace avidin-Sepharosy a streptavidin-Sepharosy
Vzorek 4 ml avidin-Sepharosy (1,4 mg avidinu na ml Sepharosy), připravený jak shora popsáno pod iii ) ad b), ale pouφ « φ · φ φ . φ · · φφφ φ φ φφ φ · · φ · φ φ φ φφφ φ φ • · φ φ ' φ · · žitím nemodifikovaného avidinu, se promyje 50mM Tris-pufrem, pH 8, a nechá se 50 minut při 23 °C reagovat se 6 μΐ ŤNM. Nitro-modifikovaná pryskyřice se promyje nejdříve ÍM NaCl, potom dvakrát destilovanou vodou a nakonec PBS.
Příklad 2
Navázání biotinylovaných proteinů na nitró-avidin
i) Navázání biotinylovaných proteinu na nitró-avidin bylo testováno několika způsoby. V jednom pokusu byl nitró-avidin imobilizován na Sepharose bromkyánovým způsobem podlé přikladu 1 ád iii) použitím 0,5 mg avidinu na ml Sepharosy. Vzorky biotinylovaňéhoBSÁ v pufru A) B nebo C (100 μΐ) bylý aplikovány ňa 100 pínitro-avidin-Sepharosové pryskyřice. Byl měřen protein v eluovaných frakcích. Procenta navázání při různých. pH byla stanovena odečtením množství proteinu ve frakcích eluentu od proteinu naneseného na pryskyřici? Jak je uvedeno ňa obrázku 3, k optimálnímu navázání došlo při pH4. Při vyšším pH (mezi 5 a 8) bylo navázání stejné. Nad pH 8 navázání značně pokleslo a při pH 10 bylo navázání zanedbatelné.
ii) Podobné výsledky byly získány použitím biotinylóvaného enzymů alkalická f osf atáza testem na mikrotitrovací desce (Obr . 4). V tomto pokusu byl nitro-avidin připravený podle příkladu 1 ad i) adsorbován na mikrotitrovací desky (l pg nitro-avidinu na 100 μΐ fosforečnanen pufrovanéhosolného roztoku (PBS/jamku) , desky byly blokovány roztokem 1% (hotn.) BSA a vzorky biotinylované alkalické fosfatázy byly aplikovány v pufrech A, B a Č o různých pH (37 μg/o,l ml pufru/jamku) . Desky byly promyty a navázaná enzymatická frakce byla stanovena kolorimetricky enzymovým testem, jak shora popsáno ve způsobu ad b) použitím p-nitrofenylfosfátu jako substrátu.
iii) Použitím podobného enzymového testu na mikrotitrovací desce byla srovnávána vazebná aktivita nitro-aVidinu s aktivitou přírodního (nemodifikovaného) avidinu. Mikrotitrovací desky
| ···· | A A | M | A - AA | »· | ||
| • | A * | • « | A A | « A | A | • |
| • | • A | • · | • A | • A | ||
| A | A A | * · A | A AAA | A | « | |
| * · | e « | * · | A | • | A |
potažené avidinem nebo nitro-avidinem (1 jig/lOO μΐ PBS/jamku) byly naplněny různými koncentracemi (mezi 10 ng a T pg vé 150 μΐ pufru A) biotinylované křenové peroxidázy při experimentálně stanoveném optimálním pH pro navázání (tj. pH 4). Desky byly promyty a enzymatická aktivita peroxidázy byla stanovena jak shora popsáno vé způsobu ad á) použitím ABTS jako substrátu. Jak je uvedeno na obrázku 5, za těchto podmínek bylo nerozlišitelné navázáni biotinu provedené s nemodifikovaným avidinem a nitro-ávidinem.
Příklad 3
Uvolnění biotinylóvaných proteinů z nitro-avidinu
i) Ábý se stanovily výhodné podmínky přo uvolnění biotinu z nitro-avidihové kolony, byl biotinylovaný BSA (1,5 mg/150 pg pufru A, pH 4) aplikován na kolonu obsahující pryskyřici nitro-avidin-Sepharosu podle příkladu 1 ad iv). Navázaný materiál byl promyt pufry A, B a C o zvyšujícím se pH. Byla sledována koncentrace protonů éluovaných frakcí. Jak je vidět z obrázku 6, pro uvolnění biotinylovaného proteinu z pryskyřice byly zapotřebí alkalické roztoky (pufr C, pH 10).
ii) Použitím stejného postupu, ale promýváním pou2é roztokem C, pH 10, byly s kolonou nitro-streptavidinu, připravenou navázáním streptavidinu na Sepharosu podle příkladu 1 ad iii), získány podobné výsledky (obr. 7).
iii) V podobném pokusu byla sledována kompétice s volným biotinem jako přostřdkem pro uvolnění biotinylovaného BSA z kolony obsahující pryskyřici nitro-avidin-Šephařosa připravenou, podle příkladu 1 ad iv). Biotinylovaný Bsa (1,5 mg/150 μΐ pufru A, pH 4) byl nanesen na 2 ml kolony nitro-avidin-Sephárosa. Kolonou byl nechán projít roztok obsahující 0,6mM biotin v pufru A, pH 4. Byla sledována koncentrace proteinu. Jak je uvedeno na obrázku 3, většinu biotinyl-BSA lzé uvolnit 0,6mM biotinem v pufru A při pH 4. Biotinem indukovaná eluce biotinyl-BSA byla • ••9 '99 * 9 • 9 9 *9
9 »99 * studována jako funkce pH s použitím pufrů A, B nebó C s pH od 4 do 10.
V iv) Za stejných podmínek byl proveden podobný pokus s.pryskyřicí nitro-avidin-Sepharosa připravenou podle příkladu 1 ad iv) až na to, že volný biotin byl rozpuštěn v pufrech o různém pH v rozmezí od 4 do 10. Jak je uvedeno na obr. 9, volný biotin byl účinným éluentem v celém testovaném rozmezí pH. Pro srovnání je uvedena eluce při pH 10 v nepřítomnosti biotinu.
Příklad 4
Blokování nemodifikovaných míst vázajících biotin
Jelikož za popsaných podmínek lze dosáhnout pouze částečné modifikace vazebných míst tyrosinu, nemodifikovaná místa by mohla potenciálně představovat problém v následujících aplikacích ni tro-avidinu. Ni tro-ávidinové vzorky připravené podlé příkladu 1 ad i) obsahující různá množství, nitro-tyrosinu (viz obr. 2) byly potaženy na jamky mikrotitrovacích destiček (1 μΐ/ /ΙΟΟμΙ PBS/jamku). Jako kontrola byl použit přírodní avidin z vaječ-—néhobílkuvpoďobnékoncentraci. Jamky byly blokovány—1% --— (hmotn.) BSA. Adsorbované proteinové vzorky byly séléktivně
Úiijálíú ir v - > „IB «9ί^' Ιιίί >bi 1ι99ι ι ιίϋιϊμιιιυ·111' ',ϊΐ'^-x^ rfe r-w w ' é il9iilÍ!9i»MliAm blokovány nadbytečnými množstvími volného biotinu 0,6mM biotinem v pufru A, ptí 4. Biotin, který zaujal modifikovaná vazebná místa, lze uvolnit alkalickými roztoky, jak je shora popsáno v příkladu 3 (pufr C, pH 10). Po blokování a působení alkalií se kapacita vázat biotin částečně nitrovaných avidinových vzorků stanoví enzymovým testem na mikrotitrovacích destičkách použitím systému biotinylované peroxidázy (shora uvedený způsob ad á)). Jak je uvedeno ňa obr. 10, bylo zjištěno. Se navázání je úměrné rozsahu modifikace s maximem při asi 60% modifikaci.
•44« 44
4 «4 4»· φ · 44 4 * · ··*·· 444
Příklad 5
Opakované použití nitro-avidinové kolony
Stabilita kolony obsahující pryskyřici Sepharosa-nitro-avidin podle příkladu 1 ad iii) byla testována opakovaným nanesením a eluovánim biotinylovaného proteinu. Na 0,75 ml kolonu pryskyřice Sepharosa-nitro-avidin byly naneseny stejné vzorky biotinylovaného BSA (300./xg/l ml pufru A, pH 4) . Kolona byla promyta pufrem A, pH 4, á eluována pufrera C, pH 10. Tento postup byl zopakován třikrát. Bradfordovým testem byl sledován protein ve frakcích (obr, 11Á). Jak je ukázáno na obr. 1ÍB, spojení eluovaných frakcí poskytlo v podstatě stejná množství biotinylovaného proteinu navázaného na nitró-avidinovou kolonu a uvolněného z nitro-avidinové kolony na cyklus.
Příklad 6
Čištění IgG na koloně nitro-avidinu s biotinylovaným proteinem A ——-Bylo zkoumánoprovedení nitro-avidinové kolony jako universální afinitní pryskyřice. Podle tohoto postupu se biotinylovaný protein A napojí na Sepharosu a nalije se na kolonu. Kolona se používá jako imunoafinitní kolona pro čištění imunoglobulinu přímo z plného králičího séra. Potom byl biotinylovaný protein A uvolněn z kolony. Na 2ml kolonu obsahující 0,5 iig nitró-ávidinu/ml Sepharosy, připraveného podle příkladu 1 ad iv), se přidá 1,8 mg proteinu A ve 4 ml pufru A, pH 4. Na kolonu se nanese celé králičí sérum (0,5 ml čtyřikrát zředěno Ο,.ΙΜ pufrem B, pH 8). Tato kolona se promyje stejným pufrem, následuje stejný pufr v lOmM koncentraci. Navázaný imunoglobulin se z kolony uvolní pufrem A, pH 4. Biotinylovaný protein A se následně odstraní 50mM pufrem C, pH 10. Výsledky jsou uvedeny na obr. 12. Různá maxima byla zkoumána SDS-PAGE, která ukazuje, že jde v podstatě o čisté frakce očekávaného proteinu (obr. 13). Vyčištěný imunoglobulin byl tak Čistý jako komerčně do*944 »· «« 4 ·· 49
4 9 4 4 44 4 4 4 ♦
4*4 · 4 * 4444 ·
4*44 44 4 4 4 4 »4 44 ·44 «4 *4 stupný vzorek ekvivalentní frakce. Biotinylovaný protein A, který byl eluován z kolony alkalickou élucí, měl podobnou čistotu.
Přiklad 7
Příprava jodovaného avidinu a navázání biotinylovaných proteinů na jodovaný avidin adsorbovaný na mikřotitrovácich deskách
i) Příprava jodovaného, avidinu ~ ~ ~
Vzorek 2 mg avidinu v 0,5 ml pufru fosforečnáhú sodn*éhó,. pH 7, byl nechán zřeagovat s 10 μΐ roztoku Kl (32 mg/ml) a 200 μΐ chloraminu-Ť (2 mg/ml) . Po: 30 minutách inkubace při 23 °C se během 1minutý přidá' 3ό(Γμϊ roztoků disiřičiťáriu sodného ( 2 mg”/ /ml). Ukončení bylo provedeno přidáním 1 ml 1% (hmotn.) roztoku Kl. Vzorek byl dialyžován přes noc proti opět dvakrát předestilované vodě.
ii) Navázání biotinylóvané péroxidázy na jodovaný avidin
Jodovaný avidin byl adsorbován na mikrotitrovací destičky, destičky byly blokovány 1% (hmotn.) roztokem BSA a vzorky bior tinylováné křenové péroxidázy byly áplikovány V pufrech A, B a G o různých pH (37 μς/Ο,1 ml pufru/jamku). Desky byly promyty a enzymatická aktivita péroxidázy byla stanovena použitím ABTS jako standardů shora popsaným způsobem ad a). jak je ukázáno na obr. 14, k optimálnímu navázání došlo při pH 5.
Přiklad 8
Připravá azotyrosin-avidinu a streptavidinu _ Roztok p-aminobenzěnarsonové kyseliny (kyselina p-arsanilová, 100 mg) v 0,3M HCl (10 ml) se nechá v ledové lázni zreagovat s NaNO2 (35 mg v 5 ml vody). Po 6 minutách se pH roztoku upraví hydroxidem sodným ná 5 a okamžitě se použije. K roztoku
0000 «0 00 · «« ·· · ·' 0 000 0 »0 0 ·· 000 0 0 · 0000 0 • 000 00 *0 00·
00 00 *00 ·0 00 avidinu (5 mg ve 4,5 ml O,ÍM pufru bořítanu sodného, pH 8,4) se přidá 0,5 ml výsledné azoarsahilové kyseliny (2 mg v Ο,ΪΜ pufru boritanu sodného, pH 8,4). Reakce se provádí 2 h za teploty místnosti/. Postup reakce se sleduje spektrofotometricky (λΜΧ 342 nm). Avidin derivatizovaný azoarsanilátem se dialyzuje proti PBS nebo 50nM Tris pufru, pH 8. - - ·.
Podobným způsobem se připraví azo-tyrosinový streptavidin ·.
Nahraženim.p-arsanilové kyseliny jinými p-aminobenzenovými deriváty, např. anthranilovou kyselinou (o-aminpbenzóová kyselina), p-aminobenzpovou kyslinou, p-aminobenzenfesforečriou kyselinou a sulfánilovou kyselinou (p-aminobenzensulfPnová kyselina) se získají odpovídající azodeřiváty.
Příklad 9 ' · · '
Příprava aminotyrósin-avidinu a streptavidinu
Nitřo-avidin nebo azotýrosin-avidin (2 mg v 1 ml 50mM Tris pufru, pH 8.) se nechá zřegovát s 24molárním nadbytkem Na2S2O4 (1,4 mg ve 4 ml stejného pufru). Reakce se provádí 16 h za teploty místnosti. Rozsah redukce se ověřuje spektrofotometricky (Snížení absorbance při λΜΧ 428 nm u nitro-avidinu nebo 342 nm u azotyrosin-avidinu). Protein byl dialyzován proti PBS.
' P -.··«· , , 1 ,
Aminotyrosin-streptavidin byl vyroben podobným postupem použitím 1 mg nitro-streptavidinu a odpovídajícího molárniho nadbytku Na2S204.
Claims (28)
- 00 0 0 0 0 0 0 0·0 φ φ •000 00 0 0·0PATENTOVÉ NÁROKYModifikovaná molekula typu avidinu vázající biotin, která je vybrána z molekul zahrnujících: i) přírodní avidin z vaječného bílku, ii) rekombinantní avidin, iii) deglýkosylované formy avidinu, iv) bakteriální streptavidin, v) rekombinarithi streptavidin, vi) upravený streptavidin a vii) deriváty ad i) až ad vi), které jsou modifikovány v jiných místech než je podstatný tyrosinový zbytek, jejíž podstatný tyrosinový zbytek v místě vázajícím biotin je“ modifikován takovým způsobem, že jeho pKa je sníženo při srovnání s pKa nemodifikovaného tyrosinového zbytku v odpovídající nemodifikované molekule typu avidinu.Modifikovaná molekula typu avidinu podlé nároků 1, v němž pKa tyrosinu v místě vázajícím biotin je sníženo přidáním jedné nebo,více elektrofilních a/nebo nukleofilních skupin na tyrosinový zbytek.Modifikovaná molekula typu avidinu podle nároku
- 2, v němž modifikovaný podstatný tyrosiiiový zbytek znamená skupinu obecného vzorceModtficd avidinOHX·, v němž Χχ i X2 znamená skupinu Vybranou z nitroskupiny, atomu halogenu, skupiny NRxR2 a -N-NR3, v nichž RT i R2 je vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, alkylu s 1 až 8 atomy uhlíku a karboxylového acylu s 1 až 6 atomy uhlíku a R3 znamená aryl substituovaný kyselinovou skupinou.- ... φ __» ,.| .Modifikovaná molekula typu avidinu podle nároků
- 3, v němž Xx a/nebo X2 znamená nitroskupinu.···· »0 00 0 «0 00 0 0 0 · · 0 · ·
- 4 · · ·*· 44 444 4 φ*· « • · 4 4 4 444 · 44 • 44 44 · 4 4 · 4 · f 4 4 ·♦· 4 44 4 4 4 4 • 4 4 4 '4
- 5. Nitro-tyrosinový přírodní avidin z vaječného bílku.
- 6. Nitro-tyřósinový bakteriální streptávidin.
- 7. Způsob výroby molekuly typu avidinu modifikované nitro-tyrosiném vázající biotin podle kteréhokoliv z nároků 4 až 6, v y z n a č u j í c í se ti m, žě, zahrnuje zreagování nemodifikované molekuly typu avidinu s tětránitromethanem za nedenaturujících podmínek*
- 8. Módifikováná molekula typu avidinu podle nároku 3, v němž Íí; a/nebo x2 znamená átom halogenu.
- 9« · 9 · · · · ···« · • * · · · · 9 · ·9. Modifikovaná molekula typu avidinu podle nároku.3, v němž ” atom halogenu žnaměha'atom” jodu........r’
- 10. Modifikovaná molekula typu avidinu podle nároku 3, v němž Xx a/nebo X2 znamená azoskupinu..
- 11. Modifikovaná molekula typu avidinu podle nároku 3, v němž Xx a/nebo X2 znamená aminoskupinu.
- 12. Modifikovaná molekula typu avidinu podle nároku 3, v němž Xx a/nebo χ2 znamená skupinu -N=NR3, vníž R3 znamená fenyl substituovaný karboxylovou nebo acylovou skupinou odvozenou od anorganické kyseliny.
- 13. Modifikovaná molekula typu avidinu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6 a 8 až 12, která je připojena na pevný nosič.
- 14. Modifikovaná molekula typu avidinu podle nároku 13, v němž pevný nosič znamená pryskyřici, mikrotítrovací desku, skleněné perličky nebo magnetické perličky.
- 15. Modifikovaná molekula typu avidinu podle nároku 14, v němž pevný nosič znamená pryskyřici.*444 44 ·»
- 16. Modifikovaná molekula typu avidinu podle nároku 15, v němž pryskyřice znamená Sepharosu.
- 17. Kolona pro imobilizáci biotinylovaného ligandu, vy z ή ačují-cí se t í m, že obsahuje modifikovanou molekulu typu avidinu podle nároku 1 připojenou na pryskyřici.
- 18. Kolona podle nároku 17, vyznač ují c í s e 7€I ra, 2 e modif i kovaná mol ekul a typů avidi nu znamená pří— rodní avidin z vaječného bílku s nitro-týrosinem a pryskyřice znamená Šěphařosu.’ ' 'I ,
- 19. Kolona podle nároku 17; vyzná čující' s é ' t Tm*: že modif ikóváriá molekula typu áviďiriú zriamená’bák- ’ teřiální streptavidin s nitro-tyrosinem a pryskyřice znamená Sepharosu.
- 20. Použití modifikované molekuly typu avidinu vázající biotin podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, 8 až 12 a 14 až 16 ne' .j . v · 4 .bo kolony podle kteréhokoliv z nároků 17 až 19 při způsobu používajícím technologii avidin-biotin.
- 21. Použiti podle nároku 20 modifikované molekuly typu avidinu nebo uvedené kolony při afinitní chromatografii pro dělení buněk, imobilizáci a uvolnění buněk,, pro zachycení a uvolnění DNA, pro imobilizáci a uvolnění biotinylovaných enzymů, pro přípravu fágóvýčh knihoven a jako reversibilní matrice pro biósenžory.
- 22. Způsob získání bučí avidinové kolony nebo biotinylovaného ligandu ve způsobu používajícím technologii avidin-biotin, vy z n a č u j ící s e t í m, že:i) imobilizuje se biotinylovaný ligand ňa koloně r* -+ J. * l - Λ* ,. Λ.· .li J f τ *· obsahující modifikovanou molekulu typu avidinu podle nároku 1 připojenou na pryskyřici, ii) provede se žádaná reakce nebo postup děleni s takto ···· ·· ·» « tt ,.··· ···· · · * * • · · · · tt tt « ··· » · ♦····# tttttt ·· tttt tttt tttttt tt* tttt imobiližovaným biotinýlovaným ligandem, iii) odstraní se biotinylovaný ligand z kolony s zmobilizovaným modifikovaným avidinem změnou podmínek a iv) isoluje.se biotinylovaný ligand a/nébo kolona s modifikovaným avidinem pro další použití.
- 23. Způsob podle nároku 22, vyzná Cu jící s e t i m, že biotinylovaný ligand se odstraní z kolony s imóbilizóváným modifikovaným avidinem zvýšením pH, zahřátím, přidáním nadbytečných množství biotinu nebo malých množství močoviny, guanidiriu nebo thiokyanátu a/nebo jejich kombinacemi.
- 24. Způsob podle nároku 23, v y z n a č u j í c i s e t i m, že se biotinylovaný ligand odstraní z kolony s imóbilizovaným modifikovahýmavidinem zvýšeními pH na 10.
- 25. Způsob podle nároku. 23, v y z n a č u jí c í s e t i m, že se biotinylovaný ligand odstraní ž kolony s imobilizovaným modifikovaným avidinem přidáním 0,6mM biot inu.
- 26. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 22 až 25, v y z n a- . Č u jí c í se ti m, že modifikovaná molekula typu ávidinu má modifikovanou podstatnou tyrósinovou skupinu obecného vzorceModíficd avidin v němž Χλ i X2 znamená skupinu vybranou z nitroskupiny, atomu halogenu, skupiny NR^ a -N=NR3, v nichž Rx i Ra je ·“ 'Mt#·-* T. » ·' 1:1 « vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíkuj alkylu s 1 až 8 atomy uhlíku a karboxy lového acylu s 1 až 6 atomy uhlíku á R3 znamená aryl substituovaný kyselinovou skupinou.• ·· II ·· 9 9« «φ *« · · 9 ♦ 9 · ·«
- 27.
- 28.Způsob podle nároku kteréhokoliv z nároků 22 až 25, v y z n a č u j í c í Se t í m, že modifikovaná molekula typu avidinu znamená přírodní aviďin z vaječného bílku s nitro-tyrosinem;•Způsob podlé kteréhokoliv 2 nároků 22 až 25, v ý z n a č u j í c í se t í m, Že modifikovaná molekula typu avidinu znamená bakteriální streptavidin s nitro-tyrosinem.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IL11414995A IL114149A0 (en) | 1995-06-14 | 1995-06-14 | Modified avidin and streptavidin molecules and use thereof |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ401697A3 true CZ401697A3 (cs) | 1998-07-15 |
Family
ID=11067612
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ974016A CZ401697A3 (cs) | 1995-06-14 | 1996-06-13 | Modifikovaná molekula typu avidin vázající biotin, její použití, nitro-tyrosinový přírodní avidin a způsob jeho výroby, bakteriální streptavidin, kolona pro imobolizaci biotinylovaného ligandu a způsob získání avidinové kolony nebo biotinylovaného ligandu |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5973124A (cs) |
| EP (1) | EP0871658B1 (cs) |
| JP (1) | JPH11507920A (cs) |
| KR (1) | KR19990022896A (cs) |
| CN (1) | CN1119353C (cs) |
| AT (1) | ATE481417T1 (cs) |
| AU (1) | AU713417B2 (cs) |
| BR (1) | BR9609241A (cs) |
| CA (1) | CA2221647A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ401697A3 (cs) |
| DE (1) | DE69638257D1 (cs) |
| HU (1) | HUP9900239A3 (cs) |
| IL (1) | IL114149A0 (cs) |
| WO (1) | WO1997000329A2 (cs) |
Families Citing this family (32)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19637718A1 (de) * | 1996-04-01 | 1997-10-02 | Boehringer Mannheim Gmbh | Rekombinante inaktive Core-Streptavidin Mutanten |
| US6368813B1 (en) | 1997-03-14 | 2002-04-09 | The Trustees Of Boston University | Multiflavor streptavidin |
| US6391571B1 (en) | 1997-04-01 | 2002-05-21 | Roche Diagnostics Gmbh | Recombinant inactive avidin mutants |
| US5985658A (en) * | 1997-11-14 | 1999-11-16 | Health Research Incorporated | Calmodulin-based cell separation technique |
| WO2000028326A1 (en) * | 1998-11-06 | 2000-05-18 | Iatron Laboratories, Inc. | Novel complexes containing crosslinked avidin, analytical method with the use of crosslinked avidin and analytical reagents and kits |
| IL126991A0 (en) * | 1998-11-10 | 1999-09-22 | Yeda Res & Dev | Azobenzene derivatives and intermediates thereof |
| WO2000027814A1 (en) * | 1998-11-10 | 2000-05-18 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Avidin derivatives and uses thereof |
| JP2002541818A (ja) * | 1999-04-14 | 2002-12-10 | ザ ガヴァメント オブ ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ、アズ レプリゼンテッド バイ ザ セクレタリー、 デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サーヴィスィズ | 高感度ファージ提示生体分子検出 |
| EP1201667B1 (en) * | 1999-07-29 | 2005-09-21 | National Institute of Advanced Industrial Science and Technology | Polymerizable biotin derivatives, biotin polymer, and polymer responsive to avidin stimulation |
| JP2004501110A (ja) * | 2000-05-23 | 2004-01-15 | ネクセル セラピューティックス インコーポレイティド | 細胞選択用試薬および使用方法 |
| GB0102568D0 (en) | 2001-02-01 | 2001-03-21 | Magnetic Biosolutions Sweden A | Method |
| US20030175818A1 (en) * | 2002-03-15 | 2003-09-18 | Ross Amelia A. | Devices and methods for isolating and recovering target cells |
| US7754155B2 (en) * | 2002-03-15 | 2010-07-13 | Ross Amelia A | Devices and methods for isolating target cells |
| US8426028B2 (en) * | 2004-04-28 | 2013-04-23 | University Of Houston | Preparation of sensors on oligo- or poly (ethylene glycol) films on silicon surfaces |
| US9302242B2 (en) * | 2004-04-28 | 2016-04-05 | University Of Houston System | Preparation of nanometric arrays of biomolecules on oligo- or poly(ethylene glycol) films on silicon surfaces |
| WO2006086019A2 (en) * | 2004-10-21 | 2006-08-17 | Optiscan Biomedical Corporation | Methods of treating diabetes |
| WO2006084388A1 (en) * | 2005-02-11 | 2006-08-17 | Uti Limited Partnership | Monomeric streptavidin muteins |
| US20070025918A1 (en) * | 2005-07-28 | 2007-02-01 | General Electric Company | Magnetic resonance imaging (MRI) agents: water soluble carbon-13 enriched fullerene and carbon nanotubes for use with dynamic nuclear polarization |
| US7704708B2 (en) * | 2006-02-13 | 2010-04-27 | Uti Limited Partnership | Monomeric streptavidin muteins |
| EP2230264B1 (en) | 2006-06-29 | 2019-10-09 | Life Technologies AS | Particles containing multi-block polymers |
| EP2109669B1 (en) | 2006-11-15 | 2015-01-07 | Life Technologies AS | Methods for reversibly binding a biotin compound to a support |
| US8506993B2 (en) * | 2007-08-14 | 2013-08-13 | University Of Houston | Compositions and methods for making and using multifunctional polymerized liposomes |
| US7842475B2 (en) * | 2008-01-08 | 2010-11-30 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Stabilization of solid support assay reagents |
| US20090209447A1 (en) * | 2008-02-15 | 2009-08-20 | Michelle Meek | Cleaning compositions |
| TWI365185B (en) * | 2008-07-24 | 2012-06-01 | Lilly Co Eli | Amidophenoxyindazoles useful as inhibitors of c-met |
| DE102008053892A1 (de) | 2008-10-30 | 2010-05-06 | Fachhochschule Gelsenkirchen | Medizinisches Implantat mit biofunktionalisierter Oberfläche |
| WO2014143954A2 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University | Biosensor microarray compositions and methods |
| HK1220759A1 (zh) | 2013-03-15 | 2017-05-12 | Hycor Biomedical Llc | 用於进行过敏症和自身免疫性疾病的诊断测定的自动化免疫分析系统 |
| WO2015195404A1 (en) | 2014-06-20 | 2015-12-23 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services | Methods for detection of an analyte by movement of tethered microparticles |
| WO2016205239A1 (en) | 2015-06-15 | 2016-12-22 | The United States Of America, As Represented By The Secretary Department Of Health And Human Services | Non-hormonal mammalian sperm decoy contraception based on the n-terminus of the zp2 protein |
| WO2018076025A1 (en) | 2016-10-21 | 2018-04-26 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Molecular nanotags |
| CN119438418A (zh) * | 2024-10-22 | 2025-02-14 | 北京大学 | 一种蛋白碘化修饰水平及其修饰位点的分析方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3027770B2 (ja) * | 1994-03-05 | 2000-04-04 | ロシュ ダイアグノスティックス ゲーエムベーハー | イムノアッセイで使用するための干渉除去剤 |
-
1995
- 1995-06-14 IL IL11414995A patent/IL114149A0/xx unknown
-
1996
- 1996-06-13 KR KR1019970709365A patent/KR19990022896A/ko not_active Withdrawn
- 1996-06-13 BR BR9609241-6A patent/BR9609241A/pt not_active Application Discontinuation
- 1996-06-13 WO PCT/IL1996/000014 patent/WO1997000329A2/en not_active Ceased
- 1996-06-13 HU HU9900239A patent/HUP9900239A3/hu unknown
- 1996-06-13 AT AT96918819T patent/ATE481417T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-06-13 US US08/973,970 patent/US5973124A/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-13 AU AU61353/96A patent/AU713417B2/en not_active Ceased
- 1996-06-13 CZ CZ974016A patent/CZ401697A3/cs unknown
- 1996-06-13 EP EP96918819A patent/EP0871658B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-13 JP JP9502873A patent/JPH11507920A/ja not_active Ceased
- 1996-06-13 CA CA002221647A patent/CA2221647A1/en not_active Abandoned
- 1996-06-13 CN CN96195475A patent/CN1119353C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1996-06-13 DE DE69638257T patent/DE69638257D1/de not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| BR9609241A (pt) | 1999-10-13 |
| IL114149A0 (en) | 1995-10-31 |
| WO1997000329A3 (en) | 1997-03-06 |
| KR19990022896A (ko) | 1999-03-25 |
| DE69638257D1 (de) | 2010-10-28 |
| AU6135396A (en) | 1997-01-15 |
| EP0871658A4 (en) | 2002-12-04 |
| US5973124A (en) | 1999-10-26 |
| CN1119353C (zh) | 2003-08-27 |
| MX9710181A (es) | 1998-03-31 |
| JPH11507920A (ja) | 1999-07-13 |
| HUP9900239A3 (en) | 1999-11-29 |
| EP0871658B1 (en) | 2010-09-15 |
| CN1191018A (zh) | 1998-08-19 |
| ATE481417T1 (de) | 2010-10-15 |
| HUP9900239A2 (hu) | 1999-05-28 |
| WO1997000329A2 (en) | 1997-01-03 |
| EP0871658A2 (en) | 1998-10-21 |
| AU713417B2 (en) | 1999-12-02 |
| CA2221647A1 (en) | 1997-01-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ401697A3 (cs) | Modifikovaná molekula typu avidin vázající biotin, její použití, nitro-tyrosinový přírodní avidin a způsob jeho výroby, bakteriální streptavidin, kolona pro imobolizaci biotinylovaného ligandu a způsob získání avidinové kolony nebo biotinylovaného ligandu | |
| Cuatrecasas | Protein purification by affinity chromatography: derivatizations of agarose and polyacrylamide beads | |
| US4992383A (en) | Method for protein and peptide sequencing using derivatized glass supports | |
| US20080090255A1 (en) | Phosphoprotein detection reagent and method of making and using the same | |
| US20070224620A1 (en) | Compositions and methods for capturing and analyzing cross-linked biomolecules | |
| KR101270870B1 (ko) | 고체상 올리고사카리드 태깅: 고정화 탄수화물의 조작 기법 | |
| JP6118560B2 (ja) | 共役反応 | |
| CA2934430A1 (en) | Mass labels and methods of use thereof for labelling analytes | |
| CN113049811A (zh) | 纳米磁珠包被物及其制备方法、检测试剂和检测试剂盒 | |
| US5137765A (en) | Derivatized glass supports for peptide and protein sequencing | |
| EP2294418A2 (en) | Cleavable catalytic binding and detection system | |
| CN105592860B (zh) | 抗体组合物和用于其的缓冲体系 | |
| AU2021210878A1 (en) | Compounds and methods for selective C-terminal labeling | |
| Másson et al. | Chemical activation of nitrocellulose membranes for peptide antigen‐antibody binding studies: direct substitution of the nitrate group with diaminoalkane | |
| JPH08509461A (ja) | ポリペプチドを固定化するための支持体及び方法 | |
| IL122444A (en) | Modified avidin and streptavidin molecules and use thereof | |
| US9086411B2 (en) | Resin assisted capture of cysteine-modified proteins/peptides and determination of presence and location of modification | |
| Chiao et al. | Interaction of modified haptoglobin with hemoglobin | |
| MXPA97010181A (en) | Modified molecules of avidina and estreptoavidina and use of mis | |
| JP4104219B2 (ja) | 抗トレポネーマ抗体測定試薬の製造方法、測定試薬及び測定方法 | |
| JPH0797988B2 (ja) | 物質の固定化方法 | |
| JPH01225494A (ja) | 水不溶性融合蛋白質の可溶化方法 | |
| WO2005106496A1 (en) | Method for protein protection | |
| JP2002286723A (ja) | タンパク質の高感度検出方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic |